CN105238797B

CN105238797B - 一种无乳链球菌的gshF基因的突变基因及其应用

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Publication number: CN105238797B
Application number: CN201510697906.8A
Authority: CN
Inventors: 徐志南; 杨修亮; 杭宝建; 陈斌斌; 李江涛; 黄磊
Original assignee: Shandong Jin Cheng Bioceuticals Inc; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Shandong Jin Cheng Bioceuticals Inc; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2018-10-02
Anticipated expiration: 2035-10-23
Also published as: CN105238797A

Abstract

本发明公开了无乳链球菌的gshF基因的突变基因以及在构建高产谷胱甘肽工程菌的应用。突变基因为gshFM1、gshFM2或gshFM3，根据突变基因，获得谷胱甘肽合成酶突变体以及毕赤酵母工程菌、酿酒酵母基因工程菌，用于合成谷胱甘肽。本发明获得的双功能谷胱甘肽合成酶突变体即不受谷胱甘肽的反馈抑制又具有高催化效率的特性；利用获得的突变体构建的基因工程菌谷胱甘肽产量很高，为工业生产制备谷胱甘肽奠定了基础。

Description

一种无乳链球菌的gshF基因的突变基因及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种通过定向进化手段获得源于无乳链球菌Streptococcus agalactiae ATCC-BAA611的谷胱甘肽合成酶基因gshF基因的突变基因，以及在构建毕赤酵母和酿酒酵母谷胱甘肽生产菌株中的应用。

背景技术

谷胱甘肽(L-Glutathione)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的生物活性三肽，全称为5-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸。

在细胞内，谷胱甘肽主要以还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)两种形式存在，其中主要以还原型为主。谷胱甘肽具有游离的巯基和很强的供电子或质子氢的能力，因此谷胱甘肽具有重要的生理功能：(1)作为胞内最丰富的抗氧化剂，保护DNA、蛋白质和其它生物分子抵抗氧化损伤；(2)通过谷胱甘肽-S-转移酶完成对外源物质的解毒作用；(3)参与氨基酸的吸收及转运；(4)参与细胞信号转导，维持细胞正常生命活动，其代谢异常可导致细胞病变如纤维化；(5)调节淋巴细胞的功能，发挥抗病毒作用。因此，谷胱甘肽在医药、食品和化妆品等行业有着广泛的应用。

GSH含有氨基、羧基、巯基和酰胺等多种给电子配位基团，可以和细胞内的有毒金属离子结合，从而起到解毒作用。大量的研究证明，有毒的金属离子(如Hg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺)能使细胞内的GSH的含量大大降低。有毒金属离子通过和GSH结合排除体外，对金属离子细胞毒性起到保护作用。因此，近年来对GSH与金属离子的相互作用的研究越来越受到重视。

目前，谷胱甘肽(GSH)的生产方法主要有化学合成法、固定化细胞法、酶法和发酵法。化学合成法生产GSH工艺已较成熟，但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需光学拆分且存在环境污染等问题；酶法生产谷胱甘肽需要获得相关的酶系，需要消耗ATP，需要加入前体氨基酸等物质，造成成本较高；发酵法生产GSH就是选育GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高GSH的产率和质量。由于该方法所用原料可再生，产物对环境无污染等优点而越来越受人们的关注。目前国内外发酵法合成GSH的菌种主要是酿酒酵母、毕赤酵母、产朊假丝酵母、大肠杆菌等，而生产菌株主要依靠传统的诱变育种方法获得。

