CN112795582B - 一种适合在微生物中高效合成nad衍生物的酶基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO.1～7任一所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因VpNadV，并敲除pncC基因、ushA基因、nadR基因和purR基因，提高了大肠杆菌细胞中的NAD衍生物的积累量，并通过优化发酵条件，使NAD衍生物的积累量得到进一步提高，使5L发酵体系下可获得1g/L以上的NAD衍生物，在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域具有广泛的应用前景。

Description

一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因
技术领域
本发明涉及一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因，可适用于如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等，属于基因工程及生物工程技术领域。
背景技术
早在20世纪30年代，人们就发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)以辅酶的形式参与诸多的氧化还原反应，起到重要作用。当时Warburg等证明NAD可以作为氢受体和氢供体参与氧化还原过程。随着科技的发展、技术手段的更新，NAD及其前体、衍生物和代谢酶最近被证明在多种生物学功能中同样起决定性作用，从经典的氧化磷酸化和氧化还原反应到调节基因转录、寿命和细胞死亡，从神经传递到轴突变性，从调节葡萄糖稳态到控制昼夜节律，氧化应激与免疫激活、能量代谢和细胞活性之间都存在着密切的相互关系。在不同生物中，NAD的生物合成过程略有不同，但都主要包含两条途径：从头合成途径和补救合成途径。从头途径中的喹啉酸(QA)和补救途径中的烟酰胺(NAM)、烟酸(NA)和烟酰胺核糖苷(NR)。喹啉酸、烟酸和烟酰胺被三种不同的磷酸核糖基转移酶：喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QAPRT)、烟酸磷酸核糖基转移酶(NAPRT)和烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)用来催化合成各自的单核苷酸，即来自喹啉酸和烟酸的烟酸单核苷酸(NAMN)和来自烟酰胺的烟酰胺单核苷酸(NMN)。烟酸单核苷酸和烟酰胺单核苷酸随后被烟酰胺腺苷酸转移酶(Nampt/NadV)分别转化为烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)和NAD。NAD合成酶(NADS)将NaAD转化为NAD。
大肠杆菌作为一种重要的工业微生物，具有繁殖速度快、遗传背景清晰、基因编辑技术成熟等众多优点，是重要的异源蛋白表达宿主菌株，所以考虑将大肠杆菌作为NAD衍生物的合成宿主菌。在大肠杆菌中合成包含两条途径：以天冬氨酸起始的从头合成途径、以烟酸、烟酰胺和烟酰胺核糖苷存在的补救合成途径。天冬氨酸和烟酸经过不同的酶催化合成同一中间物烟酸单核苷酸(NaMN)，而烟酰胺需要脱氨转变为烟酸进而利用，缺少可以直接催化烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸的酶(烟酰胺磷酸核糖基转移酶)。而烟酰胺单核苷酸作为NAD的一种重要前体物质，增加NMN的合成途径、增强NMN的合成量，也可达到强化NAD合成量的作用。烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)主要存在于哺乳动物等高等动物，在某些细菌中也发现具有相同催化活性的酶。
目前NAD衍生物主要是通过酶法合成或化学合成等方法，但是这两种方式成本相比较微生物发酵法要更高一些。关于NAD衍生物的生物合成的相关报道非常少，并且检测到产量也是相对较低。所以寻找一种更高效的微生物合成法显得非常关键。上述提到的烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)具有潜在的应用能力，可以一步催化NAD衍生物。在大肠杆菌中异源表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶可以使得重组的大肠杆菌具有利用烟酰胺合成NAD衍生物的能力。由于原始的大肠杆菌中之前不存在表达烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因，需要表达来源不同的酶基因，根据文献相关报道，选取具有催化此反应能力的酶基因。从中筛选出最佳的酶基因。
发明内容
为解决上述问题，本申请旨在寻找最高效合成NAD衍生物的酶基因，构建最利于NAD衍生物积累的重组菌株，降低NAD衍生物的生产成本，为工业化生产做基础，促使其对合成生物学的发展具有潜在的指导价值和指导意义。
本发明的第一个目的一种编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～7任一所示。
本发明的第二个目的是提供含有所述基因的重组质粒，所述质粒上含有NAD衍生物合成途径的基因。
在一种实施方式中，编码所述烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因VpNadV的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述质粒上还含有编码PRPP合酶的基因BaPRS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，以pET28a作为质粒载体，连接有BaPRS和VpNadV，获得重组质粒pET28a+BaPRS+VpNadV。
本发明的第三个目的是提供表达所述基因的重组微生物细胞，或携带所述重组质粒的重组微生物细胞。
在一种实施方式中，所述重组微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌。
在一种实施方式中，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统改造E.coli BL21(DE3)，敲除pncC基因，获得改造菌株F001 E.coli BL21(DE3),ΔpncC。
在一种实施方式中，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统改造F001 E.coli BL21(DE3),ΔpncC，敲除ushA基因，获得改造菌株F002 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA。
在一种实施方式中，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统改造F002 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA，敲除nadR基因，获得改造菌株F003 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR。
在一种实施方式中，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统改造F003 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR，敲除purR基因，获得改造菌株F004 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR、ΔpurR。
本发明的第四个目的是提供一种促进重组大肠杆菌合成NAD衍生物的方法，是在大肠杆菌中过表达如SEQ ID NO.4所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因VpNadV，并敲除pncC基因、ushA基因、nadR基因和purR基因；所述pncC基因在NCBI数据库中的Gene ID为947169，ushA基因的Gene ID为947331，nadR基因的Gene ID为948911，purR基因的Gene ID为945226。
在一种实施方式中，所述方法还包括在培养所述重组大肠杆菌时，采用IPTG诱导。
在一种实施方式中，所述方法按照1％-5％转接量转接至TB培养基中，35～37℃，培养1.5-2h至OD600＝0.6-1.0，再降温至24～26℃，加入终浓度0.2mM-1mM IPTG，并添加100mg-1000mg/L的烟酰胺。
在一种实施方式中，所述NAD衍生物包括但不限于：NR、NMN、NAD或NADH。
