CN109666618B

CN109666618B - 一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌

Info

Publication number: CN109666618B
Application number: CN201910001064.6A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 杨佩珊; 刘为佳; 朱政明; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2039-01-02
Also published as: CN109666618A

Abstract

本发明公开了一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明以编码氨基酸透性酶CtrA的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌在酸胁迫环境下的生存能力得到了显著提高，较对照菌株提高了35.7倍。

Description

一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌

技术领域

本发明涉及一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

乳酸菌是发酵葡萄糖，主要代谢终产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，包括乳杆菌属、魏斯氏菌属、肉杆菌属等，具有促进营养物质消化和吸收、降低血清胆固醇、调节肠道菌群平衡、激活机体免疫系统、改善食品风味和预防癌症等生理功能，在食品、医药、饲料、精细化学品等与人类生活密切相关的重要工业领域也具有重要的应用价值。

但是，在乳酸菌的工业化发酵生产以及作为益生菌在人体胃肠道系统发挥作用的过程中，不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，这些环境胁迫均严重限制着乳酸菌生长性能。而在乳酸菌面临的众多胁迫条件中，酸胁迫是影响其生理活性的重要胁迫条件。

酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。

对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

因此，急需获得一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌，所述乳酸菌工程菌包含携带了编码氨基酸透性酶CtrA的基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸透性酶CtrA来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氨基酸透性酶CtrA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸透性酶CtrA的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了一种提高乳酸菌在酸胁迫环境下生存能力的方法，所述方法为在乳酸菌中过量表达氨基酸透性酶CtrA。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述编码氨基酸透性酶CtrA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码氨基酸透性酶CtrA的基因与表达载体构建含有编码氨基酸透性酶CtrA的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了利用上述一种方法制备得到的在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码氨基酸透性酶CtrA的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148。

本发明提供了上述一种方法在提高乳酸菌在酸胁迫环境下生存能力方面的应用。

本发明提供了上述一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌或上述一种提高乳酸菌在酸胁迫环境下生存能力的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明首次发现在乳酸菌中过量表达CtrA蛋白可显著提高乳酸菌在酸胁迫环境下生存能力；

(2)本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达CtrA蛋白，得到了在酸胁迫环境下生存能力显著提高的重组乳酸乳球菌L lactis(CtrA)；

(3)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(CtrA)在酸胁迫环境下的生存能力较对照菌株有了明显的提高，其在乳酸调节的酸性条件下的的生存能力较对照菌株提高了35.7倍；

(4)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(CtrA)在构建时具有成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的优势，可适应大规模工业化生产。

附图说明

图1：重组质粒pNZ8148/ctrA的结构图。

图2：重组质粒pNZ8148/bglF的结构图。

图3：重组质粒pNZ8148/oppB的结构图。

图4：重组菌株L lactis(CtrA)、L lactis(BglF)、L lactis(OppB)和对照菌株的生长曲线。

图5：pH 4.0(乳酸调节)条件下重组菌株L lactis(CtrA)与对照菌株的存活率对比。

图6：重组菌株L lactis(CtrA)和对照菌株酸胁迫前后的胞内ATP含量对比。

图7：重组菌株L lactis(CtrA)和对照菌株酸胁迫前后的胞内谷氨酸含量对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000来源于荷兰NIZO研究所。

下述实施例中涉及的培养基如下：

氯霉素平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)1％(m/v)、酵母粉(Oxoid)0.5％(m/v)、氯化钠1％(m/v)及琼脂条2％(m/v)，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

GM17液体培养基：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)。

GM17氯霉素平板：在M17培养基(Oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(Glucose)及2％(m/v)的琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/mL氯霉素。

实施例1：重组菌株的构建

具体步骤如下：

(1)从NCBI数据库的中得到如SEQ ID NO.1所示的ctrA基因序列(ctrA基因是编码氨基酸透性酶CtrA的基因，氨基酸透性酶CtrA是膜上用于转运氨基酸的蛋白)、如SEQ IDNO.3所示的bglF基因序列(bglF基因是编码β-葡萄糖苷特异性PTS系统IIABC组分BglF的基因，β-葡萄糖苷特异性PTS系统IIABC组分BglF是膜上用于转运β-葡萄糖苷的蛋白)、如SEQID NO.4所示的oppB基因序列(oppB基因是编码肽转运系统通透酶OppB的基因，肽转运系统通透酶OppB是膜上用于转运寡肽的蛋白)，根据的基因序列设计分别如表1所示的引物；

