CN110591990A - 一株高产核黄素工程菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核黄素工程菌及其构建方法，其保藏编号为：CGMCC NO.16132。通过基因工程手段构建核黄素营养缺陷型菌株，随后染色体整合表达解淀粉芽孢杆菌解调的核黄素操纵子，恢复了菌株的核黄素生产能力，并通过表达载体过表达枯草芽孢杆菌解调的核黄素操纵子，提高了菌株的核黄素生产能力，此外点突变ribC基因，减弱了核黄素的分解代谢，最后将染色体上负责同源重组及DNA修复的recA基因插入失活，构建一株核黄素生产底盘细胞。在此基础之上，结合核黄素是天然荧光物质的特性，通过液滴微流控筛选出核黄素高产菌株。本发明还公开了枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法，以及高产核黄素菌株在生产核黄素中的应用和高产核黄素菌株在医药、食品、饲料中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株核黄素工程菌及其生产核黄素的方法。
背景技术
核黄素又名维生素B2，是一种水溶性B族维生素，大多数微生物和植物可自主合成，而人和动物只能从食物中摄取。核黄素在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，它作为黄素蛋白的辅酶或辅基参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，是维持机体正常代谢和生理功能所必需的营养素。核黄素被广泛应用于医药、食品和饲料等领域，由于核黄素的广泛用途，国内外对核黄素的需求量仍呈现日益增加的趋势。
微生物发酵是工业化生产核黄素的主要方法，具有成本低、环境污染小、生产周期短、产品纯度较高等优点。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有可靠的生物安全性，这对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。传统诱变育种发现，枯草芽孢杆菌突变株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力。枯草芽孢杆菌作为重要的模式菌，相关的基因工程技术和遗传转化方法都比较成熟，有利于通过理性代谢工程及系统生物学手段选育核黄素高产菌株。
在枯草芽孢杆菌中，需要经过由磷酸戊糖途径、嘌呤合成途径、核黄素合成途径催化的二十多步反应才能将葡萄糖转化为核黄素，整个反应过程需要多种来自不同代谢通路的前体物质(如：5-磷酸核酮糖、GTP、谷氨酰胺、甘氨酸、天冬氨酸等)的参与，且嘌呤合成途径及核黄素合成途径存在复杂的调控机制，包括多种转录起始阻遏机制、前导mRNA转录的衰减机制和酶水平的反馈抑制作用，这些都提高了菌株的改造难度。近年来，虽然通过代谢工程改造获得了许多高产核黄素的枯草芽孢杆菌基因工程菌，但由于我们对微生物生理及复杂代谢网络调控机制了解的局限性，运用基因工程技术对菌株继续进行理性改造，很难再获得核黄素产量进一步大幅度提升的菌株；而传统的诱变育种，工作量大、缺乏高效、快速的筛选方法，使得枯草芽孢杆菌在提高核黄素生产能力上受到很大程度的限制。
液滴微流控技术近年来在微生物领域受到较多关注，其最主要的优势就在于每一个形态稳定的液滴均可视为独立的微反应器，可以对单细胞进行包裹和分析，其速度快、通量大、能够创造独立内环境的特性，已经应用于细胞和酶的定向进化、高通量分选等领域。核黄素是天然的荧光物质，微流控分选系统特有的功能单元，使得对液滴中核黄素荧光强度的鉴别以及高荧光信号液滴的分离操作成为可能。
发明内容
由于我们对微生物生理及复杂代谢网络调控机制了解的局限性，运用传统的基因工程或诱变育种策略并不总是能得到我们所预期的高产菌株，与单纯的理性代谢工程改造或随机诱变育种相比，理性设计结合诱变育种及高通量筛选往往能够更加高效的获得高产目的产物的突变株。
本发明的目的在于提供一株高产核黄素工程菌株及其发酵生产核黄素的方法。本发明首先通过理性代谢工程改造的方法获得产核黄素的底盘细胞，包括：在出发菌株Bacillus subtilis168的染色体上整合表达解淀粉芽孢杆菌解调的核黄素操纵子，pGMBsub04过表达解调的枯草芽孢杆菌核黄素操纵子，点突变ribC基因，插入失活recA基因等。随后，在底盘细胞的基础上，通过诱变育种结合液滴微流控高通量分选技术，成功选育出一株高产核黄素的突变株。最后，阐述了突变株发酵生产核黄素的方法。
第一方面，本发明提供了一株高产核黄素工程菌，该菌株已于2018年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.16132。
第二方面，本发明提供了一种高产核黄素工程菌的构建方法，其包括如下步骤：
(1)在出发菌株的染色体上整合表达解淀粉芽孢杆菌解调的核黄素操纵子，质粒上过表达解调的枯草芽孢杆菌核黄素操纵子，点突变ribC基因以减少核黄素分解代谢，失活recA基因，获得产核黄素的底盘细胞；
(2)对步骤(1)的底盘细胞进行诱变处理；
(3)筛选获得较底盘细胞核黄素产量提高的菌株。
