CN116949119A - 一种s-乳酰谷胱甘肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种S‑乳酰谷胱甘肽的制备方法，其以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛为原料，谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛在谷胱甘肽合成酶及乙二醛酸酶的催化下转化为S‑乳酰谷胱甘肽。本发明采用成本较低的原料进行发酵，操作简易，转化率高，制备得到的S‑乳酰谷胱甘肽产量高，适合批量化工业生产。

Description

一种S-乳酰谷胱甘肽的制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一种S-乳酰谷胱甘肽的制备方法。
背景技术
谷胱甘肽(Glutathione)，是一种广泛存在于生物体内的生物活性非蛋白硫醇化合物。谷胱甘肽是体内的主要抗氧化剂，能抵抗氧化剂对巯基的破坏作用，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和酶。谷胱甘肽的生理功能主要表现在6个方面：(1)作为胞内最丰富的抗氧化剂，保护DNA、蛋白质和其他生物分子抵抗氧化损伤；(2)通过谷胱甘肽-S-转移酶完成对外源物质的解毒作用；(3)参与氨基酸的吸收与转运；(4)参与细胞信号传导，维持细胞正常生命活动；(5)参与高铁血红蛋白的还原作用以及促进铁的吸收；(6)调节淋巴细胞功能，发挥抗病毒作用。因此，还原型谷胱甘肽被广泛应用在在医药、食品、化妆品等领域，但由于谷胱甘肽结构中巯基的不稳定(易被氧化)，使其在储存、运输、应用时条件要求苛刻，限制了谷胱甘肽的进一步应用。因此相对更稳定且可以被代谢分解回谷胱甘肽的谷胱甘肽衍生物，被认为可作为未来谷胱甘肽的供应替代。
S-乳酰谷胱甘肽(S-lactoylglutathione)是由谷胱甘肽和甲基乙二醛通过乙二醛酸酶催化生成的，是甲基乙二醛解毒途径的一部分。在甲基乙二醛解毒途径中，甲基乙二醛和谷胱甘肽先在乙二醛酸酶的作用下生成S-乳酰谷胱甘肽，再在S-乳酰谷胱甘肽水解酶的作用下，水解回谷胱甘肽并生成乳酸，通过乳酸最终完成了甲基乙二醛的解毒。上述解毒过程中生成S-乳酰谷胱甘肽，可视为利用了乳酰基将谷胱甘肽易被氧化的巯基保护起来，得到不易被氧化更稳定的谷胱甘肽衍生物。
而目前S-乳酰谷胱甘肽合成的研发较少，文献集中于体外酶催化谷胱甘肽和醛直接合成，该制备方法酶提取过程复杂，原料中谷胱甘肽价格昂贵，高昂的成本使S-乳酰谷胱甘肽难以工业化大量生产。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种生产成本低、适合工业化生产的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法。
本发明所述解决的技术问题之二在于提高生产过程中的转化率，提高S-乳酰谷胱甘肽的产量。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛为原料，谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛在谷胱甘肽合成酶及乙二醛酸酶的催化下转化为S-乳酰谷胱甘肽。
进一步地，以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛为底物，加入含有谷胱甘肽合成酶编码基因和乙二醛酸酶编码基因的重组微生物进行发酵，重组微生物过表达产生所述谷胱甘肽合成酶及乙二醛酸酶。
进一步地，所述谷胱甘肽合成酶编码基因包括gshF、gshA、gshB中的一种或几种，所述乙二醛酸酶编码基因包括gloA。
进一步地，包括通过基因工程方法构建所述重组微生物，所述基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。
进一步地，重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：通过PCR扩增获得谷胱甘肽合成酶编码基因和乙二醛酸酶编码基因，将获得的基因共同连接至含有IPTG诱导型启动子的质粒载体上并转化至感受态细胞中，测序后获得重组载体；将重组载体转化至受体微生物中即得到重组微生物。
优选的，质粒载体为pZAlac、pZElac中的一种或两种。
进一步地，重组载体为pZE-gshF_gloA，所述pZE-gshF_gloA构建方法为：以大肠杆菌MG1655的基因组为模板分别通过PCR扩增得gshF基因和gloA基因，将gshF基因和gloA基因共同连接至含有IPTG诱导型启动子的pZElac载体上并转化至大肠杆菌E.coli dh5a感受态细胞中，测序后得到质粒pZE-gshF_gloA。
进一步地，所述受体微生物选自大肠杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、酵母或链霉菌中的一种或几种。
进一步地，受体微生物选自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或毕赤酵母(Pichiapastoris)中的一种或几种。
进一步地，若受体微生物含有表达S-乳酰谷胱甘肽水解酶的基因，需敲除受体微生物上表达S-乳酰谷胱甘肽水解酶的基因。
优选的，所述受体微生物为大肠杆菌MG1655ΔgloBΔgloCΔyeiG。
进一步地，若受体微生物含有表达半胱氨酸水解酶或谷胱甘肽水解酶的基因，需敲除受体微生物上表达半胱氨酸水解酶或谷胱甘肽水解酶的基因。
优选的，所述受体微生物为大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG。
进一步地，所述大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG的构建方法包括如下步骤：
