CN112575021A - 一种生产核黄素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，公开了一种生产核黄素的方法。本发明所述生产核黄素的方法包括产核黄素菌种的构建方法，以及利用所构建菌种发酵生产核黄素的方法。本发明所述的枯草芽孢杆菌其为枯草芽孢杆菌菌株中purR、ribR、ribC或pyrE中至少一个基因位点发生突变。purR、ribR、ribC或pyrE至少一个基因位点突变获得的枯草芽孢杆菌菌株在本发明公开的发酵条件下积累核黄素显著增加。本发明所述的枯草芽孢杆菌为核黄素高产菌株，生产的核黄素显著增加，为核黄素的工业化生产奠定基础。

Description

一种生产核黄素的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，公开了一种生产核黄素的方法。本发明所述生产核黄素的 方法包括产核黄素菌种的构建方法，以及利用所构建菌种发酵生产核黄素的方法。
背景技术
核黄素(Riboflavin)，又称维生素B2，分子式为C17H20O6N4，分子量：376.36，其化学结构式如图1所示。核黄素是人体必需的13种维生素之一，是B族维生素的成员之一，微 溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，微溶于乙醇、环己醇、乙酸乙酯、 苄醇和酚，不溶于乙醚、氯仿、丙酮和苯。在中性或酸性溶液中稳定，耐热、耐氧化，但在 碱溶液中不稳定，加热可被破坏，光照及紫外照射引起不可逆的分解。278～282℃时分解，饱 和水溶液的pH约为6.0，水溶液呈黄色并显绿色荧光。
核黄素是黄素酶类的辅酶组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺 嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，以辅酶或辅基的形式参与各种酶系统反应。作为黄素蛋 白的辅酶参与呼吸电子传递链及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要作用，直接参 与碳水化合物、蛋白质、脂肪的生物氧化作用，在生物体内具有多种生理功能，是生命活动 不可缺少的维生素，是维持机体正常代谢和生理功能所必须的营养素。核黄素具有促进发育 和细胞再生，促使皮肤、指甲、毛发的正常生长，帮助消除口腔内、唇、舌炎症，增进视力， 减轻眼疲劳等功效。微生物可以自身合成核黄素，但人和动物必须从食物中获取。正常成年 人血清核黄素的浓度为69～98μmol/L，人体每天需要0.3～1.8mg核黄素。核黄素成为一种重 要的饲料添加剂、食品添加剂、药品和食品染料，市场每年需求约8000～10000吨。
目前核黄素的生产方法主要有2种：半微生物发酵合成法和微生物发酵法。半微生物发 酵合成法是先通过微生物发酵生产D-核糖，再以D-核糖为原料，与3,4-二甲代苯胺反应形成 核醇二甲代苯胺，转化成偶氮染料后与巴比妥酸反应生产核黄素。该方法的优点是产品纯度 较高，达到96％，主要缺点是得率较低，约60％，且需要用到大量的有机溶剂，环境污染大。 微生物发酵法仅需一步发酵，具有生产成本低，环境污染小，生产周期短，产品纯度高等优 点。该方法是目前核黄素工业化生产的主要方法，生产的核黄素占到市场份额的90％以上。
核黄素生产菌种是微生物发酵法的核心。早期的核黄素生产菌种从丙酮丁酸梭菌，到阿 舒氏假囊酵母、棉囊阿舒酵母、解朊假丝酵母等，存在发酵周期长、原料复杂、菌体粘度大、 工艺复杂等问题。枯草芽孢杆菌和产氨棒状杆菌等核黄素工程菌相继构建成功，成为核黄素 工业生产的主要菌种。尤其是枯草芽孢杆菌具有发酵周期短、单位高、原料易得、工艺简单、 生产效率高等优势。且枯草芽孢杆菌作为重要的模式菌，其生理、生化及分子遗传学方面的 研究都比较清楚，具有基因工程改造技术成熟的优势，未来仍有较大的提升空间。
专利文献CN03143072.4和专利文献CN03143073.2公开了利用枯草芽孢杆菌生产核黄素 的方法，其生产菌种的构建方法是以产核黄素的枯草芽孢杆菌菌种作为出发菌，先对其采用 加入突变诱导剂的方法进行诱变，然后利用脯氨酸结构类似物或苏氨酸结构类似物等进行筛 选，从而获得核黄素高产菌种。此方法为随机诱变，引入的突变点具有不确定性，往往引入 较多无效突变甚至有害突变，使得生产菌种具有复杂的遗传背景；并且，新获得的生产菌种 副产脯氨酸或苏氨酸等较多，对工业化生产不利。
发明内容
本发明提供了一种生产核黄素的方法，具体的提供了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其 构建方法，以及利用产核黄素的枯草芽孢杆菌菌种发酵生产核黄素的方法。
本发明将验证有效的突变基因构建到产核黄素的枯草芽孢杆菌工程菌种上，并进行发酵 培养基和培养方法的优化，实现了核黄素积累量的增加。
本发明所述枯草芽孢杆菌为基因工程重构菌，其携带多个有助于产核黄素的突变基因。 本发明所述的产核黄素的枯草芽孢杆菌其获得过程为，首先将枯草芽孢杆菌168经多轮紫外 诱变获得诱变菌，通过全基因组测序分析，该菌株有多个重要突变，ribR基因为其中的有效 突变基因，ribR基因其289位碱基由a突变为g，328位碱基由a突变为g，ribR基因所表达 的氨基酸序列第97位由精氨酸突变为甘氨酸，第110位由赖氨酸突变为谷氨酸。其次，将上 述突变基因通过反向遗传学手段重新引入到产核黄素的枯草芽孢杆菌CGMCCNO.21202菌 株中，并进行核黄素生产测试。结果表明，突变基因对核黄素生产均有正向作用，并且具有 叠加的效果。