本发明的第五个目的是提供上述的重组大肠杆菌在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域制备含NAD衍生物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明基于已知的NAD衍生物在不同菌株中的代谢网络，并且将来源的烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)在大肠杆菌中异源表达，增加大肠杆菌内源的NAD代谢途径，强化NAD衍生物的生物合成。基于CRISPR-Cas9技术将大肠杆菌内源存在的对NAD衍生物具有分解作用的酶基因进行敲除。获得一株更适合用于合成NAD衍生物的重组菌株。选取多种不同来源的酶基因(Nampt/NadV)，连接在表达载体pET28a上，获得多个重组质粒，pET28a+MmNampt、pET28a+HdNadV、pET28a+VpNadV、pET28a+TnPBEF、pET28a+RsNadV、pET28a+FtNadV、pET28a+abNadV，转化入上述提到的改造菌株中，获得多株重组菌株，经过蛋白表达情况、NAD衍生物胞内含量变化，最终确定来源于噬菌体KVP40且基于大肠杆菌进行密码子偏好性进行优化后的酶基因VpNadV更适合在大肠杆菌中表达用于NAD衍生物的合成。
附图说明
图1为重组载体pET28a+VpNadV质粒图。
图2为重组载体pET28a+BaPRS+VpNadV质粒图。
图3为改造大肠杆菌敲除pncC菌落PCR验证的凝胶电泳图，其中，泳道1为marker，2-7泳道为成功敲除pncC菌株PCR结果。
图4为改造大肠杆菌敲除nadR菌落PCR验证的凝胶电泳图，其中，泳道1为未成功敲除，2-4为成功敲除nadR菌株PCR结果，泳道5为marker。
图5为改造大肠杆菌敲除ushA菌落PCR验证的凝胶电泳图，其中，泳道1为marker，泳道4、7、9为未成功敲除，2、3、5、6、8为成功敲除ushA菌株PCR结果。
图6为改造大肠杆菌敲除purR菌落PCR验证的凝胶电泳图，其中，泳道1为marker，泳道2为未成功敲除，泳道3、4为成功敲除purR菌株PCR结果。
图7为重组大肠杆菌、对照以及标品的LC-MS图。
图8为摇瓶水平NAD衍生物的合成量。
图9为5L发酵罐水平NAD衍生物的合成量。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。加入15g/L琼脂条，以配制LB固体培养基。
TB培养基：酵母浸粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油5g/L、K2HPO4 12.54g/L、KH2PO42.31g/L。
合成培养基一：KH2PO4 6g-12g/L、K2HPO4 16g-30g/L、硫酸铵5g-10g/L、一水柠檬酸1g-5g/L、MgSO4.7H2O 1g-5g/L、酵母粉10-30g/L、甘油30g-100g/L。
合成培养基二：KH2PO4 6g-12g/L、K2HPO4 16g-30g/L、硫酸铵5g-10g/L、一水柠檬酸1g-5g/L、MgSO4.7H2O 1g-5g/L、酵母粉10-30g/L、葡萄糖15g-50g/L。
发酵培养基：KH2PO4 3g/L、K2HPO4 7.33g/L、柠檬酸0.85g/L、硫酸铵15g/L、金属离子溶液5ml、葡萄糖20g/L、MgSO4.7H2O 1g/L、酵母粉5g/L、消泡剂4滴；补料培养基：葡萄糖700g/L、硫酸铵73g/L、MgSO4.7H2O 9g/L、酵母粉5g/L、金属离子溶液15ml、浓盐酸1ml。
(二)溶液
100g/L的烟酰胺溶液：5g烟酰胺溶于50mL的超纯水，并且过滤除菌。
(三)NAD衍生物的HPLC检测：利用色谱柱(250×4.6mm,5μm,Thermo-Fisher,MA,USA)，在30℃检测条件用日本岛津的SPD-20A检测器，流动相为20mM乙酸铵，含有5％的乙腈，再加入0.5％的氨水；流速：0.5mL/min；检测波长：259nm；柱温箱温度：30℃。
(四)大肠杆菌化学转化法：将大肠杆菌JM109划线于固体LB平板上，37℃培养12h，挑选单菌落接种于液体LB培养基中，37℃，220rpm/min生长10h，按照1％的接种量转接至新鲜的25mL液体LB培养基中，37℃培养1.5-2h，待OD600长至0.6-1，收菌制作感受态细胞。
大肠杆菌感受态的制作使用TaKaRa的Competent Cell Preparation Kit感受态制作试剂盒，具体操作流程参照使用说明。制作好的感受态细胞保存在-80℃条件，后续可以转化质粒或者片段等。
(六)质粒组装方法：Gibson反应体系如下，DNA片段加入50ng，载体加入100ng，Gibson mix加入5μL，加入无菌超纯水至体系10μL。反应条件如下，50℃反应60min，反应结束后立即置于冰上。取10μL转化至大肠杆菌感受态JM109。
无缝克隆反应体系如下，目的基因40ng，载体加入100ng，反应酶混合液5μL,加入无菌超纯水补齐至10μL。反应条件如下，50℃反应60min，反应结束后立即置于冰上。取10μL转化至大肠杆菌感受态JM109。
实施例1：NAD衍生物生物合成关键基因的全基因合成
分别合成如SEQ ID NO.1～7所示的基因。
表1不同来源的NAD衍生物生物合成基因
基因名称 基因来源 核苷酸序列
TnPBEF Tetraodon nigroviridis SEQ ID NO.1
FtNadV Francisella tμLarensis SEQ ID NO.2
abNadV Acinetobacter baumannii SEQ ID NO.3
VpNadV Vibrio bacteriophage KVP40 SEQ ID NO.4
MmNampt Mus muscμLus SEQ ID NO.5
HdNadV Haemophilus ducreyi SEQ ID NO.6
RsNadV Ralstonia solanacearum SEQ ID NO.7
实施例2：烟酰胺衍生物合成途径相关基因表达载体的构建
(1)TnPBEF表达框的构建
以TnPBEF合成序列为模板，设计引物对F1/R1，以该引物对进行PCR扩增，选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化，以载体pET28a为模板，设计引物对F2/R2，以该引物对进行PCR扩增，选择PhantaMasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将片段TnPBEF和载体pET28a重组为载体pET28a+TnPBEF。并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pET28a+TnPBEF。
(1)VpNadV表达框的构建
以VpNadV合成序列为模板，设计引物对F3/R3，以该引物对进行PCR扩增，选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，1min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化，以载体pET28a为模板，设计引物对F4/R4，以该引物对以该引物对进行PCR扩增，选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化。通过无缝克隆组装的方法将片段VpNadV和载体pET28a重组为载体pET28a+VpNadV。并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pET28a+VpNadV。
按照上述相同的的构建策略，用引物F5/R5、F6/R6构建重组质粒pET28a+FtNadV、用引物F7/R7、F8/R8构建重组质粒pET28a+RsNadV、用引物F9/R9、F10/R10构建重组质粒pET28a+abNadV、用引物F11/R11、F12/R12构建重组质粒pET28a+HdNadV、用引物F13/R13、F14/R14构建重组质粒pET28a+MmNampt。
表2引物信息
Figure GDA0003811931210000061
Figure GDA0003811931210000071
实施例3：强化PRPP合成组合质粒的构建
烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)可以催化烟酰胺一步合成NAD衍生物，该酶还需要另一个底物PRPP。在大肠杆菌中，由prs编码的PRPP合酶是PRPP的主要来源，而该酶收到purR编码的调控因子调节。为了强化PRPP的合成，首先需要通过质粒过表达PRPP合酶基因prs，将prs基因连接在之前构建的重组质粒pET28a+FtNadV、pET28a+RsNadV、pET28a+abNadV、pET28a+HdNadV、pET28a+MmNampt上，获得强化PRPP合成的重组质粒pET28a+BaPRS+FtNadV、pET28a+BaPRS+RsNadV、pET28a+BaPRS+abNadV、pET28a+BaPRS+HdNadV、pET28a+BaPRS+MmNampt.
