CN112553135B - 一种腺苷工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种腺苷工程菌及其构建方法与应用，在E.coli w3110的基因组中整合嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD，并由强启动子Ptrc启动；另外在大肠杆菌基因组上整合了腺苷琥珀酸合酶基因purA，用Ptrc启动子启动；还在mbhA位点整合了核苷酸磷酸酯酶基因yfkN，并用启动子Ptrc启动；同时缺失IMP脱氢酶,AMP核苷酸酶,腺苷脱氨酶和嘌呤核苷磷酸化酶活性，从而重构了腺苷合成途径，为利用大肠杆菌生产嘌呤类物质奠定了基础；另外利用该基因工程菌进行摇瓶发酵生产腺苷，发酵24 h生产腺苷4.3 g/L,优化了大肠发酵生产腺苷的培养基成分，从而使腺苷发酵得到最优的效果。这为后续发酵生产腺苷奠定了基础。

Description

一种腺苷工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明主要涉及基因工程技术领域，尤其是一种腺苷工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
腺苷，化学名为9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，是由腺嘌呤的N-9与D-核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物，其磷酸酯为腺苷酸。腺苷属于重要的核苷酸衍生物，是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物。腺苷可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠状血管，增加冠脉血流量，是合成腺苷酸、环腺苷酸、 三磷酸腺苷的主要原料，ATP 已被广泛应用于治疗心不全、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症。此外，腺苷还是一种抑制性神经传导物，在神经传递中起重要作用。除此之外腺苷能有效治疗室上性心动过速症，在美国 ,腺苷是经美国食品药品监督管理局批准的转复阵发性室上性心动过速的一线药物 , 也是经 FDA 批准的用于心脏药物负荷试验的两种药物之一，已经成为急诊处理快速性心律失常和药物负荷试验的常规用药。因此，腺苷在医学方面有着重要的作用。
腺苷的生产方法主要有化学合成法、RNA水解法和发酵法。化学合成法是以不同化学物质为底物进行化学合成腺苷，该方法合成腺苷存在着成本偏高，反应繁琐，产量低，收率低等一系列问题。RNA水解法是利用磷酸二酯酶水解酵母RNA，得到4种5’-核苷酸，然后进一步水解脱磷酸，该方法的缺陷是同时会得到四种核苷物质，这给后续的分离带来了困难。发酵法是通过选育解除了终产物反馈抑制的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌进行直接发酵。发酵过程中提供充足的营养使菌体大量繁殖并生产腺苷。发酵法生产腺苷成本较低，原料易得，且生产过程相对简单，产苷效率较高，因此在腺苷生产中占据绝对优势。但目前市场上用于腺苷发酵的菌种大多是枯草芽孢杆菌，其发酵过程中对培养基要求比较高，需要提供大量的氮源，有时需要加入大量的玉米浆，且发酵周期长达50-60多小时，从而大大提高了发酵成本且易造成染菌倒灌。而枯草芽孢杆菌的基因工程改造难度较大，不易进行系统定向分子改造。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种腺苷工程菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述腺苷工程菌的构建方法，通过采用大肠杆菌进行腺苷摇瓶发酵生产的方法，为用大肠杆菌进行腺苷发酵奠定了基础，且可操作性强，基因工程菌可以重复获得。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种腺苷工程菌，是由下述方法制备得到的：在大肠杆菌E.coli W3110的基因组上构建嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD，将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV(原始基因序列为序列表SEQ ID NO:1所示序列)位点上，并由Ptrc启动子启动(假基因yjiV整合purEKBCSQLFMNHD操纵子后序列为序列表SEQ ID NO:2所示序列)；还将腺苷琥珀酸合酶基因purA连接Ptrc启动子整合在大肠杆菌假基因位点yghE（核酸序列如SEQ ID NO:3所示）上（假基因yghE整合purA后序列如SEQ ID NO:4所示）；在大肠杆菌mbhA（核酸序列如SEQ ID NO:5所示）基因位点整合了核苷酸磷酸酯酶基因yfkN，并用启动子Ptrc启动（假基因mbhA整合yfkN后基因序列如SEQ ID NO:6所示）；另外缺失IMP脱氢酶（guaB，基因序列如SEQ ID NO:7所示，guaB敲除后序列如SEQ ID NO:8所示）;腺苷脱氨酶(add，基因序列如SEQ ID NO:9所示，add敲除后序列如SEQ ID NO:10所示)和AMP核苷酸酶(amn，基因序列如SEQ ID NO:11所示，Amn敲除后序列如SEQ ID NO:12所示)活性。敲除ygdH基因（基因序列如SEQ ID NO:13所示，ygdH敲除后基因序列如SEQ ID NO:14所示)。除此之外还缺失嘌呤核苷磷酸化酶（deoD，基因序列如SEQ ID NO:15所示，deoD敲除后基因序列如SEQ ID NO:16所示）活性，切断IMP，AMP和腺苷的大部分降解途径。
优选的，上述腺苷工程菌，在大肠杆菌的基因组上整合了purEKBCSQLFMNHD操纵子、purA基因和yfkN基因，并用Ptrc启动子启动，敲除guaB、add、amn、ygdH和deoD基因。
优选的，上述腺苷工程菌，所述大肠杆菌为含pREDCas9质粒的E.coli W3110，该菌株购自天津科技大学。
优选的，上述腺苷工程菌，所述嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD以及腺苷琥珀酸合酶基因purA和核苷酸磷酸酯酶基因yfkN均来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL，该菌种购自天津科技大学。
上述腺苷工程菌的构建方法，步骤如下：在大肠杆菌E.coli W3110的基因组上构建嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD，将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，并由Ptrc启动子启动（假基因yjiV原始基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示，假基因yjiV整合purEKBCSQLFMNHD操纵子后序列为序列表SEQ ID NO:2所示序列）；还在假基因位点yghE上整合了腺苷琥珀酸合酶基因purA，用Ptrc启动子启动（假基因yghE原始基因序列如序列表SEQ ID NO:3所示，整合后基因序列为序列表SEQ ID NO:4所示序列）；在大肠杆菌mbhA基因位点整合了核苷酸磷酸酯酶基因yfkN，并用启动子Ptrc启动（假基因mbhA原始基因序列如序列表SEQ ID NO:5所示，整合后基因序列为序列表SEQ ID NO:6所示序列）；另外缺失IMP脱氢酶（guaB,敲除前基因序列如序列表SEQ ID NO:7所示，敲除后基因序列为序列表SEQ ID NO:8所示）；腺苷脱氨酶(add, 敲除前基因序列如序列表SEQ ID NO:9所示，敲除后基因序列为序列表SEQ ID NO:10所示)和AMP核苷酸酶(amn, 敲除前基因序列如序列表SEQ ID NO:11所示，敲除后基因序列为序列表SEQ ID NO:12所示)。敲除ygdH基因(敲除前基因序列如序列表SEQ ID NO:13所示，敲除后基因序列为序列表SEQ ID NO:14所示)。还缺失嘌呤核苷磷酸化酶（deoD, 敲除前基因序列如序列表SEQ ID NO:15所示，敲除后基因序列为序列表SEQ ID NO:16所示）活性，切断IMP，AMP和腺苷的大部分降解途径。
优选的，上述腺苷工程菌的构建方法，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向基因改造，包括如下步骤：
（1）将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，并用强启动子Ptrc启动；
（2）腺苷琥珀酸合酶基因purA整合在大肠杆菌假基因位点yghE上，并链接Ptrc启动子；
（3）在大肠杆菌mbhA基因位点整合了核苷酸磷酸酯酶基因yfkN，并用启动子Ptrc启动；
（4）敲除guaB基因，阻断腺苷的前体物IMP的支路代谢；
（5）敲除amn，ygdH基因，减弱腺苷的前体物AMP的降解；
（6）敲除add和deoD基因，减弱腺苷的降解。
优选的，上述腺苷工程菌的构建方法，将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，并用强启动子Ptrc启动，该操纵子共十二个基因，能催化5-磷酸核糖生成IMP；腺苷琥珀酸合酶基因purA整合在大肠杆菌假基因位点yghE上，并链接Ptrc启动子；在大肠杆菌mbhA基因位点整合了核苷酸磷酸酯酶基因yfkN，并用启动子Ptrc启动。除此之外，还缺失IMP脱氢酶（guaB）,腺苷脱氨酶(add)和 AMP核苷酸酶(amn)活性,敲除ygdH基因,缺失嘌呤核苷磷酸化酶（deoD）活性，切断IMP，AMP和腺苷的大部分降解途径。
优选的，上述腺苷工程菌的构建方法，所述嘌呤核苷操纵子序列较大，大于12000bp，采用大片段整合法，总共分五次整合，包括以下步骤：
（1）将强启动子Ptrc与purE， purK和purB基因连接后,并在purB后面插入一个剪切识别序列（添加靶序列的目的是让质粒pGRB转录出的相应的gRNA与pREDCas9质粒表达出的Cas9蛋白形成复合体，识别靶序列，从而实现目的DNA双链断裂，有利于后续片段整合在该位点之后；包含该靶序列的DNA片段gRNA-pur1-S和gRNA-pur1-A见下表1, pGRB制作方法参考专利CN 108130306 A，下同），整合到E.coli W3110的假基因位点yjiV上（构建pGRB-yjiV过程中用到的靶序列的DNA片段gRNA-yjiV-S和gRNA-yjiV-A见下表1）；
（2）将purCSQ基因依次整合在purB基因的后面,在该基因后面插入一个靶序列（包含靶序列的DNA片段为gRNA-pur2-S和gRNA-pur2-A，见下表1）；
（3）用同一种方法把purL基因整合在purQ基因的后面（包含靶序列的DNA片段为gRNA-pur3-S和gRNA-pur3-A，见下表1）；
（4）同样，把purFMN基因整合在purL基因的后面(包含该靶序列的DNA片段gRNA-pur1-S和gRNA-pur1-A)；
（5）把purHD基因整合在purN基因的后面。
优选的，上述腺苷工程菌的构建方法，在上述步骤（5）的基础上，继续进行如下操作步骤：
（6）将purA基因与Ptrc启动子连接，整合到假基因yghE位点上（构建pGRB-yghE过程中用到的靶序列的DNA片段gRNA-yghE-S和gRNA-yghE-A见下表1）；
（7）把yfkN基因的前1900bp左右的碱基与强启动子Ptrc连接，后加识别靶序列（包含靶序列的DNA片段为gRNA-pur3-S和gRNA-pur3-A，见下表1），整合到假基因mbhA上（构建pGRB-mbhA过程中用到的靶序列的DNA片段gRNA-mbhA-S和gRNA-mbhA-A见下表1），之后再把yfkN基因的后半部分碱基整合到前半部分碱基的后面；
（8）将guaB基因敲除，减弱前体物IMP的支路代谢，使其更多地流向腺苷的合成途径中；
（9）敲除add基因，阻断腺苷到肌苷的降解途径；
（10）敲除amn和ygdH基因，减少腺苷前体物AMP到腺嘌呤的转化；
（11）敲除deoD基因，减弱腺苷到腺嘌呤的降解途径。
上述腺苷工程菌在摇瓶发酵生产腺苷方面的应用。
上述腺苷工程菌的应用，具体摇瓶发酵方法是：将腺苷工程菌菌株接种于LB摇管中，37℃，200 r/min培养10-12h，然后按10%的接种量接种于30 mL的发酵种子瓶中（500 mL的挡板瓶加菌液后定容至30 mL），37℃，200 rpm培养7-10h，然后再按10%的接种量接种于发酵瓶中（同上），发酵24-30 h；发酵期间需用氨水维持发酵液pH在7 .0-7 .2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行。
优选的，上述腺苷工程菌的应用，用于摇瓶发酵的种子培养基成分为：葡萄糖30g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨2 g/L,柠檬酸1 g/L,硫酸铵3 g/L,硫酸镁 0.4 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸亚铁10 mg/L，硫酸锰5 mg/L，谷氨酸0.4 g/L，VB1 0.5 mg/L，pH调至7.0-7.2，115℃灭菌15 min。
优选的，上述腺苷工程菌的应用，用于摇瓶发酵的发酵培养基成分为：葡萄糖30g/L,酵母粉4 g/L,蛋白胨1 g/L,柠檬酸1 g/L,硫酸铵3 g/L,硫酸镁 1 g/L，磷酸二氢钾3.5 g/L，硫酸亚铁20 mg/L，硫酸锰10 mg/L，谷氨酸1 g/L，VB1 0.5 mg/L，pH调至7.0-7.2，加入少量的苯酚红和消泡剂，121℃，灭菌20 min。
有益效果：