利用基因工程构建高产谷胱甘肽工程菌，主要有两种途径：

(1)将谷胱甘肽合成途径中的将谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH Ⅰ)和谷胱甘肽合成酶(GSH Ⅱ)在宿主细胞中过量表达。在大肠杆菌中过量表达大肠杆菌的GSH A和GSH B，重组菌JM109(pVB303)谷胱甘肽的合成量达到34.8mg/g湿菌体(Liao XY,ShenW,ChenJ,etal.Improved glutathione production by gene expression in Escherichiacoli.LettAppl Microbiol,2006,43(2):211-214.)；在巴斯德毕赤酵母的基因工程改造中，中国专利申请号201110343872.4公开了来源大肠杆菌的GSH A和GSH B在巴斯德毕赤酵母组成型启动子GAP下过量表达，与对照菌株相比提高了谷胱甘肽的合成量。来源酿酒酵母的GSH Ⅰ和GSH Ⅱ在重组毕赤酵母GS115(pAGPZHGSH)表达并进行高密度发酵，GSH的产量达到4.15g/L(FeiLW,YangY,Chen SX.Improved glutathione production by geneexpression in Pichiapastoris.BioprocessBiosyst ENG,2009,32:729-735)。中国专利申请号200710036487.9、200810039695.9和200910176777.2的专利也分别公开了酿酒酵母的GSH Ⅰ和GSH Ⅱ在重组毕赤酵母中过量表达来提高GSH的合成量，与对照菌株相比提高了GSH的表达量；在酿酒酵母的基因改造中，过量表达自身的GSH Ⅰ和GSH Ⅱ，在摇瓶条件下GSH产量达5.4mg/l/OD，而对照组为1.83mg/l/OD(KiriyamaK,HaraKY,KondoA.Extracellular glutathione fermentation using engineered Saccharomycescerevisiae expressing a novel glutathione exporter.ApplMicrobiol Biotechnol,2012,96(4):1021-1027)。

(2)将双功能谷胱甘肽合成酶GshF在宿主细胞中过量表达。双功能谷胱甘肽合成酶GshF同时具有γ时具有γ和GS两个功能域，使两步催化反应更加紧密，其主要来源有无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)等。中国专利申请号201110003488.X公开了对含有嗜热链球菌的谷胱甘肽合成酶GshF的重组大肠杆菌BL21/PET28a-GshF和JM109pTrc99a-GshF进行诱导表达，在补加三种氨基酸前体及ATP的条件下，其分批发酵GSH产量为4.5g/L。同样中国专利申请号201110369992.1公开了单增李斯特氏菌的GshF在巴斯德毕赤酵母中的表达，重组菌在摇瓶条件下GSH产量为190mg/L，为野生型的4倍多。

上述文献、专利所报道的高产谷胱甘肽工程菌，均是通过过量表达谷胱甘肽合成相关酶来提高GSH合成量，其中GSH A或GSH Ⅰ由于GSH的反馈抑制，其K_i约为3mM，使得GSH产量不会很高，尽管双功能谷胱甘肽合成酶能一步合成GSH，但GSH对来源单增李斯特菌的GshF的抑制常数K_i为5mM，依然受GSH反馈抑制。解除GSH对谷胱甘肽合成酶的反馈抑制是提高谷胱甘肽产量的重要途径，来源无乳链球菌的GshF对GSH的反馈抑制不敏感，其K_i约140mM，但其对L-谷氨酸的K_m值为22mM。本发明通过易错PCR突变来源无乳链球菌的谷胱甘肽合成酶基因gshF，利用高通量的筛选方法获得Km降低，催化效率提高的突变体，并用于构建谷胱甘肽高产菌株。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种无乳链球菌的gshF基因的突变基因及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种无乳链球菌的gshF基因的突变基因，所述突变基因为gshFM1、gshFM2或gshFM3，所述gshFM1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、所述gshFM2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述gshFM3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

一种由上述突变基因编码的谷胱甘肽合成酶突变体所述谷胱甘肽合成酶突变体为GshFM1、GshFM2或GshFM3，所述GshFM1由突变基因gshFM1编码，其氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，所述GshFM2由突变基因gshFM2编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述GshFM3由突变基因gshFM3编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

一种谷胱甘肽合成酶突变体的合成方法，根据突变基因(gshFM1、gshFM2或gshFM3)的核苷酸序列设计上游引物和下游引物，利用PCR扩增的方法获得扩增产物，并将扩增产物与表达载体pET-28a(+)相连后，转化到大肠杆菌BL21宿主细胞中，经诱导表达后获得谷胱甘肽合成酶突变体；所述突变基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

进一步地，所述上游引物的序列为SEQ ID NO:7，下游引物的序列为SEQ ID NO:8。

一种突变基因的应用，所述应用为：将突变基因用于制备毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌。

