CN116004489A - 一种生产nmn的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产NMN的重组大肠杆菌及其应用,属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO.1所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶NAMPT,表达如SEQ ID NO.2所示的PRPP合酶BaPRS,表达如SEQ ID NO.3所示的转运蛋白BMpnuC,并敲除pncC基因、ushA基因、nadR基因和purR基因,提高了大肠杆菌细胞中的NMN的积累量。本发明还通过优化发酵条件,使NMN可以在胞外高效积累,在5L发酵体系下可获得20g/L以上的NMN,在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产NMN的重组大肠杆菌及其应用,属于基因工程及生物工程技术领域。
背景技术
近年来,NAD+及其衍生物作为抗衰老药物的潜力而备受关注,并为其有效生产做出了巨大努力。由于,β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,简写为NMN)是一种结构复杂的同分异构体,其化学合成是一项具有挑战性的任务。目前主要通过生物合成的方式进行NMN的生产。在不同生物中,NAD+的生物合成过程略有不同,但都主要包含两条途径:从头合成途径和补救合成途径。其中起主要作用的是补救合成途径,也是NMN的合成主要路径。
NMN的合成方式主要是以化学合成和酶法合成为主。化学法主要以烟酰胺与四乙酰核糖为起始原料,经三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)缩合、脱乙酰基,再经三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化制得β-NMN;或通过将缩酮化保护的烟酰胺核糖磷酸化、脱保护制备β-NMN。化学合成方法NMN技术相对成熟,但是存在着诸多不利因素,一方面部分化学原料毒性较大,对环境的污染严;另一方面部分原料价格昂贵是的NMN的合成成本高。
酶法合成主要是采用纯酶反应和全细胞催化的方式,以D-5-磷酸核糖和烟酰胺为原料,利用磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化合成β-NMN;或以烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸为底物催化合成β-NMN。酶法合成转化率较高,但是底物成本较高,不利于放大生产。
发明内容
本申请旨在构建更利于NMN积累的重组菌株,在已构建的底盘菌株的基础上,表达合成NMN的酶基因,调整基因表达强度,并优化发酵过程,提高NMN的产量。
本发明提供了一株具有烟酰胺单核苷酸合成能力的基因工程菌株,表达了烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT酶)、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(PRPP合酶)和转运蛋白BMpnuC。
在一种实施方式中,所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT酶)的氨基酸序列与序列SEQ ID NO.1具有至少95%的一致性;所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(PRPP合酶)的氨基酸序列与序列SEQ ID NO.2具有至少95%的一致性;所述转运蛋白BMpnuC的氨基酸序列与序列SEQ ID NO.3具有至少95%的一致性。
在一种实施方式中,所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶来源于溶藻弧菌噬菌体(Vibrio Phage KVP40)含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;所述PRPP合酶来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;所述转运蛋白BMpnuC来源于类霉菌芽孢杆菌(Bacillus mycoides),含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中,编码所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因NAMPT具有SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中,编码所述PRPP合酶的基因BaPRS具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中,编码所述转运蛋白的基因BMpnuC具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中,所述基因工程菌株使用的底盘菌株包括但不限于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母菌等适合构建表达系统的微生物。
在一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌包括但不限于B.subtilis 168、B.subtilis WB600、B.subtilis WB800。