ribR属于“核黄素操纵子”的一种，所述“核黄素操纵子”是指包括：作为核黄素生物合成 基因簇的由编码嘧啶脱氨酶-还原酶(pyrimidine deaminase-reductase，RibG，NCgl1535)的ribG 基因、编码核黄素合酶α亚基(Riboflavin synthase subunit alpha，RibC，NCgl1534)的ribC基 因、编码GTP环化水解酶II(GTP cyclohydrolase II，RibA)的ribA基因，以及编码核黄素合酶 β亚基(riboflavin synthase subunit beta，RibH，NCgl1532)的ribH基因组成的基因簇(以下称为 “核黄素生物合成基因簇”)。对于所述操纵子的各基因的信息，可以从公开的数据库(NCBI的 GenBank等)中获得。
我们已经构建了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株中 下述三个位点发生了点突变：1)purR A148D：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨 酸突变为天冬氨酸；2)ribC D144R：双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突 变为精氨酸；3)pyrE K104E：乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。 作为优选的是，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株已于2020年11月18日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.21202。 该菌株具有核黄素生产能力，摇瓶水平核黄素产量可达1.65g/L。
在此基础上，本发明具体提供了一种枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR的野生 基因和突变基因purRA148D，其野生型和突变基因分别如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示，其编 码的野生型和突变蛋白如SEQ NO.7和SEQ NO.8所示。
本发明还具体提供了一种枯草芽孢杆菌双功能黄素激酶FAD合成酶RibC的野生基因和 突变基因ribCD144R，该突变基因分别如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示，其编码的野生型和突变 蛋白如SEQ NO.9和SEQ NO.10所示。
本发明还具体提供了一种枯草芽孢杆菌乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE的野生基因和突 变基因pyrEK104E，该突变基因分别如SEQ NO.5和SEQ NO.6所示，其编码的野生型和突变 蛋白分别如SEQ NO.11和SEQ NO.12所示。
在此基础上，本发明提供了一种产核黄素工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)在出 发菌株的染色体上整合了ribR的基因，其中该基因至少一个位点存在突变；(2)获得较出发菌 株相比核黄素产量提高的菌株。
作为优选的是，本发明对CGMCC NO.21202的枯草芽孢杆菌的ribR引入至少一个突变。 所述ribR基因突变优选为：ribR基因的97位精氨酸突变为甘氨酸，110位赖氨酸突变为谷氨 酸。
ribR基因编码单功能黄素激酶(RibR)，可催化核黄素转化为FMN。文献报道失活ribR 有利于核黄素的积累，但会导致FMN不足，对细胞的氧化还原反应不利。所述RibR被现有 文献报道为核黄素生物合成操纵子的一种调节因子，参与调节枯草芽孢杆菌中核黄素操纵子。
同时，本发明具体提供了一种枯草芽孢杆菌单功能黄素激酶ribR的野生基因和突变基因 ribRR97G,K110E，该突变基因分别如SEQ NO.13和SEQ NO.15所示，其编码的野生型和突变蛋 白分别如SEQ NO.14和SEQ NO.16所示。
另一方面，本发明提供了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，所述 枯草芽孢杆菌菌株中下述至少一个位点发生了点突变：1)purRA148D：嘌呤操纵子转录调节蛋 白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；2)ribRR97G,K110E：单功能黄素激酶RibR的97位 精氨酸突变为甘氨酸，110位赖氨酸突变为谷氨酸；3)ribCD144R：双功能黄素激酶FAD合成 酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；4)pyrEK104E：乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。
PurR为嘌呤操纵子转录调节因子，其148位发生氨基酸取代，其丙氨酸被天冬氨酸取代。 该氨基酸替换可能导致该转录调节因子对嘌呤操纵子的作用减弱或消失，有利于强化嘌呤合 成，进而利于其下游产物核黄素的积累。
RibC为双功能黄素激酶FAD合成酶，可催化核黄素转变为FMN及FAD。有文献报道失活ribC可利于核黄素的积累，但会导致缺失FMN和FAD，对细胞的氧化还原反应不利。点 突变弱化可以平衡两种需求。本发明获得的突变经验证具有正的效果，且为独有突变。该突变与purR突变的组合改造具有叠加的效果，也说明该位点对于核黄素合成的必要性和重要性。
PyrE是芽孢杆菌嘧啶合成途径重要基因，编码乳清酸磷酸核糖基转移酶。该酶的第104 位氨基酸赖氨酸被谷氨酸取代。从蛋白构象上解析，104位为其底物结合位点，该位点发生 氨基酸取代，且由碱性氨基酸取代为酸性氨基酸，会造成底物结合效率降低，进而降低了酶 促反应效率。而嘧啶合成途径通量的减少，节省了更多底物和能量，有利于促进嘌呤途径的 产物得率。