1)用同源重组法对野生型大肠杆菌MG1655菌株的tnaA、ggt、gloB、gloC、yeiG基因进行单独敲除获得五株单缺菌；
2)将步骤1)中得到的Δggt、ΔgloB、ΔgloC和ΔyeiG四株单缺菌分别加入野生型P1噬菌体进行培养，得到分别含有ggt、gloB、gloC和yeiG敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir ggt、P1vir gloB、P1vir gloC和P1vir yeiG；
3)将步骤1)得到的ΔtnaA单缺菌作为受体菌，依次加入步骤1)中得到的噬菌体进行转染，得到大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG。
进一步地，步骤1)中，发酵时，发酵温度为20～90℃。
优选的，发酵温度为30～65℃。
优选为30～35℃。进一步优选为30℃、优选为32℃、优选为35℃。
进一步地，所述谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、甲基乙二醛的摩尔浓度比例范围为8～12:8～12:6～10:1～4。
优选的，谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、甲基乙二醛的摩尔浓度比例范围为10:10:8:3。
进一步地，发酵时，先加入谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及重组微生物，发酵培养2～4h使谷胱甘肽积累，然后再加入甲基乙二醛继续发酵。
进一步地，发酵时，采用缓慢流加的方式使发酵罐中所述甲基乙二醛浓度维持为1～4mM。
有益效果：本发明所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，制备过程简易，操作便利，相较于直接以谷胱甘肽作为原料而言，原料成本得到显著降低，且产物的转化率及产量高，适合工业化大量生产。
附图说明
图1为实施例1中不同条件下S-乳酰谷胱甘肽的生成结果示意图。
图2为受体菌基因敲除原理图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
本文中使用冠词“一”和“所述”来指代冠词的语法宾语中的一个或多于一个。
替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应当被理解为意指替代方案中的一个或两个。
如本文所用，术语“基因合成”，指利用重组DNA技术产生或利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，术语“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
如本文所用，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的多核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。
如本文所用的，术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。转移的核酸通常连接到例如插入到载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。很多载体在本领域中是已知的，包含但不限于质粒、噬菌粒、人工染色体、细菌噬菌体以及动物病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。
本发明实例所用的DNA聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒II One Step购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
一些实施例用到的重组载体构建如下：
根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组及嗜热链球菌的基因组分别设计引物：引物与模板结合部分用大写字母表示且Tm值为58～62℃，同源臂部分用英文字母小写表示且均为20bp：
gshF_F：ttaaagaggagaaaggtaccATGACATTAAACCAACTTCTTCAAAAACTGG
gshF_R：ttaatttctcctgtcgacTTAAGTTTGACCAGCCACTATTTCTGG
gloA_F：gtcgacaggagaaattaactATGCGTCTTCTTCATACCATGCTG：
gloA_R：ttgatgcctctagaaagcttTTAGTTGCCCAGACCGCG
以大肠杆菌MG1655的基因组为模板通过PCR扩增得gloA基因片段，以嗜热链球菌的基因组为模板通过PCR扩增得gshF基因片段，并通过非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒共同连接到含有IPTG诱导型启动子的载体pZElac上，然后转化至BW25113感受态细胞，涂布硫酸卡那霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行测序验证，正确的重组载体命名为pZE-gshF_gloA。
其中：
gshF的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
gloA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一些实施例用到的受体菌构建如下：
大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG菌株构建：
1)用同源重组法对野生型大肠杆菌MG1655菌株的tnaA、ggt、gloB、gloC、yeiG基因进行单独敲除获得五株单缺菌；制备得到的五株单缺菌均带有抗硫酸卡那霉素抗性基因；