在一种实施方式中,所述大肠杆菌包括但不限于E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli Rosetta(DE3)或E.coli JM109(DE3)。
在一种实施方式中,构建基因工程菌株时使用的过表达载体质粒包括但不限于pMA5、pWB980、pHT43、pHT01和pET-22b(+)、pET-28a(+)、pET-30a(+)、pUC57等适用于构建过表达基因工程菌株的其他载体质粒。
在一种实施方式中,所述转运蛋白BMpnuC以质粒pACYCDuet-1或pCDFDuet-1为表达载体。
在一种实施方式中,所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶和PRPP合酶以pET-28a(+)或pRSFDuet-1为表达载体。
在一种实施方式中,所述重组大肠杆菌以敲除了pncC、ushA、nadR、purR的大肠杆菌为出发菌株。
在一种实施方式中,所述出发菌株为大肠杆菌F004(E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR、ΔpurR),已公开于公开号为CN112795582A的专利申请文件中。
本发明还提供了携带所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶基因和/或转运蛋白基因的重组质粒。
在一种实施方式中,携带所述转运蛋白基因的重组载体的骨架为pACYCDuet-1或pCDFDuet-1系列载体中的任意一种。
在一种实施方式中,携带所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因和5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶基因的重组载体骨架为pET-28a(+)或pRSFDuet-1系列载体中的任意一种。
本发明还提供了含有所述重组大肠杆菌的发酵剂。
本发明还提供一种促进重组大肠杆菌合成NMN的方法,是在大肠杆菌中过表达如SEQ ID NO.4所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因NAMPT,SEQ ID NO.5所示的PRPP合酶基因BaPRS,并过表达如SEQ ID NO.6所示的NMN转运蛋白BMpnuC。
在一种实施方式中,所述重组大肠杆菌还敲除了pncC、ushA、nadR和purR基因。
在一种实施方式中,所述方法还包括在培养所述重组大肠杆菌时,采用IPTG诱导。
本发明还提供一种发酵生产NMN的方法,以所述重组大肠杆菌为发酵微生物,在35~40℃,培养至OD600=0.6-1.0,再于25~37℃,用终浓度≥0.2mM的IPTG诱导NMN的合成。
在一种实施方式中,诱导时间为24~36h。
在一种实施方式中,所述诱导采用终浓度0.5mM-1mM的IPTG诱导。
在一种实施方式中,所述发酵以500mg-2000mg/L的烟酰胺为底物。
在一种实施方式中,所述方法将所述重组大肠杆菌接种至种子培养基,培养获得种子液,再按照1%-5%转接量将种子液转接至发酵培养基中,35~37℃,培养1.5-2h至OD600=0.6-1.0,再加入终浓度0.5mM-1mM IPTG,并添加500mg-2000mg/L的烟酰胺,于30~37℃诱导NMN合成。
在一种实施方式中,所述发酵培养基含有:酵母粉、柠檬酸、硫酸铵、磷酸盐(K2HPO4、KH2PO4)、葡萄糖。
在一种实施方式中,发酵过程还分批次补加或连续流加烟酰胺。
在一种实施方式中,所述分批次补加是自添加诱导剂后每2~3h补加一次烟酰胺。
在一种实施方式中,所述连续流加是自添加诱导剂后连续流加烟酰胺溶液,并控制烟酰胺在发酵体系中的浓度小于3g/L。
本发明还提供所述的重组大肠杆菌,或所述发酵剂,或所述方法在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域制备含NMN的产品中的应用。
有益效果:
(1)本发明通过过表达NMN转运蛋白BMpnuC,强化NMN向细胞外的扩散,促进反应向NMN合成方向进行。
(2)本发明优化了基因表达强度,通过在不同拷贝数的质粒上表达NMN合成相关的基因,进一步提高NMN的生物合成量,可利用1g/L烟酰胺合成2.6g/L NMN。
(3)本发明还优化了发酵条件,通过扩大培养,控制发酵过程,在含底物浓度10g/L烟酰胺的发酵体系中发酵25h可获得20g/L以上NMN,转化率在90%以上,具有工业化应用潜力。
附图说明
图1为重组载体pET28a+BaPRS+NAMPT质粒图。
图2为重组大肠杆菌、对照以及标品的LC-MS图。
图3为不同诱导温度对NMN合成量的影响。
图4为不同IPTG浓度对NMN合成量的影响。
图5为不同底物烟酰胺浓度对NMN合成量的影响。
图6为不同重组菌株对NMN合成量的影响。
图7为5L发酵罐水平分批补料NMN的合成量。
图8为5L发酵罐水平恒速流加补料NMN的合成量。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基:酵母浸粉5g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L。加入15g/L琼脂条,以配制LB固体培养基。
发酵培养基:KH2PO4 6g-12g/L、K2HPO4 16g-30g/L、硫酸铵5g-10g/L、一水柠檬酸1g-5g/L、MgSO4·7H2O 1g-5g/L、酵母粉10g-30g/L、葡萄糖15g-50g/L。
补料培养基:葡萄糖700g/L、硫酸铵73g/L、MgSO4·7H2O 9g/L、酵母粉5g/L、金属离子溶液15mL、浓盐酸1mL。