上述腺苷工程菌及其构建方法与应用，所述菌株遗传背景简单，方便后续基因工程改造，用该菌株发酵生产腺苷所需培养基成份简单，无需消耗大量氮源，因此不易染菌，减少了倒灌的风险，大大节省了发酵成本，而且有利于后续的分离提取；由于工程菌的构建使得发酵周期也可由原来的50多小时缩减为现在的24-30小时，大大缩短了发酵周期，提高了生产效率。所述构建菌株的方法简单便捷，可行性强，重构腺苷合成途径，为利用大肠杆菌生产嘌呤类物质奠定了基础，利用该基因工程菌进行摇瓶发酵生产腺苷并优化了发酵培养基成分，从而使发酵得到最优的效果，为后续发酵生产腺苷奠定了基础。
附图说明
图1为purEKB基因整合片段电泳图；
图2为purCSQ基因整合片段电泳图；
图3为purL基因整合片段电泳图；
图4为purFMN基因整合片段电泳图；
图5为purH-purD基因整合片段电泳图；
图6为 yfkN-UP基因整合片段电泳图；
图7为 yfkN-DN基因整合片段电泳图；
图8为purA基因整合片段电泳图；
图9为guaB基因敲除片段电泳图；
图10为add基因敲除片段电泳图；
图11为amn基因敲除片段电泳图；
图12为ygdH基因敲除片段电泳图；
图13为deoD基因敲除片段电泳图。
其中图1-8从左到右依次为： 1kb DNA marker；上游同源臂；下游同源臂；目的片段；重叠片段；原菌对照；阳性菌鉴定片段。
图9-13从左到右依次为： 1kb DNA marker；上游同源臂；下游同源臂；重叠片段；原菌对照；阳性菌鉴定片段。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明公开了一种腺苷工程菌的构造及其发酵方法，具体包括以下步骤：
步骤1：将强启动子Ptrc与purE， purK和purB基因连接后,在purB后面插入一个识别靶序列，整合到假基因位点yjiV上。
步骤2：将purCSQ基因依次整合在purB基因的后面，并在整合的最后一个基因上插入一个识别靶序列。
步骤3：把purL基因整合在purQ基因的后面，并在purL基因上插入一个识别靶序列。
步骤4：把purFMN基因整合在purL的后面，并在整合的最后一个基因上插入一个识别靶序列。
步骤5：把purHD基因整合在purN基因的后面。
步骤6：将purA基因与Ptrc启动子连接，整合到假基因yghE位点上。
步骤7：把yfkN基因的前1900bp左右的碱基与强启动子Ptrc连接，后加识别靶序列，整合到假基因mbhA上，之后再把yfkN基因的后半部分碱基整合到前半部分碱基的后面。
步骤8：将guaB基因敲除，减弱前体物IMP的支路代谢，使其更多地流向腺苷的合成途径中。
步骤9：敲除add基因，阻断腺苷到肌苷的降解途径。
步骤10：敲除amn和ygdH基因，减弱腺苷前体物AMP到腺嘌呤的降解途径。
步骤11：敲除deoD基因，减弱腺苷到腺嘌呤的降解途径。
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明，未明确序列的参加说明书技术方案部分。
实施例1
将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合到大肠杆菌中
1.利用premier5软件，以上述大肠杆菌基因组为模板（大肠杆菌是含pREDCas9质粒的E.coli W3110，购自天津科技大学）根据假基因yjiV的上下游设计上游同源臂引物（UP-yjiV-S、UP-yjiV-A）和下游同源臂引物（DN-yjiV-S、DN-yjiV-A）并PCR扩增其上下游同源臂片段。再以B.subtilisXGL基因组为模板设计目的基因purEKB的上下游引物（purEKB-S、purEKB-A）并PCR扩增出其目的片段。启动子设计在上游同源臂的下游引物和目的片段的上游引物中，识别靶序列则设计在目的片段的下游引物和下游同源臂的上游引物中（上述所涉及的引物见表1）。上述涉及的上游同源臂长度为477bp,下游同源臂499bp，目的基因的长度为3002bp,具体见图1。
2.利用PCR重叠技术将上游同源臂、目的基因、下游同源臂进行重叠。获得一个整合片段（上游同源臂-Ptrc-purEKB-下游同源臂）该重叠片段长度为3978bp,具体见图1。
3.制作大肠杆菌感受态细胞：将带有pREDCas9的E.coli W3110接入LB摇管中，32℃培养至OD600＝0 .1～0 .2时，添加0 .1M的IPTG(使其终浓度为0 .1mM)，继续培养至OD600＝0 .6～0 .7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
4.构建pGRB（构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与pREDCas9质粒表达出的Cas9蛋白形成复合体，并识别识别靶序列，实现目的DNA双链断裂），其方法参考专利CN 108130306 A，构建pGRB-yjiV过程中用到的靶序列的DNA片段gRNA-yjiV-S和gRNA-yjiV-A见下表1。
5.将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的E.coli W3110电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养2 h后的菌体吸取100 uL涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。
6.用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。（这里由于阳性重组子与原菌落条带大小相差不是很多，因此鉴定的时候用的鉴定引物为目的基因的上下游引物（purEKB-S、purEKB-A），所以进行菌落PCR后原菌落呈现无条带，阳性重组子的条带大小为3002bp）具体见图1。
7. 丢掉pGRB：将挑选出的阳性重组子接入含有奇霉素和阿拉伯糖的LB摇管中32℃培养过夜，在含有奇霉素的LB平板上进行平板划线32℃培养14-16 h后挑取单菌落分别在含有氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上对点，再32℃培养12 h，挑选氨苄青霉素平板上没长，奇霉素平板上长的菌进行保菌（该菌株即为丢掉pGRB质粒的菌株），以便下个基因整合时待用。
8.利用上面1-7的方法整合purCQLFMNHD基因到purEKB的后面。具体的引物设计序列见下表1，上下游同源臂，目的片段，重叠片段，原菌条带，阳性重组子大小分别见图2、3、4、5。
9. 同样利用1-7的方法将腺苷琥珀酸合酶基因purA整合在假基因位点yghE上，并链接Ptrc启动子（purA基因后无需设计靶位点）。构建pGRB-yghE过程中用到的靶序列的DNA片段gRNA-yghE-S和gRNA-yghE-A见下表1。过程中涉及到的具体引物设计序列见表1，具体基因片段大小见图6。
实施例2
把yfkN基因与强启动子Ptrc连接并整合到假基因mbhA上。与上述基因不同的是yfkN基因序列比较大，如果一次性整合效率不高，因此需要进行分段整合。因此把yfkN基因分成yfkN-UP和yfkN-DN两段。具体步骤分为以下几步：
1.利用premier5软件，以上述大肠杆菌基因组为模板根据假基因mbhA的上下游设计上游同源臂引物（UP-mbhA-S、UP-mbhA-A）和下游同源臂引物（DN-mbhA-S1、DN-mbhA-A）并PCR扩增其上下游同源臂片段。再以Bacillus subtilis XGL基因组为模板设计目的基因yfkN-UP的上下游引物（yfkN-UP-S、yfkN-UP-A）并PCR扩增出其目的片段。启动子设计在上游同源臂的下游引物和目的片段的上游引物中，为了便于yfkN-DN基因的整合，同样需要设计剪切位点，识别靶序列（包含靶序列的DNA片段为gRNA-pur3-S和gRNA-pur3-A，见下表1）则设计在目的片段的下游引物和下游同源臂的上游引物中。上述涉及的上游同源臂长度为636bp,下游同源臂686bp，目的基因的长度为2004bp,具体见图7。
2.利用PCR重叠技术将上游同源臂、目的基因、下游同源臂进行重叠。获得一个整合片段（上游同源臂-Ptrc- yfkN-UP -下游同源臂）。具体引物设计序列见表1。该重叠片段长度为3326bp,具体见图7。
3.制作大肠杆菌感受态细胞：将带有pREDCas9的E.coli W3110接入LB摇管中，32℃培养至OD600＝0 .1～0 .2时，添加0 .1M的IPTG(使其终浓度为0 .1mM)，继续培养 至OD600＝0 .6～0 .7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
4.构建pGRB，构建pGRB-mbhA过程中用到的靶序列的DNA片段gRNA-mbhA-S和gRNA-mbhA-A见下表1。
5.将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的E.coli W3110电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养2 h后的菌体吸取100 uL涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。
6.用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。其中原菌大小为1837bp,阳性重组子大小为3326bp,具体基因片段大小见图7。
7. 丢掉pGRB：将挑选出的阳性重组子接入含有奇霉素和阿拉伯糖的LB摇管中32℃培养过夜，在含有奇霉素的LB平板上进行平板划线32℃培养14-16 h后挑取单菌落分别在含有氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上对点，再32℃培养12 h，挑选氨苄青霉素平板上没长，奇霉素平板上长的菌进行保菌（该菌株即为丢掉pGRB质粒的菌株），以便下次待用。
8.利用上面1-7的方法整合yfkN-DN基因到yfkN-UP的后面。具体引物设计序列见表1，具体基因片段大小见图8。
实施例3
有关腺苷前体物和腺苷降解途径相关基因guaB，add，amn，ygdH和deoD的敲除
guaB基因的敲除
1.以大肠杆菌E.coli W3110为模板，根据guaB基因的上下游序列设计上游同源臂引物（(UP-guaB-S、UP- guaB -A）和下游同源臂引物（DN- guaB -S、DN- guaB -A），通过PCR扩增出上,下游同源臂，并通过PCR重叠技术融合获得guaB基因的敲除片段（上游同源臂-下游同源臂）。具体引物序列见下表1。
2.构建pGRB-guaB,构建pGRB-guaB过程中用到的靶序列的DNA片段gRNA-guaB-S和gRNA-guaB-A见下表1。
3.用上一个丢掉pGRB的菌株制备感受态，感受态的制备方法参考上文。进行电转化，将上述获得的guaB基因的敲除片段（根据guaB基因的上、下游序列为模板扩增出的上下游同源臂，并通过PCR重叠技术获得的融合片断）和构建的pGRB同时电转化至上述感受态细胞中（该处为guaB基因敲除，因此只需电转进guaB基因的敲除片段，与整合不同）。将电转化后复苏培养2 h后的菌体吸取100 uL涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。上述涉及的上游同源臂长度为538bp,下游同源臂577bp，重叠片段的长度为1115bp,原菌片段长度为2101bp,阳性菌扩增片段长度为1115bp，具体见图9。
4.将挑选出的阳性重组子接入含有奇霉素和阿拉伯糖的LB摇管中32℃培养过夜，在含有奇霉素的LB平板上进行平板划线32℃培养14-16 h后挑取单菌落分别在含有氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上对点，再32℃培养12 h，挑选氨苄青霉素平板上没长，奇霉素平板上长的菌进行保菌，以便下次待用。
Add，amn，ygdH和deoD敲除均与上述方法相同，具体方法详见上文，引物参考序列见下表1，条带大小见下图10，11，12，13。
实施例4
将上述基因工程菌株接种20 uL于LB摇管中，32℃，200 r/min过夜培养，然后按接种量10%接种于30 mL的发酵种子瓶中（500 mL的挡板瓶，加菌液后定容至30 mL），37℃，200rpm培养8h，然后再按10%的接种量接种于发酵瓶中（同上），发酵期间需用氨水维持发酵液pH在7 .0-7 .2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行。发酵24h后生产腺苷4.3 g/L。
用于摇瓶的种子培养基成分为：葡萄糖30 g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨2g/L,柠檬酸1 g/L,硫酸铵3 g/L,硫酸镁 0.4g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸亚铁10 mg/L，硫酸锰5 mg/L，谷氨酸0.4g/L，VB10.5 mg/L，pH调至7.0-7.2，115℃灭菌15 min。
用于摇瓶的发酵培养基成分为：葡萄糖30 g/L,酵母粉4 g/L,蛋白胨1 g/L,柠檬酸1 g/L,硫酸铵3 g/L,硫酸镁 1 g/L，磷酸二氢钾3.5 g/L，硫酸亚铁20 mg/L，硫酸锰10mg/L，谷氨酸1 g/L，VB10.5 mg/L，pH调至7.0-7.2，加入少量的苯酚红和消泡剂，121℃，灭菌20 min。
用该基因工程菌进行摇瓶发酵24h产腺苷4.3g，该基因工程菌进行腺苷发酵相比于用枯草芽孢杆菌进行腺苷发酵，发酵周期得到了大大缩短，发酵周期由原来的50多小时缩短为现在的 24-30 h，而且氮源的消耗变少，在很大程度上减少了发酵成本，且不易染菌，造成倒罐。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure 471173DEST_PATH_IMAGE002
Figure 981788DEST_PATH_IMAGE004
