CN112391329A - 一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。本发明在大肠杆菌中过表达天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB、二氢乳清酸脱氢酶PyrD、Orotidine‑5'‑磷酸脱羧酶蛋白PyrF成功构建了一类可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌；相较于对照菌株，本发明提供的重组菌株对衣康酸、D‑乳酸、琥珀酸的胁迫抗性均得到了显著提高。本发明的操作简单，可广泛的应用到工业生产中。

Description

一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。
背景技术
大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。
高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成，并且D-乳酸也是生物塑料聚乳酸的原料。目前发酵法制备乳酸以其绿色、高效、环保，在工业上具有广泛的应用前景，虽然在大肠杆菌中有固有的乳酸生成途径，可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸，不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸，但是由于大肠杆菌系统存在酸胁迫的问题，而制约着乳酸的产量的提高。
琥珀酸作为具有巨大潜力的前提物质，可以用来生产四氢呋喃等各种衍生物，在2010年被评估为“该化合物或技术已在文献中引起极大关注，具有强大的平台潜力、产品或技术的规模正在逐步扩大，以进行试点，演示或全面推广”，琥珀酸及其直接衍生物的市场潜力预计每年高达245×103吨，而琥珀酸衍生的聚合物的市场规模估计高达每年25×106吨。在传统的工程菌株发酵工艺中，琥珀酸是由曼海姆氏琥珀酸杆菌Mannheimiasucciniciproducens等发酵生产，产量约为68.41g·L-1。这类菌株是自然存在的可以代谢产生琥珀酸，也已具有较高的产量，但是这类菌株的一个共性问题是他们的代谢改造相对来说较为复杂和困难，通常来说营养缺陷型的菌株在发酵时需要更多的营养添加物质，造成了无法实现大规模的工业应用，所以研究者们又将目光瞄准了大肠杆菌。
衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是不饱和二元有机酸，它含不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯腈等聚合，是化学合成工业的重要原料，也是化工生产的重要原料。采用大肠杆菌作为天然宿主时，由于大肠杆菌本身不具备衣康酸代谢能力，起初被报道出来的产量非常低，少于1g·L-1，后来发展到4.3g·L-1。直到最近，可见的报道中，衣康酸最高的产量也仅仅为47g·L-1，其合成途径主要由乌头酸氧化途径产生，从最终的产量上来，仍然与采用曲霉菌属为宿主时的产量有一定差距，其产率为0.86g·h-1·L-1，虽然与传统的曲霉类生产菌属相比，在产量上存在一些不足，但以大肠杆菌作为衣康酸的生产宿主依然可以被认为是具有潜力的。
但是大肠杆菌本身存在对有机酸耐受性不高的限制发展因素，大肠杆菌适应生长环境为中性，可乳酸生产环境的pH值适宜在pH 5.5以上，但约50g·L-1的有机酸即会使环境pH降低至pH 2.0左右，这对大肠杆菌的生长是一种考验。
对于酸胁迫，为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。
目前，提高大肠杆菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点，且诱变后的菌种容易退化；(2)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题。
因此，急需找到一种新的效果显著、成本低、遗传稳定性好、成功率高、操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒，所述重组质粒为连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的基因、编码二氢乳清酸脱氢酶PyrD的基因、编码Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF的基因中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coli K12 MG1655。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。
在本发明的一种实施方式中，所述二氢乳清酸脱氢酶PyrD来源于大肠杆菌E.coliK12 MG1655。
在本发明的一种实施方式中，所述Orotidine-5'-磷酸脱羧酶蛋白PyrF来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明的一种实施方式中，二氢乳清酸脱氢酶PyrD的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。
在本发明的一种实施方式中，Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码二氢乳清酸脱氢酶PyrD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码Orotidine-5'-磷酸脱羧酶蛋白PyrF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pTrc99a。
本发明还提供了一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，所述方法为在大肠杆菌中过量表达天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB、二氢乳清酸脱氢酶PyrD、Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF中的一种或多种。
在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB、二氢乳清酸脱氢酶PyrD、Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF来源于大肠杆菌E.coli K12MG1655。