2)将步骤1)中通过同源重组法制备的带有抗硫酸卡那霉素抗性基因的Δggt、ΔgloB、ΔgloC和ΔyeiG四株单缺菌均于37℃过夜培养，然后转接于含5mmol/L CaCl2和0.1％葡萄糖的LB培养基中，37℃培养1h，然后加入野生型P1噬菌体继续培养1-3h。加几滴氯仿后再培养3～8min分钟，离心取上清，即得到分别含有ggt、gloB、gloC和yeiG敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir ggt、P1vir gloB、P1vir gloC和P1vir yeiG；
3)将步骤1)得到的ΔtnaA单缺菌作为受体菌，依次加入步骤1)中得到的噬菌体进行转染，得到大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG。具体为：将ΔtnaA单缺菌作为受体菌，转化pCP20质粒，表达翻转酶重组酶基因，促进FRT位点自身的同源重组，敲除抗硫酸卡那霉素抗性基因。pCP20为温敏型质粒，通过改变环境温度可以实现质粒的清除。过夜培养ΔtnaA受体菌，取1.5mL菌液10000g离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mM CaCl2和5mM MgSO4)重悬ΔtnaA受体菌，将100μL噬菌体P1vir ggt与100μLΔtnaA受体菌悬浮液混合，37℃孵育30min，然后加入1mL的LB培养基和200μL的1mol/L柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100μL的LB培养基重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上，37℃培养过夜后，挑选克隆进行PCR扩增鉴定，阳性克隆即为含抗硫酸卡那霉素抗性基因的ΔtnaAΔggt。将含抗硫酸卡那霉素抗性基因的ΔtnaAΔggt作为受体菌，利用pcp20敲除抗硫酸卡那霉素抗性基因后转染P1vir gloB获得ΔtnaAΔggtΔgloB。以此类推，通过重复敲除转染过程获得含抗硫酸卡那霉素抗性基因的ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG菌株，pcp20再敲除一次抗硫酸卡那霉素抗性基因后获得ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG目标菌株。在此过程中，转染先后顺序不受限制。
其中gloB、gloC、yeiG均为S-乳酰谷胱甘肽水解酶，而tnaA、ggt敲除后可进一步提高产物产量。构思原理如图2所示。
tnaA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
ggt的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
gloB的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
gloC的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
yeiG的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
实施例1
本实施例为摇瓶中S-乳酰谷胱甘肽的合成。
将重组质粒pZE-gshF_gloA电转至大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG中，使用氨卞青霉素(Ampicillin)抗性基因作为筛选标志，挑阳性克隆。将转化子接种到2mL LB培养基中培养12h，获得的活化菌种以1％接种量接入含有千分之一氨苄青霉素和20g/L的葡萄糖的M9培养基中，在30℃转速240rpm下于150ml三角瓶中(装液量15mL，三角瓶含0.5gCaCO3)培养至OD 0.4-0.6，加入IPTG至终浓度0.2mM，同时一次性加入10mM谷氨酸、10mM甘氨酸和8mM半胱氨酸(其中半胱氨酸比例较低可减少对大肠杆菌的毒性，且有利于降低成本的同时不减少产量)。而由于甲基乙二醛对大肠杆菌有一定毒性，选择在37℃继续培养发酵3h有一定谷胱甘肽积累后，再加入甲基乙二醛至3mM，继续持续发酵12h后，收集发酵液，利用高效液相色谱检测得谷胱甘肽浓度为1.3mM，S-乳酰谷胱甘肽的浓度为0.8mM，谷胱甘肽的转化率为38.1％。转化率＝S-乳酰谷胱甘肽/(S-乳酰谷胱甘肽终产量+谷胱甘肽终产量)
作为对照实施例1，采用大肠杆菌MG1655的野生菌直接进行发酵，采样同样条件进行接种、发酵并收集发酵液，利用高效液相色谱检测得谷胱甘肽浓度为0.08mM，S-乳酰谷胱甘肽未检出。
作为对照实施例2，采用大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG直接进行发酵，采样同样条件进行接种、发酵并收集发酵液，利用高效液相色谱检测得谷胱甘肽浓度为0.20mM，S-乳酰谷胱甘肽未检出。
作为对照实施例3，将仅含有gshF基因的重组载体转化入大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG后，采样同样条件进行接种、发酵并收集发酵液，利用高效液相色谱检测得谷胱甘肽浓度为1.7mM，S-乳酰谷胱甘肽未检出。
数据结果参见图1所示。
图中：MG1655表示对照实施例1，MG123表示对照实施例2，YC1123表示对照实施例3，YC2123表示实施例1。
由此说明，本发明的技术方案可以有效提高S-乳酰谷胱甘肽的产量和产率。
实施例2
本实施例为发酵罐中S-乳酰谷胱甘肽的合成。