Figure 27105DEST_PATH_IMAGE006
Figure 891155DEST_PATH_IMAGE008
Figure 548271DEST_PATH_IMAGE010
Figure 573995DEST_PATH_IMAGE012
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种腺苷工程菌及其构建方法与应用
<160> 101
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2924
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2924)
<400> 1
caaaacagca ttacagccag caggaagtac tgcgttggat cgatgtctgt tcagggactc 60
aacctaatgc aaaggatccc gcatttctta aagtcagggc gcatatcttc cagcgtaata 120
cctagggaat atgggcttgt gttgataaag attgcagatt aaagcacggt acaccgctcg 180
acaaaggctg gccctttggc tatgtgtatg tgaaccagcg acaaaattgt gactgtggaa 240
gccctgtata cgaagttgca ttctgtaatg attgtaatga gcctcatctt ctggcacggg 300
acaaaaaggg caaactagtc cagtgggaaa ataaaggtgg cgatgaattc tctttgcagg 360
atgaagtacc tgttgaacat gacgctacag aagaaaaagt cgaaaaagag aacagttttc 420
agcctccgtt gattattgcc gcaggagaga ccagcgaggc aggttatacc ctacaacgcc 480
tcgaccgtca gacgcgccgt attggcgtta ttaacaatga cagcattccg ctgattatta 540
atgatattga acaggtttgt agtgccagtg gctgtggcta cagaggcatg agtgggaaac 600
agcccttccg gcgtgcacta ttaggtgggc cattttacgt tactaatatc gtgcccaccg 660
ttctagagta ttgtcaggac tttaccagtg atgaaggcaa agagggcgtc ggaccagatt 720
cgttgccagg acgaggtcgt cgactcatca cctttacaga cagtcgacaa gggacagccc 780
gaatggcggt gcgtatgcag caagaagcag aacgcagtcg cttacgcgga agcgtagtcg 840
aaattctcag ctggcatcaa aggacgcaaa cgtctacagc gccgaatgcc aatgccgatc 900
tggaaaaatt agcggccagg gcgaagcaag cccgtgagca ggcagaagaa tatcgaagct 960
ggggaatgcc agaccaggcg aaattgtcac aagcacaggc tgaacagctt gaacaggctt 1020
atcaggctgc aaccggtggg aaagccgcga ctatcctggt atcccgaacc tggacggaga 1080
tggttaacga gcttaaagag agagccgata tccgcgggcc ggttctgcaa tataaccatt 1140
atcttaagcc tgaagtgttt aatgaaaacg gcggccccct taagctttct gaaatgttgt 1200
tgttccggga attcatgcgt cgccctaaac ggactaacag cctggaaaca caggggctgg 1260
ttcaggttgg ttaccagggg ctggagaaaa tacataagag ccccttgcac tggcaggaaa 1320
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catcaaaatt cgtccgtaac ccggaatcaa aagatcctga agataatcag aacagacgct 1500
ggcctcaaat tcgtaatggc aacgtatccc atcgtttagc gaagttgctg atgctggggg 1560
ctggattcaa aaccgtcaat gcggcaacta ttgatattat caatacatgg ctgaaagaag 1620
catgggccca acttaccgga ccgcttgcag tactgaaacc cgatggcaac cgtttttatt 1680
taccgaaaga gcatatgact ttttctttaa tcacggatgc ctggatttgc ccggtaacca 1740
ataaaatcct ggatacggct tttaaaggct taacccctta tctgcctacc catatttcgt 1800
tcgagcatct taccctggcg caatatgaca cttttgtcgc gcagaaagtc acaatgccgg 1860
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ttaacgatcg tgtcgtggaa ggcggcttct actatcgtac tgccgagcac tctgcccagc 2040
agtcgtcaga acgtctgcaa agctatgaaa agatgttcaa gaatgggcaa ctaaatgttc 2100
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cgcagtttgg gcaacgcttc tgggacgtgc tgtttaacga ccatgaagaa gcgcagtcac 2400
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agagttgggc aacggatgtg ctggtggagg tgatcgcctc ctga 2924
<210> 2
<211> 13423
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(13423)
<400> 2
caaaacagca ttacagccag caggaagtac tgcgttgaca attaatcatc cggctcgtat 60
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tgcgctgcat tggctaaaag atcatgcgta tctcccgcaa ggaagtgagc tgctgcttat 900
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gcaggtagaa accattaagt ccattacaac aatagtaaat gaagagcttc aaagcatctt 3600
cgacgattgt catgtcagat taatagattt caagcttgaa ttcggtttag atgcagaagg 3660
gcaagtgctt ttggcggatg aaatatctcc tgacacatgc cgcttgtggg ataaagaaac 3720
gaacgaaaag ctggacaaag atttattcag acgcaatctg ggaagcttaa ccgacgcata 3780
cgaagagatt ttcaatagac tgggaggcat tcatcatgta taaagtaaaa gtttatgtca 3840
gcttaaaaga aagtgtacta gatccacaag ggagcgctgt ccagcatgcc ttgcacagta 3900
tgacttacaa cgaagttcaa gatgtgcgca tcgggaaata catggagctt accattgaaa 3960
aatctgaccg tgatcttgac gtgctagtga aagaaatgtg cgaaaaactt cttgcgaaca 4020
cagtgattga agattataga tatgaggttg aggaggtagt cgcacagtga aatttgcggt 4080
gattgtgtta cccggctcca actgtgatat cgatatgtat catgctgtaa aggatgagct 4140
cggccatgaa gtggaatacg tctggcatga ggaaacaagc cttgacggct tcgacggcgt 4200
gttaattccg ggaggatttt cttacggcga ttacttaaga tgcggcgcca tcgcccgatt 4260
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ctgtaacgga ttccagattt tacaggagct tgggctgctg ccaggcgcaa tgagacgcaa 4380
caaagatctg aagttcattt gccgtccggt tgaattgatt gttcagaacg acgaaacctt 4440
attcacagct tcctacgaaa agggagaatc gattacaatc ccggttgccc atggtgaagg 4500
gaatttctac tgtgatgacg agacgcttgc tacattaaag gaaaacaatc aaattgcttt 4560
cacatacggc tctaatatta atggaagtgt cagcgacatt gccggtgtcg tgaatgagaa 4620
aggcaatgta ttaggcatga tgcctcaccc tgagcgcgcg gtcgatgaac tgcttggaag 4680
cgccgacggt cttaaattgt tccagtctat cgtgaaaaat tggagggaaa ctcatgtcac 4740
tactgcttga accaagtaaa gaacaaataa aagaagagaa actgtatcag caaatgggtg 4800
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gaatcgttga tatcggtgat aaccaagcgg ttgtgttcaa aattgaatca cataaccacc 5040
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agccttctca agagcctgct tactatcgcg agtttttgga aacagacgtt ccggctccgc 5940
aaattgaaga tgcgaatgaa atgctgaagg cccttcttca gcagccgacg attgcgagta 6000
aagagtgggt ttatgatcag tatgactaca tggtgcgcac gaatacagtt gtcgctcctg 6060
ggtctgatgc tggtgttctc agaatccgcg gaacgaaaaa ggcgctggcg atgacgacag 6120
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tcggcgaaac aaaaccagag tttgccggaa gcgagctgca aaaaatgaca gaaggccgta 6540
tttacggcaa agcgccgcaa atcgatcttg atgtagagct gtctcgtcaa aaagcactgc 6600
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cgaaagagct tgaacgcgta tggaaaggag ctatcccatg cttgctgaaa tcaaaggctt 6960
aaatgaagaa tgcggcgttt ttgggatttg gggacatgaa gaagccccgc aaatcacgta 7020
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aggcggcgga tacgaaaatg ttcagccgct cctcttccgt tcccaaaaca acggcagcct 7260
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aaccggggtt ccggattcca gtatttcagc ggcgatcggc tatgcagagg caacaggcat 7860
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gtgaaaaggc atgaccatta aacgtgcatt aatcagtgtt tcagataaaa caaatctcgt 10140
tcctttcgta aaagaactga cagagcttgg cgttgaagtc atctccacag gcggaacgaa 10200
aaagcttctt caagaaaacg gtgtggatgt gatcggaatt tctgaagtga caggctttcc 10260
tgaaattatg gacggccggt taaaaaccct acacccgaat attcacggcg gccttctggc 10320
