CN112442471A

CN112442471A - 一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用

Info

Publication number: CN112442471A
Application number: CN202011347849.8A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 杨谨华; 堵国成; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112442471B

Abstract

本发明公开了一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用，属于微生物工程技术领域。本发明以编码dTDP‑葡萄糖焦磷酸化酶2RffH和/或编码dTDP‑葡萄糖4,6‑脱水酶RffG的基因为目的基因，以大肠杆菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的大肠杆菌工程菌；此大肠杆菌工程菌的D‑乳酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高分别提高了28.9倍和4509.6倍。

Description

一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用

技术领域

本发明涉及一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用，属于微生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

乳酸的学名为α-羟基丙酸，分子式为C₂H₅OCOOH，是一种天然存在的有机酸。D-乳酸主要应用于聚乳酸材料的加工制造以及手性药物和农药中间体的合成。高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成。同时其最主要的应用是作为生物塑料聚乳酸的原料。在大肠杆菌中，D-乳酸通过丙酮酸代谢途径产生，野生型大肠杆菌菌株就具有固有的乳酸生成途径，可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸，不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸。但是由于大肠杆菌系统存在酸胁迫的问题，而制约着乳酸的产量的提高。

对于酸胁迫，为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高大肠杆菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点，且诱变后的菌种容易退化；(2)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题。

因此，急需找到一种遗传稳定性好、抗酸效果显著、成本低、并且成功率高及操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。

发明内容

为了得到一种遗传稳定性好、抗酸效果显著、成本低、并且成功率高及操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法，本发明提供了一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌包含连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH，或编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2RffH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶RffG的氨基酸序列如SEQID NO.10所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pTrc99a。

本发明还提供了一种提高大肠杆菌抗酸能力的方法，在大肠杆菌中过量编码表达dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH或编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2RffH、dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶RffG来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

在本发明的一种实施方式中，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2RffH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶RffG的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为，通过质粒过表达编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH或编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是D-乳酸胁迫。

本发明还提供了上述抗酸能力强的大肠杆菌工程菌在发酵生产代谢产物中的应用，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。

在本发明的一种实施方式中，所述代谢产物是甲酸、乙酸或乳酸。

本发明还提供了一种抗酸胁迫元器件，所述元器件为携带核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG的表达载体。

本发明还提供了上述大肠杆菌工程菌或上述方法在制备食品、药品、饲料及化学品方面的应用。

有益效果：

(1)本发明首次发现在大肠杆菌中过量表达RffH蛋白或RffG蛋白可显著提高大肠杆菌的酸胁迫抗性。

(2)利用本发明的方法得到的重组大肠杆菌Eschericha coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH对酸胁迫抗性较对照菌株有了明显的提高，其对D-乳酸的抗性较对照菌株提高了28.9倍。

(3)利用本发明的方法得到的重组大肠杆菌Eschericha coli K12 MG1655/pTrc99a-RffG对酸胁迫抗性较对照菌株有了明显的提高，其对D-乳酸的抗性较对照菌株提高了4509.6倍。

附图说明

图1：重组菌株和对照菌株在正常条件下的生长曲线图。

图2：重组菌株和对照菌株在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率图。

具体实施方式

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1及琼脂粉20g·L^-1。

LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1。

D-乳酸LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L^-1、酵母粉(Oxoid)5g·L^-1、氯化钠10g·L^-1，pH 4.0(D-乳酸调节)。

实施例1：重组大肠杆菌Eschericha coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH的构建

具体步骤如下：

(1)基于NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.1所示的rffH基因序列(编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2，参与聚酮糖单元的生物合成，调控葡萄糖-1-磷酸胸苷基的转移)，设计分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物pTrc99a-rffH-F，pTrc99a-rffH-R；

(2)根据待重组的基因序列设计分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R；

(3)以E.coli K12 MG1655的基因组为模板，pTrc99a-rffH-F，pTrc99a-rffH-R为引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1所示的基因片段；

(4)以载体pTrc99a为模板，以环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R为引物通过PCR扩增获得载体线性化的长片段；

(5)将步骤(3)和(4)中获得的PCR产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化至大肠杆菌E.coli K12 MG1655感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pTrc99a-rffH的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH。

(6)基于以上相同的方法，将空载质粒pTrc99a转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655，构建对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a。