合成如SEQ ID NO.8所示的PRPP合酶基因，该基因BaPRS来源解淀粉芽孢杆菌且突变后具有抗ADP等反馈抑制的能力，可以更好的合成PRPP，供给合成NAD衍生物所需。
以pET28a+TnPBEF、pET28a+VpNadV、pET28a+FtNadV、pET28a+RsNadV、pET28a+abNadV、pET28a+HdNadV、pET28a+MmNampt为模板，设计引物对F15/R15、F16/R16、F17/R17、F18/R18、F19/R19、F20/R20、F21/R21，以该引物对进行PCR扩增，选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，3min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化，分别获得片段pET28a+TnPBEF-1、pET28a+VpNadV-1、pET28a+FtNadV-1、pET28a+RsNadV-1、pET28a+abNadV-1、pET28a+HdNadV-1、pET28a+MmNampt-1。以BaPRS为模板，设计引物对F22/R22，以该引物对进行PCR扩增，选择Phanta MasterMix(Vazyme公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化，获得片段BaPRS+TnPBEF、BaPRS+VpNadV、BaPRS+FtNadV、BaPRS+RsNadV、BaPRS+abNadV、BaPRS+HdNadV、BaPRS+MmNampt。通过无缝克隆组装的方法将片段BaPRS+TnPBEF、BaPRS+VpNadV、BaPRS+FtNadV、BaPRS+RsNadV、BaPRS+abNadV、BaPRS+HdNadV、BaPRS+MmNampt以及载体pET28a+TnPBEF-1、pET28a+VpNadV-1、pET28a+FtNadV-1、pET28a+RsNadV-1、pET28a+abNadV-1、pET28a+HdNadV-1、pET28a+MmNampt-1重组为载体并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送上海生工测序，比对正确后得到正确的重组载体pET28a+BaPRS+TnPBEF、pET28a+BaPRS+VpNadV、pET28a+BaPRS+FtNadV、pET28a+BaPRS+RsNadV、pET28a+BaPRS+abNadV、pET28a+BaPRS+HdNadV、pET28a+BaPRS+MmNampt.(见图1)。
表3引物信息
Figure GDA0003811931210000081
Figure GDA0003811931210000091
实施例4：合成NAD衍生物底盘菌株E.coli BL21(DE3),ΔpncC的构建
在大肠杆菌中存在着分解NAD衍生物的酶基因，为减少内源酶对NAD衍生物的降解，保留这些分解酶的基因就可能会对后期NAD衍生物的积累产生负面影响，所以需要利CRISPR-Cas9基因编辑系统，将内源的酶基因进行敲除。原始的大肠杆菌中，存在着编码分解NAD衍生物的酶基因。其中具有分解作用的酶基因：pncC和ushA，调控基因：nadR和purR。pncC编码NMN氨基水解酶可以将烟酰胺单核苷酸(NMN)脱氨为烟酸单核苷酸(NaMN)；ushA编码的5’-核苷酸酶可以将烟酰胺单核苷酸降解为烟酰胺核糖苷(NR)；nadR编码的酶具有调控NAD衍生物合成的能力，当NAD衍生物浓度达到一定量时会抑制烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)；purR具有调控PRPP的能力，PRPP作为烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt/NadV)的另一重要底物，PRPP的供给对于NAD衍生物的合成也具有重要意义。
利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对相关酶基因进行敲除，将来源本实验室构建的含有Cas9蛋白的质粒pCas9通过化学转化法转入E.coli BL21(DE3)感受态中，涂板于含有Kana抗性的平板上，37℃过夜培养20h；挑选单菌落接种于含有Kana的液体LB中，30℃，220rpm/min培养12h；按体积计1％-5％接种量转接至新鲜的LB中，同时加入10g/L-50g/L阿拉伯糖；30℃培养1.5-2h，待OD600长至0.2时，再加入1％-5％阿拉伯糖；继续培养至OD600＝0.6-1，收菌制作电转感受态。电转感受态细胞需要用10％的无菌甘油清洗两次，再用10％甘油重悬，-80℃保存。
将同源片段T-pncC和pncC-sgRNA质粒加入之前制作好的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kV电击5ms，加入1mL预冷LB液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1-2h后，涂布添加相应抗生素的LB平板，30℃培养24h。使用通用引物sgRNA-F(CTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG)与pncC特异引物YAN-pncC-sgRNA-R(CGTTGTTCACTTCAACTAGTATTATACCTAGGAC)进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子，得到菌株F001(E.coli BL21(DE3),ΔpncC)。
在F001的基础上需要继续敲除其他分解及调控基因，需要消除菌株内的pncC-sgRNA，接种于含有相应抗性的液体LB时，加入终浓度0.5mM-1mM的IPTG可诱导Cas9蛋白将质粒pncC-sgRNA切割，整个过程培养温度保持在30℃，防止温敏的pCas9质粒丢失。验证pncC-sgRNA质粒消除完成后，以F001菌株按照之前的流程制作电转感受态，用于实施例5敲除下一个基因做准备。
实施例5：合成NAD衍生物底盘菌株E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA的构建
将同源片段T-ushA和ushA-sgRNA质粒加入实施例4构建的大肠杆菌F001的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kV电击5ms，加入1mL预冷LB液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1-2h后，涂布添加相应抗生素的LB平板，30℃培养24h。使用通用引物sgRNA-F(CTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG)与ushA特异引物YAN-ushA-sgRNA-R(TCGCCGCGATAATAACTAGTATTATACCTA)进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子，得到菌株F002(E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA)。
在F002的基础上需要继续敲除其他分解及调控基因，需要消除菌株内的ushA-sgRNA，接种于含有相应抗性的液体LB时，加入终浓度0.5mM-1mM的IPTG可诱导Cas9蛋白将质粒ushA-sgRNA切割，整个过程培养温度保持在30℃，防止温敏的pCas9质粒丢失。验证ushA-sgRNA质粒消除完成后，以F002菌株按照之前的流程制作电转感受态，为实施例6敲除下一个基因做准备。
实施例6：合成NAD衍生物底盘菌株E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR的构建
将同源片段T-nadR和nadR-sgRNA质粒加入制作好F001的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kV电击5ms，加入1mL预冷LB液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1-2h后，涂布添加相应抗生素的LB平板，30℃培养24h。使用通用引物引物sgRNA-F(CTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG)与ushA特异引物YAN-nadR-sgRNA-R(TGGTGGTATTGAAGACTAGTATTATACCTAGG)进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子，得到菌株F003(E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR)。