ggttcgcggc aatgaagagc atatggcgca gatcaatgaa cacgggattc agccgattga 10380
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<210> 3
<211> 926
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(926)
<400> 3
accaggatat cgatgaactg catttcgccc cgttgaatat cgaccagcaa ctggcaaccg 60
tagcagtgat tcaccaacag catatgcgca acattgcgca gtggttgcag gaaaacggca 120
tcacccgcgc taccgtcgcg ccggactgga tgtccattcc ttgtgggttt atggcttgcg 180
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cggagcagaa gcggattgtg aatttacgct ctcaggtgac gatggcgctg aaaaaatatc 660
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aatcagcgtc actttccgac atcgaaatgc gtggttttac ctttgatcaa aaacgccaga 780
tacttcacct ccagctacgg gccgcgaact ttgccagttt cgacaaactg cgtagtgtac 840
tggcaaccga ttatgttgtg caacaggacg cgttacagaa agagggtgat gcggtttccg 900
gcggcgtaac gttgcggagg aaataa 926
<210> 4
<211> 1827
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1827)
<400> 4
accaggatat cgatgaactg catttcgccc cgttgaatat cgaccagcaa ctggcaaccg 60
tagcagtgat tcaccaacag catatgcgca acattgcgca gtggttgcag gaaaacggca 120
tcacccgcgc taccgtcgcg ccggactgga tgtccattcc ttgtgggttt atggcttgcg 180
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 240
acaggaaaca gaccatgtct tcagtagttg tagtaggtac gcaatggggc gatgaaggaa 300
aaggtaaaat tacagatttc ctatcagaaa atgcagaagt gatcgcccgt tatcaaggcg 360
gaaataacgc agggcataca atcaagtttg acggaatcac atataagctt cacttaatcc 420
cgtctggaat tttctataag gataaaacgt gtgtaatcgg aaacggaatg gttgtagatc 480
cgaaagcatt agtcacagag cttgcgtatc ttcatgagcg caacgtgagt acagataacc 540
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<222> (1)..(756)
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ctgaagaaga aatccgccac cgagcttggt gagctggcaa ccagtatcaa caccattgcc 240
cgtgatgcgc atatggaagc gaatctggag atggagattg ttccccaggg attacgcgtg 300
ctgattaaag acgaccagaa ccgcaatatg tttgaacgcg gcagcgcgaa gattatgccg 360
ttctttaaaa cgctgctggt ggagctcgcg ccagtgttcg actcgctcga taataaaatt 420
attattaccg ggcataccga tgcgatggcc tacaaaaaca atatctacaa caactggaac 480
ctttcgggtg accgcgcgct ttcggctcgt cgggtgctgg aagaggccgg aatgccggaa 540
gataaagtga tgcaggtaag cgcaatggcg gaccagatgc tgctggattc caaaaatccg 600
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(4791)
<400> 6
gtcagtaaat ccgagcgtga aagcattatc gccgcgctgc acgggcagtc gatttttaac 60
ggtggtgggc tgtcgccgtt aaataaaatc agcccgtctc atccgccaaa acctgccacc 120
gtgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 180
cacacaggaa acagaccgtg agaatacaga aaagacgaac acacgtcgaa aacattctcc 240
gtattctttt gcccccaatt atgatactta gcctaatcct cccaacacca cccattcatg 300
cagaagaaag cgcggctcct caggtgcatc tgagtatttt ggctacgact gatattcatg 360
ccaacatgat ggattacgat tactacagcg acaaagaaac ggcggatttc ggtctggcga 420
gaacagcgca attgatccaa aagcaccgcg agcaaaaccc taacaccctg cttgtggata 480
acggcgactt gattcaaggg aatccgctgg gtgaatacgc ggtgaaatat caaaaagacg 540
acattatctc cggcacgaaa acccatccga ttatcagcgt catgaatgcg ctgaaatacg 600
acgccggaac gcttggcaat catgaattca actacgggct cgactttctc gacggcacaa 660
tcaaaggagc cgatttcccg attgtaaatg ccaacgtcaa aacaactagc ggcgaaaacc 720
gttatacgcc gtatgtgatt aatgaaaaaa ccctcattga tgaaaacggt aatgagcaga 780
aagtaaaagt cggctacata ggctttgtcc cgccgcaaat catgacatgg gacaaaaaga 840
atctcgaggg gcaagttcag gtgcaggata tcgtagaatc cgccaatgaa acgatcccga 900
aaatgaaggc ggaaggcgca gatgtcatta ttgccctcgc ccacaccggc attgaaaagc 960
aggcgcaatc atcaggcgca gaaaacgccg tgtttgacct tgccaccaaa acgaaaggca 1020
ttgacgcgat tatctcgggc catcagcacg gactctttcc ttccgccgag tatgcgggtg 1080
ttgctcagtt caatgtggaa aagggaacaa ttaacggcat tcctgtcgtc atgccaagca 1140
gctggggcaa atatttaggc gtgattgacc tcaagcttga aaaggcggac ggctcatgga 1200
aggtagcaga ttccaaagga agtattgaat ctattgctgg caacgtcaca tcaagaaacg 1260
aaaccgttac aaacaccatt cagcaaacac accaaaacac actggagtat gtccgaaagc 1320
cagtcggcaa aaccgaagca gatattaaca gcttctttgc acaggtcaaa gatgatcctt 1380
ccattcagat cgtgactgac gcgcaaaagt ggtacgctga aaaagaaatg aaggataccg 1440
agtacaagaa cctgccgatt ttatccgctg gagcgccgtt taaagcaggc ggcagaaacg 1500
gagccaatta ctatacaaac attccagccg gagatcttgc gattaaaaat gtcggtgact 1560
tgtatcttta cgataatact gttcaaatcg tcaagctgac aggcagcgag gtcaaggact 1620
ggctggagat gtcagcaggc caattcaatc aaattgatcc agctaaaggc ggcgaccagg 1680
ccttgctgaa cgagaatttc cgctcctata attttgacgt gattgacggt gtcacatatc 1740
aggtcgatgt gacaaaaccg gctaaataca atgagaacgg aaaagtgatc aatgcggatt 1800
catcccgtat catcaatctt tcctatgaag gcaagccgat cagcccaagc caggaatttc 1860
tcgtagtcac caataactat cgtgcgtccg gaggcggcgg gttccctcat ctgacgagcg 1920
ataaaattgt ccacggctct gcagttgaaa ataggcaggt gctgatggat tacattattg 1980
aacaaaaaac agtcaatcca aaagcagaca acaactggtc aatcgcgcct gtttccggca 2040
cgaatctgac gtttgaatcc tcgcttttgg ccaagccatt tgccgataaa gcagacgatg 2100
tcgcttatgt aggcaagtct gcgaatgaag gctatggtgt gtataagctg caattcgatg 2160
atgattcaaa tccagatcct cctaaagacg gactgtggga tctgaccgtc atgcacacca 2220
atgatacgca cgcccatctc gatgatgcag cgagacgaat gacgaaaatc aacgaagtac 2280
gcagcgaaac aaatcacaat attctccttg atgcgggaga tgtgttttcc ggcgatctgt 2340
attttactaa atggaacggt ttggccgatc tgaaaatgat gaacatgatg ggctatgacg 2400
ccatgacctt cggaaaccat gaatttgaca aaggcccgac ggtgctttct gattttctaa 2460
gcggaaacag cgcaaccgtt gatccggcga accgctatca ctttgaagcg ccggaatttc 2520
cgattgtcag tgcaaacgta gatgtgtcaa atgagcccaa gctgaaatca tttgtcaaaa 2580
agccgcaaac ctttacggca ggtgaaaaga aagaggccgg cattcaccct tacattctgt 2640
tagacgttga cggggagaaa gtcgccgtat tcggcctgac aacagaagat acagccacca 2700
catcaagccc gggcaaaagc atcgtattca atgatgcctt tgaaacagca caaaacaccg 2760
tcaaagcgat tcaagaagaa gaaaaggtaa ataaaattat tgctttaacc cacatcggac 2820
ataaccggga tcttgagcta gccaaaaaag taaaaggcat tgatttgatc atcggcggac 2880
acactcacac cctcgtagac aaaatggagg tcgtgaacaa cgaagaaccg acgatcgtgg 2940
cgcaggcaaa agaatacggc caattcttgg ggcgcgttga tgtcgcgttt gatgaaaaag 3000
gcgttgtgca aacagataaa tcaaatctga gcgtgctgcc aattgatgaa catacagaag 3060
aaaacccaga agcaaaacaa gagctcgatc agttcaaaaa tgaattagag gacgtgaaaa 3120
atgaaaaagt cggctacacg gatgtggcgc ttgacggcca gcgtgagcat gtgcgcacga 3180
aagaaacgaa tctcggaaac ttcatcgcgg acggtatgct ggcaaaagcg aaagaagcag 3240
ccggcgccag aatagcgata acaaatggcg gcggcatcag agcaggcatt gacaaaggtg 3300
atatcacact cggcgaggtg ctcaacgtga tgccgttcgg caatacgctt tacgtggccg 3360
