CN109593701A - 一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法 - Google Patents

一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达RbsA或RbsB蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(RbsA)以及Lactococcus lactis(RbsB)；利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)的耐酸能力均较野生型有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力分别较野生型提高了5.2倍、12.2倍。

Description

一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物被广泛应用于食品、医药、饲料、精细化学品等工业领域中。但是，在乳酸菌的工业化发酵生产以及作为益生菌在人体胃肠道系统发挥作用的过程中，不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，这些环境胁迫均严重限制着乳酸菌生长性能。
而在乳酸菌面临的众多胁迫条件中，酸胁迫是影响其生理活性的重要胁迫条件。因此，提供一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法尤为重要。
酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。
对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。
然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。
目前，提高乳酸菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低、成功率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但是，利用该方法获得耐酸乳酸菌生产成本过高，也不适用于工业化生产。
因此，急需找到一种耐酸能力强且易获得的乳酸菌以适应工业化生产。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种耐酸能力强且易获得的重组乳酸菌。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种耐酸重组乳酸菌，所述重组乳酸菌过量表达了D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB。
在本发明的一种实施方式中，编码所述D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因与表达载体构建含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体、pNZ8149载体、pNZ8151载体或pNZ8152载体。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒的方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述构建含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒时，使用的限制性内切酶为Nco I和Hind III。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒的方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述构建含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒时，使用的限制性内切酶为Nco I以及Hind III。
本发明还提供了上述一种抗酸胁迫重组乳酸菌的构建方法，所述方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒，最后将得到的重组质粒转化至Lactococcus lactis NZ9000中，得到抗酸胁迫重组乳酸菌；
或所述方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒，最后将得到的重组质粒转化至Lactococcus lactis NZ9000中，得到抗酸胁迫重组乳酸菌。
在本发明的一种实施方式中，所述限制性内切酶为Nco I以及Hind III。
本发明还提供了应用上述构建方法制备得到的耐酸重组乳酸菌。
本发明还提供了上述一种耐酸重组乳酸菌或上述制备得到的耐酸重组乳酸菌在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。
[有益效果]
(1)本发明首次发现在乳酸菌中过量表达RbsA或RbsB蛋白可显著提高乳酸菌的耐酸能力；
(2)本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达RbsA或RbsB蛋白，得到了耐酸能力显著提高的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(RbsA)以及Lactococcus lactis(RbsB)；
(3)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(RbsA)的耐酸能力较野生型有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较野生型提高了5.2倍；利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis(RbsB)的耐酸能力较野生型有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较野生型提高了12.2倍；
(4)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌在构建时具有成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的优势，可适应大规模工业化生产。
附图说明
图1：重组质粒Vector/RbsA的结构图。
图2：重组质粒Vector/RbsB的结构图。
图3：重组质粒Vector/MalF的结构图。
图4：重组质粒Vector/BglF的结构图。
图5：重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)、Lactococcus lactis(BglF)、Lactococcus lactis(MalF)和对照菌株的生长曲线图。
图6：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)与对照菌株的存活率对比。
图7：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株Lactococcus lactis(RbsB)与对照菌株的存活率对比。
图8：重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)和对照菌株酸胁迫前后的胞内ATP含量对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000来源于荷兰NIZO研究所。
下述实施例中涉及的培养基如下：
氯霉素平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)1％(m/v)、酵母粉(Oxoid)0.5％(m/v)、氯化钠1％(m/v)及琼脂条2％(m/v)，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。
GM17液体培养基：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)。