所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，二氢乳清酸脱氢酶PyrD的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码二氢乳清酸脱氢酶PyrD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码Orotidine-5'-磷酸脱羧酶蛋白PyrF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中所述过量表达为先将编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的基因、编码二氢乳清酸脱氢酶PyrD的基因或编码Orotidine-5'-磷酸脱羧酶PyrF的基因与表达载体连接，构建含有编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的基因、二氢乳清酸脱氢酶PyrD的基因或Orotidine-5'-磷酸脱羧酶PyrF的基因的重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是D-乳酸胁迫。
在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是衣康酸胁迫。
在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是琥珀酸胁迫。
本发明还提供了上述一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌在发酵生产代谢产物中的应用，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。
在本发明的一种实施方式中，所述代谢产物是甲酸、乙酸、乳酸。
本发明还提供了一种抗酸胁迫元器件，所述元器件为携带核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的二氢乳清酸脱氢酶PyrD基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Orotidine-5'-磷酸脱羧酶蛋白PyrF基因中的一种或多种的表达载体。
有益效果：
(1)本发明在大肠杆菌中过量表达PyrB蛋白、PyrD蛋白和PyrF蛋白显著提高了大肠杆菌的酸胁迫抗性；本发明的操作简单，可广泛的应用到工业生产中。
(2)本发明通过在大肠杆菌中过量表达PyrB蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组大肠杆菌E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB，该菌株对酸胁迫抗性较对照菌株有了明显的提高，其对衣康酸的抗性是对照菌株的23.7倍；其对D-乳酸的抗性是对照菌株的1.7倍；其对琥珀酸的抗性是对照菌株的1.2倍。
(3)本发明通过在大肠杆菌中过量表达PyrD蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组大肠杆菌E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD；该菌株对酸胁迫抗性较对照菌株有了明显的提高，其对衣康酸的抗性是对照菌株的94.1倍；其对D-乳酸的抗性是对照菌株的3.2倍；其对琥珀酸的抗性是对照菌株的1.4倍。
(4)利用本发明的方法得到的重组大肠杆菌E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF对酸胁迫抗性较对照菌株有了明显的提高，其对衣康酸的抗性是对照菌株的3.0倍；其对D-乳酸的抗性是对照菌株的2.3倍；其对琥珀酸的抗性是对照菌株的3.3倍。
附图说明
图1：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在正常条件下的生长曲线图。
图2：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在正常条件下的生长曲线图。
图3：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在正常条件下的生长曲线图。
图4：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在衣康酸胁迫(pH 4.2)胁迫耐受性试验的存活率图。
图5：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在衣康酸胁迫(pH 4.2)胁迫耐受性试验的存活率图。
图6：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在衣康酸胁迫(pH 4.2)胁迫耐受性试验的存活率图。
图7：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率图。
图8：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率图。
图9：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率图。
图10：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在琥珀酸胁迫(pH 4.3)胁迫耐受性试验的存活率图。
图11：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在琥珀酸胁迫(pH 4.3)胁迫耐受性试验的存活率图。
图12：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF和对照菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a在琥珀酸胁迫(pH 4.3)胁迫耐受性试验的存活率图。
具体实施方式
下述实施例中涉及的E.coli K12 MG1655菌株购自北京百欧博伟生物技术有限公司，pTrc99a载体购自武汉淼灵生物科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB固体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L-1、酵母粉(Oxoid)5g·L-1、氯化钠10g·L-1及琼脂粉20g·L-1。
LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L-1、酵母粉(Oxoid)5g·L-1、氯化钠10g·L-1。
衣康酸LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L-1、酵母粉(Oxoid)5g·L-1、氯化钠10g·L-1，pH 4.2(衣康酸调节)。
D-乳酸LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L-1、酵母粉(Oxoid)5g·L-1、氯化钠10g·L-1，pH 4.0(D-乳酸调节)。
琥珀酸LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g·L-1、酵母粉(Oxoid)5g·L-1、氯化钠10g·L-1，pH 4.3(琥珀酸调节)。
实施例1：重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB的构建