在F003的基础上需要继续敲除其他分解及调控基因，需要消除菌株内的nadR-sgRNA，接种于含有相应抗性的液体LB时，加入终浓度0.5mM-1mM的IPTG可诱导Cas9蛋白将质粒nadR-sgRNA切割，整个过程培养温度保持在30℃，防止温敏的pCas9质粒丢失。验证nadR-sgRNA质粒消除完成后，以F003菌株按照之前的流程制作电转感受态，为敲除下一个基因做准备。
实施例7：合成NAD衍生物底盘菌株E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR、ΔpurR的构建
将同源片段T-purR和purR-sgRNA质粒加入制作好F001的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。混合液再加入到1mm电转杯(至于冰上预冷)中，1.8kV电击5ms，加入1mL预冷LB液体培养基。30℃，220r/min摇床复苏1-2h后，涂布添加相应抗生素的LB平板，30℃培养24h。使用通用引物sgRNA-F(CTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG)与ushA特异引物YAN-purR-sgRNA-R(GGGAGTAGTGTAATACTAGTATTATACCTAGGACT)进行菌落PCR验证，筛选阳性转化子，得到菌株F004 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR、ΔpurR。
获得的F004改造菌株，作为后续发酵的底盘菌株，需要将胞内所包含的CRISPR-Cas9系统使用的质粒消除掉。消除菌株内的purR-sgRNA，接种于含有相应抗性的液体LB时，加入终浓度0.5mM-1mM的IPTG可诱导Cas9蛋白将质粒purR-sgRNA切割，验证ushA-sgRNA质粒消除完成后，继续将pCas9质粒去除，接种于无抗的液体LB培养基中，42℃，培养6h-10h。验证pCas9质粒消除后，菌株-80℃保藏。
表4引物信息
Figure GDA0003811931210000111
Figure GDA0003811931210000121
实施例8：NAD衍生物合成途径的解析
将测序正确的重组载体pET28a+BaPRS+TnPBEF、pET28a+BaPRS+VpNadV、pET28a+BaPRS+FtNadV、pET28a+BaPRS+RsNadV、pET28a+BaPRS+abNadV、pET28a+BaPRS+HdNadV、pET28a+BaPRS+MmNampt分别转化入原始菌株E.coli BL21(DE3)中，涂板于含有相应抗性的平板，37℃，培养12h；挑选单菌落接种于含有相应的液体LB中，37℃，220rpm/min培养10h，按照1％-5％转接量转接至TB培养基中，37℃，培养1.5-2h至OD600＝0.6-1.0降温至25℃，加入终浓度0.2mM-1mM IPTG，同时添加100mg-1000mg/L的烟酰胺。诱导3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h取样，由于NAD衍生物存在于胞内没有转运载体，所以需要破碎细胞，检测胞内物质。取1mL样品离心去上清，用pH＝7.0的PBS缓冲液重悬细胞，超声破碎，离心去除细胞碎片，制成液相检测样品。但是HPLC并没有检测到相应NAD衍生物的生成。
将测序正确的重组载体pET28a+BaPRS+TnPBEF、pET28a+BaPRS+VpNadV、pET28a+BaPRS+FtNadV、pET28a+BaPRS+RsNadV、pET28a+BaPRS+abNadV、pET28a+BaPRS+HdNadV、pET28a+BaPRS+MmNampt分别转化入改造菌株F004 E.coli BL21(DE3),ΔpncC、ΔushA、ΔnadR、ΔpurR中，涂板于含有相应抗性的平板，37℃，培养12h；挑选单菌落接种于含有相应的液体LB中，37℃，220rpm/min培养10h，按照1％-5％转接量转接至TB培养基中，37℃，培养1.5-2h至OD600＝0.6-1.0降温至25℃，分别加入终浓度0.5mM-1.0mM IPTG诱导，并添加200mg-4000mg/L的烟酰胺。分别于诱导3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h取样，取1mL样品离心去上清，用pH＝7.0的PBS缓冲液重悬细胞，超声破碎，离心去除细胞碎片，制成液相检测样品含量，并采用LC-MS确定NAD衍生物，检测结果显示(图7)，在对照组(不含重组质粒或原始菌株)中均未检测到NAD衍生物，而在重组菌株HF001发酵12h的样品中可检测到20mg/LNAD衍生物。
表5不同菌株中NAD衍生物含量
菌株含有的质粒 NAD衍生物含量
pET28a+BaPRS+VpNadV 20.0mg/L
pET28a+BaPRS+TnPBEF 5mg/L
pET28a+BaPRS+FtNadV 7.6mg/L
pET28a+BaPRS+RsNadV 10.3mg/L
pET28a+BaPRS+abNadV 6.8mg/L
pET28a+BaPRS+HdNadV 6.5mg/L
pET28a+BaPRS+MmNampt 未检测到
根据LC-MS鉴定结果，确定有NAD衍生物的合成。并且在含有pET28a+BaPRS+TnPBEF、pET28a+BaPRS+VpNadV、pET28a+BaPRS+FtNadV、pET28a+BaPRS+RsNadV、pET28a+BaPRS+abNadV、pET28a+BaPRS+HdNadV、pET28a+BaPRS+MmNampt的菌株发酵结果显示，其中pET28a+BaPRS+VpNadV胞内NAD衍生物的量更优于其他酶基因。
实施例9：大肠杆菌合成NAD衍生物最适酶基因的鉴定
以含有pET28a+BaPRS+VpNadV的重组菌HF001作为发酵菌株，在摇瓶水平进行优化。挑选单菌落接种于含有相应的液体LB中，37℃，220rpm/min培养10h，获得种子液，分别将种子液以1％的接种量接种于TB培养基、合成培养基一和合成培养基二中，37℃，220rpm/min培养1.5-2h，待OD长至0.6-1时，分别降温于25、30、37℃条件下加入0.5～1.0mM的IPTG诱导。在诱导同时，按照不同的实验组(一次补料或分批补料)添加底物烟酰胺，一次补料是在诱导同时一次补加1g/L烟酰胺，分批补料为分别在诱导0h、2h、4h、6h、8h每次补加200mg/L烟酰胺。
不同发酵条件的发酵结果如图8所示，30℃时NAD衍生物的积累量达134mg/L，比其它温度下的积累效果提高了30％以上；不同的补料方式：一次补料和分批补料，结果显示分批补料效果优于一次补料50％以上；更换不同的培养基：TB、合成培养基一、合成培养基二，其中合成培养基二的效果更优，NAD衍生物可以积累156mg/L。
实施例10：菌株HF001扩大培养合成NAD衍生物
以HF001为发酵菌株，尝试利用5L发酵罐扩大培养。在更好的环境下，是否更利于NAD衍生物的合成与积累。从甘油管中划线于含有相应抗性的平板，37℃，培养12h；挑选单菌落接种于含有相应的液体LB中，37℃，220rpm/min培养10h，按照5％-20％转接量转接至装有5L合成培养基2的发酵罐中，初始条件：pH用35％氨水控制在6.0-7.0，通气量1-2vvm，转速400rpm/min-1000rpm/min与溶氧DO关联控制在30％-50％。待出现DO反弹时，降温至25～30℃用0.5～1mM的IPTG诱导，并分别在诱导0h、2h、4h、6h加入终浓度2g/L的烟酰胺(共加入8g/L)。取样破碎细胞，检测胞内NAD衍生物浓度。结果显示，诱导8h可使NAD衍生物积累量在500mg/L以上，OD达15～20。
实施例11：菌株HF001扩大培养合成NAD衍生物
通过将胞内NAD衍生物的合成量与生长藕连，以获得更高的NAD衍生物浓度。具体实施方式同实施例10，区别在于，将合成培养基2更换发酵培养基，采用相同的方法诱导，并分别在诱导0h、2h、4h、6h加入终浓度5g/L的烟酰胺(共加入20g/L)。结果显示，含有pET28a+BaPRS+VpNadV的重组菌株在5L发酵罐上，诱导8h可以合成1g/L的NAD衍生物，OD可达25以上。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种适合在微生物中高效合成NAD衍生物的酶基因
