CN104232674A - 一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法，该方法以温敏型质粒pKS2为载体，通过同源重组的方法去除嘌呤操纵子(purEKBCSQLFMNHD)的启动子部分片段，其优选序列片段是缺失purE基因前-193～-29bp片段，缺失该片段后的菌株解除了purR(嘌呤操纵子的阻遏蛋白)的阻遏效应和该段片段的回文结构带来的转录衰减作用。purF编码磷酸核糖焦磷酸(PRRR)转酰胺酶基因通过点突变脱敏，其优选是217亮氨酸突变为异亮氨酸(L217I)，其所受产物腺苷酸，鸟苷酸的反馈抑制被解除。经过改造后的基因工程菌鸟苷生产能力明显提高。

Description

一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法。

技术背景

鸟嘌呤核苷，即鸟苷，是嘌呤核苷类的一种，是鸟嘌呤N-9与D-核糖的C-1通过β-糖苷键相连形成的。鸟苷在食品和医药工业有非常广泛的用途。在食品工业，鸟苷磷酸酯为鸟苷酸，鸟苷酸和肌苷酸组成呈味核苷酸钠作为新一代的核苷类食品增鲜剂，是味精鲜味的十几倍，是目前方便面调味包、调味品(如鸡精、酱油等)的主要呈味成分之一。在医药工业，鸟苷作为很多高效药物的中间体，比如流感病毒、艾滋病毒和疱疹病毒等抗病毒药物。例如许多乙肝病毒药物，如拉米夫定、恩替卡韦等，中间体都是鸟苷。

目前，微生物发酵生产是鸟苷主要的生产方法，微生物发酵生产菌主要是芽孢杆菌类，包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌很短小芽孢杆菌等。芽孢杆菌类作为生产鸟苷的出发菌株的特点是磷酸戊糖途径比较活跃，嘌呤核苷磷酸化酶活力低。在微生物体内，鸟苷的生物合成途径有两条：分别是从头合成途径和补救合成途径。在工业微生物生产中，通过添加碳源、氮源、无机盐和生长因子为原材料，经过一系列酶促反应，从头合成生成鸟苷。在芽孢杆菌中，生产核苷需要经过一个包含12个基因的操纵子(purEKBCSQLFMNHD)，称为嘌呤操纵子。嘌呤核苷酸生物合成的调控机制非常复杂，包括转录阻遏、转录衰减及末端产物反馈抑制等。而嘌呤操纵子的调控直接导致嘌呤核苷的产量。purR是嘌呤操纵子的阻遏蛋白，调控一系列有关嘌呤代谢基因表达，Aloke等[Aloke Kumar Bera,Jianghai Zhu,Howard Zalkin,et al.Fuctional Dissection of the Bacillus subtilis purOperator site.Jouranl of Bacteriology,2003,185(14):4099-4109]报道purR基因特异性的锚定在purE基因前两个14个核苷酸反向重复称之为“PurBox”上，阻碍嘌呤操纵子的转录。嘌呤操纵子的转录除了受purR的阻遏作用外，还受转录衰减的调控。Daniel等报道[Daniel J.Ebbole and Howard zalkin.Detection of purOperon-attenuated mRNA and Accumulated Degradation Intermediates in Bacillussubtilis.The Journal of Biological Chemistry.1988,263(22):10894-10902]调控操纵子的转录从purE基因上游242个核苷酸开始，在这之间有两个回文结构，使转录提前终止，这个终止转录并不依赖σ因子。因此，通过对嘌呤操纵子上游基因进行操作可以解除purR表达的阻遏蛋白对嘌呤操纵子的转录起始的阻遏效应，也可以避免回文结构使嘌呤操纵子的转录提前结束。

purF编码PRPP转酰胺酶是芽孢杆菌属内鸟苷合成途径上的一个关键酶，催化PRPP生成5-磷酸核糖胺，促进胞内的PRPP进入嘌呤(pur)合成途径。何逵夫等(何逵夫，马跃超，杜姗姗，谢希贤，徐庆阳，陈宁.解淀粉芽孢杆菌关键酶基因过量表达对鸟苷积累的影响.微生物学报.2012,52(6):718～725)通过换用强启动子增强purF的表达来增加鸟苷的产量，指出过量表达策略能使鸟苷产量提高，这可能与胞内的核苷酸浓度很低以至于反馈抑制没有形成有关。但关键酶的反馈抑制并未解除。PRPP转酰胺酶主要受到腺苷酸的反馈抑制，还受到GMP的反馈抑制作用。Shimaoka等(Shimaoka M.,Takenaka Y.,Kurahashi O.,etal.Effect ofamplification of desensitized purF and prs on inosine accumulation in Escherichia coli[J].J Biosci Bioeng,2007,103(3):255-61)将脱敏的PurF和Prs导入到大肠杆菌中表达，成功地提高了肌苷的产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现在技术的不足，提供一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法。