具体步骤如下：
(1)基于NCBI数据库的中的pyrB基因序列(编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB基因参与嘧啶代谢途径，调控天冬氨酸氨基甲酰基转移)设计分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物PTrc99a-PyrB-F，PTrc99a-PyrB-R；
(2)设计分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R；
(3)以E.coli K12 MG1655的基因组为模板，以PTrc99a-PyrB-F，PTrc99a-PyrB-R为引物通过PCR扩增，获得SEQ ID NO.1所示的基因片段；
(4)以载体pTrc99a为模板，以环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R为引物通过PCR扩增，获得载体线性化的长片段；
(5)将步骤(3)和(4)中获得的PCR产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒PTrc99a-PyrB的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB。
(6)基于以上相同的方法，将空载质粒PTrc99a转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655，构建对照菌株E.coli K12 MG1655/PTrc99a。
实施例2：重组菌株E.coli K12 MG1655/PTrc99a-PyrD的构建
具体步骤如下：
(1)基于NCBI数据库中的pyrD基因序列(编码二氢乳清酸脱氢酶PyrD的核苷酸序列基因，参与嘧啶代谢途径，调控二氢乳清酸的脱氢化过程)设计分别如SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示的引物PTrc99a-PyrD-F，PTrc99a-PyrD-R；
(2)设计分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R；
(3)以E.coli K12 MG1655的基因组为模板，以PTrc99a-PyrD-F，PTrc99a-PyrD-R为引物通过PCR扩增，获得SEQ ID NO.2所示的基因片段；
(4)以载体pTrc99a为模板，以环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R为引物通过PCR扩增，获得载体线性化的长片段；
(5)将步骤(3)和(4)中获得的PCR产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒PTrc99a-PyrD的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD。
(6)基于以上相同的方法，构建E.coli K12 MG1655/pTrc99a作为对照菌株。
实施例3：重组菌株E.coli K12 MG1655/PTrc99a-PyrF的构建
具体步骤如下：
(1)基于NCBI数据库中的pyrF基因序列(编码Orotidine-5'-磷酸脱羧酶蛋白PyrF基因，参与嘧啶代谢途径，调控Orotidine-5'-磷酸的脱羧化)设计分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物PTrc99a-PyrF-F，PTrc99a-PyrF-R；
(2)设计分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R；
(3)以E.coli K12 MG1655的基因组为模板，以PTrc99a-PyrF-F，PTrc99a-PyrF-R为引物通过PCR扩增获得SEQ ID NO.3所示的基因片段；
(4)以载体pTrc99a为模板，以环p-pTrc99a-F，环p-pTrc99a-R为引物通过PCR扩增获得载体线性化的长片段；
(5)将步骤(3)和(4)中获得的PCR产物进行连接，得到连接产物，然后将连接产物转化大肠杆菌E.coli K12 MG1655感受态，得到转化产物，将转化产物接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，经菌落PCR验证片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒PTrc99a-PyrF的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF。
实施例4：重组菌株和对照菌株在正常条件下的生长情况
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1、2、3中得到的对照菌株E.coli K12 MG1655/PTrc99a、重组菌株E.coli K12 MG1655/PTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/PTrc99a-PyrD、E.coli K12MG1655/PTrc99a-PyrF分别接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养过夜，得到种子液；
(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至LB液体培养基中，放在37℃摇床中220rpm培养；
(3)在步骤(2)的培养过程中，每隔2小时取样，测定600nm波长下的OD值，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图1-图3所示)。
结果如图1-图3所示，经生长性能试验分析，培养12h后，4株重组菌株的生长情况与对照菌株无明显差异，说明在E.coli MG1655中分别过量表达PyrB、PyrD、PyrF蛋白对菌株的生长性能没有影响。
实施例5：重组菌株在衣康酸胁迫(pH 4.2)耐受性试验
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1、2、3中得到的对照菌株E.coli K12 MG1655/PTrc99a、重组菌株E.coli K12 MG1655/PTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/PTrc99a-PyrD、E.coli K12MG1655/PTrc99a-PyrF接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养12h，得到种子液；
(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床中220rpm培养4.5h，培养至对数生长中期，此时的OD600为1.4-1.5，得到培养液；