将重组质粒pZE-gshF_gloA电转至大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG中，使用氨卞青霉素(Ampicillin)抗性基因作为筛选标志，挑阳性克隆。将上述重组菌单菌落分别接种50mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养14h后将菌种接入含有氨苄青霉素和50g/L葡萄糖的M9培养基，1L发酵罐中(装液量500mL)，转速600rpm，发酵培养6h，加入IPTG至终浓度0.1mM，同时一次性加入谷氨酸至25mM、甘氨酸至25mM和半胱氨酸至17mM，实验中发现一次性添加3mM甲基乙二醛对大肠杆菌生长有影响，因此发酵时选择通过缓慢流加控制甲基乙二醛浓度维持在1mM，继续持续发酵24h，收集发酵液，利用高效液相色谱检测谷胱甘肽浓度为2.1g/L和S-乳酰谷胱甘肽浓度约2.8g/L，谷胱甘肽的转化率为57.1％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 西湖大学
<120> 一种S-乳酰谷胱甘肽的制备方法
<130> 2022
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2265
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 1
atgacattaa accaacttct tcaaaaactg gaagctacca gccctattct ccaagctaat 60
tttggaatcg agcgcgagag tctacgtgtc gataggcaag gacaactggt gcatacacct 120
cacccatcct gtctaggagc tcgtagtttc cacccctata ttcagactga tttttgcgag 180
tttcagatgg aactcatcac accagttgcc aaatctacta ctgaggctcg ccgatttctg 240
ggagctatta ctgatgtagc aggccgctct attgctacag acgaggttct ctggcctttg 300
tccatgccac ctcgtctaaa ggcagaggag attcaagttg ctcaactgga aaatgacttc 360
gaacgccatt atcgtaacta tttggctgaa aaatacggaa ctaaactaca agctatctca 420
ggtatccact ataatatgga actgggtaaa gatttagttg aggccttgtt ccaagaaagt 480
gatcagaccg atatgattgc cttcaaaaac gccctctatc ttaagctggc tcagaactac 540
ttgcgctacc gttgggtgat tacctatctc tttggggcct cacccatcgc cgaacaaggt 600
ttctttgacc aggaagttcc agaacctgtg cgttccttcc gtaacagtga ccacggctat 660
gtcaataagg aagagattca agtatccttt gtaagtctag aagattatgt ctcagccatt 720
gaaacctata tcgaacaagg agatttgaat gcagagaaag aattttactc agctgttcgt 780
ttccgtggac aaaaggttaa tcgttccttc cttgacaaag gaatcaccta cctagagttc 840
cgtaatttcg accttaaccc ttttgagcgt atcggtatta gtcagactac tatggacact 900
gtgcacttac tcattttagc cttcctttgg cttgatagcc ctgaaaatgt cgaccaagct 960
cttgcacaag gccacgcgtt aaatgagaaa attgccctct ctcatcctct aaaacctcta 1020
ccttcggagg ctaaaactca ggacattgta actgccctag accaactggt gcaacacttt 1080
ggacttggtg actatcatca agatctggtt aaacaagtta aggcagcctt tgcggatcca 1140
aatcaaacgc tctctgccca gctcttaccc tatatcaaag acaaatctct agccgaattt 1200
gctttaaaca aggctcttgc ctatcatgat tacgactgga ctgcccacta tgctctcaag 1260
ggctatgaag agatggaact ctccacccag atgttgctct ttgatgccat ccaaaaggga 1320
attcactttg aaatattgga tgagcaagat caattcctaa aactttggca ccaagaccat 1380
gttgaatacg tcaaaaacgg taacatgacc tcaaaagaca actacgtggt tccccttgct 1440
atggctaata agaccgtaac caagaagatt ctagcagatg ctggcttttc agttccttca 1500
ggagacgaat ttaccagtct tgaggaagga cttgcctact accctcttat caaggataag 1560
caaattgttg tcaaacccaa gtcaactaac tttggtctgg gaatttccat tttccaagaa 1620
cctgccagtc ttgacaacta tcaaaaagcc cttgaaattg ctttcgcaga agatacctct 1680
gtccttgttg aagaatttat tccaggaacc gaataccgtt tcttcatctt ggatgggcgt 1740
