CN113073074A - 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用，属于生物发酵技术领域，本发明通过敲除了编码purR的基因，敲低了编码glnR和tnrA的基因，并且采用过表达了来源于玻璃颤菌的血红蛋白，解除发酵过程中的溶氧限制，降低发酵过程中的能源消耗，提高核黄素产量；采用本发明构建的工程菌株RF1‑aPaGaTgV的核黄素产量在摇瓶阶段提高了50.78％，达到2.51g/L。在5‑L发酵水平，采用本发明构建的RF1‑aPaGaTgV的核黄素的最高产量提高了45.51％，达到10.71g/L。

Description

一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

核黄素(维生素B2)是维持人体正常生理代谢的营养元素，只能通过饮食获得。自然界中只有微生物和植物细胞具有合成核黄素的能力，而哺乳动物细胞缺乏相应的合成途径。核黄素在我们的日常生活中有着广泛的应用，可以作为食品添加剂、药品、保健品和化妆品原料等。近年来，微生物发酵生产核黄素在工业上已完全取代化学合成。发酵产生核黄素的微生物主要有Bacillus subtilis和Ashbya gossypii。此外，Candida flareri、E.coli和Lactobacillus plantarum也被用作合成核黄素底盘细胞，但这些菌株在工业生产中很少见到。

微生物细胞具有相似的核黄素合成途径，有两个重要的核黄素合成前体：核酮糖-5磷酸来自戊糖磷酸途径，鸟嘌呤(GTP)来自嘌呤途径。然后由rib基因编码的酶通过7步反应将两种前体转化为核黄素。枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌，是目前最具竞争力的核黄素生产菌株，已广泛用于工业核黄素生产。使用枯草芽孢杆菌生产核黄素的一个明显优势是，它被美国食品和药物管理局认定为GRAS(公认安全)菌株，并长期用于嘌呤核苷、肌苷和生产。枯草芽孢杆菌不能天然过度生产核黄素，是经过多轮育种和选择后获得这一优良性状。随后，通过启动子替换、基因敲除和外源表达等基因工程和代谢工程策略进一步提高工程菌株的产量。例如，基因purF、purM、purN、purH和purD过表达受强启动子P₄₃控制，导致工程菌株核黄素产量增加25％。此外，过表达突变体PurF显著增加核黄素前体鸟嘌呤的合成，并使核黄素的产量增加3倍。虽然目前的代谢工程方法已经大大提高了核黄素的产量，但要继续提高产量仍存在各种瓶颈。

而目前工业上采用生物法制备核黄素时，主要是采用基因工程菌进行发酵培养生产核黄素，并且，需要采用不断供氧的方式进行发酵，原因如下：大多数需氧生物代谢过程都以氧为电子受体。溶解氧是好氧微生物发酵过程中的一个重要参数，通常影响细胞的生长和代谢产物的合成。在发酵后期，溶解氧是限制好氧微生物生长和合成的主要因素，特别是高密度发酵。当外界氧气有限时，微生物可以利用另一种电子受体，即硝酸盐或亚硝酸盐，通过厌氧呼吸生长。缺氧导致低效的NADH和NADPH氧化，这是三羧酸(TCA)循环中产生ATP和低代谢流量的必要反应。能量转换效率低下会直接影响细胞增殖，导致细胞生长缓慢。为了克服这个问题，高密度发酵系统使用纯氧来补充或替代供气，为生长中的细菌提供足够的氧气。纯供氧将使液体培养中的氧传输率不再是一个限制因素。但这也对工业发酵提出了更高的要求，增加了消费成本。

例如公开号为CN102816823B的中国发明专利中公开了一种利用多阶段转速调控策略提高Bacillus subtilis发酵生产核黄素产量的方法；采用多阶段控制溶氧的策略提高核黄素的产量，但该方法在工业应用中操作繁琐，不易掌握调整转速的时间节点，对工业发酵的操作提出更高的要求，且无法进一步突破溶氧的限制。