RibR是单功能酶，具有黄素激酶活性，可催化核黄素合成黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)； 同时，RibR蛋白是核黄素生素合成操纵子的调节蛋白，对核黄素生物合成具有负调控作用。 该酶的第97位由精氨酸突变为甘氨酸，第110位由赖氨酸突变为谷氨酸，起到ribR基因的 表达弱化作用，对提高核黄素产量非常关键。
本发明还提供核黄素发酵生产所需的培养基配方，及发酵培养方法，实现了核黄素积累 量的增加。
本发明提供一种采用发酵罐制备核黄素的方法，包括如下步骤：
(1)将甘油管保藏的权利要求4所述工程菌在LB平板进行无菌划线，36℃过夜培养；
(2)挑一环培养物接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；
(3)二级种子培养：制备30mL的摇瓶种子，种子OD为4.5-5.0(560nm波长检测)，将30mL摇瓶种子在火焰下无菌接种到20L的种子罐中，种子罐的装液量为10L；二级种子OD 达到5.0-6.0后，结束培养；
(4)主发酵培养：取(3)制备的二级种子3L，在火焰下无菌转接到50L的主发酵罐中， 主发酵罐的装液量为20L，发酵过程取样检测OD和核黄素含量，发酵40h结束。
所述培养基配方包括二级种子培养配方，及主发酵培养配方。
所述二级种子培养配方为(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
所述主发酵培养配方为(g/L)：葡萄糖10-20，酵母粉2，豆粕粉(90目，120目，150目) 10-20，磷酸二氢钾2，硫酸铵2，硫酸锰0.01，硫酸镁5，玉米浆干粉15，pH 7.0～7.2，121℃ 灭菌20分钟。主发酵流加糖浓度：500-750g/L。主发酵流加培养基配方(g/L)：酵母粉2，酵 母粉2，豆粕粉(90目，120目，150目)10-20，pH5.0～7.0，121℃灭菌20分钟。
所述豆粕粉(90目，120目，150目)为高温豆粕拿去粉碎成不同粒度，豆粕粉的粒度决定了豆粕粉都作为氮源被细菌代谢的快慢，理论上粒度小的豆粕粉代谢快，有助于长菌体； 粒度大的豆粕粉代谢慢，有助于产核黄素。根据不同菌种的需要，本发明获得了适合核黄素 发酵的最佳豆粕粉。
所述发酵培养方法为：
(1)二级种子培养：按照实施例9的2.培养方法(1)和(2)制备30mL的摇瓶种子，种子OD为4.5-5.0(560nm波长检测)，将30mL摇瓶种子在火焰下无菌接种到20L的种子罐中，种子罐的装液量为10L。二级种子的培养温度为36-37℃，用氨水(质量体积含量为28％)调节pH6.6-7.5，初始转速为200r/min，初始风量为6L/min，罐压全程控制0.05Mpa，二级种子培养过程通过交替提升转速和风量来维持溶氧大于30％，溶氧全程控大于30％。二级种子OD 达到5.0-6.0后，结束培养。
(2)主发酵培养：取(1)制备的二级种子3L，在火焰下无菌转接到50L的主发酵罐中， 主发酵罐的装液量为20L。主发酵的培养温度为36-37℃，用氨水(质量体积含量为28％)调 节pH6.6-7.5，发酵罐的初始转速为200r/min，初始风量为10L/min，罐压全程控制0.05Mpa， 发酵过程通过交替提升转速和风量来维持溶氧大于20％，溶氧全程控大于20％。底糖耗尽后 控制残糖1-10g/L，残糖低于1g/L开始流加糖(浓度500-750g/L)。发酵12h开始匀速流加培 养基，每小时流加100±10mL。发酵过程取样检测OD和核黄素含量，发酵40h结束。
本发明所获得的产核黄素的菌株，及核黄素合成或分解相关基因的有益突变，对核黄素 工业化生产具有重要的指导作用。
本发明通过传统诱变方式获得了一株核黄素高产菌，并鉴定得到多个基因的有益突变。 将相关突变通过反向遗传学手段移植到模式菌株后，模式菌株也获得了产核黄素表型。并且， 相关工程菌株的生产核黄素能力显著增强。同时，在本发明提供的培养基配方和培养方法下， 利用120目的豆粕粉能更好的发挥菌种的生产性能，为工业化生产核黄素提供了技术支持。
附图说明
图1：核黄素的化学结构式。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买 获得。本发明所用到的原始菌株枯草芽孢杆菌168(B.subtilis 168)来源为BGSC(Bacillus GeneticStock Center，http://www.bgsc.org/)。本发明所用到的核黄素标准品从Sigma公司购买， 所用DNA聚合酶、DNA纯化试剂盒、限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物 学试剂从Thermo公司购买，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买。
实施例中使用的引物信息见表1。
表1引物序列
Figure BDA0002837354590000061
Figure BDA0002837354590000071
实施例1.诱变筛选获得核黄素高产菌株
以枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)作为原始菌株，B.subtilis 168菌株先用紫外 15W、30cm、20min进行常规诱变处理，再用亚硝基胍进行诱变，条件为0.4mg/mL、36℃、 20min。然后，涂布在含有0.2g/L 8-氮鸟嘌呤的基本培养基上(g/L：葡萄糖20、硫酸铵2、 硫酸镁0.4、氯化钙0.02、硫酸亚铁0.02、磷酸氢二钠1.5、硫酸锌0.01、硫酸锰0.01、磷酸 二氢钾1.5、琼脂18，pH7.0～7.2)，36℃培养24h。之后，挑选长势最好的菌株进行下一轮 诱变，并提高基本培养基中8-氮鸟嘌呤的浓度。经过多轮诱变筛选后，获得了B.subtilis MHZ-1908-1菌株，该菌能在含有1.0g/L的8-氮鸟嘌呤培养基上生长。B.subtilisMHZ-1908-1 菌株摇瓶发酵60小时产核黄素水平为1.2g/L，对葡萄糖的得率为4.00％(g/g)。