(二)溶液
100g/L的烟酰胺溶液:5g烟酰胺溶于50mL的超纯水,并且过滤除菌。
金属离子溶液:10g/L FeSO4·7H2O,1.53g/L CaCl2,2.2g/L ZnSO4·7H2O,MnSO4·4H2O,1g/L CuSO4·5H2O,0.1g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.2g/L Na2B4O7·10H2O,1g/L NiCl2,1g/L H3BO3,10mL/L HCl用于配制发酵培养基及补料培养基。
(三)NMN的HPLC检测:利用色谱柱(250×4.6mm,5μm,Thermo-Fisher,MA,USA),在30℃检测条件用日本岛津的SPD-20A检测器,流动相为20mM乙酸铵,含有5%的乙腈;流速:1.0mL/min;检测波长:259nm;柱温箱温度:30℃。
(四)NMN转化率计算方法:摩尔转化率=(NMN浓度/(补加烟酰胺浓度-剩余烟酰胺浓度)×(NMN相对分子量/烟酰胺相对分子质量))×100%。
(五)大肠杆菌化学转化法:将大肠杆菌JM109划线于固体LB平板上,37℃培养12h,挑选单菌落接种于液体LB培养基中,37℃,220r/min生长10h,按照1%的接种量转接至新鲜的25mL液体LB培养基中,37℃培养1.5-2h,待OD600长至0.6-1,收菌制作感受态细胞。
大肠杆菌感受态的制作使用TaKaRa的Competent Cell Preparation Kit感受态制作试剂盒,具体操作流程参照使用说明。制作好的感受态细胞保存在-80℃条件,后续可以转化质粒或者片段等。
(六)质粒组装方法:Gibson反应体系如下,DNA片段加入50ng,载体加入100ng,Gibson mix加入5μL,加入无菌超纯水至体系10μL。反应条件如下,50℃反应60min,反应结束后立即置于冰上。取10μL转化至大肠杆菌感受态JM109。
无缝克隆反应体系如下,目的基因40ng,载体加入100ng,反应酶混合液5μL,加入无菌超纯水补齐至10μL。反应条件如下,50℃反应60min,反应结束后立即置于冰上。取10μL转化至大肠杆菌感受态JM109。
(七)氨基酸及核苷酸序列
在以下具体实施方式中,转运蛋白PnuC包括由如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列及在此基础上进行1个或多个氨基酸取代而得到的同功能氨基酸序列。本领域技术人员可以根据本申请公开的PnuC的氨基酸序列,基于现有的分子生物学技术,采用克隆或合成的方法或其他适合的方法获得本申请的BMpnuC基因。另外不同菌株、菌种或其他物种来源的pnuC基因基因具有相似功能,因此,编码上述pnuC基因的核苷酸序列并不仅限于如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。如果编码得到的蛋白与SEQ ID NO.3所述蛋白没有明显的功能差异,也包括在本发明的范围内。
与之类似的,烟酰胺磷酸核糖基转移酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列及在此基础上进行1个或多个氨基酸取代而得到的同功能氨基酸序列;PRPP合酶具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列及在此基础上进行1个或多个氨基酸取代而得到的同功能氨基酸序列,基于现有基于现有的分子生物学技术,采用克隆或合成的方法或其他适合的方法获得的编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示蛋白的基因(例如SEQ ID NO.4的NAMPT基因或SEQ ID NO.5所示的BaPRS基因)也包括在本发明的范围内。
实施例1:NMN生物合成相关表达质粒的构建
(1)NAMPT表达框的构建
以SEQ ID NO.4所示的NAMPT合成序列为模板,用引物对F1/R1进行PCR扩增,选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行,条件为预变性95℃,3min;扩增阶段30个循环,按照95℃,15s,58℃,15s,72℃,1min进行;延伸72℃,5min。将PCR产物进行产物纯化,以载体pET-28a(+)为模板,用引物对F2/R2进行PCR扩增,选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行,条件为预变性95℃,3min;扩增阶段30个循环,按照95℃,15s,58℃,15s,72℃,3min进行;延伸72℃,5min。将PCR产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将片段NAMPT和载体pET-28a(+)重组为载体pET28a+NAMPT。并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序,比对正确后得到正确的重组载体pET28a+NAMPT。
(2)BaPRS+NAMPT表达框的构建