尽管生物技术应用有许多优点，但对氧气的巨大需求已成为大规模生产的瓶颈。核黄素的合成过程需要大量的溶解氧，而溶解氧的水平是限制核黄素生产的重要因素。研究表明，溶解氧不足是核黄素合成的限制因素之一，溶解氧不足导致核黄素合成相关基因表达水平显著差异。因此，缓解溶氧对核黄素代谢的限制是提高核黄素产量的有效策略；而如何能够得到一株能够高效生产核黄素并且不需要采用高成本的供氧体系的基因工程菌成为研究的难点。

发明内容

技术问题：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够高效生产核黄素并且不需要采用高成本的供氧体系的基因工程菌，并且采用该基因工程菌生产核黄素，解除发酵过程中的溶氧限制，降低发酵过程中的能源消耗，提高核黄素产量。

技术方案：

为了解决上述技术问题，发明人课题组前期研究了核黄素生产菌株Bacillussubtilis RF1(公开于“Enhanced riboflavin production by recombinant Bacillussubtilis RF1 through the optimization of agitation speed”论文当中)在不同溶氧条件下表现出明显的生长及核黄素合成差异。在5-L生物反应器上进行补料分批发酵，模拟溶解氧对核黄素生产的影响。结果显示，接种6h后，细胞处于生长适应期，生长缓慢，同时核黄素合成率很低。12h后，细胞进入指数期，葡萄糖消耗显著增加。然后通过降低生物反应器的搅拌速度模拟缺氧环境，分析溶解氧对细胞代谢调控的影响。降低溶解氧后，细胞生长明显慢于高溶解氧条件。可见，溶解氧对于核黄素的生产影响很大。

因此，本发明以提高溶氧利用率为策略，通过降低purR表达水平解除嘌呤代谢抑制，降低氮代谢调控基因tnrA和glnR表达水平提高核黄素产量，并且动态调控血红蛋白基因vgb表达水平，以提高溶氧利用率。

为此，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌敲除了编码purR的基因(编码嘌呤生物合成操纵子的转录调控因子)，通过P₄₃启动子表达了glnR基因的反转录基因(氮代谢转录调节因子)和tnrA基因的反转录基因(氮敏感转录调节因子)，并且过表达了来源于玻璃颤菌的血红蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌采用启动子P_glnR强化表达编码血红蛋白的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为核黄素生产菌株RF1。

在本发明的一种实施方式中，所述编码purR的基因如SEQ ID NO.1所示；所述编码glnR的基因如SEQ ID NO.2所示；所述编码tnrA的基因如SEQ ID NO.3所示；所述血红蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明一种实施方式中，编码所述血红蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_glnR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，以连接了链丝菌素乙酰基转移酶基因的质粒pMA5-sat为表达载体(构建方法公开于程毅鹏等“一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用”论文中)。

本发明还提供了一种合成核黄素的方法，所述方法为，将上述基因工程菌发酵制备核黄素。

在本发明的一种实施方式中，将上述基因工程菌添加至种子培养基中，得到种子液，将种子液添加至发酵培养基中，发酵制备核黄素。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液在发酵培养基中的添加量至少为10％(v/v)。

在本发明的一种实施方式中，将上述基因工程菌添加至种子培养基中，在37℃，180rpm，培养24h。

在本发明的一种实施方式中，将种子液添加至发酵培养基中进行培养，在41℃，180rpm，培养24h。

本发明还提供了上述基因工程菌在制备含有核黄素产品中的应用。

有益效果

(1)本发明通过不同溶氧条件的转录组分析，揭示溶氧影响枯草芽孢杆菌嘌呤代谢及氮代谢。本发明通过敲除了编码purR的基因，解除嘌呤抑制因子PurR对嘌呤合成的抑制，使核黄素的产量提高16.21％；通过敲低基因tnrA和glnR的表达水平，使核黄素产量分别提高12.05％和23.37％，达到1.76g/L和2.02g/L。通过采用启动子P_glnR过表达vhb得到的工程菌株RF1-gV的核黄素产量比采用启动子P₄₃过表达vhb得到的RF1-v提高了18.62％，并且，比原始菌株RF1/pMA5-sat提高了38.42％，达到2.31g/L。