将B.subtilis MHZ-1908-1进行全基因组测序分析，序列信息与其出发菌株枯草芽孢杆菌 168进行比对，其突变率大于千分之零点二。通过比较基因组学分析，B.subtilisMHZ-1908-1 在相关代谢路径上具有多个重要突变，推测可能与核黄素高产相关。具体突变信息为：突变 的嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；突变的双功能黄素激酶 FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；突变的乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE， 其104位赖氨酸突变为谷氨酸；突变的单功能黄素激酶(RibR)，其97位由精氨酸突变为甘 氨酸，第110位由赖氨酸突变为谷氨酸。嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR与嘌呤合成相关，而 三磷酸鸟嘌呤核苷是核黄素的重要前体。RibC是双功能酶，可催化核黄素合成黄素腺嘌呤单 核苷酸(FMN)，并进一步合成黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，二者是核黄素的下游产物，也 是重要的辅酶。乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE是嘧啶合成关键基因，与嘌呤合成是竞争关系。 RibR是单功能酶，具有黄素激酶活性，可催化核黄素合成黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)；同 时，RibR蛋白是核黄素生素合成操纵子的调节蛋白，对核黄素生物合成具有负调控作用。ribR 基因的表达弱化对提高核黄素产量非常关键。
实施例2：基因无痕编辑方法构建B.subtilis168,Δupp菌株
以枯草芽孢杆菌B.subtilis168为出发菌株，本发明所用基因无痕编辑方法是基于温敏质 粒介导的两步整合，通过氯霉素正筛及5-氟尿嘧啶(5-FU)反筛。该筛选方法需首选缺失目 标菌株基因组上的upp基因，该基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，当upp与5-FU同时存在时， 对细胞具有致死作用。具体原理及操作方法参考以下文献：AppliedMicrobiology and Biotechnology,2014,98(21):8963-8973.Zhang W,GaoW,FengJ,etal。
具体构建过程如下：用引物upp-1f/1r、upp-2f/2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用 pfu DNA聚合酶扩增分别得到888bp和938bp的上下游同源臂，用引物upp-1f/2r扩增得到上 下游融合片段，将片段与pKSV7(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作，得 到质粒pKSV7-Δupp。通过Spizizen方法转化至B.subtilis 168中，用含2.5μg/mL氯霉素的 LB平板在30℃下筛选，获得转化子。将获得的转化子接种到5ml LB液体培养基中，42℃、 200rpm培养12h并传代一次，稀释涂布于含有5μg/mL的氯霉素LB平板，获得一次重组子。 将一次重组子接种到5ml LB液体培养基中，42℃、200rpm培养12h并传代一次，稀释涂布 于含有0.8μM 5-FU(5-氟尿嘧啶，upp作用底物)的LB平板进行筛选，获得二次重组子， 即B.subtilis 168,Δupp菌株，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1909-1。
实施例3：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,ribRR97G,K110E的构建
用引物ribR-1f、ribR-1r和ribR-2f、ribR-2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu 高保真DNA聚合酶扩增，分别得到ribRR97G上、下游同源臂；用引物ribR-1f、ribR-2r融合 扩增上、下游片段，得到ribRR97G融合片段(含R97G突变)。
用引物ribR-1f、ribR-3r和ribR-3f、ribR-2r，以ribRR97G融合片段为模板，使用pfu高保 真DNA聚合酶扩增，分别得到ribRR97G,K110E上、下游同源臂；用引物ribR-1f、ribR-2r融合 扩增上、下游片段，得到ribRR97G,K110E融合片段(含R97G、K110E两个点突变)。
将ribRR97G,K110E融合片段与pKSU质粒(工具载体)分别进行SalI、PstI双酶切，然后进 行连接，并转化至Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞。最终，得到重组质粒pKSU-ribRR97G ,K110E。
后续转化及筛选方法同实施例2，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入ribR双点 突变的菌株B.subtilis 168,Δupp,ribRR97G,K110E，该菌株命名为B.subtilisMHZ-1909-2。
完整ribR野生型及突变型核苷酸序列如SEQ NO.13、SEQ NO.15所示。
实施例4：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D的构建