以步骤(1)构建的pET28a+NAMPT为模板,用引物对F3/R3进行PCR扩增,选择PhantaMasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行,条件为预变性95℃,3min;扩增阶段30个循环,按照95℃,15s,58℃,15s,72℃,3min进行;延伸72℃,5min。将PCR产物进行产物纯化,分别获得pET28a+NAMPT片段;以SEQ ID NO.5所示的BaPRS为模板,用引物对F4/R4进行PCR扩增,选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行,条件为预变性95℃,3min;扩增阶段30个循环,按照95℃,15s,58℃,15s,72℃,30s进行;延伸72℃,5min。将PCR产物进行产物纯化,获得BaPRS片段。通过无缝克隆组装的方法将pET28a+NAMPT片段和BaPRS片段重组为载体并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序,比对正确后得到正确的重组载体pET28a+BaPRS+NAMPT(图1)
(3)NMN转运蛋白表达框的构建
以SEQ ID NO.6所示的BMpnuC基因序列为模板,用引物对F5/R5进行PCR扩增,选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行,条件为预变性95℃,3min;扩增阶段30个循环,按照95℃,15s,58℃,15s,72℃,1min进行;延伸72℃,5min。将PCR产物进行产物纯化,以载体pACYCDuet-1为模板,用引物对F6/R7进行PCR扩增,选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行,条件为预变性95℃,3min;扩增阶段30个循环,按照95℃,15s,58℃,15s,72℃,3min进行;延伸72℃,5min。将PCR产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将片段BMpnuC和载体pACYCDuet-1重组为载体pACYCDuet+BMpnuC。并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序,比对正确后得到正确的重组载体pACYCDuet+BMpnuC。
表1引物信息
实施例2:生物合成NMN的重组菌株的构建及发酵
以底盘菌株F004(E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR、ΔpurR)公开于公开号为CN112795582A的专利申请文件)为宿主菌,将按实施例1的方法构建的NMN合成质粒pET28a+BaPRS+NAMPT、和NMN转运质粒pACYCDuet+BMpnuC转化至宿主菌中,获得重组菌株NMN01。
为验证重组菌株NMN01合成NMN的能力,将重组菌株NMN01划线于适当抗性的LB固体平板上,37℃过夜培养;挑选单菌落接种于含有相应抗性的LB培养基中,37℃,220r/min,培养10~12h;按照2%转接量转接至30mL发酵培养基中,37℃培养至OD600为0.6~1.0时,降温至25℃。加入终浓度为0.2~0.5mM IPTG,加入1~3g/L烟酰胺,定时取样,离心取上清,HPLC检测NMN的合成情况。
结果显示,在HPLC检测中发现样品中出现与标品NMN出峰时间一致的吸收峰,为进一步验证是否样品中是否有NMN的合成,将样品进行LC-MS验证,如图2所示,样品中确定有NMN的合成,在底物烟酰胺浓度为1g/L的情况下,诱导24h胞外积累NMN达980mg/L。
实施例3:摇瓶水平NMN合成条件的优化
为进一步提高NMN合成量,提高转化率,以实施例2构建的具有合成NMN能力的重组菌株NMN01为发酵微生物,在摇瓶水平对NMN发酵过程条件进行优化,主要包含诱导温度、IPTG浓度、底物添加浓度。
(1)不同诱导温度对NMN合成的影响
将实施例2构建的重组菌株NMN01划线于适当抗性的LB固体平板上,37℃过夜培养;挑选单菌落接种于含有卡纳和氯霉素抗性的LB培养基中,37℃,220r/min,培养10~12h;按照2%转接量转接至30mL发酵培养基中,37℃培养至OD600为0.6~1.0时,加入终浓度为0.2~0.5mM IPTG,加入终浓度为1~3g/L烟酰胺,分别在25℃、30℃、37℃下诱导蛋白表达。定时取样,离心取上清,HPLC检测上清液中的NMN含量。结果如图3所示,在底物烟酰胺浓度为1g/L时,在37℃下,诱导24h可以合成NMN 1560mg/L,相比较诱导温度为25℃和30℃分别提高了35.7%和24.8%。
(2)IPTG浓度对NMN合成的影响
将实施例2构建的重组菌株NMN01划线于适当抗性的LB固体平板上,37℃过夜培养;挑选单菌落接种于含有卡纳和氯霉素抗性的LB培养基中,37℃,220r/min,培养10~12h;按照2%转接量转接至30mL发酵培养基中,37℃培养至OD600为0.6~1.0时,分别加入终浓度为0.2、0.5、1.0mM的IPTG,并加入终浓度1~3g/L烟酰胺,在37℃诱导蛋白表达。定时取样,离心取上清,HPLC检测上清液中的NMN含量。如图4所示,在添加底物烟酰胺1g/L、诱导温度30℃的条件下,采用终浓度0.5mM IPTG诱导24h,可以合成NMN 1809mg/L,相比IPTG终浓度为0.2、1.0mM的合成能力分别提高15%和8.5%。
(3)底物添加量对NMN合成量的影响
将实施例2构建的重组菌株NMN01划线于适当抗性的LB固体平板上,37℃过夜培养;挑选单菌落接种于含有卡纳和氯霉素的LB培养基中,37℃,220r/min,培养10~12h;按照2%转接量转接至30mL发酵培养基中,于37℃培养至OD600为0.6~1.0时,加入终浓度0.5mM IPTG诱导蛋白表达,并分别加入终浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0g/L的烟酰胺,定时取样,离心取上清,HPLC检测上清液中的NMN含量。结果如图5所示,在0.5g/L和2.0g/L的烟酰胺浓度下,NMN产量达1450mg/L以上,在1g/L烟酰胺浓度下菌体NMN的产量可达1871mg/L。