(2)在摇瓶发酵水平，采用本发明构建的敲除了编码purR的基因，敲低了编码glnR和tnrA的基因，并且过表达了来源于玻璃颤菌的血红蛋白构建得到的工程菌株RF1-aPaGaTgV的核黄素产量提高了50.78％，达到2.51g/L。

(3)在5-L发酵水平，采用本发明构建的RF1-aPaGaTgV的核黄素的最高产量提高了45.51％，达到10.71g/L。本发明在相同的溶氧条件下，显著提高核黄素的产量，有效缓解了溶氧对核黄素生产的限制。

附图说明

图1：摇瓶水平鉴定重组基因工程菌株RF1-aP的核黄素产量。

图2：摇瓶水平鉴定重组基因工程菌株RF1-V和RF1-gV的核黄素产量。

图3：摇瓶水平鉴定重组基因工程菌株RF1-aPaGaTgV的核黄素产量。

图4：5L发酵罐水平上鉴定重组基因工程菌株RF1-aPaGaTgV的核黄素产量。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。

LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl。

摇瓶发酵培养基：20g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，4g/L柠檬酸铵，1g/L K₂HPO₄，1g/LKH₂PO₄，2g/L MgSO₄·7H₂O，0.04g/L MnCl₂，0.06g/L CaCl₂，2g/L CuSO₄，pH 6.8。

种子培养基：40g/L葡萄糖、5g/L酵母膏、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl和10μg/m L氯霉素。

分批补料发酵培养基：20g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，6g/L(NH₄)₂HPO₄，5g/L K₂HPO₄，1.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.03g/L ZnSO₄·7H₂O，0.05g/L MnCl₂，0.02g/L FeSO₄·7H₂O。

补料培养基：600g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，6g/L(NH₄)₂HPO₄，5g/L K₂HPO₄，0.5g/LMgSO₄·7H₂O。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

用分光光度计监测OD600nm下细胞的生长。

将制备得到的发酵液用0.01M NaOH稀释，然后在12000rpm下离心2min，取上清液测定核黄素浓度。将上清液转移到新的EP管中，并稀释至合适的浓度范围(0.3-0.8)，使用分光光度计在OD₄₄₄nm处测量吸光度值。核黄素浓度根据核黄素浓度标准曲线计算。按照核黄素标准曲线计算公式为：OD₄₄₄*稀释倍数*30/1000。

使用Glucose analysis(Model-SBA40,Shandong,China)测量葡萄糖浓度。

下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：

表1引物序列

实施例1：工程菌株RF1-aP的构建

利用同源重组的方式将基因purR从基因组上敲除，解除细胞内的嘌呤代谢阻遏。

具体步骤如下：

(1)按照表1的引物序列扩增基因purR上游同源臂(1000bp)和下游同源臂(1000bp)，并通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并切胶回收目的PCR产物。然后将同源臂与敲除Marker通过融合PCR的策略进行融合。首先将上下游片段按体积比1:1混合，加入等体积的PCR酶进行融合PCR反应，条件为98℃3min，98℃8s,61℃5s,72℃2min,扩增13个循环，以该步反应后的产物为模板，使用引物purR-q-F1和purR-q-R3扩增融合片段，反应条件为：98℃3min，98℃10s,58℃15s,72℃1min，扩增34个循环。将PCR产物纯化回收用于敲除反应，融合后的片段含有博来霉素抗性基因和lox66-lox71重组位点，便于后期敲除菌株的筛选和抗性基因的消除。