本发明的方法涉及的宿主菌是解淀粉芽孢杆菌，通过对该菌进行两个位点的改造。两个改造位点一个是嘌呤操纵子(purEKBCSQLFMNHD)的启动子部分片段即是缺失purE基因前-193～-29bp片段；第二个是purF编码磷酸核糖焦磷酸(PRRR)转酰胺酶基因氨基酸217亮氨酸突变为异亮氨酸(L217I)的点突变。经过改造后的基因工程菌鸟苷生产能力提高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法，包括如下步骤：嘌呤操纵子(purEKBCSQLFMNHD)的启动子部分片段即purE基因(编码磷酸核糖氨基咪唑碳酸化酶)前-193～-29bp片段缺失；或是将purF基因(编码磷酸核糖焦磷酸PRRR转酰胺酶)的217位氨基酸亮氨酸突变为异亮氨酸(L217I)。所述purE基因前-193～-29bp片段缺失，其DNA序列如SEQIDNO:1所示。所述purF基因氨基酸序列217位突变，其DNA序列如SEQIDNO:2所示。

在上述方法中，所述构建解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensXH-Δpo：PCR扩增解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株(BacillusamyloliquefaciensDSM7：ATCC23350)嘌呤启动子基因的DNA片段，然后通过融合PCR将purE基因前-193～-29bp片段缺失，融合PCR扩增产物连接入pKS2质粒基因，最后将重组的pKS2质粒转化入解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensXH，经过同源重组，得到解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensXH-Δpo；

在上述方法中，所述构建解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-△po-purF-217：PCR扩增解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株(BacillusamyloliquefaciensDSM7：ATCC23350)purF基因，然后通过融合PCR将purF基因217位氨基酸突变(L217I)由原来的亮氨酸突变为异亮氨酸，融合PCR扩增产物连接入pKS2质粒基因，最后将重组的pKS2质粒转化入解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensXH-Δpo，经过同源重组，得到解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-△po-purF-217。

利用改造后所得解淀粉芽孢杆菌工程菌生产鸟苷的方法，包括以下步骤：将解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-△po-purF-217在37℃的固体活化培养基中培养24～36h，得到活化的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensXH7-△po-purF-217；然后将活化的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensXH7-△po-purF-217以单菌落接入摇瓶种子培养基，37℃培养6～7h，按体积比10％的接种量接种到摇瓶发酵培养基中，37℃发酵60～72h，将发酵液加热、离心，将上清液过0.22μm的膜HPLC检测鸟苷含量。

所述固体活化培养基成分(重量百分比)：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母抽提物，1％葡萄糖，1.5％琼脂，余量为水；摇瓶种子培养基成分(重量百分比)：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，余量为水，pH7.2；摇瓶发酵培养基成分(重量百分比)：葡萄糖8％，硫酸镁0.6％，酵母粉0.8％，硫酸二氢钾0.15％，硫酸铵1.0％，氯化钾0.15％，味精1.6％，碳酸钙0.3％，余量为水，pH7.2。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明是在一株解淀粉芽孢杆菌菌株上进行基因工程操作达到积累、提高鸟苷产量的目的。涉及两个新的改造位点，一是优选序列片段操纵子(purEKBCSQLFMNHD)的启动子部分片段即缺失purE基因前-193～-29bp片段，缺失该片段后的菌株解除了purR(嘌呤操纵子的阻遏蛋白)的阻遏效应和该段片段的回文结构带来的转录衰减作用。二是purF编码磷酸核糖焦磷酸(PRRR)转酰胺酶基因优选是217亮氨酸突变为异亮氨酸(L217I)，其所受产物腺苷酸，鸟苷酸的反馈抑制被解除。

(2)通过温敏性质粒以同源重组的方法在基因组染色体上的改造，无抗生素标记和外源DNA片段。所构建的工程菌因目的基因整合到染色体上，遗传稳定性高，从而导致生产性能稳定。

附图说明

图1是实施例中1扩增purE基因起始密码子-193～-29bp截断的PCR产物电泳图；

图2是实施例中2扩增含有purF基因L217I突变位点的PCR产物电泳图；

图3是(a)实施例中1嘌呤启动子缺失片段和(b)实施例中2purF基因点突变片段构建示意图；

图4是实施例中1嘌呤启动子截断片段DNA的载体构建示意图；

图5是实施例中2含有purF(L217I)突变片段的载体构建示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段酶切、连接、凝胶电泳都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,Russell DW,JanssenK,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。

实施例1：

以解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensXH7为出发菌株的产鸟苷工程菌B.amyloliquefaciens XH-△po的构建