(2)以L.lactis NZ9000的基因组为模板，分别以表1中的引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的基因片段；

(3)将PCR产物和载体pNZ8148分别用表1中的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；

(4)将连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/ctrA(结构如图1所示)、pNZ8148/bglF(结构如图2所示)、pNZ8148/oppB(结构如图3所示)；

(5)从重组E.coli MC1061中提取重组质粒，电转化感受态L.lactis NZ9000细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L lactis(CtrA)、L lactis(BglF)以及L lactis(OppB)；

其中，电转化条件为：1μL质粒中与40μL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000V，电容25μf，电阻200Ω进行电击；电击完毕后，立即向电转杯中加入含有20mM MgCl₂和2mM CaCl₂的GM17培养基(培养基配方：M17broth培养基+0.5％glucose)；然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物与酶切位点

实施例2：重组菌株的生长性能试验

具体步骤如下：

(1)将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(CtrA)、L lactis(BglF)以及L lactis(OppB)分别接种于加了10μg/mL氯霉素的GM17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；

(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/mL)GM17液体培养基中，30℃静置培养；

(3)在培养过程中，每隔一定时间取样，测定600nm波长下的OD值；

(4)培养至OD₆₀₀ 0.4时加入10ng/mL的Nisin诱导表达转运蛋白，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图4所示)。

结果如图4所示，经生长性能试验分析，重组菌株L lactis(CtrA)的生物量与对照菌株相比没有太大差距，说明在L lactis NZ9000中过量表达CtrA蛋白对菌株的生长性能没有影响；然而，重组菌株L lactis(BglF)以及L lactis(OppB)的生物量明显低于对照菌株，说明在L lactis NZ9000中过量表达BglF和OppB蛋白会影响菌株的正常生长。因此，后续实验对能正常生长的重组菌株L lactis(CtrA)的耐酸性能进行试验。

实施例3：重组菌株在乳酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(CtrA)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，分别胁迫1.5h、2.5h以及3h；将胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点种于GM17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图5所示)；

其中，存活率＝(N/N₀)×100％；

式中，N₀是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。

由图5可知，经耐受性实验分析，在pH 4.0的GM17中胁迫3h后，重组菌株L lactis(CtrA)的存活率为对照的35.7倍，说明重组菌株L lactis(CtrA)对酸胁迫的耐受性较对照菌株有了明显的提高。

实施例4：重组菌株胞内ATP含量的测定

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(CtrA)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·L^-1，pH 7.0)洗涤2次重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫1h，取4.0mL菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用，用ATP检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定胞内ATP的含量(结果如图6所示)。

由图6可知，酸胁迫前后重组菌株胞内ATP含量均高于对照菌株，在pH 4.0的GM17中胁迫1h后重组菌株L lactis(CtrA)的胞内ATP含量是对照菌株的1.31倍，表明重组菌株可以释放更多的ATP，满足胁迫条件下细胞对能量的需求，进而增强L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性。

实施例5：重组菌株胞内氨基酸含量的测定

具体步骤如下：

将仅含有空白质粒pNZ8148的菌株L lactis(Vector)(对照)和实施例1得到的菌株L lactis(CtrA)分别在GM17培养基中于30℃的条件下诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·L^-1，pH 7.0)洗涤2次重悬于与所收集的菌液等体积的新鲜的pH 4.0(乳酸调节)的GM17(含有氯霉素10μg/mL)中，胁迫3h，取10.0mL菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用，应用高效液相色谱仪对重组菌株胞内氨基酸含量进行检测(结果如图7所示)；

其中，高效液相色谱仪检测样品的制备：取1mL磷酸缓冲液重悬菌体，菌悬液转移至破碎管，使用FastPrep-24振荡破碎细胞(4.0m·s^-1)至菌悬液澄清；离心，取上清500μL，加等体积5％(m/v)的三氯乙酸(TCA)，静止放置30min去除可溶性蛋白；离心，取上清液，用水系滤膜(0.2μm)过滤到干净的样品瓶中备用；