atttaaccgg aaaacaaatt aaagaagccc ttgaacaagg cctaagcaat gtggaaaatg 3420
gcggcggcgc tttccctcag gtggccggaa tcgaatatac ctttacatta aacaacaaac 3480
ctggacaccg tgtgttagaa gtgaaaattg aatcgcctaa cggagacaaa gttgctataa 3540
atacggatga tacctaccgc gtggcaacaa ataattttgt cggtgccgga ggagacggat 3600
attctgtctt tacagaagcc tcccatggtg aagaccttgg ctacgttgat tatgagattt 3660
tcaccgaaca gctgaaaaaa ctaggaaaca aggtctctcc taaagttgaa ggacgaatca 3720
aagaagtatt cctgccgaca aagcagaagg acggcagctg gacacttgat gaagacaaat 3780
ttgcgattta tgctaaaaat gccaacacgc catttgtcta ttatggaata catgaaggat 3840
ctcaagagaa gcctatcaat cttaaagtga aaaaagatca ggtcaaactt ttgaaagaaa 3900
gagagtcaga tccttcattg acgatgttca actactggta cagcatgaag atgccaatgg 3960
cgaaccttaa aaccgcagac actgcaatcg gaatcaagtc tacgggagaa ttggatgtgt 4020
cactgtcaga tgtatatgac tttacagtga agcaaaaagg aaaagaaata aaatcattca 4080
aggagcccgt acagctttcg cttcgcatgt ttgatattga agaagcccat aaccctgcca 4140
tttatcacgt cgatagaaaa aagaaagctt tcacaaagac aggtcacgga tcagtcgatg 4200
atgatatggt gacaggatat acaaaccact tcagcgaata cacgatctta aattccggtt 4260
caaacaacaa accgccggca ttcccgtcag atcaaccgac aggcggtgat gacggcaatc 4320
atggcggagg ctccgacaaa ccaggcggaa aacagccaac tgacggaaac ggaggaaatg 4380
atacgcctcc cggcactcaa ccgactaacg gctctggtgg aaacggttcg ggcggatcag 4440
gaacagacgg tccggctggc ggcctgcttc cggacacagc cacatccatg tactcgatcc 4500
tgttggccgg atttctgatc agcgcactcg gaacggcaat gtacttacat cagaggagaa 4560
aacagaatag agcgaatcag gcataacaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 4620
cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatgaccaaa 4680
agtgcgtccg atacgctgta tcaatacttt ggtcagcatg gggataaagt ggtgcagccg 4740
ctggtgcaaa agctggataa gcagcaggtg ctttcgcagc gaacgcgtta a 4791
<210> 7
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1467)
<400> 7
atgctacgta tcgctaaaga agctctgacg tttgacgacg ttctcctcgt tcctgctcac 60
tctaccgttc tgccgaatac tgctgacctc agcacccagc tgacgaaaac tattcgtctg 120
aatatcccta tgctttccgc agcaatggat accgtaacgg aagcgcgcct ggctattgct 180
ctggctcagg aaggcggtat cggctttatc cacaaaaaca tgtccattga acgccaggca 240
gaagaagttc gccgtgtgaa aaaacacgaa tctggtgtgg tgactgatcc gcagactgtt 300
ctgccaacca cgacgctgcg cgaagtgaaa gaactgaccg agcgtaacgg ttttgcgggc 360
tatccggtcg ttaccgaaga aaacgaactg gtgggtatta tcaccggtcg tgacgtgcgt 420
tttgttaccg acctgaacca gccggttagc gtttacatga cgccgaaaga gcgtctggtc 480
accgtgcgtg aaggtgaagc ccgtgaagtg gtgctggcaa aaatgcacga aaaacgcgtt 540
gaaaaagcgc tggtggttga tgacgaattc cacctgatcg gcatgatcac cgtgaaagac 600
ttccagaaag cggaacgtaa accgaacgcc tgtaaagacg agcaaggccg tctgcgtgtt 660
ggtgcagcgg ttggcgcagg tgcgggtaac gaagagcgtg ttgacgcgct ggttgccgca 720
ggcgttgacg ttctgctgat cgactcctcc cacggtcact cagaaggtgt actgcaacgt 780
atccgtgaaa cccgtgctaa atatccggat ctgcaaatta tcggcggcaa cgtggcaaca 840
gctgcaggtg cacgcgctct ggcagaagct ggttgcagtg cggttaaagt cggcattggc 900
cctggctcta tctgtacaac tcgtatcgtg actggcgtcg gtgttccgca gattaccgct 960
gttgctgacg cagtagaagc cctggaaggc accggtattc cggttatcgc tgatggcggt 1020
attcgcttct ccggcgacat cgccaaagct atcgccgctg gcgcaagcgc ggtgatggta 1080
ggttccatgc tggcgggtac tgaagaatct ccgggtgaaa tcgaactcta ccagggccgt 1140
tcttacaaat cttaccgtgg tatgggttcc ctgggcgcga tgtccaaagg ttcctctgac 1200
cgttatttcc agagcgataa cgctgccgac aaactggtgc cggaaggtat cgaaggtcgc 1260
gtagcctata aaggtcgcct gaaagagatc attcaccagc agatgggcgg cctgcgctcc 1320
tgtatgggtc tgaccggctg tggtactatc gacgaactgc gtactaaagc ggagtttgta 1380
cgtatcagcg gtgcgggcat tcaggaaagc cacgttcacg acgtgaccat tactaaagag 1440
tccccgaact accgtctggg ctcctga 1467
<210> 8
<211> 481
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(481)
<400> 8
atgctacgta tcgctaaaga agctctgacg tttgacgacg ttctcctcgt tcctgctcac 60
tctaccgttc tgccgaatac tgctgacctc agcacccagc tgacgaaaac tattcgtctg 120
aatatcccta tgctttccgc agcaatggat accgtaacgg aagcgcgcct ggctattgct 180
ctggctcagg aaggcggtat cggctttatc tgaccgttat ttccagagcg ataacgctgc 240
cgacaaactg gtgccggaag gtatcgaagg tcgcgtagcc tataaaggtc gcctgaaaga 300
gatcattcac cagcagatgg gcggcctgcg ctcctgtatg ggtctgaccg gctgtggtac 360
tatcgacgaa ctgcgtacta aagcggagtt tgtacgtatc agcggtgcgg gcattcagga 420
aagccacgtt cacgacgtga ccattactaa agagtccccg aactaccgtc tgggctcctg 480
a 481
<210> 9
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1002)
<400> 9
atgattgata ccaccctgcc attaactgat atccatcgcc accttgatgg caacattcgt 60
ccccagacca ttcttgaact tggccgccag tataatatct cgcttcctgc acaatccctg 120
gaaacactga ttccccacgt tcaggtcatt gccaacgaac ccgatctggt gagctttctg 180
accaaacttg actggggcgt taaagttctc gcctctcttg atgcctgtcg ccgcgtggca 240
tttgaaaaca ttgaagatgc agcccgtcac ggcctgcact atgtcgagct gcgtttttca 300
ccaggctaca tggcaatggc acatcagctg cctgtagcgg gtgttgtcga agcggtgatc 360
gatggcgtac gtgaaggttg ccgcaccttt ggtgtgcagg cgaagcttat cggcattatg 420
agccggacct tcggcgaagc cgcctgtcag caagagctgg aggccttttt agcccaccgt 480
gaccagatta ccgcacttga tttagccggt gatgaacttg gtttcccggg aagtctgttc 540
ctttctcact tcaaccgcgc gcgtgatgcg ggctggcata ttaccgtcca tgcaggcgaa 600
gctgccgggc cggaaagcat ctggcaggcg attcgtgaac tgggtgcgga gcgtattgga 660
catggcgtaa aagccattga agatcgggcg ctgatggatt ttctcgccga gcaacaaatt 720
ggtattgaat cctgtctgac ctccaatatt cagaccagca ccgtagcaga gctggctgca 780
catccgctga aaacgttcct tgagcatggc attcgtgcca gcattaacac tgacgatccc 840
ggcgtacagg gagtggatat cattcacgaa tataccgttg ccgcgccagc tgctgggtta 900
tcccgcgagc aaatccgcca ggcacagatt aatggtctgg aaatggcttt cctcagcgct 960
gaggaaaaac gcgcactgcg agaaaaagtc gccgcgaagt aa 1002
<210> 10
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(132)
<400> 10
atgattgata ccaccctgcc attaaggtta tcccgcgagc aaatccgcca ggcacagatt 60
aatggtctgg aaatggcttt cctcagcgct gaggaaaaac gcgcactgcg agaaaaagtc 120
gccgcgaagt aa 132
<210> 11
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1455)
<400> 11
atgaataata agggctccgg tctgacccca gctcaggcac tggataaact cgacgcgctg 60
tatgagcaat ctgtagtcgc attacgcaac gccattggca actatattac aagtggcgaa 120
ttacctgatg aaaacgcccg caaacaaggt ctttttgtct atccatcact gaccgtaacc 180
tgggacggta gcacaaccaa tccccccaaa acgcgcgcat ttggtcgctt tacccacgca 240
ggcagctaca ccaccacgat tactcgccct actctctttc gttcgtatct taatgaacaa 300
cttacgttgc tgtatcagga ttatggtgcg catatctcag tgcaaccctc gcagcatgaa 360