(3)将步骤(2)中得到的培养液在6000rpm条件下离心5min，收集菌体，将得到的菌体经0.85％的PBS缓冲液洗涤两次后，重悬于等体积的新鲜的衣康酸LB液体培养基(pH4.2)中，胁迫不同时间。
分别将胁迫0h，1h，2h，3h，4h胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点，并接种于LB固体培养基上测定活菌数和存活率。
存活率＝(N/N0)×100％
其中，N0是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。
结果如图4-图6和表1所示，经耐受性实验分析，在胁迫4h后，菌株E.coli K12MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF的存活率分别为对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a的23.7、94.1和3.0倍，可见，E.coli K12MG1655中过量表达PyrB、PyrD和PyrF蛋白，重组菌株对衣康酸胁迫的耐受性提高。
表1驯化菌株和对照菌株在衣康酸胁迫(pH 4.2)耐受性试验的存活率
Figure BDA0002773923180000091
实施例6：重组菌株在D-乳酸胁迫(pH 4.0)胁迫耐受性试验
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1、2、3中得到的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF和对照菌株E.coliK12MG1655/pTrc99a接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养12h，得到种子液；
(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床中220rpm培养4.5h，培养至对数生长中期，此时的OD600为1.4-1.5，得到培养液；
(3)将步骤(2)中得到的培养液在6000rpm条件下离心5min，收集菌体，将得到的菌体经0.85％的PBS缓冲液洗涤两次后，重悬于等体积的新鲜的D-乳酸LB液体培养基(pH4.0)中，胁迫不同时间；分别将胁迫0h，1h，2h，3h，4h后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点，并接种于LB固体培养基上测定活菌数和存活率。
存活率＝(N/N0)×100％；
其中，N0是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。
结果如图7-图9和表2所示，经耐受性实验分析，在pH 4.0D-乳酸LB液体培养基中胁迫4h后，菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF的存活率分别为对照的1.7倍，3.2倍，2.3倍；说明E.coli K12MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12MG1655/pTrc99a-PyrF对D-乳酸胁迫的耐受性显著提高。
表2驯化菌株和对照菌株在D-乳酸胁迫(pH 4.0)耐受性试验的存活率
Figure BDA0002773923180000101
实施例7：重组菌株在琥珀酸胁迫(pH 4.3)胁迫耐受性试验
(1)分别将实施例1、2、3中得到的重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF和对照菌株E.coliK12MG1655/pTrc99a、分别接种于LB液体培养基中进行活化，放在37℃摇床中220rpm培养12h，得到种子液；
(2)分别以2％(v/v)的接种量将上述(1)中得到的种子液转接至新鲜的LB液体培养基中，37℃摇床中220rpm培养4.5h，培养至对数生长中期，此时的OD600为1.4-1.5，得到培养液；
(3)将步骤(2)中得到的培养液在6000rpm条件下离心5min，收集菌体，将得到的菌体经0.85％的PBS缓冲液洗涤两次后，重悬于等体积的新鲜的琥珀酸LB液体培养基(pH4.3)中，胁迫不同时间；分别将胁迫0h，1h，2h，3h，4h后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μL重悬液，稀释不同梯度点，并接种于LB固体培养基上测定活菌数和存活率。
存活率＝(N/N0)×100％；
其中，N0是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；N是胁迫后平板上长出的活菌落数。
结果如图10-图12和表3所示，经耐受性实验分析，在pH 4.3的琥珀酸LB液体培养基胁迫4h后，菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF的存活率分别为对照的1.2倍，1.4倍和3.3倍，重组菌株对琥珀酸胁迫的耐受性提高。说明重组菌株E.coli MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coliMG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli MG1655/pTrc99a-PyrF对琥珀酸胁迫的耐受性显著提高。
表3驯化菌株和对照菌株在琥珀酸胁迫(pH 4.3)耐受性试验的存活率
Figure BDA0002773923180000111
实施例8：重组菌株的耐酸性稳定性试验
具体步骤如下：
1、将重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF在LB液体培养基中连续传代30次，细胞生长性能无明显变化，证明本发明提供的技术方案得到的菌株具有传代稳定性。
2、具体实施方式同实施例5-7，区别在于，调整重组菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF为步骤1得到的连续传代30次的菌株，对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a处理方式为：LB液体培养基中连续传代30次；结果为：
经衣康酸胁迫后，经耐受性实验分析，胁迫4h后，连续传代30次的菌株E.coliK12MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF的存活率分别为0.00186719、0.006460、0.00032193，同传代之前的菌株的存活率基本一致，分别是连续传代30次的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a存活率0.000071548的26.1、90.3、4.5倍；