(2)将得到的融合PCR产物利用化转的方法化转至Bacillus subtilis RF1中，并涂布在含有30μg/mL博来霉素的LB固体培养基，37℃培养12h，LB固体培养基上生长的菌株使用菌落PCR方法验证敲除是否成功，验证引物使用purR-q-F1和purR-q-R3,PCR反应条件为95℃3min，95℃30s,60℃30s,72℃1min，扩增30个循环。

(3)将pDG148质粒化转至步骤(2)制备得到的正确的工程菌株中，180rpm,37℃震荡培养24h,然后取部分培养液涂布于LB固体培养基上，37℃培养12h,用无菌牙签将LB固体培养基上的菌落一一对应点到另一块含有30μg/mL博来霉素的LB固体培养基上，37℃培养培养12h，在LB平板上可以生长，而在含有30μg/mL博来霉素LB固体培养基上无法生长的菌落为消除博来霉素抗性的敲除菌株。将得到的敲除菌株在180rpm,42℃震荡培养24h用来消除pDG148质粒。将部分培养液涂布于LB固体培养基上，然后37℃培养培养12h后，用无菌牙签将LB平板上的菌落一一对应点到另一块含有氨苄青霉素的抗性平板上，37℃培养培养12h，在LB平板上可以生长，而在含有30μg/mL博来霉素LB固体培养基上无法生长的菌落为消除质pDG148粒的敲除菌株。最后得到的菌株为无痕敲除的目的菌株RF1-aP。

实施例2：工程菌株RF1-aG和RF1-aT的构建

将基因glnR和tnrA的反义链在强启动子P₄₃控制下过表达，该反义RNA与细胞内正常表达的基因glnR和tnrA的mRNA互补配对，从而阻止GlnR和TnrA的正常翻译，调控细胞内的氮代谢水平。通过反义RNA策略抑制glnR和tnrA基因的翻译。利用启动子P₄₃控制基因glnR和tnrA的反义RNA，构建工程菌株RF1-aG和RF1-aT。

具体步骤如下：

1、基因工程菌株RF1-aG的制备

(1)利用引物P₄₃-AntiglnR-F1和P₄₃-AntiglnR-R1扩增基因P₄₃，引物P₄₃-AntiglnR-F2和P₄₃-AntiglnR-R2扩增基因glnR,将目的片段通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，然后将目的片段按照体积比1：1混合，混合后的片段加入PCR酶进行反应，条件为98℃3min，98℃8s,61℃5s,72℃2min,扩增13个循环，以该步反应后的产物为模板，使用引物P₄₃-AntiglnR-F1和P₄₃-AntiglnR-R2扩增融合片段，反应条件为：98℃3min，98℃10s,58℃15s,72℃1min，扩增34个循环，将PCR产物回收后保存备用，该步反应将P₄₃启动子与基因glnR的3’端连接，构成反向转录基因glnR的结构。将质粒pMA5-sat使用限制性内切酶HindIII和EcoRI在37℃处理30min并纯化回收，然后将融合的PCR产物与质粒pMA5-sat的酶切产物通过同源重组连接酶连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态中，37℃培养16h，并通过菌落PCR筛选正确转化子，PCR反应条件：95℃3min，95℃30s,60℃30s,72℃1min，扩增30个循环。

(2)将步骤(1)测序正确的重组质粒通过化转的方式转到枯草芽孢杆菌RF1中，构建得到反向转录glnR基因的基因工程菌株RF1-aG。

2、基因工程菌株RF1-aT的制备

具体实施方式同步骤1，区别在于，引物是P₄₃-AntitnrA-F1和P₄₃-AntitnrA-R1，P₄₃-AntitnrA-F2和P₄₃-AntitnrA-R2，构建得到反向转录tnrA基因的工程菌株RF1-aG。