其中，所述步骤(1)中的出发菌株为枯草芽孢杆菌，优选为Bacillus subtilis168；所述步骤(1)中的质粒为芽孢杆菌常用表达质粒，优选为pGMBsub04。
优选地，所述步骤(2)中的诱变处理为化学诱变或物理诱变，优选为物理诱变，进一步优选为ARTP诱变。
优选地，所述步骤(3)中的筛选所用方法为高通量筛选，优选为采用液滴微流控进行高通量筛选；
优选地，所述步骤(3)中核黄素产量提高的菌株为突变株CGMCC NO.16132。
第三方面，本发明提供了一种生产核黄素的方法，其包括如下步骤：
(1)在一定温度条件下培养权利要求1所述工程菌，以获得单菌落；
(2)步骤(1)中的单菌落接种斜面，在一定温度条件下培养一定时间；
(3)刮取步骤(2)中斜面上的一定量的菌苔接种发酵培养基并振荡培养一定时间获得发酵液；
(4)离心收集步骤(3)中的发酵液，可见分光光度计检测核黄素。
其中，所述步骤(1)的一定温度为30-40℃，优选为37℃；
优选地，所述步骤(2)中的一定温度为30-40℃，优选为37℃，培养一定时间的时间为36-60h，优选为48h；
优选地，所述步骤(3)中一定量的菌苔为1/3斜面的菌苔，振荡培养时的转速为180-220rpm，优选为200rpm，振荡培养一定时间的时间为36-48h，优选为41h。
第四方面，本发明提供了权利要求1所述的工程菌在生产核黄素中的应用。
第五方面，本发明提供了权利要求1所述的工程菌在饲料、医药、食品中的应用。
附图说明
图1.液滴微流控检测不同浓度的核黄素标品与荧光强度的关系
图2.致死率曲线
图3.酶标仪检测核黄素浓度的标准曲线
图4.突变株96深孔板发酵初筛柱状图
图5.突变株96深孔板发酵复筛柱状图
图6.突变株摇瓶发酵柱状图
具体实施方式
本发明的实施方案已公开如下，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：构建用于高通量筛选的核黄素生产底盘细胞
(1)构建核黄素营养缺陷型菌株
以Bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物UPrib-F、UPrib-R扩增UPrib片段，用引物DNrib-F、DNrib-R扩增DNrib片段；以pC194质粒为模板，用引物cat-F、cat-R扩增带接头的cat片段。UPrib片段、cat片段和DNrib片段通过融合PCR组装成rib-UCD片段。将rib-UCD片段Spizizen转化Bacillus subtilis 168，获得核黄素营养缺陷型菌株BS168△rib。
(2)构建核黄素操纵子回复菌株
以Bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物UPrib-F、UPrib-R扩增UPrib片段，用引物DNrib-F、DNrib-R扩增DNrib片段；以Bacillus amyloliquefaciens strainSRCM101267染色体为模板，用引物rib-F、rib-R扩增带接头的解淀粉芽孢杆菌解调的核黄素操纵子片段rib。UPrib片段、rib片段和DNrib片段通过融合PCR组装成UribD片段。将UribD片段Spizizen转化BS168△rib，获得核黄素操纵子回复菌株BS168 rib。
(3)构建过表达核黄素操纵子的菌株
将实验室保存的，含有枯草芽孢杆菌解调的核黄素操纵子的质粒pGMBsub04(GenBank：LT622643.1)经Spizizen转化BS168 rib，获得核黄素生产能力提高的菌株BS168rib+。
(4)构建核黄素分解代谢途径减弱的菌株
以Bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物UParaR-F、UParaR-R扩增UParaR片段，用引物Para-F、Para-R扩增带接头的Para片段，用引物DNaraR-F、DNaraR-R扩增带接头的DNaraR片段；以pMA5质粒为模板，用引物neo-F、neo-R扩增neo片段。UParaR片段、Para片段、neo片段和DNaraR片段通过融合PCR组装成UND片段。将UND片段Spizizen转化BS168rib+，获得用于点突变ribC基因的负筛选菌株BS168△araR。以Bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物UPribC-F、UPribC-R(含DR)扩增带接头的UPribC(含DR)片段，用引物araR-F、araR-R(含DR)扩增带接头的araR(含DR)片段；以pC194质粒为模板，用引物catR-F、catR-R扩增带接头的catR片段；以Bacillus subtilis 24染色体为模板，用引物ribCm-F、ribCm-R扩增ribCm片段。UPribC片段、catR片段、araR片段和ribCm片段通过融合PCR组装成UCR-ribCm片段。将UCR-ribCm片段Spizizen转化BS168△araR，获得ribC基因带有点突变的中间菌株BS168UCR-ribCm，随后该菌株通过DR片段发生染色体内部同源重组，获得了去掉筛选标记catR-araR且ribC基因带有点突变的核黄素分解代谢途径减弱的菌株BS168ribCm。
(5)构建高通量筛选核黄素的底盘细胞
以Bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物UPrecA-F、UPrecA-R扩增UPrecA片段，用引物DNrecA-F、DNrecA-R扩增DNrecA片段；以pC194质粒为模板，用引物cat’-F、cat’-R扩增带接头的cat’片段。UPrecA片段、cat’片段和DNrecA片段通过融合PCR组装成recA-UCD片段。将recA-UCD片段Spizizen转化BS168 ribCm，获得用于高通量筛选的核黄素生产底盘细胞SF0。
本部分所用引物如下：
表1构建高通量筛选核黄素生产底盘细胞所用到的引物
本部分所用到的菌株及质粒如下：
表2构建高通量筛选核黄素生产底盘细胞所用到的菌株和质粒
实施例2：液滴微流控检测核黄素浓度与荧光强度的关系
核黄素是天然的荧光物质，为了验证不同浓度的核黄素标品通过液滴微流控能够显示出不同强度的荧光信号，我们用发酵培养基(发酵培养基成份为：玉米浆干粉10g/L、蔗糖30g/L、硫酸镁2g/L、硫酸铵7g/L、磷酸氢二钾3g/L、磷酸二氢钾1g/L)配置了不同浓度的核黄素标品，不同浓度的核黄素标品用液滴包埋后通过液滴微流控检测荧光信号，结果如图1所示，液滴中核黄素浓度与荧光信号强度呈一定的线性关系。因此，荧光值的强弱可以作为后续核黄素产量高低筛选的参数。
实施例3：常压室温等离子体(ARTP)诱变时间的确定、突变体库的构建及液滴微流控分选
(1)致死率的测定
为了获得一个比较广的突变体库，我们对底盘细胞SF0进行了常压室温等离子体(ARTP)诱变。首先，对等离子诱变条件下SF0的致死率进行测定。将种子培养至对数中期的SF0细胞用0.8％NaCl溶液稀释成108个细胞/mL的悬液，取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后带有细胞的铁片置于1mL无菌水中漩涡震荡洗下细胞，将细胞悬液10倍稀释至10-2，取稀释后的细胞悬液100μL涂板，37℃培养36h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变Ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中N＝5、10、15、20、25、30。
从图2中可知，诱变15s时的致死率为76.98％，诱变30s时的致死率达到99.86％以上，致死率为70％-80％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择15s作为最终构建突变体库的诱变时间。
(2)突变体库的构建及筛选
取浓度为108个/mL的细胞悬液10uL涂布于铁片上进行ARTP诱变，诱变时间为15s，共对10个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这10个铁片上的细胞在同一个含有1mL发酵培养基的EP管中涡旋振荡重悬。
将重悬后的细胞悬液进行液滴包埋，包埋后在37℃静置培养18h，以允许细胞在液滴中产生核黄素，由于核黄素是天然的荧光物质，使用两步连续的液滴微流控分选技术来富集荧光强度高的细胞进行后续的初筛和复筛。第一轮液滴微流控分选，从2.5×106个阳性液滴(总共2.5×107个液滴，约10％细胞装载)中收集了约5000个高荧光的液滴。将第一轮筛选出的高荧光液滴破乳后接种发酵培养基进行液滴包埋，包埋后静置培养18h，进行第二轮液滴微流控分选，将从5×104个阳性液滴(总共5×105个液滴，约10％细胞装载)中收集到的约300个高荧光信号的液滴涂布琼脂平板，37℃倒置培养36h，长出258个单菌落。
实施例4：突变株96深孔板发酵初筛
(1)96深孔板发酵
分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL种子培养基(种子培养基成份为：蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 10g/L)的96深孔板中(每个孔板上包含6株对照菌株SF0)，37℃、800rpm、80％湿度振荡培养18h后，按10％(v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，37℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养24h后检测核黄素产量。
(2)酶标仪检测发酵液中核黄素浓度
为了高通量检测发酵液中核黄素的浓度，首先用酶标仪测定了444nm处不同浓度核黄素标品的吸光度。用0.01mol/L NaOH配置不同浓度的核黄素标准品，再用0.01mol/LNaOH将不同浓度的核黄素标准品稀释50倍后，用酶标仪测定444nm处的吸光度，以核黄素浓度为横坐标，444nm处的吸光度为纵坐标，做出酶标仪检测核黄素浓度的标准曲线(如图3所示)。
发酵液混匀，用0.01mol/L NaOH将其稀释50倍后，混匀，避光碱溶20min，4500rpm离心15min，取上清于酶标板中，以0.01mol/L NaOH做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.1-0.8之间)。96深孔板发酵初筛结果如图4所示，将ARTP诱变后，与SF0相比核黄素产量提升最高的前26株菌进行96深孔板发酵复筛。