GM17氯霉素平板：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)及2％(m/v)的琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。
实施例1：重组菌株的构建
具体步骤如下：
(1)从NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.1所示的rbsA基因序列(rbsA基因是编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因，D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA是膜上用于转运D-核糖的ATP结合的蛋白)、如SEQ ID NO.2所示的rbsB基因序列(rbsB是编码D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因，D-核糖转运底物结合蛋白RbsB是膜上用于转运D-核糖的底物结合蛋白)、如SEQ ID NO.7所示的malF基因序列(malF是编码糖苷特异性PTS(磷酸转移酶)系统IIABC组分MalF的基因，MalF是膜上转运糖苷特异性PTS(磷酸转移酶)系统的组分蛋白)、如SEQID NO.8所示的bglF基因序列(bglF是编码麦芽糖ABC转运体渗透酶蛋白BglF的基因，BglF是膜上用于转运麦芽糖ABC的渗透酶蛋白)，根据的基因序列设计分别如表1所示的引物；
(2)以L.lactis NZ9000的基因组为模板，分别以表1中的引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的基因片段；
(3)将PCR产物和载体pNZ8148分别用表1中的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；
(4)将连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒Vector/RbsA(结构如图1所示)、Vector/RbsB(结构如图2所示)、Vector/MalF(结构如图3所示)、Vector/BglF(结构如图4所示)；
(5)从重组E.coli MC1061中提取重组质粒，电转化感受态L.lactis NZ9000细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)、Lactococcus lactis(MalF)、Lactococcus lactis(BglF)；
其中，电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μf，电阻200Ω进行电击；电击完毕后，立即向电转杯中加入含有20mM MgCl2和2mM CaCl2的GM17培养基(培养基配方：M17broth培养基+0.5％glucose)；然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。
表1引物与酶切位点
实施例2：重组菌株的生长性能试验
具体步骤如下：
(1)将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株Lactococcus lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)、Lactococcuslactis(MalF)、Lactococcus lactis(BglF)分别接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；
(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；
(3)在培养过程中，每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值；
(4)培养至OD600 0.4时加入10ng/mL的Nisin诱导表达硫胺素转运蛋白，以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图5)。
结果如图5所示，经生长性能试验分析，重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)的生物量和对照菌株没有太大差距，说明在L lactis NZ9000中过量表达RbsA和RbsB蛋白对菌株的生长性能没有影响，而重组菌株Lactococcus lactis(MalF)、Lactococcus lactis(BglF)的生物量明显低于对照菌株，说明在L lactis NZ9000中过量表达MalF和BglF蛋白会对菌株的生长造成抑制。
实施例3：重组菌株在乳酸胁迫条件下的耐受性试验
具体步骤如下：
将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株Lactococcus lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，分别胁迫1.5h、2.5h以及3h；将胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图6-7所示)；
其中，存活率＝(N/N0)×100％；
式中，N0是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。
由图6-7可知，经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)的存活率为分别对照的5.8、12.2倍，说明重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)对酸胁迫的耐受性显著提高。
实施例4：重组菌株胞内ATP含量的测定
具体步骤如下：
将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株Lactococcus lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·L-1，pH 7.0)洗涤2次重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫1h、2.5h，取4.0mL菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用，用ATP检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定胞内ATP的含量(结果如图8所示)。
由图8可知，酸胁迫前Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)胞内ATP含量为对照菌株的65％和54％，胁迫后重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)、Lactococcus lactis(RbsB)胞内ATP含量均有提升，其中，重组菌株Lactococcus lactis(RbsA)的胞内ATP含量为对照菌株的88％，重组菌株Lactococcus lactis(RbsB)的胞内ATP含量较对照菌株提高了30％，结果表明重组菌株可以释放更多的ATP，满足胁迫条件下细胞对能量的需求，进而增强L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgaaaatag aaatgaagaa catttctaaa tcatttggaa ccaacaaagt tctcgaagca 60
attgatttaa ctatcaattc tggagaagtt catgccttaa tgggggaaaa tggtgctgga 120
aaatccacgc taatgaatat tctgactgga cttttcccag cttctggtgg agaaattgag 180
attgataagg aggataaaac tttcaagaat cctcaagagg cagaaggatt tggcattagc 240