atcccttatc cttatgtcat cgatggctct gaattgacac ttgatcgctc aatgagcgct 420
gggttaactc gctacttccc gacaacagaa ctggcgcaaa ttggcgatga aactgcagac 480
ggcatttatc atccaactga attctccccg ctatcgcatt ttgatgcgcg ccgcgtcgat 540
ttttccctcg cacggttgcg ccattatacc ggtacgccag ttgaacattt tcagccgttc 600
gtcttgttta ccaactacac acgttatgtg gatgaattcg ttcgttgggg atgcagccag 660
atcctcgatc ctgatagtcc ctacattgcc ctttcttgtg ctggcgggaa ctggatcacc 720
gccgaaaccg aagcgccaga agaagccatt tccgaccttg catggaaaaa acatcagatg 780
ccagcatggc atttaattac cgccgatggt cagggtatta ctctggtgaa tattggcgtg 840
ggaccgtcaa atgctaaaac catctgcgat catctggcag tgctacgccc ggatgtctgg 900
ttgatgattg gtcactgtgg cggattacgt gaaagtcagg ccattggcga ttatgtactt 960
gcacacgctt atttacgcga tgaccacgtt cttgatgcgg ttctgccgcc cgatattcct 1020
attccgagca ttgctgaagt gcaacgtgcg ctttatgacg ccaccaagct ggtgagcggc 1080
aggcccggtg aggaagtcaa acagcggcta cgtactggta ctgtggtaac cacagatgac 1140
aggaactggg aattacgtta ctcagcttct gcacttcgtt ttaacttaag ccgggccgta 1200
gcaattgata tggaaagtgc aaccattgcc gcgcaaggat atcgtttccg cgtgccatac 1260
gggacactac tgtgtgtttc agataaaccg ttgcatggcg agattaaact tcccggccag 1320
gctaaccgtt tttatgaagg cgctatttcc gaacatctgc aaattggcat tcgggcgatc 1380
gatttgctgc gcgcagaagg cgaccgactg cattcgcgta aattacgaac ctttaatgag 1440
ccgccgttcc gataa 1455
<210> 12
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(291)
<400> 12
atgaataata agggctccgg tctgacccca gctcaggcac tggataaact cgacgcgctg 60
tatgagcaat ctgtagtcgc attacgcgtg ccatacggga cactactgtg tgtttcagat 120
aaaccgttgc atggcgagat taaacttccc ggccaggcta accgttttta tgaaggcgct 180
atttccgaac atctgcaaat tggcattcgg gcgatcgatt tgctgcgcgc agaaggcgac 240
cgactgcatt cgcgtaaatt acgaaccttt aatgagccgc cgttccgata a 291
<210> 13
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1365)
<400> 13
ttgattacac atattagccc gcttggctcc atggatatgt tgtcgcagct ggaagtggat 60
atgcttaaac gcaccgccag cagcgacctc tatcaactgt ttcgcaactg ttcacttgcc 120
gtactgaact ccggtagttt gaccgataac agcaaagaat tgctgtctcg ttttgaaaat 180
ttcgatatta acgtcttgcg ccgtgaacgc ggcgtaaagc tggaactgat taatcccccg 240
gaagaggctt ttgtcgatgg gcgaattatt cgcgctttgc aggccaactt gttcgcggtc 300
ctgcgtgaca ttctcttcgt ttacgggcaa atccataaca ccgttcgttt tcccaacctg 360
aatctcgaca actccgtcca catcactaac ctggtctttt ccatcttgcg taacgctcgc 420
gcgctgcatg tgggtgaagc gccaaatatg gtggtctgct ggggcggtca ctcaattaac 480
gaaaacgagt atttgtatgc ccgtcgcgtc ggaaaccagc tgggcctgcg tgagctgaat 540
atctgcaccg gctgtggtcc gggagcgatg gaagcgccga tgaaaggtgc tgcggtcgga 600
cacgcgcagc agcgttacaa agacagtcgt tttattggta tgacagagcc gtcgattatc 660
gccgctgaac cgcctaaccc gctggtcaac gaattgatca tcatgccaga tatcgaaaaa 720
cgtctggaag cgtttgtccg tatcgctcac ggtatcatta tcttccctgg cggtgtgggt 780
acggcagaag agttgctcta tttgctggga attttaatga acccggccaa caaagatcag 840
gttttaccat tgatcctcac cggcccgaaa gagagcgccg actacttccg cgtactggac 900
gagtttgtcg tgcatacgct gggtgaaaac gcgcgccgcc attaccgcat catcattgat 960
gacgccgctg aagtcgctcg tcagatgaaa aaatcgatgc cgctggtgaa agaaaatcgc 1020
cgtgatacag gcgatgccta cagctttaac tggtcaatgc gcattgcgcc agatttgcaa 1080
atgccgtttg agccgtctca cgagaatatg gctaatctga agctttaccc ggatcaacct 1140
gttgaagtgc tggctgccga cctgcgccgt gcgttctccg gtattgtggc gggtaacgta 1200
aaagaagtcg gtattcgcgc cattgaagag tttggtcctt acaaaatcaa cggcgataaa 1260
gagattatgc gtcgtatgga cgacctgcta cagggttttg ttgcccagca tcgtatgaag 1320
ttgccaggct cagcctacat cccttgctac gaaatctgca cgtaa 1365
<210> 14
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(258)
<400> 14
ttgattacac atattagccc gcttggctcc atggatatgt tgtcgcagct ggaagtggat 60
atgcttaaac gcaccgccag cagcgacctc tatcaactgt ttcgcaactg ttcacttgcc 120
gtactgaact ccggtagttt gaccgataac agcgagatta tgcgtcgtat ggacgacctg 180
ctacagggtt ttgttgccca gcatcgtatg aagttgccag gctcagccta catcccttgc 240
tacgaaatct gcacgtaa 258
<210> 15
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(720)
<400> 15
atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60
ggcgacccgc tgcgtgcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120
aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180
atgggtcacg gtatgggtat cccgtcctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgat 240
ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt tcctgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300
ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360
tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtaa cgcagtagat 420
gcagctaaag cactgggtat tgatgctcgc gtgggtaacc tgttctccgc tgacctgttc 480
tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattct cggcgtggaa 540
atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600
tgcaccgtat ctgaccacat ccgcactcac gagcagacca ctgccgctga gcgtcagact 660
accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaagagtaa 720
<210> 16
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> gene
<222> (1)..(261)
<400> 16
atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60
ggcgaccttc tcggcgtgga aatggaagcg gctggtatct acggcgtcgc tgcagaattt 120
ggcgcgaaag ccctgaccat ctgcaccgta tctgaccaca tccgcactca cgagcagacc 180
actgccgctg agcgtcagac taccttcaac gacatgatca aaatcgcact ggaatccgtt 240
ctgctgggcg ataaagagta a 261
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 17
gtgctggagg gatgattgtt gggag 25
<210> 18
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(76)
<400> 18
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaacgca 60
gtacttcctg ctggct 76
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 19
tgcgctggtt gatttcttct aggcgaatta ccggcgttca ctata 45
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 20
tcacctccac cagcacatcc 20
<210> 21
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(69)
<400> 21
tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaccatgcag ccgctagtag 60
gaatcatca 69
<210> 22
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(70)
<400> 22
tatagtgaac gccggtaatt cgcctagaag aaatcaacca gcgcactatg ctaaacctaa 60
acgttcaaag 70
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 23
ggttcatctg caatgccgc 19
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 24
gaaagacgtg acgtgatttt ctctt 25
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 25