用引物purR-1f、purR-1r和purR-2f、purR-2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu 高保真DNA聚合酶扩增，分别得到purRA148D上、下游同源臂；用引物purR-1f、purR-2r融 合扩增上、下游片段，得到purRA148D融合片段(含A148D突变，完整purR野生型及突变型核苷酸序列如SEQ ID No.1、2所示。将融合片段与pKSU质粒(工具载体)分别进行SalI、PstI双酶切，然后进行连接，并转化至Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞。最终，得到重组质粒pKSU-purRA148D。
后续转化及筛选方法同实施例2，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入purR点突 变的菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1909-3。
实施例5：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,ribCD144R的构建
用引物ribC-1f、ribC-1r和ribC-2f、ribC-2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu 高保真DNA聚合酶扩增，分别得到ribCD144R上、下游同源臂；用引物ribC-1f、ribC-2r融 合扩增上、下游片段，得到ribCD144R融合片段(含D144R突变，完整ribC野生型及突变型核苷酸序列如SEQ ID No.3、4所示。将融合片段与pKSU质粒(工具载体)分别进行SalI、PstI双酶切，然后进行连接，并转化至Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞。最终，得到重组质粒pKSU-ribCD144R。
后续转化及筛选方法同实施例2，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入ribC点突 变的菌株B.subtilis 168,Δupp,ribCD144R，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1909-4。
实施例6：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R的构建
以携带purR点突变的B.subtilis MHZ-1910-3为出发菌株，叠加ribC突变改造。具体操 作方法同前述实施例2-4，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入purR、ribC双点突变的 菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R，该菌株命名为B.subtilisMHZ-1909-5。
实施例7：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R,pyrEK104E的构建
用引物pyrE-1f、pyrE-1r和pyrE-2f、pyrE-2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用 pfu高保真DNA聚合酶扩增，分别得到pyrEK104E上、下游同源臂；用引物pyrE-1f、pyrE-2r 融合扩增上、下游片段，得到pyrEK104E融合片段(含K104E突变，完整pyrE野生型及突变型核苷酸序列如SEQ ID No.5、6所示。将融合片段与pKSU质粒(工具载体)分别进行SalI、PstI双酶切，然后进行连接，并转化至Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞。最终，得到重组质粒pKSU-pyrEK104E。
后续转化及筛选方法同实施例2。以携带purR、ribC双点突变的B.subtilis MHZ-1909-5 为出发菌株，叠加pyrE突变改造，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入purR、ribC、 pyrE三点突变叠加的菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R,pyrEK104E，该菌株命名为 B.subtilis MHZ-1910-1(保藏编号CGMCC NO.21202)。
实施例8：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R,pyrEK104E,ribRR97G ,K110E的构建
按实施例3所述方法，得到的重组质粒pKSU-ribRR97G,K110E，转化实施例7获得的菌株 B.subtilis MHZ-1910-1(菌株的基因型为B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R,pyrEK104E)， 此菌种目前中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.21202。
转化及筛选方法同实施例2，最终得到在B.subtilis168MHZ-1910-1菌株中引入ribR双点 突变的菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R,pyrEK104E,ribRR97G,K110E，该菌株命名为B. subtilis MHZ-1911-1。
实施例9：工程菌株产核黄素摇瓶发酵性能测试
1.培养基：