<130> BAA201349A
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> Tetraodon nigroviridis
<400> 1
atggaacacc gtgattctga ttttaacatc ctgctggcga ccgactctta caaagttacc 60
cactacaaac agtacccgcc gaacacctct aaagtttact cctacttcga atgccgtgaa 120
aaacgtaccg atccgtctaa atctcgtaaa gtgacctacg ataaaaccgt tttctacggt 180
ctgcagtata tcctgcacaa atacctgaaa ggcaaagttg ttaccccgga aaaaatccag 240
gaagcgaaag acgtttaccg tgaacacttc caggatgacg ttttcaacga aaaaggctgg 300
acctacatcc tggaaaaata caacggtcac ctgccgatcg aaatcaaagc agttccggaa 360
ggttccgtta tcccgcgtgg taacgttctg ttcaccgttg aaagcaccga tccggaatgt 420
tactggctga ccaactgggt tgaaaccatc ctggttcaga tctggtaccc gatcaccgtt 480
gcgaccaaca gccgtgaaca gaagaaaatc ctggcgcagt acctgctgga aaccagcggc 540
tctctggaag gcctggaata caaactgcac gatttcggct accgtggcgt gagctcccag 600
gaaaccgcgg gtatcggcgc tagcgctcac ctggttaact ttaaaggcac cgataccgtt 660
gcgggcatcg gcgtgatcaa aaaattctac ggcaccaaag atccggtgcc gggtttctct 720
ctgccggcgg cggaacacag cactatcacc gcatggggta aagatcacga aaaagatgcg 780
ttcgaacaca tcgttaaaca gttcccgtct gttccggtta gcgttgtgag cgactcttac 840
gatatctaca acgcgtgtga aaaaatttgg ggcgaagatc tgcgtagcct gatcgaaact 900
cgtagcgcag acgcgccgct ggttgttcgt ccggattctg gtaacccgct ggataccgtg 960
ctgaaagttc tggaaatcct gggcaaaaaa ttcatcccgg ttgaaaactc caaaggctac 1020
aaagtgctgc cgccgtacat ccgtgttatt cagggtgatg gcgttgacat caacaccctg 1080
caggaaatcg tggaaggtat gaaagaacac aaatggagca ttgaaaacat cgcgttcggc 1140
tccggtggtg cgctgctgca gaaactgacc cgtgatctgc tgaactgctc tttcaaatgc 1200
tcttacgttg ttaccaacgg tctgggcgtt aacgttttca aagatccggt tgcggatccg 1260
aacaaacgta gcaaaaaagg tcgtctgtcc ctgcaccgta cccagtccgg tgatttcgtg 1320
accctggaag aaggtaaagg tgacctggaa gaatacggcg cggatctgct gcacaccgtt 1380
ttccagaacg gtaaaattgt taaaacctac accttcgatg aagttcgtga taacgctaaa 1440
ctgaaagaat ctgaactgca ggaactgctc gag 1473
<210> 2
<211> 1413
<212> DNA
<213> Francisella tμLarensis
<400> 2
atgagcttcg ataacctgct gctgatgacc gatagctaca aacacagcca ccgttaccag 60
tacccgcgtg atacccacta cctgcacttc tacctggaaa gccgtggcac cgcgaacaaa 120
gacctgggca actacaccaa attcttcggt ctgcagtact acgttaaaaa atacctgagc 180
cagccgatca cccagcagat gattgatgac gcagaaaaaa tcctgctggc gcacggtctg 240
ccgttctacc gctctggttt cgaaaaaatc ctgaacaact acaacggcta cctgccgatc 300
cgtatccgcg cagtgcgtga aggtagcctg atcccgctgc acaacgttct gatgaccatc 360
gaatccaccg atgaagaact gttctggctg ccgggtttcg ttgaaaccct gctgctgaaa 420
gtttggtacc cgactaccgt tgcgaccatc tcttttaaca ttaaacagct gattaaacgt 480
tacctgctgg aaaccgcgga ttctctggac aaactggatt tcatgctgca cgatttcggc 540
taccgtggcg tttcttctga agaatctgcg ggtatcggcg gcgcagcgca cctgaccaac 600
tttctgggta ccgataccct ggcagcgctg cacgtgtgca aagaattcta cgcggaagat 660
atggccggct tctctatccc ggcgtctgaa cacagcacca tgacctcttg gggtgttggc 720
actgaatgtg aacgtgaagc tttcgaaaac atgattgcgc agttcggcga tagctccgtt 780
ctgtacgcgt gcgtttccga ttcttgggat ttcaaaaaag cgatccagac ctgggttgat 840
ctgaaagacc gcgttaccgc gaaaaaagct aacctggtta tccgcccgga ttccggtgat 900
gcggttgata acattctgta tgcgctgtat gaactggaca aaggctacgg ctctcgtctg 960
aacagcaaag gttacaaagt tctgaacaac gtggcgctga tccagggcta ctctgttagc 1020
atctctctgg ctaaaaaagt tctggaagcg atgaaaattc agggttactc cgcagaaaac 1080
atcgcattcg gtatgggcgg tgctctgctg cagggtaact acgaatctag catcaaccgt 1140
gacagcttca aattcgcgat caaatgctcc gcgattatgc gtggtaacac cctgattggc 1200
gtgaaaaaag aaccgatcac cgacctggcc aaaaaatcca aacagggtcg tctggatctg 1260
atcaaagatg cgaaaggtaa ctacaaaacc attgttctgg atgacagcta cgcgctgggt 1320
gaataccacc cggaaagcca gctgcagacc tattatgata acggcgaaat caaattcgaa 1380
cagtccctgg cgcagatccg taactacacc aac 1413
<210> 3
<211> 1494
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 3