atgaacataa ctcaatttgt aggcgaatta ccggcgttca ctata 45
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(28)
<400> 26
aagagaaaat cacgtcacgt ctttctcc 28
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(48)
<400> 27
cctacaaatt gagttatgtt cattcaagca gtagtgacat gagtttcc 48
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<400> 28
gaggattttc ttacggcgat tact 24
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(34)
<400> 29
tcacgataga ctggaacaat ttaagaccgt cggc 34
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 30
aggaatatcc gcaataatta tggcgaatta ccggcgttca ctata 45
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(27)
<400> 31
gtcttaaatt gttccagtct atcgtga 27
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(51)
<400> 32
attcgccata attattgcgg atattccttt aagcctttga tttcagcaag c 51
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 33
agatacagcg cacattacaa cacag 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 34
caaatggaac gattgatatt catgg 25
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 35
tgcgctggtt gatttcttct aggcgaatta ccggcgttca ctata 45
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<400> 36
aatatcaatc gttccatttg cagc 24
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(59)
<400> 37
ccggtaattc gcctagaaga aatcaaccag cgcagctgtt taatcacact cggatacca 59
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 38
acaaaccgca ggcgaaagt 19
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 39
ctgtggagat gacttcaacg ccaagctctg tcagttcttt tacg 44
<210> 40
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(46)
<400> 40
gctttaaagg ctgcccaaaa ataacgaatt accggcgttc actata 46
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 41
cgtaaaagaa ctgacagagc ttggcgttga agtcatctcc acag 44
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(46)
<400> 42
tatagtgaac gccggtaatt cgttattttt gggcagcctt taaagc 46
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 43
gtcaggcact ggcgaaagat 20
<210> 44
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(75)
<400> 44
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaacgca 60
agccataaac ccaca 75
<210> 45
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(82)
<400> 45
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60
aatttccgac atcgaaatgc gt 82
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 46
aggcgttgtt gtggcagatt 20
<210> 47
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(75)
<400> 47
tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatgt cttcagtagt 60
tgtagtaggt acgca 75
<210> 48
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(57)
<400> 48
agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttagtt cgcacggtac acactgc 57
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 49
gccagcacga acataatccc 20
<210> 50
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(74)
<400> 50
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaacacg 60
gtggcaggtt ttgg 74
<210> 51
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 51
aggaatatcc gcaataatta tgggaccaaa agtgcgtccg atac 44
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 52
cggcgtaatc acaaactggc 20
<210> 53
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(87)
<400> 53
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
gtgagaatac agaaaagacg aacacac 87
<210> 54
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(59)
<400> 54
cgcacttttg gtcccataat tattgcggat attcctcatt cgcagacttg cctacataa 59
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 55
tgttcaaatc gtcaagctga cag 23
<210> 56
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(34)
<400> 56
cattcgcaga cttgcctaca taagcgacat cgtc 34
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(40)
<400> 57
atgtcgctta tgtaggcaag tctgcgaatg aaggctatgg 40
<210> 58
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 58
gtatcggacg cacttttggt cttatgcctg attcgctcta ttctg 45
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 59
gcggtgtcgt ctttgagtgt aa 22
<210> 60
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 60
tcgctctgga aataacggtc agataaagcc gataccgcct tc 42
<210> 61
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 61
gaaggcggta tcggctttat ctgaccgtta tttccagagc ga 42
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 62
cgcctgcttc aaagacatac tg 22
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 63
accggtgctt acgggattat ag 22
<210> 64
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(41)
<400> 64
tttgctcgcg ggataacctt aatggcaggg tggtatcaat c 41
<210> 65
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(41)
<400> 65
gattgatacc accctgccat taaggttatc ccgcgagcaa a 41
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(21)
<400> 66
atcccgaggc agttatgtga a 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 67
ttggtcgccg tagggtttat 20
<210> 68
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 68
agtagtgtcc cgtatggcac gcgtaatgcg actacagatt gctc 44
<210> 69
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 69
gagcaatctg tagtcgcatt acgcgtgcca tacgggacac tact 44
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 70
ttcatctccg ccgccttt 18
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 71
ataactggga tgaggtgcgc 20
<210> 72
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 72
cgtccatacg acgcataatc tcgctgttat cggtcaaact accg 44
<210> 73
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 73
cggtagtttg accgataaca gcgagattat gcgtcgtatg gacg 44
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 74
ggcgttgatt ggcaggaa 18
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 75
tgacgccacc atcaaagaga 20
<210> 76
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(36)
<400> 76
ccatttccac gccgagaagg tcgcctggca tcaaaa 36
<210> 77
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(36)
<400> 77
ttttgatgcc aggcgacctt ctcggcgtgg aaatgg 36
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 78
tggcaacaag gcgtgagaac 20
<210> 79
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 79
agtcctaggt ataatactag tatcccgcat ttcttaaagt cgttttagag ctagaa 56
<210> 80
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 80
ttctagctct aaaacgactt taagaaatgc gggatactag tattatacct aggact 56