(1)种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5， 硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
(2)发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖50，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01， 硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
2.培养方法：
(1)将甘油管保藏的菌株LB平板进行无菌划线，36℃过夜培养；
(2)挑一环培养物接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；
(3)按10％接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速120rpm，36℃培养40h。
3.摇瓶发酵性能测试结果见表2。
表2核黄素摇瓶发酵测试
Figure BDA0002837354590000101
Figure BDA0002837354590000111
从测试结果可以看出，出发菌株B.subtilis168本身不积累核黄素，诱变菌(编号MHZ-1908-1)具有较高核黄素积累量和产物得率。本发明构建的基因工程菌株均积累核黄素， 且效果显著，说明本发明公开的基因的突变均有正效果，并且突变可组合使用，具有叠加的 正效果。该结果与前期理性分析相符。
实施例10：工程菌株产核黄素50L发酵罐性能测试
1.培养基：
(1)种子罐培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5， 硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
(2)主发酵罐培养基配方(g/L)：葡萄糖10-20，酵母粉2，豆粕粉(90目，120目，150目)10-20， 磷酸二氢钾2，硫酸铵2，硫酸锰0.01，硫酸镁5，玉米浆干粉15，pH 7.0～7.2，121℃灭菌 20分钟。豆粕粉的粒度决定了豆粕粉都作为氮源被细菌代谢的快慢，理论上粒度小的豆粕粉 代谢快，有助于长菌体；粒度大的豆粕粉代谢慢，有助于产核黄素。根据不同菌种的需要， 本发明获得了适合核黄素发酵的最佳豆粕粉。
(3)主发酵流加糖浓度：500-750g/L。
(4)主发酵流加培养基配方(g/L)：酵母粉2，酵母粉2，豆粕粉(90目，120目，150目)10-20， pH5.0～7.0，121℃灭菌20分钟。
2.培养方法：
(1)二级种子培养：按照实施例9的2.培养方法(1)和(2)制备30mL的摇瓶种子，种子 OD为4.5-5.0(560nm波长检测)，将30mL摇瓶种子在火焰下无菌接种到20L的种子罐中，种子罐的装液量为10L。二级种子的培养温度为36-37℃，用氨水(质量体积含量为28％)调节pH6.6-7.5，初始转速为200r/min，初始风量为6L/min，罐压全程控制0.05Mpa，二级种子培养过程通过交替提升转速和风量来维持溶氧大于30％，溶氧全程控大于30％。二级种子OD 达到5.0-6.0后，结束培养。
(2)主发酵培养：取(1)制备的二级种子3L，在火焰下无菌转接到50L的主发酵罐中，主发 酵罐的装液量为20L。主发酵的培养温度为36-37℃，用氨水(质量体积含量为28％)调节 pH6.6-7.5，发酵罐的初始转速为200r/min，初始风量为10L/min，罐压全程控制0.05Mpa，发 酵过程通过交替提升转速和风量来维持溶氧大于20％，溶氧全程控大于20％。底糖耗尽后控 制残糖1-10g/L，残糖低于1g/L开始流加糖(浓度500-750g/L)。发酵12h开始匀速流加培养 基，每小时流加100±10mL。发酵过程取样检测OD和核黄素含量，发酵40h结束。
(3)50L发酵结果见表3。
表3核黄素50L罐发酵测试
Figure BDA0002837354590000121
从50L罐发酵结果可以看出，菌株MHZ-1911-1较出发菌MHZ-1910-1(CGMCCNO.21202) 生产核黄素的能力显著增强，说明本发明公开的基因的突变均有正效果，并且突变可组合使 用，具有叠加的正效果。同时，相较于90目和150目豆粕粉，120目豆粕粉更适合作为核黄 素生产菌种的有机氮源。
本发明的菌株构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容 达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。本发明中的菌株编号是为了方便描述，但不应 理解为对本发明的限定。上述方法构建的包含有枯草芽孢杆菌的嘌呤操纵子转录调节因子突 变体PurRA148D、黄素激酶突变体RibCD144R、乳清酸磷酸核糖基转移酶突变体PyrEK104E、单 功能黄素激突变体RibRR97G,K110E的工程菌的用途，包括但不局限于核黄素生产。
本发明公开了一种核黄素高产菌株构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容， 或进行适当改进。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而 易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更 与组合，来实现和应用本发明技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人
<120> 一种生产核黄素的方法
<130> 一种生产核黄素的方法
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
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<213> B. subtilis 168