进一步地，将突变基因用于制备毕赤酵母工程菌，具体为：将权利1所述的突变基因(gshFM1、gshFM2或gshFM3)与pGAPZA毕赤酵母表达载体相连接，得到重组质粒，将重组质粒利用内切酶Avr Ⅱ酶切线性化，导入巴斯德毕赤酵母菌GS115，得到表达权利2所述的毕赤酵母工程菌。

进一步地，将突变基因用于制备酿酒酵母基因工程菌，具体为：根据突变基因(gshFM1、gshFM2或gshFM3)的核苷酸序列设计上游引物和下游引物，利用PCR扩增的方法获得PCR扩增产物；将酿酒酵母启动子TEF1P、终止子TEF1T、EcorI线性化载体pRS426与PCR扩增产物共同转化酿酒酵母By4741，利用酿酒酵母By4741自身重组系统得到重组质粒，并得到表达权利2所述谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母工程菌，所述谷胱甘肽合成酶突变基因选自gshFM1、gshFM2或gshFM3。

进一步地，所述上游引物的序列为SEQ ID NO:9，下游引物的序列为SEQ ID NO:10。

一种毕赤酵母工程菌的应用，所述应用为：将毕赤酵母工程菌应用于合成谷胱甘肽。

一种酿酒酵母基因工程菌的应用，所述应用为：将酿酒酵母工程菌应用于合成谷胱甘肽。

本发明的有益效果在于：

本发明获得的谷胱甘肽合成酶突变体，不受谷胱甘肽的反馈抑制，且与野生型的谷胱甘肽合成酶GshF相比，Km值降低，增强了对L-谷氨酸的亲和性，提高了催化效率。

本发明方法获得的毕赤酵母基因工程菌GS115/pGAPZA-gshFM3，谷胱甘肽产量较原始菌株毕赤酵母GS115菌株提高了4.1倍。

本发明方法获得的酿酒酵母基因工程菌By4741/pGAPZA-gshFM3，谷胱甘肽产量较原始菌株By4741提高了61％。

具体实施方式

本发明提供了一种双功能谷胱甘肽合成酶突变基因以及在构建高产谷胱甘肽工程菌构建方面的应用。下面结合几个实施例对本发明进一步说明。

实施例1

本实施例利用易错PCR方法构建谷胱甘肽双功能酶基因的突变文库，筛选高酶活谷胱甘肽双功能酶突变体。

1.重组质粒PUC19-gshF的构建。

模板：无乳链球菌S.agalactiaeATCC-BAA611基因组DNA；

载体：PUC19用HindⅢ/Pst Ⅰ双酶切，纯化回收后得到线性化质粒PUC19。所述PUC19购于Takara公司产品目录号为3219。

引物：

gshF上游引物gshF-1：CCCAAGCTTATGATTATCGATCAACTGTTAC；

gshF下游引物gshF-2：TGCACTGCAGTTATAATTCTGGGAACAGTTTA；

PCR扩增条件：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2.5min，共30个循环。

扩增得到的PCR产物，用HindⅢ/Pst Ⅰ进行双酶切，切胶回收后与上述线性化质粒PUC19连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选转化子，提质粒后测序验证，获得重组质粒PUC19-gshF。

2.gshF突变文库的构建。

以所述已构建好的重组质粒PUC19-gshF为模板，利用易错PCR技术在体外向谷胱甘肽双功能酶基因gshF引入核苷酸突变。易错PCR反应条件如下：

dCTP(25mmol/L)	1μL
		dTTP(25mmol/L)	1μL
dGTP(10mmol/L)	0.4μL
		dATP(10mmol/L)	0.4μL
gshF-1(20pmol/μL)	0.6μL
		gshF-2(20pmol/μL)	0.6μL
Mg²⁺(25mM)	7μL
		Mn²⁺(5mM)	0.7μL
PUC19-gshF	0.2μL
		Taq DNA聚合酶(2.5U)	0.2μL
10×PCR缓冲液(不含MgCl₂)	2μL
		ddH₂O	5.9μL