tgtgaggctg tgcttctgcg tgtcgctgcc aatgttattg gtgatggcaa acacaccatt 1800
cgtgaactag tcgctcagaa aaatgctaat ccattgcgtg gccgtgatca ccggtcacct 1860
ctggaaatca ttgagctagg agacatcgaa caactaatgt tagctcaaca gggttataca 1920
cctgatgata ttctcccaga aggaaaaaag gtcaatctgc gtcgtaattc caacatctct 1980
acaggtggtg actctattga tgtcactgag accatggatt cctcttacca agaattagcc 2040
gcagccatgg caactagcat gggcgcctgg gcttgcgggg ttgatctgat aattccagat 2100
gaaactcaaa ttgccaccaa ggaaaatcct cattgcacct gcattgagct caactttaac 2160
ccttcgatgt atatgcacac ctactgtgct gagggtcctg gccaagctat cactactaaa 2220
atcctagata aactttttcc agaaatagtg gctggtcaaa cttaa 2265
<210> 2
<211> 408
<212> DNA
<213> E.coli Strain
<400> 2
atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat 60
accaaagtgc tgggcatgaa actgctgcgt accagcgaaa acccggaata caaatactca 120
ctggcgtttg ttggctacgg cccggaaacc gaagaagcgg tgattgaact gacctacaac 180
tggggcgtgg ataaatacga actcggcact gcttatggtc acatcgcgct tagcgtagat 240
aacgccgctg aagcgtgcga aaaaatccgt caaaacgggg gtaacgtgac ccgtgaagcg 300
ggtccggtaa aaggcggtac tacggttatc gcgtttgtgg aagatccgga cggttacaaa 360
attgagttaa tcgaagagaa agacgccggt cgcggtctgg gcaactaa 408
<210> 3
<211> 1417
<212> DNA
<213> E.coli Strain
<400> 3
aatggaaaac tttaaacatc tccctgaacc gttccgcatt cgtgttattg agccagtaaa 60
acgtaccact cgcgcttatc gtgaagaggc aattattaaa tccggtatga acccgttcct 120
gctggatagc gaagatgttt ttatcgattt actgaccgac agcggcaccg gggcggtgac 180
gcagagcatg caggctgcga tgatgcgcgg cgacgaagcc tacagcggca gtcgtagcta 240
ctatgcgtta gccgagtcag tgaaaaatat ctttggttat caatacacca ttccgactca 300
ccagggccgt ggcgcagagc aaatctatat tccggtactg attaaaaaac gcgagcagga 360
aaaaggcctg gatcgcagca aaatggtggc gttctctaac tatttctttg ataccacgca 420
gggccatagc cagatcaacg gctgtaccgt gcgtaacgtc tatatcaaag aagccttcga 480
tacgggcgtg cgttacgact ttaaaggcaa ctttgacctt gagggattag aacgcggtat 540
tgaagaagtt ggtccgaata acgtgccgta tatcgttgca accatcacca gtaactctgc 600
aggtggtcag ccggtttcac tggcaaactt aaaagcgatg tacagcatcg cgaagaaata 660
cgatattccg gtggtaatgg actccgcgcg ctttgctgaa aacgcctatt tcatcaagca 720
gcgtgaagca gaatacaaag actggaccat cgagcagatc acccgcgaaa cctacaaata 780
tgccgatatg ctggcgatgt ccgccaagaa agatgcgatg gtgccgatgg gcggcctgct 840
gtgcatgaaa gacgacagct tctttgatgt gtacaccgag tgcagaaccc tttgcgtggt 900
gcaggaaggc ttcccgacat atggcggcct ggaaggcggc gcgatggagc gtctggcggt 960
aggtctgtat gacggcatga atctcgactg gctggcttat cgtatcgcgc aggtacagta 1020
tctggtcgat ggtctggaag agattggcgt tgtctgccag caggcgggcg gtcacgcggc 1080
attcgttgat gccggtaaac tgttgccgca tatcccggca gaccagttcc cggcacaggc 1140