经D-乳酸胁迫后，经耐受性实验分析，胁迫4h后，连续传代30次的菌株E.coliK12MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF的存活率分别为0.00008592、0.00032806和0.00029682，较传代之前的菌株的存活率有所提高，分别是连续传代30次的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a存活率0.000078115的1.1、4.2、3.8倍；
经琥珀酸胁迫后，经耐受性实验分析，胁迫4h后，连续传代30次的菌株E.coliK12MG1655/pTrc99a-PyrB、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrD、E.coli K12 MG1655/pTrc99a-PyrF存活率为0.0005427、0.00046517、0.0007236，同传代之前的菌株的存活率基本一致，分别是连续传代30次的对照菌株E.coli K12 MG1655/pTrc99a存活率0.00025843的2.1、1.8、2.8倍。
上述实施例证明了在E.coli K12 MG1655中过量表达PyrB、PyrD和PyrF蛋白，重组菌株对有机酸胁迫的耐受性提高，并且具有传代稳定性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用
<130> BAA200781A
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctaatc cgctatatca gaaacatatc atttccataa acgaccttag tcgcgatgac 60
cttaatctgg tgctggcgac agcggcgaaa ctgaaagcaa acccgcaacc agagctgttg 120
aagcacaaag tcattgccag ctgtttcttc gaagcctcta cccgtacccg cctctctttc 180
gaaacatcta tgcaccgcct gggggccagc gtggtgggct tctccgacag cgccaataca 240
tcactgggta aaaagggcga aacgctggcc gataccattt cggttatcag cacttacgtc 300
gatgcgatag tgatgcgtca tccgcaggaa ggtgcggcgc gcctggccac cgagttttcc 360
ggcaatgtac cggtactgaa tgccggtgat ggctccaacc aacatccgac gcaaaccttg 420
ctggacttat tcactattca ggaaacccag gggcgtctgg acaatctcca cgtcgcaatg 480
gttggtgacc tgaaatatgg ccgcaccgtt cactccctga ctcaggcgtt agcgaagttc 540
gacggcaacc gtttttactt catcgcgccg gacgcgctgg caatgccgca atacattctg 600
gatatgctcg atgaaaaagg gatcgcatgg agtctgcaca gctctattga agaagtgatg 660
gcggaagtag acatcctgta catgacccgc gtgcaaaaag agcgtctgga cccgtccgag 720
tacgccaacg tgaaagcgca gtttgttctt cgcgccagcg atctccacaa cgccaaagcc 780
aatatgaaag tgctgcatcc gctgccgcgt gttgatgaga ttgcgacgga tgttgataaa 840
acgccacacg cctggtactt ccagcaggca ggcaacggga ttttcgctcg ccaggcgtta 900
ctggcactgg ttctgaatcg cgatctggta ctgtaa 936
<210> 2
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtactacc ccttcgttcg taaagccctt ttccagctcg atccagagcg cgctcatgag 60
tttacttttc agcaattacg ccgtattaca ggaacgccgt ttgaagcact ggtgcggcag 120
aaagtgcctg cgaaacctgt taactgcatg ggcctgacgt ttaaaaatcc gcttggtctg 180
gcagccggtc ttgataaaga cggggagtgc attgacgcgt taggcgcgat gggatttgga 240
tcgatcgaga tcggtaccgt cacgccacgt ccacagccag gtaatgacaa gccgcgtctc 300
tttcgtctgg tagatgccga aggtttgatc aaccgtatgg gctttaataa tcttggcgtt 360
gataacctcg tagagaacgt aaaaaaggcc cattatgacg gcgtcctggg tattaacatc 420
ggcaaaaata aagatacgcc agtggagcag ggcaaagatg actatctgat ttgtatggaa 480
aaaatctatg cctatgcggg atatatcgcc atcaatattt catcgccgaa taccccagga 540
ttacgcacgc tgcaatatgg tgaagcgctg gatgatctct taaccgcgat taaaaataag 600
caaaatgatt tgcaagcgat gcaccataaa tatgtgccga tcgcagtgaa gatcgcgccg 660
gatctttctg aagaagaatt gatccaggtt gccgatagtt tagttcgcca taatattgat 720
ggcgttattg caaccaatac cacactcgat cgttctcttg ttcagggaat gaaaaattgc 780
gatcaaaccg gtggcttaag tggtcgtccg cttcagttaa aaagcaccga aattattcgc 840
cgcttgtcac tggaattaaa cggtcgctta ccgatcatcg gtgttggcgg catcgactcg 900
gttatcgctg cgcgtgaaaa gattgctgcg ggtgcctcac tggtgcaaat ttattctggt 960
tttattttta aaggtccgcc gctgattaaa gaaatcgtta cccatatcta a 1011
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgacgttaa ctgcttcatc ttcttcccgc gctgttacga attctcctgt ggttgttgcc 60
cttgattatc ataatcgtga tgacgcgctg gcctttgtcg acaagatcga cccacgcgat 120