实施例4:应用不同拷贝数的质粒调整基因表达强度
按照实施例1~2的策略构建重组菌株,区别在于,将菌株NMN01的NMN转运蛋白质粒由pACYCDuet-1替换为pCDFDuet-1,获得的重组菌株命名为NMN02。
将重组菌株NMN02划线于适当抗性的LB固体平板上,37℃过夜培养;挑选单菌落接种于含有相应抗性的LB培养基中,37℃,220r/min,培养10~12h;按照2%转接量转接至30mL发酵培养基中,37℃培养至OD600为0.6~1.0时,于37℃,加入终浓度0.5mM IPTG诱导蛋白表达,并加入按终浓度计1g/L烟酰胺,定时取样,离心取上清,HPLC检测NMN的合成情况。结果如图6所示,在诱导24h后,重组菌株NMN01和NMN02分别可以积累1.9g/L、2.6g/L,在NMN的合成能力上重组菌NMN02更强,相比较NMN01提高36.8%。
实施例5:菌株NMN02扩大培养合成NMN
以重组菌NMN02为发酵菌株,利用5L发酵罐扩大培养。将菌株NMN02从甘油管中划线于含有相应抗性的LB固体培养基,37℃培养12h;挑选单菌落接种于含有相应的液体LB中,37℃,220r/min培养10h,按照5%-20%转接量转接至装有2.5L发酵培养基和5-10mL金属离子溶液的5L发酵罐中,初始条件:pH用35%氨水控制在6.0-7.0,通气量1-2vvm,转速300r/min-1000r/min与溶氧DO关联控制在30%-50%。待出现DO反弹时,用终浓度0.5~1mM的IPTG继续于37℃诱导,并分别在诱导0h、2h、4h、6h、8h时分别加入的烟酰胺2g/L烟酰胺(共计加入10g/L)。按时取样检测NMN的合成情况。结果显示,诱导24h可使NMN积累量在12.3g/L以上,OD达25~30。
实施例6:菌株NMN02扩大培养合成NMN
通过将胞内NMN的合成量与生长藕连,以获得更高的NMN浓度。具体实施方式同实施例5,区别在于,底物烟酰胺的补加方式变为流加,在加入诱导剂的同时开始恒速流加烟酰胺,实时检测培养基中烟酰胺的剩余,控制烟酰胺的浓度维持在相对低的浓度(<3g/L)。结果显示,重组菌株NMN02在5L发酵罐上,发酵25h(诱导20h)可以合成20.3g/L的NMN,共流加烟酰胺9.6g/L,剩余2.13g/L烟酰胺,消耗的烟酰胺向NMN的摩尔转化率为98.97%,OD可达30以上。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种具有烟酰胺单核苷酸合成能力的大肠杆菌工程菌株,其特征在于,含有烟酰胺磷酸核糖基转移酶、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶和转运蛋白;所述转运蛋白含有SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列;所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌株,其特征在于,所述工程菌株还敲除了pncC、ushA、nadR、purR基因。
3.一种重组载体,其特征在于,含有编码权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶基因和/或转运蛋白基因。
4.根据权利要求3所述的重组载体,其特征在于,携带所述转运蛋白基因的重组载体的骨架为pACYCDuet-1或pCDFDuet-1系列载体中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的重组载体,其特征在于,携带所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因和5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶基因的重组载体骨架为pET-28a(+)或pRSFDuet-1系列载体中的任意一种。
6.一种促进重组大肠杆菌合成NMN的方法,其特征在于,在大肠杆菌中过表达如SEQ IDNO.1所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶,如SEQ ID NO.2所示的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶,并过表达如SEQ ID NO.3所示NMN转运蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,还敲除大肠杆菌的pncC、ushA、nadR和purR基因。
8.一种发酵生产NMN的方法,其特征在于,以权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌株为发酵微生物,在35~40℃培养至OD600=0.6~1.0,用诱导剂诱导NMN的合成;
可选地,所述诱导剂为IPTG,浓度为0.5~1mM;
可选地,诱导温度为25~37℃;
可选地,诱导时间为24~36h。
9.含有权利要求1或2所述大肠杆菌工程菌株的发酵剂。
10.权利要求1或2所述的大肠杆菌工程菌株,或权利要求3~5任一所述的重组载体,或权利要求6~8任一所述的方法,或权利要求9所述的发酵剂在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域制备含NMN的产品中的应用。
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