实施例2：重组大肠杆菌Eschericha coli K12 MG1655/pTrc99a-RffG的构建

具体步骤如下：

(1)基于NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.2所示的rffG基因序列(编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶，参与聚酮糖单元的生物合成，调控dTDP-葡萄糖的脱水)，设计分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物pTrc99a-rffG-F，pTrc99a-rffG-R；

(3)以E.coli K12 MG1655的基因组为模板，pTrc99a-rffG-F，pTrc99a-rffG-R为引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.2所示的基因片段；

(5)将步骤(3)和(4)中获得的PCR产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化至大肠杆菌E.coli K12 MG1655感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pTrc99a-rffG的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffG。

实施例3：重组菌株和对照菌株在正常条件下的生长情况

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1和2中得到的菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH、E.coliK12MG1655/pTrc99a-RffG和对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养过夜；

(2)分别以2％(v/v)的接种量将步骤(1)中得到的种子液转接至LB液体培养基中，放在37℃摇床中220rpm培养；

(3)在步骤(2)中菌株的培养过程中，每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图1所示)。

结果如图1所示，经生长性能试验分析，培养10h后，重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH的生长情况与对照菌株无明显差异，重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffG的生长存在了一定滞后性，但最终生物量无明显差异，证明在E.coli K12 MG1655中过表达rffH和rffG基因对菌株的生产性能的没有影响。

实施例4：重组菌株在D-乳酸胁迫(pH 4.0)胁迫耐受性试验

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1和2中得到的菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH、E.coliK12 MG1655/pTrc99a-RffG和对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养过夜；

(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床中220rpm培养4.5h，培养至对数生长中期，此时的OD₆₀₀为1.4-1.5，得到培养液；

(3)将步骤(2)中得到的培养液在6000rpm条件下离心5min，收集菌体，将得到的菌体经0.85％的PBS缓冲液洗涤两次后，重悬于等体积的新鲜的D-乳酸LB液体培养基(pH4.0)中，胁迫不同时间；分别将胁迫0h，1h，2h，3h，4h后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点，并接种于LB固体培养基上测定活菌数和存活率。

存活率＝(N/N₀)×100％；

其中，N₀是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。

结果如图2和表1所示，经耐受性实验分析，在pH 4.0D-乳酸LB液体培养基中胁迫4h后，菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffG的存活率分别为对照的28.9倍，4509.6倍；说明E.coli K12 MG1655/pTrc99a-RffH、E.coli K12MG1655/pTrc99a-RffG对D乳酸胁迫的耐受性显著提高。

表1驯化菌株和对照菌株在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用

<130> BAA200780A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaaggta ttatcctggc gggcggttcc ggcacccgat tgcatccgat tacgcgcggc 60

gtatcgaagc aactgttgcc gatttacgat aagccaatga tttactatcc gctgtcggtg 120

ctgatgctgg ccggtatccg cgaaattctc atcatcacta cgccggaaga taaaggttat 180

ttccagcgcc tgctgggcga tggtagtgag ttcggtatcc agctggaata tgccgaacag 240

cccagcccgg acggtctggc gcaggccttt atcatcggtg aaaccttcct taatggtgaa 300

ccttcttgtc tggtgctggg cgataacatc ttcttcggtc agggcttcag tccgaagctg 360

cgtcatgttg cggcgcgcac cgaaggggcg acggtttttg gctatcaggt gatggacccg 420

gaacgctttg gcgtggtgga gtttgacgac aatttccgcg ctatctcgct ggaagaaaag 480

ccaaaacagc cgaagtcaaa ctgggcggtg accgggcttt atttctacga cagtaaagtc 540

gtggagtacg caaagcaggt gaagccgtcg gagcgtggtg aactggagat tacctccatc 600

aaccagatgt acctcgaggc gggcaacctg accgttgaac tgctcgggcg cggatttgcc 660

tggctggata ccggcactca cgacagcctg attgaagcca gcacctttgt acagacggtg 720

gaaaaacgcc agggctttaa gattgcctgc ctggaagaga ttgcctggcg taacggctgg 780

ctcgatgacg agggtgtgaa gcgtgctgcc agttcattag cgaaaactgg ctacggccaa 840

tatctgctgg agttacttcg tgcccgtccg cgccagtatt ga 882

<210> 2

<211> 1068

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagaaaaa ttctgataac aggtggtgcc gggtttattg gctcggcgct ggtgcgttat 60