实施例3：工程菌株RF1-gV的构建

在工业微生物代谢修饰过程中，玻璃颤菌血红蛋白(VHb)常用于缓解发酵过程中溶解氧限制，提高目标产物的产量。为了避免外源基因过表达对细胞造成的负担和氧化应激对细胞的损伤，采用动态调控策略控制基因vgb的表达。

具体步骤如下：

(1)用引物P_glnR-gfp-F1和P_glnR-gfp-R1扩增基因glnR的启动子序列并回收纯化，然后引物P_glnR-gfp-F2和P_glnR-gfp-R2扩增的基因gfp序列并回收纯化，将上述的两个片段按体积比1:1混合，然后加入PCR酶进行重叠PCR反应，反应条件为98℃3min，98℃8s,61℃5s,72℃2min,扩增13个循环。以重叠PCR反应产物为模板扩增融合片段，反应条件为：98℃3min，98℃10s,58℃15s,72℃1min，扩增34个循环，将PCR产物回收后保存备用。将质粒pMA5使用限制性内切酶HindIII和EcoRI在37℃处理30min并纯化回收，然后将融合的PCR产物与质粒pMA5的酶切产物通过同源重组酶连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态中，37℃培养16h，并通过菌落PCR筛选正确转化子，PCR反应条件：95℃3min，95℃30s,60℃30s,72℃1min，扩增30个循环。

将得到的转化子提取质粒并通过化转的方式转到枯草芽孢杆菌168中，得到报告菌株P_glnR-GFP，用于表征基因glnR启动子强度用于后续实验。

利用引物P₄₃-GFP-F1和P₄₃-GFP-R1扩增启动子P₄₃序列，得到305bp的产物，利用引物P₄₃-GFP-F2和P₄₃-GFP-R2扩增基因gfp，得到736bp序列，按照构建报告菌株P_glnR-GFP的构建方法构建工程菌株P₄₃-GFP，该菌株为对照质粒，用于表征报告菌株基因P_glnR-GFP的荧光值变化。将报告菌株P_glnR-GFP和P₄₃-GFP接种在5mL的LB液体培养基中，180rpm,37℃震荡培养24h，然后按照体积1％的转接量接种到含有4％葡萄糖的LB液体培养基中，180rpm,37℃震荡，并在4h，8h，12h，16h，20h分别取样测定荧光值，荧光值测定使用多功能酶标仪在激发波长488nm和发射波长523nm条件下测定，并计算相对值(P_glnR-GFP/P₄₃-GFP)结果如表2所示：

表2不同启动子的荧光值

经荧光值测定分析启动子P_glnR对溶氧敏感且表达量高，因此选该启动子调控基因vgb表达。

(2)在发酵过程中，随着细胞密度的增加，基因tnrA和glnR的表达量逐渐增加。发酵20h后，基因glnR的启动子表达量增加了11.07倍在发酵前期，启动子P_glnR的表达强度与启动子P₄₃的表达强度相似，而在发酵后期，启动子P_glnR的表达强度是启动子P₄₃的10.5倍。因此，可以利用启动子P_glnR控制基因vgb的表达，构建工程菌株RF1-gV。

(3)利用引物P_glnR-vgb-F1和P_glnR-vgb-R1扩增基因glnR启动子P_glnR，引物P_glnR-vgb-F2和P_glnR-vgb-R2扩增vgb，将上述的两个片段按体积比1:1混合，然后加入PCR酶进行重叠PCR反应，反应条件为98℃3min，98℃8s,61℃5s,72℃2min,扩增13个循环。以重叠PCR反应产物为模板扩增融合片段，反应条件为：98℃3min，98℃10s,58℃15s,72℃1min，扩增34个循环，将PCR产物回收后保存备用。将质粒pMA5-sat使用限制性内切酶HindIII和EcoRI在37℃处理30min并纯化回收，然后将融合的PCR产物与质粒pMA5-sat的酶切产物通过同源重组酶连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态中，37℃培养16h，并通过菌落PCR筛选正确转化子，PCR反应条件：95℃3min，95℃30s,60℃30s,72℃1min，扩增30个循环。