高效液相色谱仪分析方法：OPA和硼酸进行柱前衍生；柱温设定为40.0℃；流速设定为1.0mL·min^-1；紫外检测器的波长为338nm；色谱柱选用ODS HYPERSIL(250.0mm×4.6mm×5.0μm)。

由图7可知，酸胁迫前重组菌株胞内谷氨酸含量低于对照菌株，pH4.0胁迫3h后，重组菌株胞内谷氨酸含量明显高于对照菌株，是对照菌株的5.73倍，表明重组菌株可以在酸胁迫过程中维持相对较高的谷氨酸含量，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下，消耗H⁺，生成碱性较强的γ-氨基丁酸并释放CO₂，维持胞内pH的稳态，进而帮助细胞抵御酸胁迫。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggattta tgagaaaagc cgattttgag ctttatcgtg atgcagataa acattataat 60

caggtactaa ccacacgtga ttttcttgca ctaggtgttg gaacaattat ttcaacttct 120

atctttacct tgccaggaca agttgccgct caatttgcgg gcccaggggt tgtcttttct 180

tatctacttg ccgctttggt cgctggtttt gtggccttgg cttatgctga aatgtcaaca 240

gtaatgccct ttgctggttc agcctattct tggatttcgg tcttatttgg cgaaggtttc 300

ggctggattg ctggttgggc tttgcttgcg gaatatttta ttgctgttgc ctttgttggc 360

tcaggtttct cagcaaatct tcagcaatta ctagcgccac tcggtttcca actgccaaaa 420

gtattggcca acccttttgg tacagatggt ggaatcgttg atattatttc acttttggtc 480

attttgctct cggcaattat tgtctttcgt ggggcatctg atgctggacg aatcagtcaa 540

attcttgttg tgcttaaagt ggcagcggtt attgctttca tcattgtggg gattacggtc 600

attaagccag caaattacca tccatttatt ccgccacaca atccgaaaac aggttttggt 660

ggcttctcgg ggatttggtc tggggtgtcg atgattttct tggcctatat cggttttgat 720

tcaattgcag ccaattcagc ggaagctaaa aatccccaaa aaacaatgcc acgtggaatt 780

attgggtcgc ttctcattgc tgttgttcta tttgcagcag taaccttggt acttgtaggg 840

atgcatcctt actcagccta tgcaggaaat gcagcgccag ttggttgggc ccttcaacaa 900

tcaggttatt ctgttttatc agaagttgtc acagcgattg cacttgccgg aatgtttatc 960

gctcttttgg gaatggtcct tgcaggttcg cgtttgcttt atgcttttgg acgcgatgga 1020

cttttgccta aaggtttagg taaaatgaat gctcgaaatc ttccagcaaa tggtgtgtgg 1080

accttagcca ttgttgctat tgtcattggg gcattcttcc cctttgcttt tcttgctcaa 1140

cttatctcag ccggaacttt gattgctttc atgtttgtaa ctcttggaat ttattcgctc 1200

cgtcgtcgtc aaggaaaaga tttaccagaa gcaacttata aaatgccttt ttatccagta 1260

ctaccagctc ttggttttat tgggtcatta tttgtctttt ggggactgga tgttcaagca 1320

aaactttatt ctggaatttg gttccttatt ggaattgcga tttattttgc ttatggaaat 1380

cgtcgcaaaa agaaataa 1398

<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Phe Met Arg Lys Ala Asp Phe Glu Leu Tyr Arg Asp Ala Asp