易错PCR循环程序：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2.5min，共30个循环。

易错PCR产物纯化回收后用HindⅢ/Pst Ⅰ双酶切，酶切产物回收后与上述线性化质粒PUC19连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含100μg/mL的AMP LB培养基平板，37℃培养12h，构成突变文库。所述AMP为氨苄西林，所述LB培养基成分为：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠。

3.高酶活谷胱甘肽双功能酶突变体的筛选。

利用谷胱甘肽对重金属Cu²⁺的解毒作用，采取含Cu²⁺的抗性平板对谷胱甘肽双功能酶突变文库进行筛选。

平板初筛：用灭菌牙签将上述LB平板上生长出的转化子复制到含1mM-10mMCu²⁺，0.1mMIPTG的LB平板的相同位置，培养12h。所述IPTG为异丙基硫代半乳糖苷。

平板复筛：用灭菌牙签将上述在1-10mM Cu²⁺生长出的单菌落复制到含2mM-50mMCu²⁺，0.1mMIPTG的LB抗性平板，培养12h。

以易错PCR构建的突变文库为基础进行筛选。获得3株酶活明显提高的菌株，抽提质粒，获得的重组质粒为PUC19-gshFM1，PUC19-gshFM2，PUC19-gshFM3，进一步测定谷胱甘肽双功能酶的核苷酸序列，分别命名为gshFM1、gshFM2、gshFM3，进一步推导出其氨基酸序列，分别命名为GshFM1，GshFM2，GshFM3。

所述gshFM1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1，所述gshFM2的核苷酸序列如SEQ IDNO：2，所述gshFM2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3；所述GshFM1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4，所述GshFM2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5，所述GshFM3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6。其中，GshFM1相对于野生型其第450位的Gln突变成Arg；GshFM2相对于野生型其第352位的Asp突变成Glu、第514位Tyr突变成Cys；GshFM 3相对于野生型其第143位Ile突变成Leu、第514位Tyr突变成Cys，如表1所示。

4.谷胱甘肽合成酶的活性的测定。

4.1利用PCR反应获取突变体基因gshFM1、gshFM2、gshFM3；

模板：以上述获得的重组质粒PUC19-gshFM1，PUC19-gshFM2，PUC19-gshFM3，以及无乳链球菌S.agalactiaeATCC-BAA611基因组为模板。

引物：

上游：5’-ATATCCATGGTTATCGATCAACTGTTACAAAGAAGCC‐3’；

下游：5’-ATGATCTCGAGTAATTCTGGGAACAGTTTAGCCAAAATT‐3’；

PCR扩增反应：模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，上下游引物各2μL，dNTP 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL，PCR循环程序：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2.5min，共30个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳回收后用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，获得带有酶切位点的谷胱甘肽合成酶基因gshF、gshFM1、gshFM2、gshFM3。

4.2谷胱甘肽合成酶的制备。

表达载体构建：将上述4.1中获得的带有酶切位点的谷胱甘肽合成酶基因gshF、gshFM1、gshFM2、gshFM3分别与相同酶切位点的线性化质粒pET28a在T4连接酶作用下连接过夜，连接产物转化E.coli BL21，挑选转化子抽提质粒，酶切并测序验证，显示pET28a-gshF、pET28a-gshFM1、pET28a-gshFM2、pET28a-gshFM3已分别成功转化至大肠杆菌E.coliBL21。

摇瓶发酵：将上述获得的4株重组表达菌株，接种至5ml含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，按10％接种量接种于50ml含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6左右时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，并调整温度至30℃，进行诱导培养，6h后离心收集菌体。

细胞破胞：将诱导培养好的发酵液5000g离心10min，弃上清，加入5倍浓缩体积的预冷平衡缓冲液。利用超声破胞仪进行破胞处理：200W，工作5s，停7s，共进行30次，破胞过程中保存冰浴，避免蛋白受热变性。处理完后以12000g离心10min，上清即为含有可溶目标蛋白的粗酶液。