将菌落PCR验证正确的大肠杆菌转化子提取质粒，并将质粒转化至Bacillussubtilis RF1中，得到工程菌株RF1-gV。

作为对照，将原始质粒pMA5-sat转至草芽孢杆菌RF1中，构建RF1/pMA5-sat；

同时，按照上述的实施方法，将启动子P₄₃与基因vgb融合，工程菌株RF1-V，该工程菌株在启动子P₄₃控制下过表达基因veg。

实施例4：基因工程菌株RF1-aPaGaTgV的构建

在RF1中，敲除基因purR及强启动子控制基因glnR和tnrA的反义链，构建工程菌株，通过过表达反义RNA敲低基因的表达水平，以提高核黄素产量。将P_glnR控制表达的VHb基因进行组合，最终得到工程菌株RF1-aPaGaTgV

具体步骤如下：

(1)使用引物P₄₃-aGaT-F和P₄₃-aGaT-R扩增P₄₃控制的基因glnR反义链，并连于质粒pMA5-sat，制备得到pMA5-sat-glnR反义链；

(2)以实施例3中RF1-gV为模板，使用引物vgb-tnrA-F1和vgb-tnrA-R1扩增片段P_glnR-vgb，将扩增片段纯化回收。以实施例2-2中RF1-aT为模板，使用vgb-tnrA-F2和vgb-tnrA-R2扩增P₄₃-antitnrA片段，将扩增的片段纯化回收。然后将片段P_glnR-vgb和P₄₃-antitnrA通过融合PCR方法进行融合，PCR反应条件：反应条件为98℃3min，98℃8s,61℃5s,72℃2min,扩增13个循环。以重叠PCR反应产物为模板扩增融合片段，反应条件为：98℃3min，98℃10s,58℃15s,72℃2min，扩增34个循环，将PCR产物回收后保存备用。将融合的片段连于连于步骤(1)制备得到的重组质粒pMA5-sat-glnR质粒上，将构建的重组质粒导入实施例1制备得到的菌株RF-aP中，构建工程菌株RF1-aPaGaTgV

实施例5：摇瓶阶段采用基因工程菌株发酵生产核黄素

分别采用实施例1～4制备得到的菌株发酵生产核黄素，具体步骤如下：

分别将实施例1～4制备得到的基因工程菌添加至含有4％葡萄糖的LB液体培养基中，在180rpm，41℃条件下反应16时间，制备得到种子液；

分别将上述种子液按照10％(v/v)的比例添加至摇瓶发酵培养基中，使用250mL挡板三角形，培养基为50mL，在41℃，200rpm培养48h，制备得到发酵液，分别检测发酵液中核黄素的产量，结果如表3所示：

表3：不同基因工程菌生产核黄素

同时，检测细胞生长过程中的生物量，结果如表4所示：

表4：不同基因工程菌株在发酵48h的生物量

结果表明：(1)在高溶解氧条件下，RF1-aP的核黄素产量提高了16.21％(图1所示)。因此，PurR直接参与了溶解氧对核黄素合成的影响。

(2)工程菌RF1-aG和RF1-aT在摇瓶发酵过程中核黄素浓度显著提高至1.76g/L和2.02g/L，比RF1/pMA5-sat分别提高了12.05％和23.37％(图2所示)。

这些结果表明，氮代谢可能参与核黄素的合成和低溶解氧条件下细胞的生理代谢。

摇瓶发酵结果表明，工程菌株RF1-gV的核黄素产量比RF1-v提高了18.62％，比原始菌株RF1/pMA5-sat提高了38.42％，达到2.31g/L(图2所示)。