tgtcgtctga aggtcggcaa agagatgttt acattgtttg ggccacagtt tgtgcgcgaa 180
cttcaacagc gtggttttga tatctttctt gacctgaaat tccacgatat ccccaacact 240
gcagcgcacg ctgtcgctgc tgcagctgac ttaggcgtgt ggatggtgaa tgttcatgcc 300
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gcaccgcttt tgattgctgt gacagtgttg accagcatgg aagccagcga cctggtcgat 420
cttggcatga cactgtcacc tgcagattat gcagaacgtc tggcggcact gacgcaaaaa 480
tgtggccttg atggtgtggt gtgttctgct caggaagctg tgcgctttaa acaggtattc 540
ggtcaggagt tcaaactggt tacgccgggc attcgtccgc aggggagtga agctggtgac 600
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggatcctcta gagtcgac 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaattccatg gtctgtttcc tg 22
<210> 12
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Ala Asn Pro Leu Tyr Gln Lys His Ile Ile Ser Ile Asn Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Asp Asp Leu Asn Leu Val Leu Ala Thr Ala Ala Lys Leu Lys
20 25 30
Ala Asn Pro Gln Pro Glu Leu Leu Lys His Lys Val Ile Ala Ser Cys
35 40 45
Phe Phe Glu Ala Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser Phe Glu Thr Ser Met
50 55 60
His Arg Leu Gly Ala Ser Val Val Gly Phe Ser Asp Ser Ala Asn Thr
65 70 75 80
Ser Leu Gly Lys Lys Gly Glu Thr Leu Ala Asp Thr Ile Ser Val Ile
85 90 95
Ser Thr Tyr Val Asp Ala Ile Val Met Arg His Pro Gln Glu Gly Ala
100 105 110
Ala Arg Leu Ala Thr Glu Phe Ser Gly Asn Val Pro Val Leu Asn Ala
115 120 125
Gly Asp Gly Ser Asn Gln His Pro Thr Gln Thr Leu Leu Asp Leu Phe
130 135 140
Thr Ile Gln Glu Thr Gln Gly Arg Leu Asp Asn Leu His Val Ala Met
145 150 155 160
Val Gly Asp Leu Lys Tyr Gly Arg Thr Val His Ser Leu Thr Gln Ala
165 170 175
Leu Ala Lys Phe Asp Gly Asn Arg Phe Tyr Phe Ile Ala Pro Asp Ala
180 185 190
Leu Ala Met Pro Gln Tyr Ile Leu Asp Met Leu Asp Glu Lys Gly Ile
195 200 205
Ala Trp Ser Leu His Ser Ser Ile Glu Glu Val Met Ala Glu Val Asp
210 215 220
Ile Leu Tyr Met Thr Arg Val Gln Lys Glu Arg Leu Asp Pro Ser Glu
225 230 235 240
Tyr Ala Asn Val Lys Ala Gln Phe Val Leu Arg Ala Ser Asp Leu His
245 250 255
Asn Ala Lys Ala Asn Met Lys Val Leu His Pro Leu Pro Arg Val Asp
260 265 270
Glu Ile Ala Thr Asp Val Asp Lys Thr Pro His Ala Trp Tyr Phe Gln
275 280 285
Gln Ala Gly Asn Gly Ile Phe Ala Arg Gln Ala Leu Leu Ala Leu Val
290 295 300
Leu Asn Arg Asp Leu Val Leu
305 310
<210> 13
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Tyr Tyr Pro Phe Val Arg Lys Ala Leu Phe Gln Leu Asp Pro Glu
1 5 10 15
Arg Ala His Glu Phe Thr Phe Gln Gln Leu Arg Arg Ile Thr Gly Thr
20 25 30
Pro Phe Glu Ala Leu Val Arg Gln Lys Val Pro Ala Lys Pro Val Asn
35 40 45
Cys Met Gly Leu Thr Phe Lys Asn Pro Leu Gly Leu Ala Ala Gly Leu
50 55 60
Asp Lys Asp Gly Glu Cys Ile Asp Ala Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly
65 70 75 80
Ser Ile Glu Ile Gly Thr Val Thr Pro Arg Pro Gln Pro Gly Asn Asp
85 90 95
Lys Pro Arg Leu Phe Arg Leu Val Asp Ala Glu Gly Leu Ile Asn Arg
100 105 110
Met Gly Phe Asn Asn Leu Gly Val Asp Asn Leu Val Glu Asn Val Lys
115 120 125
Lys Ala His Tyr Asp Gly Val Leu Gly Ile Asn Ile Gly Lys Asn Lys
130 135 140
Asp Thr Pro Val Glu Gln Gly Lys Asp Asp Tyr Leu Ile Cys Met Glu