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gagtttaacg caaatgtggc gggaatcggc gtcttagttg aagccgaagg agtagatgaa 720
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cctaaagcgg aggaagcctt cgcaaaggca gaactgccat actactcatt aaccgattat 540
gatacgctca cagaggtcgc gcttgaaaac ggaaatattc attcagatga tctaaaaaag 600
ctgcaaacat ggaaacgaaa tcccgagtca aaagattggt ttaaaaaata a 651
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<213> B. subtilis 168
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Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg
20 25 30
Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys
35 40 45
Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly
50 55 60
Asp Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala
65 70 75 80
Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg
85 90 95
Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro
100 105 110
Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu
115 120 125
Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu
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Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg
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Val Lys Thr Ile His Ile Thr His Pro His His Leu Ile Lys Glu Glu
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Gly His Gln Lys Val Ile Gly Thr Ala Lys Gln Ile Ala Glu Glu Lys
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Gly Leu Thr Leu Ala Val Met Thr Phe His Pro His Pro Ser His Val
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Lys Ile Asn Gln Ile Glu Gln Leu Gly Thr Glu Val Leu Tyr Val Val
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Gly Ala Ala Ile Lys Ile Glu Trp Tyr Lys Arg Ile Arg Ser Glu Arg
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Met Gly Gly Asn Gln Ile Leu Lys Gln Ile Ile Ala Lys His Leu Leu
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Asp Ile Gln Ala Val Phe Leu Arg Pro Asn Glu Pro Phe Thr Trp Ala
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Ser Gly Ile Leu Ser Pro Ile Tyr Cys Asp Asn Arg Leu Thr Leu Ser
35 40 45
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65 70 75 80
Gly Ile Pro His Ala Ala Leu Ala Ala Asp His Leu Asn Leu Pro Met
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115 120 125
Ile Ser Thr Gly Gly Ser Val Leu Glu Ala Cys Ala Ala Leu Gln Ala
130 135 140
Ala Gly Cys Glu Val Leu Gly Val Val Ser Ile Phe Thr Tyr Gly Leu
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Pro Lys Ala Glu Glu Ala Phe Ala Lys Ala Glu Leu Pro Tyr Tyr Ser