与此同时，工程菌株RF1-gV的生物量比RF1/pMA5-sat和RF1-V分别提高了29.42％和14.31％(图2所示)。

以上结果表明，提高细胞氧利用效率可以显著提高核黄素的产量和细胞的生长。

(4)菌株RF1-aPaGaT产生的核黄素为2.28g/L，比原菌株RF1/pMA5-sat提高了36.73％。然而，最大生物量与起始菌株没有显著差异。

另外，将启动子P_glnR控制的基因vgb在RF1-aPaGaT中表达，构建工程菌株RF1-aPaGaTgV。摇瓶发酵结果表明，与RF1/pMA5-sat相比，工程菌株的核黄素产量提高了50.78％，达到2.51g/L，最大生物量提高了15.34％(图3)。

实施例6：发酵罐水平采用基因工程菌株发酵生产核黄素

具体步骤如下：

(1)分别将在10mL LB液体培养基中培养24h的枯草芽孢杆菌菌株RF1-aPaGaTgV、RF1按照体积比3％的接种量接种到100mL种子培养基中，种子培养基包括20g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，4g/L柠檬酸铵，1g/L K₂HPO₄，1g/L KH₂PO₄，2g/L MgSO₄·7H₂O，0.04g/LMnCl₂，0.06g/L CaCl₂，2g/L CuSO₄，温度为41℃，转速为180rpm，培养16h后，制备得到种子液；

(2)将制备得到的100mL种子液全部接种到含有1900mL的发酵培养基的5L发酵罐中，进行分批补料发酵。

通过控制补料培养基流量，使发酵液中的剩余葡萄糖浓度保持在不低于5g/L。发酵过程中，发酵液pH为6.8，加1M H₂SO₄和50％氨水。在开始分批进料前，转速保持在400rpm，然后提高到800rpm直到发酵结束，温度始终保持在41℃。

结果显示：采用基因工程菌RF1-aPaGaTgV在发酵罐水平生产核黄素，测定了RF1和RF1-aPaGaTgV在5-L补料分批发酵过程中取样测定黄素产量，并绘制发酵过程曲线。结果如表5所示：

表5：不同菌株在发酵过程中的核黄素的产量

时间	0h	6h	12h	18h	24h	30h	36h	42h	48h
										RF1	0.0983	0.1753	1.268	2.472	4.29	5.65	6.67	6.99	7.36
RF1-aPaGaTgV	0.09694	0.0878	0.688	1.8	3.995	6.245	8.5	9.98	10.71

发酵结果表明，核黄素的最高产量提高了45.51％，达到10.71g/L(如图4所示)。同时,增强了细胞生长代谢工程的基因,和最大细胞生长速率达到2.53μ·h,RF1相比提高了18.34％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用

<130> BAA210143A

<160> 6

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<210> 1

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagtttc gtcgcagcgg cagattggtg gacttaacaa attatttgtt aacccatccg 60

cacgagttaa taccgctaac ctttttctct gagcggtatg aatctgcaaa atcatcgatc 120

agtgaagatt taacaattat taaacaaacc tttgaacagc aggggattgg tactttgctt 180

actgttcccg gagctgccgg aggcgttaaa tatattccga aaatgaagca ggctgaagct 240

gaagagtttg tgcagacact tggacagtcg ctggcaaatc ctgagcgtat ccttccgggc 300

ggttatgtat atttaacgga tatcttagga aagccatctg tactctccaa ggtagggaag 360

ctgtttgctt ccgtgtttgc agagcgcgaa attgatgttg tcatgaccgt tgccacgaaa 420

ggcatccctc ttgcgtacgc agctgcaagc tatttgaatg tgcctgttgt gatcgttcgt 480

aaagacaata aggtaacaga gggctccaca gtcagcatta attacgtttc aggctcctca 540

aaccgcattc aaacaatgtc acttgcgaaa agaagcatga aaacgggttc aaacgtactc 600

attattgatg actttatgaa agcaggcggc accattaatg gtatgattaa cctgttggat 660

gagtttaacg caaatgtggc gggaatcggc gtcttagttg aagccgaagg agtagatgaa 720

cgtcttgttg acgaatatat gtcacttctt actctttcaa ccatcaacat gaaagagaag 780

tccattgaaa ttcagaatgg caattttctg cgttttttta aagacaatct tttaaagaat 840

ggagagacag aatcatga 858

<210> 2

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtgata atattcgccg ctcaatgcct ttatttccaa taggaattgt catgcagtta 60