145 150 155 160
Lys Ile Tyr Ala Tyr Ala Gly Tyr Ile Ala Ile Asn Ile Ser Ser Pro
165 170 175
Asn Thr Pro Gly Leu Arg Thr Leu Gln Tyr Gly Glu Ala Leu Asp Asp
180 185 190
Leu Leu Thr Ala Ile Lys Asn Lys Gln Asn Asp Leu Gln Ala Met His
195 200 205
His Lys Tyr Val Pro Ile Ala Val Lys Ile Ala Pro Asp Leu Ser Glu
210 215 220
Glu Glu Leu Ile Gln Val Ala Asp Ser Leu Val Arg His Asn Ile Asp
225 230 235 240
Gly Val Ile Ala Thr Asn Thr Thr Leu Asp Arg Ser Leu Val Gln Gly
245 250 255
Met Lys Asn Cys Asp Gln Thr Gly Gly Leu Ser Gly Arg Pro Leu Gln
260 265 270
Leu Lys Ser Thr Glu Ile Ile Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Asn Gly
275 280 285
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<213> 人工序列
<400> 14
Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Thr
1 5 10 15
Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Ala Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr
35 40 45
Gly Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Cys Cys Cys Thr Thr Gly
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Thr Cys Ala Thr Ala Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala
65 70 75 80
Thr Gly Ala Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Thr
85 90 95
Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala Cys Cys
100 105 110
Cys Ala Cys Gly Cys Gly Ala Thr Thr Gly Thr Cys Gly Thr Cys Thr
115 120 125
Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly
130 135 140
Ala Thr Gly Thr Thr Thr Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly
145 150 155 160
Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Gly Thr Thr Thr Gly Thr Gly Cys Gly
165 170 175
Cys Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Thr
180 185 190
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala Thr Cys Thr Thr Thr Cys
195 200 205
Thr Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys Ala
210 215 220
Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Thr
225 230 235 240
Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Gly
245 250 255
Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr
260 265 270
Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly
275 280 285
Ala Ala Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly
290 295 300
Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr
305 310 315 320
Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Gly
325 330 335
Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly
340 345 350
Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr
355 360 365
Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys Ala
370 375 380
Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly Gly
385 390 395 400
Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr
405 410 415
Cys Gly Ala Thr Cys Thr Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Cys Ala
420 425 430
Cys Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr
435 440 445
Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys
450 455 460
Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala
465 470 475 480
Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly
485 490 495
Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala
500 505 510
Gly Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr
515 520 525
Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Thr Ala Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys
530 535 540
Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr
545 550 555 560
Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Thr Thr Cys Gly Thr
565 570 575
Cys Cys Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly
580 585 590
Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Gly
595 600 605
Cys Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala
610 615 620
Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Thr Gly Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly
625 630 635 640
Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Gly Thr
645 650 655
Gly Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr Ala
660 665 670
Ala Cys Gly Cys Ala Ala Thr Cys Gly Gly Thr Ala Gly Ala Thr Cys
675 680 685
Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala
690 695 700
Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr
705 710 715 720
Thr Thr Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly Cys Ala Thr
725 730 735
Gly Ala

Claims (10)

1.一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，其特征在于，所述方法为在大肠杆菌中过量表达天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB、二氢乳清酸脱氢酶PyrD、Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，其特征在于，所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB、二氢乳清酸脱氢酶PyrD、Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。
3.如权利要求1或2所述的一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，其特征在于，所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，二氢乳清酸脱氢酶PyrD的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
4.如权利要求1-3任一所述的一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，其特征在于，所述过量表达为先将编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的基因、编码二氢乳清酸脱氢酶PyrD的基因或编码Orotidine-5'-磷酸脱羧酶PyrF的基因与表达载体连接，构建含有编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的基因、二氢乳清酸脱氢酶PyrD的基因或Orotidine-5'-磷酸脱羧酶PyrF的基因的重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中。
5.一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒，所述重组质粒为连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的基因、编码二氢乳清酸脱氢酶PyrD的基因、编码Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF的基因中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB、二氢乳清酸脱氢酶PyrD、Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF均来源于大肠杆菌E.coli K12 MG1655。
7.如权利要求5或6所述的一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，二氢乳清酸脱氢酶PyrD的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，Orotidine-5'-磷酸脱羧酶的PyrF的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
8.如权利要求5-7任一所述的一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述表达载体为pTrc99a。
9.权利要求5-8任一所述的一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌在发酵生产代谢产物中的应用，其特征在于，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。
10.一种抗酸胁迫元器件，其特征在于，所述元器件为携带核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的二氢乳清酸脱氢酶PyrD基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Orotidine-5'-磷酸脱羧酶蛋白PyrF基因中的一种或多种的表达载体。
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