atcatcaacg aaacgagcga cgcggtggta gtggtcgata agctgaccta cgccggaaac 120

ctgatgtcgc tggcaccggt cgcgcaaagc gagcgctttg cctttgagaa agttgatatc 180

tgcgatcggg cagaactggc acgcgtattc actgagcatc agccagactg tgtcatgcat 240

ctggcagccg aaagccatgt tgaccgttct attgacggcc cggcagcgtt tattgaaacc 300

aacattgtcg ggacttatac attgcttgaa gcggcgcggg cttactggaa tgcgctgacg 360

gaagataaaa aatcagcgtt ccgttttcat catatctcca ctgacgaagt atatggtgac 420

ctgcactcga cggatgattt cttcaccgaa accacgccgt atgcgccgag cagcccttat 480

tccgcgtcaa aagccagcag cgaccatctg gtgcgcgcct ggctgcggac ctatggtctg 540

ccgacgctta tcaccaactg ctcgaataac tacggccctt accactttcc ggaaaaactg 600

atcccgctga tgatcctcaa cgcgctggcg ggtaaatcgc tgccggtata tggcaacggg 660

cagcaaatcc gtgactggct gtatgtggaa gatcacgccc gcgcgctgta ttgcgtggcg 720

accaccggga aagtcggtga aacctataat attggtggtc acaacgagcg taagaatctc 780

gatgttgtgg aaaccatttg cgagctgctg gaagaactgg ctccgaacaa gccgcacggc 840

gtggcgcact atcgtgacct gatcaccttt gtcgctgacc gtccggggca tgatctgcgt 900

tatgccattg atgcttcgaa aattgcccgt gaacttggct ggctgccgca ggaaaccttt 960

gaaagtggaa tgcgtaaaac ggttcagtgg tatctggcta atgaaagctg gtggaagcag 1020

gtgcaggacg gcagctatca gggcgagcgt ttaggtctga aaggctaa 1068

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaacagacc atggaattca tgaaaggtat tatcctggcg gg 42

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcgactcta gaggatcctc aatactggcg cggacgg 37

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaacagacc atggaattca tgagaaaaat tctgataaca ggtggtgc 48

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcgactcta gaggatccca gttagccttt cagacctaaa cgctcg 46

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggatcctcta gagtcgac 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaattccatg gtctgtttcc tg 22

<210> 9

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Lys Gly Ile Ile Leu Ala Gly Gly Ser Gly Thr Arg Leu His Pro

1 5 10 15

Ile Thr Arg Gly Val Ser Lys Gln Leu Leu Pro Ile Tyr Asp Lys Pro

20 25 30

Met Ile Tyr Tyr Pro Leu Ser Val Leu Met Leu Ala Gly Ile Arg Glu

35 40 45

Ile Leu Ile Ile Thr Thr Pro Glu Asp Lys Gly Tyr Phe Gln Arg Leu

50 55 60

Leu Gly Asp Gly Ser Glu Phe Gly Ile Gln Leu Glu Tyr Ala Glu Gln

65 70 75 80

Pro Ser Pro Asp Gly Leu Ala Gln Ala Phe Ile Ile Gly Glu Thr Phe

85 90 95

Leu Asn Gly Glu Pro Ser Cys Leu Val Leu Gly Asp Asn Ile Phe Phe

100 105 110

Gly Gln Gly Phe Ser Pro Lys Leu Arg His Val Ala Ala Arg Thr Glu

115 120 125

Gly Ala Thr Val Phe Gly Tyr Gln Val Met Asp Pro Glu Arg Phe Gly

130 135 140

Val Val Glu Phe Asp Asp Asn Phe Arg Ala Ile Ser Leu Glu Glu Lys

145 150 155 160

Pro Lys Gln Pro Lys Ser Asn Trp Ala Val Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr

165 170 175

Asp Ser Lys Val Val Glu Tyr Ala Lys Gln Val Lys Pro Ser Glu Arg

180 185 190

Gly Glu Leu Glu Ile Thr Ser Ile Asn Gln Met Tyr Leu Glu Ala Gly

195 200 205

Asn Leu Thr Val Glu Leu Leu Gly Arg Gly Phe Ala Trp Leu Asp Thr

210 215 220

Gly Thr His Asp Ser Leu Ile Glu Ala Ser Thr Phe Val Gln Thr Val

225 230 235 240

Glu Lys Arg Gln Gly Phe Lys Ile Ala Cys Leu Glu Glu Ile Ala Trp

245 250 255

Arg Asn Gly Trp Leu Asp Asp Glu Gly Val Lys Arg Ala Ala Ser Ser

260 265 270

Leu Ala Lys Thr Gly Tyr Gly Gln Tyr Leu Leu Glu Leu Leu Arg Ala

275 280 285

Arg Pro Arg Gln Tyr

290

<210> 10

<211> 355

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Arg Lys Ile Leu Ile Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser Ala

1 5 10 15

Leu Val Arg Tyr Ile Ile Asn Glu Thr Ser Asp Ala Val Val Val Val

20 25 30

Asp Lys Leu Thr Tyr Ala Gly Asn Leu Met Ser Leu Ala Pro Val Ala

35 40 45

Gln Ser Glu Arg Phe Ala Phe Glu Lys Val Asp Ile Cys Asp Arg Ala

50 55 60

Glu Leu Ala Arg Val Phe Thr Glu His Gln Pro Asp Cys Val Met His

65 70 75 80

Leu Ala Ala Glu Ser His Val Asp Arg Ser Ile Asp Gly Pro Ala Ala

85 90 95

Phe Ile Glu Thr Asn Ile Val Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Glu Ala Ala

100 105 110

Arg Ala Tyr Trp Asn Ala Leu Thr Glu Asp Lys Lys Ser Ala Phe Arg

115 120 125

Phe His His Ile Ser Thr Asp Glu Val Tyr Gly Asp Leu His Ser Thr

130 135 140

Asp Asp Phe Phe Thr Glu Thr Thr Pro Tyr Ala Pro Ser Ser Pro Tyr

145 150 155 160

Ser Ala Ser Lys Ala Ser Ser Asp His Leu Val Arg Ala Trp Leu Arg

165 170 175

Thr Tyr Gly Leu Pro Thr Leu Ile Thr Asn Cys Ser Asn Asn Tyr Gly

180 185 190

Pro Tyr His Phe Pro Glu Lys Leu Ile Pro Leu Met Ile Leu Asn Ala

195 200 205

Leu Ala Gly Lys Ser Leu Pro Val Tyr Gly Asn Gly Gln Gln Ile Arg

210 215 220

Asp Trp Leu Tyr Val Glu Asp His Ala Arg Ala Leu Tyr Cys Val Ala

225 230 235 240

Thr Thr Gly Lys Val Gly Glu Thr Tyr Asn Ile Gly Gly His Asn Glu

245 250 255

Arg Lys Asn Leu Asp Val Val Glu Thr Ile Cys Glu Leu Leu Glu Glu

260 265 270

Leu Ala Pro Asn Lys Pro His Gly Val Ala His Tyr Arg Asp Leu Ile

275 280 285

Thr Phe Val Ala Asp Arg Pro Gly His Asp Leu Arg Tyr Ala Ile Asp

290 295 300

Ala Ser Lys Ile Ala Arg Glu Leu Gly Trp Leu Pro Gln Glu Thr Phe

305 310 315 320

Glu Ser Gly Met Arg Lys Thr Val Gln Trp Tyr Leu Ala Asn Glu Ser

325 330 335

Trp Trp Lys Gln Val Gln Asp Gly Ser Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Gly

340 345 350

Leu Lys Gly

355

Claims

1.一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，含有连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH或编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG。

2.如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述表达载体为pTrc99a。

3.如权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2、dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

4.如权利要求1-3任一所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的氨基酸序列如SEQID NO.10所示。

5.一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，其特征在于，在大肠杆菌中过量编码表达dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH或编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG。

6.如权利要求5所述的一种提高大肠杆菌抗酸能力的方法，其特征在于，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶、dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。

7.如权利要求6所述的一种提高大肠杆菌抗酸能力的方法，其特征在于，所述dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

8.如权利要求5-7任一所述的一种提高大肠杆菌抗酸能力的方法，其特征在于，所述过量表达为，通过质粒过表达编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH或编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG。

9.权利要求1-4任一所述的大肠杆菌工程菌在发酵生产代谢产物中的应用，其特征在于，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。

10.一种抗酸胁迫元器件，其特征在于，所述元器件为携带核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶2的基因rffH和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶的基因rffG的表达载体。