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Leu Thr Asp Tyr Asp Thr Leu Thr Glu Val Ala Leu Glu Asn Gly Asn
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Met Gly Gly Asn Gln Ile Leu Lys Gln Ile Ile Ala Lys His Leu Leu
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Asp Ile Gln Ala Val Phe Leu Arg Pro Asn Glu Pro Phe Thr Trp Ala
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Ser Gly Ile Leu Ser Pro Ile Tyr Cys Asp Asn Arg Leu Thr Leu Ser
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130 135 140
Ala Gly Cys Glu Val Leu Gly Val Val Ser Ile Phe Thr Tyr Gly Leu
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Pro Lys Ala Glu Glu Ala Phe Ala Lys Ala Glu Leu Pro Tyr Tyr Ser
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Lys Leu Gly Phe Pro Thr Ala Asn Val Asp Ala Lys Ile His Gly Leu
20 25 30
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65 70 75 80
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Leu Thr Ile Ile Ala Gly Thr Val Val Lys Gly Lys Gln Leu Gly Arg
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Gly Glu Lys Ile Glu Cys Ser Ile Leu Phe Lys Ile Arg Glu Glu Arg
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Leu Ala Asp Lys Leu Asn Arg Phe Ile Ser Ser Tyr Val Glu Glu Ser
210 215 220
Glu Glu Asn Ile Leu Gly
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Claims (8)

1.一种产核黄素工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)在出发菌株的染色体上整合了ribR的基因，其中该基因至少一个位点存在突变；
(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述基因突变优选为：ribR基因的97位精氨酸突变为甘氨酸，110位赖氨酸突变为谷氨酸；所述步骤(1)中的出发菌株为枯草芽孢杆菌，优选为CGMCC NO.21202。
3.一种枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子转录调节蛋白RibR的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQ NO.15所示；编码的蛋白如SEQ NO.16所示。
4.采用权利要求1-2所述的构建方法所构建的产核黄素工程菌。
5.一种采用发酵罐制备核黄素的方法，包括如下步骤：
(1)将甘油管保藏的权利要求4所述工程菌在LB平板进行无菌划线，36℃过夜培养；
(2)挑一环培养物接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；
(3)二级种子培养：制备30mL的摇瓶种子，种子OD为4.5-5.0(560nm波长检测)，将30mL摇瓶种子在火焰下无菌接种到20L的种子罐中，种子罐的装液量为10L；二级种子OD达到5.0-6.0后，结束培养；
(4)主发酵培养：取(3)制备的二级种子3L，在火焰下无菌转接到50L的主发酵罐中，主发酵罐的装液量为20L，发酵过程取样检测OD和核黄素含量，发酵40h结束。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述二级种子培养配方为(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；所述主发酵培养配方为(g/L)：葡萄糖10-20，酵母粉2，豆粕粉(90目，120目，150目)10-20，磷酸二氢钾2，硫酸铵2，硫酸锰0.01，硫酸镁5，玉米浆干粉15，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。主发酵流加糖浓度：500-750g/L。主发酵流加培养基配方(g/L)：酵母粉2，酵母粉2，豆粕粉(90目，120目，150目)10-20，pH5.0～7.0，121℃灭菌20分钟。
7.权利要求4所述的工程菌在饲料、医药、食品中的应用。
8.权利要求3所述的突变基因或蛋白在生产核黄素中的应用。
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