actgagttat cagcaagaca aattcgatat tatgaggaaa atggactgat atttccagcc 120

agaagtgaag gaaatagacg attattttca tttcatgatg tagataaact gttagaaatc 180

aagcacctga tagaacaagg tgtaaacatg gcaggaatta aacagattct ggcgaaagcc 240

gaagccgagc cagaacaaaa acaaaacgag aagacgaaaa aaccaatgaa acatgatctg 300

tccgatgacg aactgagaca gctcctgaaa aacgagctca tgcaagccgg ccgttttcaa 360

agagggaata cattccgtca aggcgacatg tcccgcttct ttcattaa 408

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaccacag aagatcattc ttataaagac aaaaaagtga tttcaatcgg aattgtgagt 60

gaattgacag gattgtccgt aagacagatc aggtattatg aggaacgaaa gctcatttac 120

ccgcagcgtt cttcaagggg gacaagaaaa tactcctttg ccgatgtgga gcggctgatg 180

gatatcgcca ataagcgtga agacggcgta cagacggcag agattttaaa ggatatgcgc 240

aaaaaagaac agatgttaaa aaacgatccg caagtgcgga aaaaaatgct ggaggggcag 300

cttaatgctc actttcggta caaaaaccgt taa 333

<210> 4

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60

ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120

cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180

gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240

attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 300

gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 360

gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg 420

tacgctcaag cggttgaata a 441

<210> 5

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccgttgagt tttctgacag agaaaagatg attgcttttt gccaggctat tcaatttgca 60

tcgccaatca atgctcatgt gacgccttat ccagcctaca tgcctggata cgaggatgat 120

gtcattatgg cagcagggac gtttattcaa ggagcaagca tcgaattatc agctgatggc 180

cctatccgcc cgccgtatgt agcgtatgtt cagggaggat taacctattc gcatgtgaag 240

aatgccatat gcagtgcagt ggattcattg atgcaaaagc aattaattta aattttttaa 300

aaatttctct ggatttgatg ttaagaatcc ttacatcgta ttgacacata atataacatc 360

acctataatg aaactaagtt aagaaaagga ggaaattgag 400

<210> 6

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

20 25 30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

85 90 95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

115 120 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

130 135 140

Val Glu

145

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其特征在于，敲除了编码purR的基因，通过P₄₃启动子表达了glnR基因的反转录基因和tnrA基因的反转录基因，并且过表达了来源于玻璃颤菌的血红蛋白。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还采用启动子P_glnR强化表达了编码血红蛋白的基因。

3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主细胞。

4.如权利要求1～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，编码purR的基因如SEQ IDNO.1所示；编码glnR的基因如SEQ ID NO.2所示；编码tnrA的基因如SEQ ID NO.3所示；所述血红蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.如权利要求2～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述启动子P_glnR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.如权利要求1～5任一所述的基因工程菌，其特征在于，以连接了链丝菌素乙酰基转移酶基因的质粒pMA5-sat为表达载体。

7.一种合成核黄素的方法，其特征在于，采用权利要求1～6任一所述的基因工程菌发酵制备核黄素。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将基因工程菌添加至种子培养基中，得到种子液，将种子液按照至少10％的接种量添加至发酵培养基中，发酵制备核黄素。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将种子液添加至发酵培养基中进行培养，在38～42℃，160～200rpm，培养22～26h。

10.权利要求1～6任一所述的基因工程菌在制备含有核黄素产品中的应用。

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