分离纯化：得到的粗酶液注入预先用平衡液(20mmol/L Tris，20mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)平衡的镍柱中，再用2倍柱体积的预洗脱液(20mmol/L Tris，70mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)洗脱除去杂蛋白，然后用洗脱液(20mmol/L Tris，250mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH 8.0)洗脱得到谷胱甘肽合成酶GshF、GshFM1、GshFM2、GshFM3。

4.3谷胱甘肽合成酶活性测定。

谷胱甘肽合成酶酶活测定方法：谷胱甘肽合成反应体系：100mmol/L Tris-HClbuffer(pH8.5)，20mmol/L Glu，20mmol/L Gly，20mmol/L Cys，10mmol/L ATP，30mmol/LMgCl2。1ml反应体系中加入50μl步骤4.2中获得的谷胱甘肽合成酶GshF、GshFM1、GshFM2、GshFM3，反应在37℃水浴下20min，煮沸终止反应，测定谷胱甘肽的产量。一个酶活力单位定义为37℃条件下，每分钟催化生成1μmol谷胱甘肽所需的酶量。

谷胱甘肽的检测：采用DTNB[5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)]法测定谷胱甘肽的含量。将待分析样品0.5mL加入1.5mL 0.15mol/L NaOH溶液中，摇匀，加入3％甲醛溶液0.5mL以消除半胱氨酸的干扰，摇匀，静置2min。取0.5ml加入2.5mL DTNB分析液，摇匀，在25℃水浴保温5min，以水为空白对照，测定在波长412nm处的吸光值，其中DTNB分析液由1体积0.01mol/L DTNB溶液加100体积0.25mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成。

谷胱甘肽合成酶对谷氨酸Km值的测定：为测定谷胱甘肽合成酶对谷氨酸的Km值，在谷胱甘肽合成反应体系中，改变谷氨酸的浓度，分别为20mM、40mM、60mM、80mM、100mM。利用上述条件分别测分离纯化获得的GshF反应的初速度，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作图，横轴截距为1/Km，纵轴截距为1/Vmax.由截距可获得各个GshF的K_cat及对谷氨酸的Km值。测定2-200mM的谷胱甘肽对酶活力的影响，Lineweaver-Burk双倒数作图，求其表观米氏常数，然后代入Kmapp＝Km(1+[I]/Ki)计算出Ki。

表1：3个谷胱甘肽合成酶突变体的氨基酸取代及其对谷氨酸的Km值

与原始谷胱甘肽合成酶GshF相比突变体GshFM1、GshFM2、GshFM3对谷胱甘肽的反馈抑制常数Ki(GSH)并没有显著降低，谷胱甘肽合成酶突变体GshFM1、GshFM2、GshFM3对谷胱甘肽的反馈抑制不敏感。Kcat/Km表示谷胱甘肽合成酶的催化效率，原始谷胱甘肽合成酶GshF的Kcat/Km为2.4s^-1.mM^-1，谷胱甘肽合成酶突变体GshFM1、GshFM2、GshFM3的Kcat/Km分别提高到3.33s^-1.mM^-1、4.38s^-1.mM^-1、5.36s^-1.mM^-1。

实施例2

本实施例采用实施例1获得的谷胱甘肽合成酶基因突变体，制备毕赤酵母工程菌。

1.利用PCR反应获取突变体基因gshFM1、gshFM2、gshFM3及gshF。

模板：上述获得的重组质粒PUC19-gshFM1、PUC19-gshFM2、PUC19-gshFM3以及无乳链球菌S.agalactiaeATCC-BAA611基因组

引物：

上游：5’-CAATTGAACAACTATTTCGAAACGATGATTATCGATCAACTGTTACAAAGAAG-3’；

下游：5’-GACGGCCGGCTGGGCCACGTGAATTTATAATTCTGGGAACAGTTTAGCCAA-3’；

PCR扩增反应：模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，上下游引物各2μL，dNTP5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL，PCR循环程序：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2.5min，共30个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳回收后用Cla Ⅰ和Not Ⅰ双酶切，获得带有酶切位点的谷胱甘肽合成酶基因gshF、gshFM1、gshFM2、gshFM3。