<210> 81
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 81
agtcctaggt ataatactag ttgcgctggt tgatttcttc tgttttagag ctagaa 56
<210> 82
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 82
ttctagctct aaaacagaag aaatcaacca gcgcaactag tattatacct aggact 56
<210> 83
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 83
agtcctaggt ataatactag tatgaacata actcaatttg tgttttagag ctagaa 56
<210> 84
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 84
ttctagctct aaaacacaaa ttgagttatg ttcatactag tattatacct aggact 56
<210> 85
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 85
agtcctaggt ataatactag tcgtgaaaga cttccagaaa ggttttagag ctagaa 56
<210> 86
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 86
ttctagctct aaaacctttc tggaagtctt tcacgactag tattatacct aggact 56
<210> 87
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 87
agtcctaggt ataatactag tattgaagat gcagcccgtc agttttagag ctagaa 56
<210> 88
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 88
ttctagctct aaaactgacg ggctgcatct tcaatactag tattatacct aggact 56
<210> 89
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 89
agtcctaggt ataatactag tacaacagaa ctggcgcaaa tgttttagag ctagaa 56
<210> 90
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 90
ttctagctct aaaacatttg cgccagttct gttgtactag tattatacct aggact 56
<210> 91
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 91
agtcctaggt ataatactag tgcgaattat tcgcgctttg cgttttagag ctagaa 56
<210> 92
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 92
ttctagctct aaaacgcaaa gcgcgaataa ttcgcactag tattatacct aggact 56
<210> 93
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 93
agtcctaggt ataatactag tactgggtat tgatgctcgc ggttttagag ctagaa 56
<210> 94
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 94
ttctagctct aaaaccgcga gcatcaatac ccagtactag tattatacct aggact 56
<210> 95
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(84)
<400> 95
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60
aatgaccaaa agtgcgtccg atac 84
<210> 97
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(56)
<400> 97
agtcctaggt ataatactag taggaatatc cgcaataatt agttttagag ctagaa 56
<210> 97
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<400> 97
ttctagctct aaaactaatt attgcggata ttcctactag tattatacct aggact 56
<210> 98
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<222> (1)..(56)
<400> 98
agtcctaggt ataatactag tcattaccac ttatggcgaa cgttttagag ctagaa 56
<210> 99
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<222> (1)..(56)
<400> 99
ttctagctct aaaacgttcg ccataagtgg taatgactag tattatacct aggact 56
<210> 100
<211> 56
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<222> (1)..(56)
<400> 100
agtcctaggt ataatactag tgcgtgatgt gaatgagaaa agttttagag ctagaa 56
<210> 101
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<222> (1)..(56)
<400> 101
ttctagctct aaaacttttc tcattcacat cacgcactag tattatacct aggact 56

Claims (6)

1.一种腺苷工程菌，其特征在于：是由下述方法制备得到的：在含pREDCas9质粒的大肠杆菌E.coli W3110的基因组上构建嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD，将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，所述大肠杆菌假基因yjiV的原始基因序列为序列表SEQ ID NO:1所示序列，还将腺苷琥珀酸合酶基因purA连接Ptrc启动子整合在大肠杆菌假基因位点yghE上；在大肠杆菌mbhA基因位点整合了核苷酸磷酸酯酶基因yfkN，并用启动子Ptrc启动，敲除guaB、add、amn、ygdH和deoD基因，所述嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD以及purA基因和yfkN基因均来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL。
2.权利要求1所述腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：在含pREDCas9质粒的大肠杆菌E.coli W3110的基因组上构建嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD，将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，并由Ptrc启动子启动；还在假基因位点yghE上整合了purA基因，用Ptrc启动子启动；在大肠杆菌mbhA基因位点整合了yfkN基因，并用启动子Ptrc启动，敲除guaB、add、amn、ygdH和deoD基因，所述嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD以及purA基因和yfkN基因均来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL。
3.根据权利要求2所述的腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向基因改造，包括如下步骤：
（1）将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，并用强启动子Ptrc启动；
（2）purA基因整合在大肠杆菌假基因位点yghE上，并链接Ptrc启动子；
（3）在大肠杆菌mbhA基因位点整合了yfkN基因，并用启动子Ptrc启动；
（4）敲除guaB基因，阻断腺苷的前体物IMP的支路代谢；
（5）敲除amn，ygdH基因，减弱腺苷的前体物AMP的降解；
（6）敲除add和deoD基因，减弱腺苷的降解。
4.根据权利要求2所述的腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将强启动子Ptrc与purE， purK和purB基因连接后,并在purB后面插入一个剪切识别序列，整合到E.coli W3110的假基因位点yjiV上；
（2）将purCSQ基因依次整合在purB基因的后面,在该基因后面插入靶序列gRNA-pur1-S和gRNA-pur1 -A；
（3）把purL基因整合在purQ基因的后面；
（4）把purFMN基因整合在purL基因的后面；
（5）把purHD基因整合在purN基因的后面。
5.根据权利要求4所述的腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：在上述步骤（5）的基础上，继续进行如下操作步骤：
（6）将purA基因与Ptrc启动子连接，整合到假基因yghE位点上；
（7）把yfkN基因的前1900bp的碱基与强启动子Ptrc连接，后加识别靶序列，整合到假基因mbhA上，之后再把yfkN基因的后半部分碱基整合到前半部分碱基的后面；
（8）将guaB基因敲除，减弱前体物IMP的支路代谢，使其更多地流向腺苷的合成途径中；
（9）敲除add基因，阻断腺苷到肌苷的降解途径；
（10）敲除amn和ygdH基因，减少腺苷前体物AMP到腺嘌呤的转化；
（11）敲除deoD基因，减弱腺苷到腺嘌呤的降解途径。
6.权利要求1所述腺苷工程菌在摇瓶发酵生产腺苷方面的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116144560A (zh) * 2022-09-28 2023-05-23 天津科技大学 一种苯丙氨酸大肠杆菌生产菌及其应用
CN116925993B (zh) * 2023-09-19 2023-12-08 北京量维生物科技研究院有限公司 用于酶催化生产胞苷酸的基因工程改造菌株和方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232674A (zh) * 2014-07-15 2014-12-24 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法
WO2018083692A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Tamar Levin Novel methods for modulating protein expression in microorganisms
WO2020071538A1 (en) * 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
CN111363709A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232674A (zh) * 2014-07-15 2014-12-24 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法
WO2018083692A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Tamar Levin Novel methods for modulating protein expression in microorganisms
WO2020071538A1 (en) * 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
CN111363709A (zh) * 2018-12-26 2020-07-03 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Transcriptome analysis guided metabolic engineering of Bacillus subtilis for riboflavin production;Shuobo Shi等;《Metabolic Engineering》;20091230;全文 *
枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响;徐庆阳等;《微生物学报》;20141230;全文 *

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