1 5 10 15

Lys His Tyr Asn Gln Val Leu Thr Thr Arg Asp Phe Leu Ala Leu Gly

20 25 30

Val Gly Thr Ile Ile Ser Thr Ser Ile Phe Thr Leu Pro Gly Gln Val

35 40 45

Ala Ala Gln Phe Ala Gly Pro Gly Val Val Phe Ser Tyr Leu Leu Ala

50 55 60

Ala Leu Val Ala Gly Phe Val Ala Leu Ala Tyr Ala Glu Met Ser Thr

65 70 75 80

Val Met Pro Phe Ala Gly Ser Ala Tyr Ser Trp Ile Ser Val Leu Phe

85 90 95

Gly Glu Gly Phe Gly Trp Ile Ala Gly Trp Ala Leu Leu Ala Glu Tyr

100 105 110

Phe Ile Ala Val Ala Phe Val Gly Ser Gly Phe Ser Ala Asn Leu Gln

115 120 125

Gln Leu Leu Ala Pro Leu Gly Phe Gln Leu Pro Lys Val Leu Ala Asn

130 135 140

Pro Phe Gly Thr Asp Gly Gly Ile Val Asp Ile Ile Ser Leu Leu Val

145 150 155 160

Ile Leu Leu Ser Ala Ile Ile Val Phe Arg Gly Ala Ser Asp Ala Gly

165 170 175

Arg Ile Ser Gln Ile Leu Val Val Leu Lys Val Ala Ala Val Ile Ala

180 185 190

Phe Ile Ile Val Gly Ile Thr Val Ile Lys Pro Ala Asn Tyr His Pro

195 200 205

Phe Ile Pro Pro His Asn Pro Lys Thr Gly Phe Gly Gly Phe Ser Gly

210 215 220

Ile Trp Ser Gly Val Ser Met Ile Phe Leu Ala Tyr Ile Gly Phe Asp

225 230 235 240

Ser Ile Ala Ala Asn Ser Ala Glu Ala Lys Asn Pro Gln Lys Thr Met

245 250 255

Pro Arg Gly Ile Ile Gly Ser Leu Leu Ile Ala Val Val Leu Phe Ala

260 265 270

Ala Val Thr Leu Val Leu Val Gly Met His Pro Tyr Ser Ala Tyr Ala

275 280 285

Gly Asn Ala Ala Pro Val Gly Trp Ala Leu Gln Gln Ser Gly Tyr Ser

290 295 300

Val Leu Ser Glu Val Val Thr Ala Ile Ala Leu Ala Gly Met Phe Ile

305 310 315 320

Ala Leu Leu Gly Met Val Leu Ala Gly Ser Arg Leu Leu Tyr Ala Phe

325 330 335

Gly Arg Asp Gly Leu Leu Pro Lys Gly Leu Gly Lys Met Asn Ala Arg

340 345 350

Asn Leu Pro Ala Asn Gly Val Trp Thr Leu Ala Ile Val Ala Ile Val

355 360 365

Ile Gly Ala Phe Phe Pro Phe Ala Phe Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala

370 375 380

Gly Thr Leu Ile Ala Phe Met Phe Val Thr Leu Gly Ile Tyr Ser Leu

385 390 395 400

Arg Arg Arg Gln Gly Lys Asp Leu Pro Glu Ala Thr Tyr Lys Met Pro

405 410 415

Phe Tyr Pro Val Leu Pro Ala Leu Gly Phe Ile Gly Ser Leu Phe Val

420 425 430

Phe Trp Gly Leu Asp Val Gln Ala Lys Leu Tyr Ser Gly Ile Trp Phe

435 440 445

Leu Ile Gly Ile Ala Ile Tyr Phe Ala Tyr Gly Asn Arg Arg Lys Lys

450 455 460

Lys

465

<210> 3

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcaaatt attcacaact tgcgacagaa attatcgcaa atgtaggtgg cgctgagaat 60