atgaccatta aactgaaccc gctgaacgcg attgatttct ataaagcgga tcaccgccgt 60
cagtacccgg cgggcaccga atacgtttac gctaacttca ccccgcgttc tagccgtctg 120
gctaaaatgc tgccggattt cgatgacaaa gttgttttct tcggcctgca gggcttcatt 180
aaacactttc tgatcgatac ctggaacgaa ggcttcttca aacagccgaa agataaagtt 240
gttgctgcgt ataaacgccg tatggattct tccctgggtg aaggtgctgt tccggtggat 300
cacattgaag cgctgcatga tctgggctac ctgccgctgc gcattaaagc actgccggaa 360
ggctctcgtg tgaacatgcg tgtgccggtt ctgaccgtta ttaacaccga tccgcgcttc 420
ttttggctga ccaactacat cgaaaccgtg ctgtctgccg aactgtggaa atcctgcacc 480
actgcaacca tcgcttacga atataaacgc ctgctgaccc agtacgcggt taaaaccggc 540
gcgccgctgg atttcgttcc ggttcagggt cacgatttct cttctcgtgg tatgagcggt 600
atctatgatg cggctcagtc tggtgttggc cacctgacta gcttcatcgg caccgactct 660
gttgcatcta ttgattacgc ggaggaatac tacaacgcta ccggtgtgat tggtgtttct 720
gttccggcaa ccgaacattc tgtgatgtgc atgggtaccg aagatagcga actggaaacc 780
tttaaacgtc tgatctgcga actgtatcca agcggcgtcg tttctatcgt tagcgacacc 840
tgggacttct ggcgtgtgat caccgaattt accgttgcgc tgaaaccgga aatcctggcg 900
cgtcagccga acgccctggg tctggcgaaa cttgtattcc gtccggatag cggtgatccg 960
gttaaaatca tctgtggcga tccggatgcg gaagttggta gcccggcgta taaaggcgcg 1020
gttgaatgcc tgtgggaagt ttttggtggt accaccaccg accagggcta caaagttctg 1080
aacgaacgtg tgggcctgat ttacggtgat tctatcaccc tggaccgtgc tcagcgtatc 1140
ctggaaggcc tggaagcgaa aggcttcgcg tctaacaacc tggttttcgg tattggtagc 1200
tttacctata actatctgac ccgcgatacc ttcggcttcg cggttaaagc gacctggggc 1260
caggttaacg gtgttggtcg tgaactgttc aaagatccga tcaccgactc cggcgtgaaa 1320
aaatctgcga aaggcctgct gcgtatcgaa gaaaacgata acggcttcac tctgtttgat 1380
gaacagaccg ctgaacagga acagggcggt gctctgaaaa ccgttttcga aaacggtaaa 1440
ctgcagtacg aatgcaccct ggatcagatc cgtgaacgtc tgagcatcgc gtaa 1494
<210> 4
<211> 1494
<212> DNA
<213> Vibrio bacteriophage
<400> 4
atgggcctga acctgaacca gaacatcgcg atcgcgaccg atagctacaa agtttctcac 60
tggtctcagt tcccgcgtgg tctggaatac tctcagtact atgttgaatc tcgtggcggt 120
aaattcgata aaatcatggt tgacggcatg gcgtatatgt gtcgtatcct ggaaaaaggt 180
gtgagcatga acgatgttaa acgtgcaaaa cgcctgttca aaaaacactt cggtagcgaa 240
gttttcaacg ataaaggttg ggatatcatc gttaacgaac tgaaaggtaa actgccgatc 300
aaaatccgtg cggtgaaaga aggtaccgtt gttccggtga aacacccgat cctgaccatc 360
gaaaacaccg atccgcgttt cggttggctg ccgggctacc tggaaacctt catcctgcgt 420
gcgctgtggt acccgaccac cgttgccacc atcagcttcg aagtgaagaa aattatccgt 480
cagttcatga agaaaaccgt tgatgatgaa cgtatcgcag aacaggaacc gttcaaactg 540
catgatttcg gtagccgtgg cgttagctct ggtgaatctg cggcgatcgg tggtagcgcg 600
cacctgaaaa acttcctggg taccgatacc gttgaagcgt tagtggcggt tgaagaactg 660
tatgcggaag acgttgaaga tttcatcgcg ggtttctcca ttccggcgcg tgaacacagc 720
accaccacca tctataaaga agcgggtgaa gatcaggcgt tcctgaactc tattgaacag 780
tggggtgcgg cgctgtacgc gtgcgtgatg gattcttacg attacgaagc ggcgatgaac 840
cgtgtttcta ccggccgttt caaagaactg attatctcca aaggtggcac cttcgttgcg 900
cgtccggatt ctggcgtgcc ggttgatgtt gttatgaaag gtctggaaat cctgggtaaa 960
aacgttggtt acaccatcaa ctctaaaggt tacaaagttc tgcacccgtc ttaccgtatc 1020
atccagggtg atggcgttaa catcgaagaa attcgtcgta tcctgagcta catggaatct 1080
aaaggttgga gcgctgaaaa catcgcgttc ggcatgggcg gcggcctgct gcagcagctg 1140
gatcgtgaca cccagcgttt cgcgatgaaa atgtctgcgg cgatcatcaa cggtgaatat 1200
gtttccgttt tcaaaatgcc gaaaactgat ccgaccaaag cgtctaaagc gggctttctg 1260
gacctgatcg cggttgatgc ggataacccg aacccggcgg cgcgtggtta tgttaccttc 1320
agctctgaag attacgataa ccgtgttcac ccgaaatccg ttatgcagac catcttcgaa 1380
gatggcgtta ccgtggcaga tttcagcctg gaagaagctc gtaaactgtc tgacgttcag 1440
gctgacttcc tgaacgaagg tgaatggaaa atcgcgaaaa agatccagac cgcg 1494
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<211> 1476
<212> DNA
<213> Mus muscμLus
<400> 5
atgaatgcgg cggcggaggc cgagttcaac attctgctcg cgaccgatag ctataaagtg 60
acccactata agcagtaccc gccaaacacg agcaaggtgt acagttattt tgaatgccgt 120