tttattcatc aggaaatgaa tacatggcct gatttaacag tcttagagaa cctttttctt 300
ggtcgagaaa taaaaaataa atttggtatt ttagatacaa aagctatgcg taaaaaagct 360
acttttgctt ttgaacaatt gggagtaact attgatttag ataaagaaat cgggaacttg 420
tcagttggtc agcaacaaat ggttgaaatt gctaaaagtt ttttatctga tttgaaaatt 480
ttgattatgg atgaaccgac agccgcgttg acagaaagag aaacagaacg tttattttca 540
gttatcgcag gccttaaagc acaaggcgtt ggtattattt atatttctca ccgaatggaa 600
gaaattttta agattaccga ttgtgtgaca gttatgcgtg atggtttggt catcgatact 660
aaaaaaacaa aagagacaaa tgttgatgag ttagttcgga aaatggttgg tcgctcaatt 720
acagattatt atccccaaaa aaatgctaaa attcgagaaa ttgtattcga agcagaaaat 780
ttatccacag ctgactttaa aaatatttcc ttttcagttc gttcaggtga aatccttggt 840
tttgcaggac tcatgggagc tggtagaacc gaggtcatgc gagcaatttt tggaattgac 900
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cgtggagtcg atgtaggagc caaacgagag atttatcaat tgatgaatga actcgcagaa 1320
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<210> 2
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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accgcatgta gtctttatac cggaattccc ggtcgtgatg gaaaagaaaa agtagaagag 120
gtcgcacaca agaaagcaaa tgaattaaat attggtgttt ctatttcaac aacgaacaat 180
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ttaactgtct ctgatgctca aaatgattcg gcaactcaac tcaataatgt ccaaaatttc 300
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ttaaatatat tatcaagtca atctgcaaat tttgaccgga ctactggttt gaataccact 660
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<211> 29
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catgccatgg ggatgaaatt agtaaaaaaa ttaacttttg cc 42
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccaagctttt accatttgtg ttcatcaaca ttatc 35
<210> 7
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggcaaatt attcacaact tgcgacagaa attatcgcaa atgtaggtgg cgctgagaat 60
gtcacaaaag ttattcactg tatcactcgt cttcgtttta ccttgaaaga caaagataaa 120
gcagatacgg cggcgattga agccttacct ggtgtcgctg gagctgttta taactcaaac 180
ttgaatcaat atcaagtagt tattggacaa gctgtagaag atgtttatga cgaggttgtt 240
gaacagcttg gagattcagt tgttgatgaa gatgcaacgg cgcaagcact tgctgcaaca 300
gcaccggcta gtggtaaaaa acaaaatcca attgttcatg ctttccaagt ggttattggg 360
acaattacag gttcgatgat tccaattatt ggtttacttg cggctggtgg gatgattaat 420
ggattattaa gtatctttgt taaaggaaat cgtttaattg aagtgattga ccctgcaagt 480
tcaacttacg tcattatctc aactctagca atgacaccat tttatttctt acctgtttta 540
gtaggatttt cagcagcaaa acaattagca cctaaagata ctgttttaca atttattggt 600
gctgctgttg gtggtttcat gattaatcca gggattacta acttggtaaa tgctcatgtt 660
ggaacaaatg cggccggtaa aaatgttgtt gttgaagcag cagctccagt agcaaatttc 720
cttggagtca cttttaatac aagttatttt ggaattccgg ttgctttgcc aagttatgct 780
tatacaattt tcccaatcat tgtggcggta gcaatcgcta aacctttgaa tgcttggttg 840
aaaaaggttt taccacttgc cttgcgtcca attttccaac cgatgattac tttcttcatc 900
actgcttcaa tcattttact cttggtcggt cctgttattt caacaatttc atctggtttg 960
tcattcgtta ttgaccatat cttgtcatta aacttaggga ttgcaagtat tatcgtcggt 1020
ggtttgtatc aatgtttggt tatatttggt ttgcactggt tggttgtacc acttatttca 1080
caagagttgg cagcaacagg agcaagctca cttaatatga ttgttagctt cacaatgctt 1140
gcgcaaggag ttggtgcctt gactgtcttc tttaaatcta aaaaagctga ccttaaagga 1200
ctttctgctc cagctgccat ttcggctttt tgtggagtaa ctgaacctgc catgtacgga 1260
attaacttga aatatgttcg cgtcttcatc atgtcttcaa ttggtgcagc aattggtgct 1320
gggattgccg gatttggtgg cttacaaatg tttggatttt cagggtcatt gattagtttt 1380
cctaacttta tctctaatcc attgacgcat catgcacctg cgggtaactt aatgctcttc 1440
tggattgcca ctgcggtatg tgctgttgcc actttcttat tagtttggtt ctttggttac 1500
aaggatactg atgtcatggg acaaggagtt gaacaaaaaa atgcatttaa ggatgctgta 1560