2.表达载体pGAPZA-gshF、pGAPZA-gshFM1、pGAPZA-gshFM2、pGAPZA-gshFM3的构建。

步骤1中获得带有酶切位点的谷胱甘肽合成酶基因gshF、gshFM1、gshFM2、gshFM3与EcorI酶切的载体pGAPZA在克隆用In-Fusion酶的作用下37℃反应30min，产物转入E.coli DH5α，得到转化子，提取质粒，酶切和测序验证，测序结果表明pGAPZA-gshF、pGAPZA-gshFM1、pGAPZA-gshFM2、pGAPZA-gshFM3构建成功。所述载体pGAPZA购自Invitrogen公司，产品目录号为V20520。所述In-Fusion酶购于Takara公司，产品目录号为638909。

3.重组毕赤酵母GS115的构建。

将上述重组表达质粒pGAPZA-gshF、pGAPZA-gshFM1、pGAPZA-gshFM2、pGAPZA-gshFM3各约10μg用Avr Ⅱ酶切线性化，纯化回收线性DNA溶解于15μL无菌水中。再与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混合，转入预冷的0.2cm的电转杯中，根据所使用电转仪预设的毕赤酵母参数进行电击。电击结束后立即加入1mL预冷的1M山梨醇，然后将电击杯中的溶液全部转移至1.5mL无菌离心管中，30℃孵育1-2h，取500μL涂布于含有500mg/L博莱霉素YPD平板，于30℃培养。挑取单菌落进行测序验证。至此，得到三株含有gshF突变的重组毕赤酵母菌株，分别命名为GS115/gshFM1、GS115/gshFM2、GS115/gshFM3和一株含有原始谷胱甘肽合成酶基因gshF的毕赤酵母菌株GS115/gshF。

实施例3

本实施例采用实施例2获得的毕赤酵母工程菌合成谷胱甘肽。

将于30℃，在YPD培养基固体平板上生长三天的GS115/gshFM1、GS115/gshFM2、GS115/gshFM3、GS115/gshF以及GS115单菌落，接种至30mL的YPD培养基中，于30℃，220rpm培养20h；然后接入320mL的YPD培养基中，8h后接入6L(10L发酵罐)的发酵培养基BMGY中，并添加消泡剂，控制温度30℃，过程中补加甘油，同时控制pH在6.0。发酵30h开始流加半胱氨酸，保持发酵液中半胱氨酸浓度在0.1～0.2mmol/L，继续发酵至70h停止发酵。所述YPD培养基成分为Glucose 20g/L，Tryptone 20g/L，Yeast Extract 10g/L。所述BMGY培养基成分为：酵母10g/L，蛋白胨20g/L，酵母用氮源1.34g/L，0.1MpH6.0磷酸盐缓冲液10mL/L,甘油10mL/L。

取1ml菌液1500rpm离心去上清，沉淀用1ml去离子水洗涤，1500rpm离心收集沉淀。沉淀加1ml去离子水100℃沸水水浴30分钟，冷却至室温，12000rpm离心取上清0.5ml加入1.5mL 0.15mol/L NaOH溶液中，摇匀，加入3％甲醛溶液0.5mL，摇匀，静置2min。取0.5ml加入2.5mL DTNB(由1体积0.01mol/L5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液加100体积0.25mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成)分析液，摇匀，在25℃水浴保温5min，测定在波长412nm处的吸光度A，得出相应GSH浓度。体内谷胱甘肽浓度结果如表2。

表2：不同重组毕赤酵母谷胱甘肽产量。

菌株	谷胱甘肽浓度(mg/L)
		GS115	203
GS115/gshF	211
		GS115/gshFM1	436
GS115/gshFM2	682
		GS115/gshFM3	837

结果表明对照组毕赤酵母GS115野生菌产谷胱甘肽仅为203mg/L，对照组毕赤酵母GS115/gshF产谷胱甘肽仅为211mg/L，重组毕赤酵母GS115/gshFM1、GS115/gshFM2、GS115/gshFM3胞内合成谷胱甘肽的产量分别提高到436mg/L、682mg/L、837mg/L。