gctggcctgc gagctgtata aagtcgccgg tatccgtgcg gtagaaattg gctctttcct 1200
gttaggccgc gatccgaaaa ccggtaaaca actgccatgc ccggctgaac tgctgcgttt 1260
aaccattccg cgcgcaacat atactcaaac acatatggac ttcattattg aagcctttaa 1320
acatgtgaaa gagaacgcgg cgaatattaa aggattaacc tttacgtacg aaccgaaagt 1380
attgcgtcac ttcaccgcaa aacttaaaga agtttaa 1417
<210> 4
<211> 1743
<212> DNA
<213> E.coli Strain
<400> 4
atgataaaac cgacgttttt acgccgggtg gccattgctg ctctgctctc aggaagttgt 60
tttagcgccg ccgccgcgcc tcctgcgccg cccgtctcgt atggtgtgga ggaagatgtc 120
ttccacccgg tacgcgcgaa acagggaatg gtagcgtctg tggacgccac tgccactcag 180
gtgggggtgg atattctcaa ggagggcggg aatgccgttg atgccgccgt ggcggtgggc 240
tacgcgctgg cggtaacgca tccgcaggca gggaatctgg gcggtggtgg ttttatgtta 300
atccgctcga aaaatggcaa taccacggct atcgatttcc gcgaaatggc acccgccaaa 360
gcgacccgcg atatgttcct cgatgatcag ggcaacccgg acagcaaaaa atcactcact 420
tcgcatctgg cttccggcac accgggtacg gtagcaggtt tctcgctggc gctggataaa 480
tacggcacca tgccgctgaa caaagtcgtg cagcccgcgt ttaaactggc acgcgatggt 540
tttatcgtta acgacgcgct ggctgacgat ctcaaaacct acggtagcga agtgttgccg 600
aatcacgaaa acagtaaagc tatcttctgg aaagagggcg agccgctgaa aaagggcgac 660
acgctggtgc aggcgaacct ggcaaagagc ctggagatga ttgctgaaaa cggcccggac 720
gaattctata aaggcacgat tgcggaacag atcgcccagg agatgcagaa aaacggtggc 780
ttgatcacta aagaagattt agcagcctat aaagcggtcg aacgcactcc gataagcggc 840
gattatcgcg ggtatcaggt ttactccatg ccaccgccat cctccggcgg gatccatatc 900
gtacaaatcc tcaatattct ggaaaacttc gatatgaaga aatacggctt tggcagcgcc 960
gatgcgatgc aaatcatggc agaagcggag aaatacgcct acgccgaccg ctcggaatat 1020
cttggcgacc cggattttgt caaagtaccg tggcaggcgc tgaccaataa agcctatgcc 1080
aaatctattg ccgatcaaat tgatatcaat aaagcgaagc catccagcga aattcgcccc 1140
ggcaagcttg cgccttatga gagtaatcaa actacccatt actcagtggt ggataaagat 1200
ggtaacgcgg tggcggtgac ctatacgctg aacaccacct tcggtacggg cattgtcgcg 1260
ggcgagagcg gtattctgct taataaccag atggatgatt tctccgccaa accgggcgta 1320
ccgaacgttt acgggctggt gggcggtgat gccaacgccg tcgggccgaa caaacgcccg 1380
ctgtcgtcga tgtcgccgac cattgtggtg aaagacggta aaacctggct ggttaccggt 1440
agcccaggcg gtagccggat catcactaca gtgctgcaaa tggtggtgaa tagcatcgat 1500
tatggcttga acgtcgccga agcgaccaat gcgccgcgtt tccaccatca gtggttgccg 1560
gacgagctgc gtgtcgaaaa agggtttagc ccggatacgc tcaagctgct ggaagcaaaa 1620
ggtcagaaag tggcgctgaa agaggcgatg ggcagtacac aaagcattat ggttgggccg 1680
gacggtgagt tgtacggcgc atccgacccg cgctcggtgg atgatttaac ggcggggtac 1740
taa 1743
<210> 5
<211> 756
<212> DNA
<213> E.coli Strain
<400> 5
atgaatctta acagtattcc cgcctttgat gacaattaca tctgggtttt gaatgatgaa 60
gcaggtcgct gcctgattgt cgatcccgga gacgcagagc cagtattaaa cgccattgcc 120