aaataa 1566
<210> 8
<211> 1383
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgactaaaa agaaaaaaag aaaacaaacc gaaagtaatg tttctcctga agaaaaatct 60
attaaactac gtgaagtttt ccaaaaaggt aataccgtta caaaattaac tttcttcgtg 120
atgggcctga atcaaataaa aaacaaacag tgggtaaaag gatttacttt cttaattctt 180
gaaattgcat ttattggttg gcttcttttc tctggactta gtgctttttc tcttttgagt 240
agcttaggtc caaataaaac acttaaagaa acaacagacg ccaatggctt tccagttatt 300
attcaacccg atcactctgt tttgatttta ctttggggac tcattgcttg tcttgtcgtt 360
gttctcttta ttttacttta ctggttcaac tatcgttcaa acaaacatct ctactattta 420
gaacgggaag gcaaacatat ccctacaaat agagaagaac ttgcatccct acttgatgaa 480
aaactctatg cgacattaat ggctgttcct ttaattggag ttctagcttt cactgttttg 540
cctactgttt acatgatttc gatggctttc acaaactatg atcgtctaca tgctactgct 600
ttctcatgga ccggttttca agcctttggt aatgtcttaa ccggggattt agcgggaaca 660
ttcttccccg ttcttggttg gacattagta tgggcaattg tagcaacagc aacaacattt 720
ctcggtggtg ttttacttgc cttactcatt gagtcaactg gaattaaatt taaaggattc 780
tggagaacag tttttgttat cgtctttgcc gttccacaat ttgtaaccct attaatgatg 840
gcacaatttt tggaccaaca aggagctttt aatggaattt tgatgaatct tcatctaatt 900
tccaatccga tcaactttat tggtgcggct tctgacccaa tggttgcaag aatcactgtt 960
atatttgtta atatgtggat tggtatccct gtttcaatgc ttgtatctac agcaattatc 1020
caaaaccttc cccaagacca aatcgaagct gcacgtattg atggagcaaa tagtttaaat 1080
atcttccgtt ctatcacttt tcctcagatt ctctttgtta tgactcctgc attgattcaa 1140
caatttattg gtaacatcaa taacttcaat gttatttatc tactaacgca aggttggcca 1200
atgaatccaa actaccaagg agcaggttca accgaccttc ttgttacttg gctctacaac 1260
ctcgtctttg gtcaaactca acgttacaat gctgccgctg ttcttggtat cttgattttc 1320
attgttaatg catcaatttc attagtagca taccgtcgta ccaatgcatt taaggagggc 1380
taa 1383
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
catgccatgg ggatggcaaa ttattcacaa cttgcg 36
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccaagcttt tattttacag catccttaaa tgcat 35
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
catgccatgg ggatgactaa aaagaaaaaa agaaaac 37
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cccaagcttt tagccctcct taaatgcatt g 31

Claims (10)

1.一种耐酸重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌过量表达了D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB。
2.如权利要求1所述的一种耐酸重组乳酸菌，其特征在于，编码所述D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的一种耐酸重组乳酸菌，其特征在于，所述过量表达为先将编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因与表达载体构建含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA和/或D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。
4.如权利要求3所述的一种耐酸重组乳酸菌，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体、pNZ8149载体、pNZ8151载体或pNZ8152载体。
5.如权利要求4所述的一种耐酸重组乳酸菌，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒的方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒。
6.如权利要求5所述的一种耐酸重组乳酸菌，其特征在于，所述限制性内切酶为Nco I和Hind III。
7.如权利要求4所述的一种耐酸重组乳酸菌，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒的方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒。
8.权利要求1-7任一所述的一种耐酸重组乳酸菌的构建方法，其特征在于，所述方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运ATP结合蛋白RbsA的基因的重组质粒，最后将得到的重组质粒转化至Lactococcus lactisNZ9000中，得到抗酸胁迫重组乳酸菌；
或所述方法为先以Lactococcus lactis NZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQID NO.2所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，再将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码D-核糖转运底物结合蛋白RbsB的基因的重组质粒，最后将得到的重组质粒转化至Lactococcus lactis NZ9000中，得到抗酸胁迫重组乳酸菌。
9.应用权利要求8所述的构建方法制备得到的耐酸重组乳酸菌。
10.权利要求1-7任一所述的一种耐酸重组乳酸菌或权利要求9所述的制备得到的耐酸重组乳酸菌在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。
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