gtcacaaaag ttattcactg tatcactcgt cttcgtttta ccttgaaaga caaagataaa 120

gcagatacgg cggcgattga agccttacct ggtgtcgctg gagctgttta taactcaaac 180

ttgaatcaat atcaagtagt tattggacaa gctgtagaag atgtttatga cgaggttgtt 240

gaacagcttg gagattcagt tgttgatgaa gatgcaacgg cgcaagcact tgctgcaaca 300

gcaccggcta gtggtaaaaa acaaaatcca attgttcatg ctttccaagt ggttattggg 360

acaattacag gttcgatgat tccaattatt ggtttacttg cggctggtgg gatgattaat 420

ggattattaa gtatctttgt taaaggaaat cgtttaattg aagtgattga ccctgcaagt 480

tcaacttacg tcattatctc aactctagca atgacaccat tttatttctt acctgtttta 540

gtaggatttt cagcagcaaa acaattagca cctaaagata ctgttttaca atttattggt 600

gctgctgttg gtggtttcat gattaatcca gggattacta acttggtaaa tgctcatgtt 660

ggaacaaatg cggccggtaa aaatgttgtt gttgaagcag cagctccagt agcaaatttc 720

cttggagtca cttttaatac aagttatttt ggaattccgg ttgctttgcc aagttatgct 780

tatacaattt tcccaatcat tgtggcggta gcaatcgcta aacctttgaa tgcttggttg 840

aaaaaggttt taccacttgc cttgcgtcca attttccaac cgatgattac tttcttcatc 900

actgcttcaa tcattttact cttggtcggt cctgttattt caacaatttc atctggtttg 960

tcattcgtta ttgaccatat cttgtcatta aacttaggga ttgcaagtat tatcgtcggt 1020

ggtttgtatc aatgtttggt tatatttggt ttgcactggt tggttgtacc acttatttca 1080

caagagttgg cagcaacagg agcaagctca cttaatatga ttgttagctt cacaatgctt 1140

gcgcaaggag ttggtgcctt gactgtcttc tttaaatcta aaaaagctga ccttaaagga 1200

ctttctgctc cagctgccat ttcggctttt tgtggagtaa ctgaacctgc catgtacgga 1260

attaacttga aatatgttcg cgtcttcatc atgtcttcaa ttggtgcagc aattggtgct 1320

gggattgccg gatttggtgg cttacaaatg tttggatttt cagggtcatt gattagtttt 1380

cctaacttta tctctaatcc attgacgcat catgcacctg cgggtaactt aatgctcttc 1440

tggattgcca ctgcggtatg tgctgttgcc actttcttat tagtttggtt ctttggttac 1500

aaggatactg atgtcatggg acaaggagtt gaacaaaaaa atgcatttaa ggatgctgta 1560

aaataa 1566

<210> 4

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtggaaag taattattag acgtatttta ttgatgatcc ctcaattatt tatcttgagt 60

attcttgttt tcttctttgc taaattgatg cctggtgatc ctttttcagg gttgattggt 120

cctcataccg acccacatga agttgaagca ttaagacggg cagcaggttt atatgaccct 180

tggtgggagc agtatctcag gtggctaggg aatgccatac atgggaattt aggaatgtcc 240

tataatctca aagagcctgt gatgactgtc attggacata gagcgattaa tactttttgg 300

atgtcacttt tgtcagttat tttaacttac ttatttgcta ttccgatgtc gatagttgca 360

gctcgaaatg aaggaaaatg gcaagaccaa ttgtggttga cctataattc aattactttt 420

ggtattccac cttacgtatt ctatctcttg attatcttta tctttggtta tagtcttaat 480

tggtttccga caggtgggac ggtaagtcca gatgcgatgg gaataattcc tgttttcttt 540

agtaagattt atcacatgat tcttccggct tttagtttgg cggtctttgg aacagttgga 600

atctttactt acttccgctc aggaatttta gatgaacaaa cacaagatta tgtacgaacg 660

gctcgagcca aaggggttaa ggaaaaagtg atttttagac gtcatatttt gagaaatgcc 720

tcattaccaa ttgcttctaa ttttggattt gtgattactg gactcttggg aggagcaatc 780

tttgctgaaa caattttcgg ctatcctggc ttaggacaac tttttattac ttcaatatct 840

gggcgagatt attcaatgat tacggctttg attttattaa atggtttttt gggacttctt 900

ggagccctcc tgtcggatat tatcatggca atggttgacc cacgaattcg gattcaataa 960

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catgccatgg ggatgggatt tatgagaaaa gccg 34

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctagatt atttcttttt gcgacgattt c 31

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgccatgg ggatggcaaa ttattcacaa cttgcg 36

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccaagcttt tattttacag catccttaaa tgcat 35

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catgccatgg ggatgtggaa agtaattatt agacgtattt tatt 44

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccaagcttt tattgaatcc gaattcgtgg g 31

Claims

1.氨基酸透性酶CtrA在提高乳酸乳球菌在酸胁迫环境下生存能力方面的应用，其特征在于，所述应用为在乳酸乳球菌中过量表达氨基酸透性酶CtrA；编码所述氨基酸透性酶CtrA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨基酸透性酶CtrA来源于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述过量表达为先构建含有编码氨基酸透性酶CtrA的基因与表达载体的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸乳球菌中。