gccaataact ggcaaccgga ggccatattt ctcacccacc atcaccacga tcacgttggc 180
ggcgtaaaag aactggtgga aaagtttcca caaattgtgg tgtatggtcc acaagagaca 240
caagataagg gaacaacaca ggtagtcaaa gatggcgaaa ctgccttcgt tttggggcat 300
gaatttagtg taattgctac gccgggtcac actttaggac atatctgtta cttcagtaaa 360
ccttatctat tttgcggcga cacactgttt tctggtgggt gtggtcggtt gtttgaaggg 420
acagcatcac aaatgtatca atcacttaaa aagttaagtg cgttacctga cgatacattg 480
gtatgttgtg ctcatgaata taccttatca aatatgaagt ttgctttgag tattcttccg 540
cacgatttgt ccataaatga ttattatcgt aaagttaagg agttacgggc aaaaaatcaa 600
ataacactac ccgtaattct gaaaaatgag cggcaaatta atgttttttt aagaacggaa 660
gatattgatt taattaatgt aattaatgaa gaaacattat tgcaacaacc tgaagagcgt 720
tttgcatggt taaggtcaaa gaaagatagg ttctga 756
<210> 6
<211> 648
<212> DNA
<213> E.coli Strain
<400> 6
atgaactatc gtattattcc ggtcaccgca ttctcccaga actgttcatt aatctggtgt 60
gaacaaaccc gtctggccgc actggtcgat cctggcggcg atgcggaaaa aatcaaacag 120
gaagttgatg acagcggcct gacactgatg cagatcctgc tgacgcatgg tcatctggac 180
cacgttggcg cagcggcgga actggcgcaa cattacggcg tgccggtttt cggcccggaa 240
aaagaagatg agttctggct gcaaggcttg cctgcgcaaa gtcgtatgtt tggtctggaa 300
gagtgccagc cgctgacgcc agatcgttgg ctgaacgaag gcgataccat cagcataggg 360
aatgtgactt tacaggtgtt acattgccct gggcatacgc cgggtcatgt cgtgtttttt 420
gatgatcggg caaagctgct gatttctggc gatgttattt tcaaaggcgg agtagggcgc 480
agtgacttcc cgcgtggcga tcataatcaa ctgatttctt caatcaaaga taaattgctg 540
ccactggggg atgacgtgat atttattccg ggtcacggac cattatccac acttggttat 600
gaacgcctgc ataatccctt cctgcaagac gaaatgcccg tctggtaa 648
<210> 7
<211> 837
<212> DNA
<213> E.coli Strain
<400> 7
atggaaatgc tcgaagagca ccgctgtttt gaaggctggc agcaacgctg gcgacacgac 60
tccagtacct taaactgccc gatgacgttc agtatctttc tccctccacc tcgtgatcac 120
actccgccac cagtgctgta ctggctttcc ggattaacct gcaatgacga gaacttcacc 180
accaaggcgg gtgcccagcg ggtagcggcg gaactgggga ttgtactggt gatgccagac 240
accagcccgc gcggcgaaaa ggttgccaac gacgatggct acgatttagg ccagggcgca 300
ggcttttatc ttaatgccac gcaaccgccg tgggcgacgc attaccggat gtatgattat 360
ctgcgcgatg aattaccggc gctggttcag tcgcaattta atgtcagcga ccgctgcgcc 420
attagcggtc actcaatggg tggtcacggt gcgctgatta tggcgctgaa aaatccgggt 480
aaatacacca gcgtttcggc ctttgcgcca attgtgaatc cgtgcagcgt cccgtgggga 540
atcaaagcgt ttagcagcta tttaggtgag gacaaaaatg catggctgga atgggacagt 600
tgcgcactga tgtatgccag taacgcgcag gatgcgatcc cgacgcttat cgatcagggc 660
gataatgatc agtttcttgc cgaccagttg caacctgcgg tactggcaga agccgcgcgc 720
cagaaagcgt ggccgatgac gctgcgtatt cagccgggat atgatcacag ttactacttc 780
atcgcctctt ttatagagga tcacctgcgc ttccatgcgc agtatttact gaagtga 837