实施例5：突变株96深孔板发酵复筛
分别挑取27株菌的单菌落(包含一个对照菌株SF0)接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，37℃、800rpm、80％湿度振荡培养18h后，按10％(v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中(每株菌3个平行)，37℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养24h后检测核黄素产量。
发酵液混匀，用0.01mol/L NaOH将其稀释50倍后，混匀，避光碱溶20min，4500rpm离心15min，取上清于酶标板中，以0.01mol/L NaOH做空白在444nm下测定吸光度。发酵结果如图5所示，ARTP诱变后，与SF0相比，核黄素产量提升最高的前5株菌为SF1、SF5、SF8、SF11、SF15，其中SF5菌株核黄素产量最高，达到0.89g/L，是底盘菌株核黄素产量的1.95倍。
实施例6：高产菌摇瓶发酵验证
(1)摇瓶发酵
分别挑取新鲜活化的SF0、SF1、SF5、SF8、SF11、SF15单菌落接种斜面，37℃培养48h。刮取1/3斜面上的菌苔接种含有70mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中(每株菌3个平行)，37℃、200rpm振荡培养41h。
(2)可见分光光度计检测发酵液的OD600和核黄素浓度
发酵液混匀，用0.8％NaCl溶液将其稀释到适当的倍数，充分混匀，以0.8％NaCl溶液做空白在600nm下测吸光度(显示值控制在0.2-0.8)，按以下公式计算OD600值：OD600＝稀释倍数*吸光度。
发酵液混匀，用0.01mol/L NaOH将其稀释到适当的倍数后，混匀，避光碱溶20min，12000rpm离心2min，取上清液以0.01mol/L NaOH做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.2-0.8之间)，按以下公式计算核黄素的含量：FB(mg/L)＝(稀释倍数*吸光度)/0.0321。发酵结果如图6所示，SF5菌株核黄素产量为2.17g/L，较对照菌株产量提高了97％。SF5菌株已于2018年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.16132。
Claims (10)
1.一株高产核黄素工程菌，其特征在于，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC NO.16132。
2.一种高产核黄素工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)在出发菌株的染色体上整合表达解淀粉芽孢杆菌解调的核黄素操纵子，质粒上过表达解调的枯草芽孢杆菌核黄素操纵子，点突变ribC基因以减少核黄素分解代谢，失活recA基因，获得产核黄素的底盘细胞；
(2)对步骤(1)的底盘细胞进行诱变处理；
(3)筛选获得较底盘细胞核黄素产量提高的菌株。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中的出发菌株为枯草芽孢杆菌，优选为Bacillus subtilis 168；所述步骤(1)中的质粒为芽孢杆菌常用表达质粒，优选为pGMBsub04。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中的诱变处理为化学诱变或物理诱变，优选为物理诱变，进一步优选为ARTP诱变。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中的筛选所用方法为高通量筛选，优选为采用液滴微流控进行高通量筛选。
6.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中核黄素产量提高的菌株为突变株CGMCC NO.16132。
7.一种制备核黄素的方法，包括如下步骤：
(1)在一定温度条件下培养权利要求1所述工程菌，以获得单菌落；
(2)步骤(1)中的单菌落接种斜面，在一定温度条件下培养一定时间；
(3)刮取步骤(2)中斜面上的一定量的菌苔接种发酵培养基并振荡培养一定时间获得发酵液；
(4)离心收集步骤(3)中的发酵液，可见分光光度计检测核黄素。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(1)的一定温度为30-40℃，优选为37℃；
所述步骤(2)中的一定温度为30-40℃，优选为37℃，培养一定时间的时间为36-60h，优选为48h；
所述步骤(3)中一定量的菌苔为1/3斜面的菌苔，振荡培养时的转速为180-220rpm，优选为200rpm，振荡培养一定时间的时间为36-48h，优选为41h。
9.权利要求1所述的工程菌在生产核黄素中的应用。
10.权利要求1所述的工程菌在饲料、医药、食品中的应用。
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