gagaagaaga ccgagaatag caaggtgcgc aaggtgaagt acgaagagac cgtgttctac 180
ggtctgcagt acattctgaa caagtacctc aagggcaagg tggttacgaa ggagaagatc 240
caagaagcca aagaggttta ccgcgaacat ttccaagatg acgtgtttaa cgaacgcggc 300
tggaactaca tcctcgagaa atacgacggc catctgccga ttgaggtgaa ggccgtgccg 360
gaaggtagcg tgatcccacg cggcaacgtt ctgttcaccg tggagaatac cgatccggag 420
tgttactggc tgaccaactg gatcgagacg attctggttc agagctggta tccgatcacc 480
gtggccacga atagccgcga acagaaaaag attctggcca agtatctgct ggagacgagt 540
ggcaatctgg acggtctgga gtacaaactg catgacttcg gctaccgcgg tgtgagcagc 600
caagaaacgg cgggtattgg tgccagcgcc cacctcgtga atttcaaagg caccgacacg 660
gttgcgggca tcgcgctcat caagaagtat tacggcacga aggacccggt tccgggttat 720
agtgtgccag ccgccgaaca cagcaccatt accgcgtggg gcaaggacca cgagaaagac 780
gcgtttgagc atatcgtgac gcagttcagc agcgttccag tgagcgttgt gagcgacagt 840
tacgacatct acaacgcgtg cgagaagatc tggggcgagg atctgcgcca tctgatcgtt 900
agccgtagca ccgaggcgcc actcattatc cgcccggata gcggcaatcc gctggatacc 960
gtgctgaagg tgctggacat tctgggcaaa aagttcccgg tgaccgagaa cagcaagggc 1020
tataaactgc tgccgccata tctgcgcgtg atccaaggcg atggcgttga catcaacacg 1080
ctgcaagaga tcgtggaggg catgaaacag aaaaaatgga gcatcgagaa cgttagtttc 1140
ggtagcggtg gtgcgctgct gcaaaagctc acgcgcgatc tgctgaactg tagcttcaag 1200
tgcagctatg tggttacgaa cggtctgggc gttaacgtgt tcaaagaccc ggttgccgac 1260
ccaaacaagc gtagcaagaa gggccgtctc agtctccatc gcacgccagc cggcaatttc 1320
gtgacgctcg aagaaggcaa gggtgacctc gaggaatacg gccacgatct gctgcatacc 1380
gtgttcaaga acggcaaggt gaccaagagc tacagcttcg acgaagttcg caagaacgcc 1440
cagctcaaca ttgaacaaga tgtggcgccg cactaa 1476
<210> 6
<211> 1488
<212> DNA
<213> Haemophilus ducreyi
<400> 6
atggacaatc tgctgaacta cagcagccgt gcgagcgcga tcccaagtct gctgtgcgac 60
ttttacaaga ccagccaccg catcatgtat ccggagtgta gccaaatcat ctatagcacg 120
ttcaccccgc gtagcaatga gcaagcccca tatctgacgc aagttgtgag cttcggcttc 180
caagcgttca tcatcaagta tctgattcat tatttcaatg ataacttctt cagccgcgat 240
aagcacgacg ttgtgaccga gtacagcgcc ttcatcgaga aaacgctgca gctggaggac 300
accggtgagc atatcgcgaa actgcatgaa ctgggctatc tgccgatccg catcaaagcc 360
atcccggaag gcaaaacggt tgcgatcaag gttccggtga tgacgatcga gaacacgcac 420
agcgacttct tttggctgac gaactacctc gagacgctga ttaatgtgag tctgtggcag 480
ccgatgacga gcgccagcat tgccttcgcg taccgcaccg cgctgatcaa attcgcgaac 540
gaaacgtgcg acaaccaaga acacgttccg ttccagagcc acgacttcag tatgcgcggt 600
atgagcagcc tcgaaagcgc cgaaaccagt ggtgccggtc atctgaccag cttcctcggt 660
acggacacca tcccggcgct gagtttcgtg gaagcgtact acggtagcag cagtctgatt 720
ggcacgagca tcccggccag tgagcacagc gttatgagca gccacggcgt ggatgaactg 780
agcaccttcc gctatctcat ggccaagttc ccacacaaca tgctgagcat cgtgagcgat 840
accacggact tctggcacaa tatcacggtt aatctgccgc tgctcaagca agaaatcatt 900
gcgcgcccgg aaaatgcccg cctcgtgatc cgcccagata gcggcaactt cttcgcgatc 960
atttgcggtg atccgaccgc ggacaccgag catgagcgca aaggcctcat cgagtgtctc 1020
tgggacatct tcggcggcac cgtgaatcag aaaggctaca aagtgatcaa cccgcacatc 1080
ggcgcgatct atggcgatgg cgtgacctac gagaaaatgt tcaagatcct cgagggtctc 1140
caagcgaaag gcttcgcgag cagtaacatc gtttttggcg ttggcgccca gacgtaccag 1200
cgtaatacgc gcgacacgct gggtttcgcg ctgaaagcga ccagcatcac gattaacggc 1260
gaagagaagg cgatcttcaa gaacccgaaa accgacgacg gcttcaagaa gagccagaag 1320
ggtcgcgtta aggtgctcag ccgcgacacc tacgtggatg gtctgaccag tgccgatgac 1380
ttcagcgacg atctgctgga gctgctcttc gaggatggta aactgctgcg ccagaccgac 1440
ttcgacgaaa tccgccagaa tctgctggtg agccgcacca cgctgtaa 1488
<210> 7
<211> 1452
<212> DNA
<213> Ralstonia solanacearum
<400> 7
atgcagaacg acctgcctgg tttgtccgct atccttagca acccaatctt aaataccgac 60
agttacaagg cgtcgcatta cctgcaatac ccagccggta cttcggcgat gttctcctac 120
gtagaatccc gtggaggtcg ttatgatcgt accgttttct tcggacttca aatgctggca 180
aaggaatact tatgccgtcc tattacccct gctatgatcg atgctgcccg cgggtttttc 240