Claims (16)

1.一种S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛为原料，谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛在谷胱甘肽合成酶及乙二醛酸酶的催化下转化为S-乳酰谷胱甘肽。
2.根据权利要求1所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及甲基乙二醛为底物，加入含有谷胱甘肽合成酶编码基因和乙二醛酸酶编码基因的重组微生物进行发酵，重组微生物过表达产生所述谷胱甘肽合成酶及乙二醛酸酶。
3.根据权利要求2所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶编码基因包括gshF、gshA、gshB中的一种或几种，所述乙二醛酸酶编码基因包括gloA。
4.根据权利要求2所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，包括通过基因工程方法构建所述重组微生物，所述基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。
5.根据权利要求4所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：通过PCR扩增获得谷胱甘肽合成酶编码基因和乙二醛酸酶编码基因，将获得的基因共同连接至含有IPTG诱导型启动子的质粒载体上并转化至感受态细胞中，测序后获得重组载体；将重组载体转化至受体微生物中即得到重组微生物。
6.根据权利要求5所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，重组载体为pZE-gshF_gloA，所述pZE-gshF_gloA构建方法为：以大肠杆菌MG1655的基因组为模板分别通过PCR扩增得gshF基因和gloA基因，将gshF基因和gloA基因共同连接至含有IPTG诱导型启动子的pZElac载体上并转化至大肠杆菌E.coli dh5a感受态细胞中，测序后得到质粒pZE-gshF_gloA。
7.根据权利要求5所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述受体微生物选自大肠杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、酵母或链霉菌中的一种或几种。
8.根据权利要求5所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，受体微生物选自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或毕赤酵母(Pichia pastoris)中的一种或几种。
9.根据权利要求5所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，若受体微生物含有表达S-乳酰谷胱甘肽水解酶的基因，需敲除受体微生物上表达S-乳酰谷胱甘肽水解酶的基因。
10.根据权利要求9所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，若受体微生物含有表达半胱氨酸水解酶或谷胱甘肽水解酶的基因，需进一步敲除受体微生物上表达半胱氨酸水解酶或谷胱甘肽水解酶的基因。
11.根据权利要求9所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述受体微生物为大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG。
12.根据权利要求11所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG的构建方法包括如下步骤：
1)用同源重组法对野生型大肠杆菌MG1655菌株的tnaA、ggt、gloB、gloC、yeiG基因进行单独敲除获得五株单缺菌；
2)将步骤1)中得到的Δggt、ΔgloB、ΔgloC和ΔyeiG四株单缺菌分别加入野生型P1噬菌体进行培养，得到分别含有ggt、gloB、gloC和yeiG敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体P1vir ggt、P1vir gloB、P1vir gloC和P1vir yeiG；
3)将步骤1)得到的ΔtnaA单缺菌作为受体菌，依次加入步骤1)中得到的噬菌体进行转染，得到大肠杆菌MG1655ΔtnaAΔggtΔgloBΔgloCΔyeiG。
13.根据权利要求1所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，步骤1)中，发酵时，发酵温度为20～90℃。
14.根据权利要求1所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、甲基乙二醛的摩尔浓度比例范围为8～12:8～12:6～10:1～4。
15.根据权利要求10所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，发酵时，先加入谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸以及重组微生物，发酵培养2～4h使谷胱甘肽积累，然后再加入甲基乙二醛继续发酵。
16.根据权利要求15所述的S-乳酰谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，发酵时，采用缓慢流加的方式使发酵罐中所述甲基乙二醛浓度维持为1～4mM。
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