实施例4

本实施例采用实施例1获得的谷胱甘肽合成酶基因突变体，制备酿酒酵母工程菌。

1.利用PCR反应获取突变体基因gshFM1、gshFM2、gshFM3及gshF。

模板：上述获得的重组质粒PUC19-gshFM1、PUC19-gshFM2、PUC19-gshFM3以及无乳链球菌S.agalactiaeATCC-BAA611基因组；

引物：

上游：5’-AGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAATGATTATCGATCAACTGTTACAAAGAAGC-3’；

下游：5’-CAACTAGAAAAGTCTTATCAATCTCCTTATAATTCTGGGAACAGTTTAGCCAAA-3’；

PCR扩增反应：模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，上下游引物各2μL，dNTP 5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL，PCR循环程序：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2.5min，共30个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳切胶回收，获得谷胱甘肽合成酶基因gshF、gshFM1、gshFM2、gshFM3。

2.TEF1启动子扩增。

模板：酿酒酵母By4741基因组DNA。

根据酿酒酵母By4741基因组设计引物：

上游：5’-TTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGATAGCTTCAAAATGTTTCTA-3’；

下游：5’-GTGGCTTCTTTGTAACAGTTGATCGATAATCATTTTGTAATTAAAACTTAGATTA-3’；

PCR扩增反应：模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，上下游引物各2μL，dNTP 5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL，PCR循环程序：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2.5min，共30个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳回收，获得TEF1启动子。所述酿酒酵母By4741基因组的genebank号为NC_001148.4。

3.TEF1终止子扩增。

模板：酿酒酵母By4741基因组DNA；

根据酿酒酵母By4741基因组设计引物：

上游：5’-TTTGGCTAAACTGTTCCCAGAATTATAAGGAGATTGATAAGACTTTTCTAGTTGC‐3’；

下游：5’-CACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTAGATAGCGCCGATCAAAGTA-3’；

PCR扩增反应：模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，引物2μL，dNTP 5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，总反应体积为20μL，PCR循环程序：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2.5min，共30个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳回收。所述酿酒酵母By4741基因组的genebank号为NC_001148.4。

4.表达载体的构建及重组酿酒酵母的构建。(注步骤1是指实例4的步骤1，)

将步骤1中获得谷胱甘肽合成酶基因gshF、gshFM1、gshFM2、gshFM3，步骤2中获得的TEF1启动子，步骤2中获得的TEF2终止子，载体pRS426用EcorI酶切回收的片段，片段各1μg溶于10μL水，再与80μL酿酒酵母By4741感受态细胞混合，转入预冷的0.2cm的电转杯中，根据所使用电转仪预设的酿酒酵母参数进行电击，所述载体pRS426的genbank号为U03451.1。电击结束后立即加入1mL预冷的1M山梨醇，然后将电击杯中的溶液全部转移至1.5mL无菌离心管中，30℃孵育1-2h，取500μL涂布于尿嘧啶缺陷培养基上，于30℃培养。两天后挑取单菌落进行培养提取质粒测序验证。至此，得到含有重组载体pRS-GshF，pRS-GshF1M、pRS-GshF2M、pRS-GshF3M的重组酿酒酵母菌株，分别命名为By4741/gshFM1、By4741/gshFM2、By4741/gshFM3和一株含有原始gshF的酿酒酵母菌株By4741/gshF。

实施例5

本实施例采用实施例4获得的酿酒酵母工程菌合成谷胱甘肽。

将于30℃，在YPD培养基平板上生长三天的By4741/gshFM1、By4741/gshFM2、By4741/gshFM3、By4741/gshF以及By4741单菌落，接种至30mL的YPD培养基中，于30℃，220rpm培养20h；然后接入320mL的YPD培养基中，8h后接入6L(10L发酵罐)的发酵培养基BMGY中，并添加消泡剂，控制温度30℃，过程中补加甘油，同时控制pH在6.0。发酵30h开始流加半胱氨酸，保持发酵液中半胱氨酸浓度在0.1～0.2mmol/L，继续发酵至70h停止发酵。所述YPD培养基成分为：Glucose20g/L，Tryptone 20g/L，Yeast Extract 10g/L。所述BMGY培养基成分为：酵母10g/L，蛋白胨20g/L，酵母用氮源1.34g/L，0.1MpH6.0磷酸盐缓冲液10mL/L,甘油10mL/L。