gcagcacacg gggagccgtt taacgaggcg ggatggcgtt atattgttgc ccgttatgat 300
ggctatctgc ccgtacgtat ccgtgcggtt cccgaggggt cagtggtacc taatcacaac 360
gtgctgatga cagtcgaatg tgacgatcct gaagttttct ggcttgcgtc atatctggaa 420
actatgttat tgcgcgtgtg gtatccgatt acagttgcga cccagagctg gcatctgcgt 480
caacttgtcc accgctacct ggagcaaaca agtgatgacc caggacagtt gccattcaag 540
gttcatgatt tcggtgctcg cggtgtatct agcgcggaaa gttcggctat tgggggagca 600
gctcaccttg tgtctttcat gggtagtgac acggttttgg gtgtggccgc cgcaaacctg 660
tattacaatg ctcaaatggc cgcgttttct gtacccgcgg cggagcacag tacgattaca 720
gcctggggac gtgccgggga agcagatgcg tatcgtaata tgttacgcca attcggtaaa 780
cctggtgcga tcgtgagtgt tgtcagtgac agttatgact tattcgccgc gcttcgcctg 840
tggggagggg aattacgcca ggcagtcatc gactctgggg ctacgcttgt cgtacgtccc 900
gattctggcg accctcgctc cattgttctt cagacagtcc gcgcgcttga tgcttcattt 960
ggagcaacag tgaacgggaa agggtaccgt gtcctgaacc acgtccgcgt cattcaaggc 1020
gatggaatta atgcagcatc gatcgaggca attcttgccg agttagaggc tgcgggatat 1080
gcggcggata acattgtatt cgggatggga ggtgccctgt tacaacaatt aaaccgcgac 1140
acacagcgct ttgcaatgaa gtgctcagca gtccgtgttg acggggcgtg gcgtgaagtc 1200
tgtaaagacc cggtgaccga cgcggggaaa cgttctaaga aaggacgtct tacacttttg 1260
cgcaaccgtg tgagcgggga gtacgccaca gccactttgc ccttggcctg ggatgatcgc 1320
cgcatcgagg gggaatggga ggatgctctg gtgacggtat tcgagaatgg gcgtctttta 1380
caggatgtca gccttgacgc ggtccgcgcg cgcgctcaag cccatgagtt ggcacccgcc 1440
cttgtcgact ga 1452
<210> 8
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgagcaacg aatacggcga caagaatctg aagatcttca gcctcaacag caatccagaa 60
ctggccaaag agatcgccga caacgttggc gtgcagctgg gcaaatgcag cgttacccgc 120
ttcagcgatg gtgaggtgca gatcaacatc gaggagagca tccgtggctg cgactgctac 180
atcatccaga gcaccagtgc cccggtgaac gagcacatca tggagctgct catcatggtt 240
gacgcgctga aacgtgccag cgcgaaaacg atcaacatcg tgatcccgta ctacggctac 300
gcgcgccaag atcgtaaagc gcgcagtcgc gagccgatta ccgcgaagct gttcgccaat 360
ctgctggaaa ccgccggtgc gacccgtgtt attgcgctgg acatccacgc cccgcagatc 420
caaggctttt tcgacatccc gattgaccat ctgatgggcg tgccgattct gggccactac 480
ttcgagggca aggatctgaa ggatatcgtg atcgtgagcc cggatcatgg cggtgttacc 540
cgtgcgcgca aactcgccga tcgtctgaaa gcgccgatcg cgatcatcga caagcgccgt 600
ccgcgtccga atgaggttga ggtgatgaac atcgtgggca acgttgaagg caagacggcc 660
atcctcatcg acgacatcat tgacacggcg ggtacgatca cgctggccgc caatgcgctc 720
gtggaaaacg gcgcggcgga agtgtatgcg tgctgcaccc acccagttct gagtggccca 780
gcggttgagc gcatcaataa cagtaagatc aaggagctgg tggtgacgaa cagcatcaag 840
ctgccggaag agaaaaagat cgaacgcttc aaacaactca gcgtgggtcc actgctcgcg 900
gaagccatta tccgcgtgca cgagaaacag agcgtgagct atctgttcag ctaa 954

Claims (7)

1.一种合成NMN的重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌中表达编码烟酰胺磷酸核糖基转移酶的基因VpNadV和编码PRPP合酶的基因BaPRS；并敲除了pncC基因、ushA基因、nadR基因和purR基因；所述基因VpNadV的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述基因BaPRS的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述pncC基因的核苷酸序列如Gene ID：947169所示，ushA基因的核苷酸序列如Gene ID：947331所示，nadR基因的核苷酸序列如Gene ID：948911所示，purR基因的核苷酸序列如Gene ID：945226所示。
2.一种促进重组大肠杆菌合成NMN的方法，其特征在于，在大肠杆菌中过表达如SEQ IDNO.4所示的烟酰胺磷酸核糖基转移酶基因VpNadV和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的基因BaPRS；并敲除pncC基因、ushA基因、nadR基因和purR基因；所述pncC基因的核苷酸序列如Gene ID：947169所示，ushA基因的核苷酸序列如Gene ID：947331所示，nadR基因的核苷酸序列如Gene ID：948911所示，purR基因的核苷酸序列如Gene ID：945226所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在培养基中培养至OD为0.6～1.0，加入IPTG诱导，并加入烟酰胺。
4.根据权利要求3所述的方法，所述IPTG的终浓度为0.2mM-1mM IPTG。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺的终浓度为100mg-1000mg/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在培养基中培养至OD为0.6～1.0，再降温至24～26℃，加入终浓度0.2mM-1mM IPTG，并添加100mg-1000mg/L的烟酰胺。
7.权利要求1所述的重组大肠杆菌，或权利要求2～6任一所述的方法在食品、药品、化妆品、饲料、纺织品领域制备含NMN的产品中的应用。
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