取1ml菌液1500rpm离心去上清，沉淀用1ml去离子水洗涤，1500rpm离心收集沉淀。沉淀加1ml去离子水100℃沸水水浴30分钟，冷却至室温，12000rpm离心取上清0.5ml加入1.5mL 0.15mol/L NaOH溶液中，摇匀，加入3％甲醛溶液0.5mL，摇匀，静置2min。取0.5ml加入2.5mL DTNB分析液，摇匀，在25℃水浴保温5min，测定在波长412nm处的吸光度A，得出相应GSH浓度。所述DTNB分析由1体积0.01mol/L5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液加100体积0.25mol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成。体内谷胱甘肽浓度结果如表3。

表3：不同重组酿酒酵母谷胱甘肽产量

菌株	谷胱甘肽浓度(mg/L)
		By4741	85
By4741/gshF	84
		By4741/gshFM1	95
By4741/gshFM2	99
		By4741/gshFM3	137

结果表明对照组酿酒酵母By4741野生菌产谷胱甘肽仅为85mg/L，对照组酿酒酵母By4741/gshF产谷胱甘肽仅为84mg/L，重组酿酒酵母By4741/gshFM1、By4741/gshFM2、By4741/gshFM3胞内合成谷胱甘肽的产量分别为95mg/L、99mg/L、137mg/L。

Claims

1.一种无乳链球菌的gshF基因的突变基因，其特征在于，所述突变基因为gshFM1、gshFM2或gshFM3，所述gshFM1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1、所述gshFM2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述gshFM3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

2.一种由权利要求1所述的突变基因编码的谷胱甘肽合成酶突变体，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶突变体为GshFM1、GshFM2或GshFM3，所述GshFM1由突变基因gshFM1编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述GshFM2由突变基因gshFM2编码，其氨基酸序列如SEQID NO：5所示，所述GshFM3由突变基因gshFM3编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

3.一种权利要求2所述的谷胱甘肽合成酶突变体的合成方法，其特征在于，根据突变基因(gshFM1、gshFM2或gshFM3)的核苷酸序列设计上游引物和下游引物，利用PCR扩增的方法获得扩增产物，并将扩增产物与表达载体pET-28a(+)相连后，转化到大肠杆菌BL21宿主细胞中，经诱导表达后获得谷胱甘肽合成酶突变体；所述突变基因的核苷酸序列为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述上游引物的序列为SEQ ID NO:7，下游引物的序列为SEQ ID NO:8。

5.一种权利要求1所述的突变基因的应用，其特征在于，所述应用为：将突变基因用于制备毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将突变基因用于制备毕赤酵母工程菌，具体为：将权利1所述的突变基因(gshFM1、gshFM2或gshFM3)与pGAPZA毕赤酵母表达载体相连接，得到重组质粒，将重组质粒利用内切酶Avr Ⅱ酶切线性化，导入巴斯德毕赤酵母菌GS115，得到表达权利2所述的毕赤酵母工程菌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将突变基因用于制备酿酒酵母基因工程菌，具体为：根据突变基因(gshFM1、gshFM2或gshFM3)的核苷酸序列设计上游引物和下游引物，利用PCR扩增的方法获得PCR扩增产物；将酿酒酵母启动子TEF1P、终止子TEF1T、EcorI线性化载体pRS426与PCR扩增产物共同转化酿酒酵母By4741，利用酿酒酵母By4741自身重组系统得到重组质粒，并得到表达权利2所述谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母工程菌，所述谷胱甘肽合成酶突变基因选自gshFM1、gshFM2或gshFM3。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述上游引物的序列为SEQ ID NO:9，下游引物的序列为SEQ ID NO:10。

9.一种由权利要求5所述应用制备的毕赤酵母工程菌的应用，其特征在于，所述应用为：将权利要求5制备的毕赤酵母工程菌应用于合成谷胱甘肽。

10.一种由权利要求5所述应用制备的酿酒酵母基因工程菌的应用，其特征在于，所述应用为：将权利要求5制备的酿酒酵母工程菌应用于合成谷胱甘肽。