(1)含有嘌呤启动子截断片段的获得：含有解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株(Bacillus amyloliquefaciens XH7：CP002927)嘌呤启动子基因的DNA片段通过用该细菌的染色体DNA作为模板进行PCR而获得，引物为SEQ ID No.3、SEQID No.4扩增同源臂左臂，引物为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6扩增同源臂右臂，基因PCR扩增的产物胶回收，然后取等摩尔比例的扩增产物作为模板，所用正向引物和反向引物分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.6，扩增出与purE基因起始密码子-193～-29bp截断基因大小相符的DNA片段，如图1所示，图中泳道1为DNA marker；泳道2、3均为RCR产物(purE基因起始密码子-193～-29bp截断的基因)。通过Sanger测序结果证明获得片段是将purE基因起始密码子-193～-29bp的DNA片段截断的DNA片段。

(2)同源替换载体的构建：将温敏性质粒PKS2用speI、kpnI双酶切，speI、kpnI双酶切上下同源臂然后用cycle pure柱纯化产物，以T4DNA连接酶连接，所使用的同源臂是解淀粉芽孢杆菌DSM7的yebG和purE基因，将融合PCR的产物插入，即成功构建融合质粒PKS2-△po。

(3)目的菌株的获得：将构建好的融合质粒PKS2-△po转化芽孢杆菌XH7，通过同源重组的方式整合到芽孢杆菌XH7基因组上，转化方法参见以下文献记载Natalia P，Zakataeva，Oksana V et al.A simple method to introduce marker-freegenetic modification into chromosome of naturally nontransformable Bacillusamyloliquefaciens strains[J].Appl Microbiol Biotechnol.2010,85:1201-1209)，得到新的菌株B.amyloliquefaciens XH7-△po。

实施例2：

以解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensXH-△po为出发菌株的产鸟苷工程菌B.amyloliquefaciensXH7-△po-purF-217的构建

(1)purF基因扩增和突变片段的获得：含有解淀粉芽孢杆菌XH7菌株(Bacillus amyloliquefaciens XH7：CP002927)嘌呤启动子基因的DNA片段通过用该细菌的染色体DNA作为模板进行PCR而获得，引物为SEQ ID No7、SEQ IDNo8扩增同源臂左臂，引物为SEQIDNo9、SEQIDNo10扩增同源臂右臂，基因PCR扩增的产物胶回收，然后取等摩尔比例的扩增产物作为模板，所用正向引物和反向引物分别为SEQ ID No.7、SEQ ID No.10，扩增出一条含有purF基因L217I突变位点的大小相符的DNA片段。如图2所示，图中泳道1为DNAmarker；泳道2、3均为RCR产物(含有purF基因L217I突变位点基因片段)。通过Sanger测序结果证明获得片段大小是有purF基因L217I突变位点的基因，即leu(DNA:CTT)突变为ile(DNA:ATT)。

(2)同源替换载体的构建：将温敏性质粒PKS2用speI、kpnI双酶切，speI、kpnI双酶切上下同源臂然后用cycle pure柱纯化产物，以T4DNA连接酶连接，所使用的同源臂是解淀粉芽孢杆菌XH7的purF基因，将融合突变位点的purF产物插入，即成功构建融合质粒PKS2-purF-217。

(3)将融合基因整合到产核苷菌株基因组上获得purF突变的菌株：将构建好的融合质粒PKS2-purF-217转化芽孢杆菌XH7-△po，通过同源重组的方式整合到芽孢杆菌XH7基因组上，转化方法参见以下文献记载Natalia P，Zakataeva，Oksana V et al.A simple method to introduce marker-free genetic modification intochromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains[J].Appl Microbiol Biotechnol.2010,85:1201-1209)，得到新的菌株Bacillus amyloliquefaciens XH7-△po-purF-217。

实施例3：

构建的解淀粉芽孢杆菌工程菌Bacillus amyloliquefaciensXH-△po和B.amyloliquefaciensXH7-△po-purF-217摇瓶发酵产鸟苷能力的检测

(1)从保藏的甘油管中(甘油浓度18％，-80℃保藏)划线于优选的固体活化培养基(重量百分比)(成分：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母抽提物，1％葡萄糖，1.5％琼脂，余量为水)上，37℃培养24～36h；挑取固体平板上长出的单菌落，接种于摇瓶种子培养基(重量百分比)(成分：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，pH7.2)中，37℃培养6～7h，按体积比10％的接种量接种到摇瓶发酵培养基(重量百分比)(葡萄糖8％，硫酸镁0.6％，酵母粉0.8％，硫酸二氢钾0.15％；硫酸铵1.0％，氯化钾0.15％，味精1.6％，碳酸钙0.3％(分消)，余量为水，pH7.2。)中，37℃发酵60～72h。

(2)将发酵液于沸水中保温5min，5000rpm转速离心2min，将上清液过0.22μm的膜HPLC检测鸟苷含量。HPLC检测鸟苷的条件是：流动相甲醇：水＝10:90(体积比)；检测柱：Phenomenex Gemini5μmC18规格250*4.6mm；检测波长：紫外254nm；流速：1ml/min；柱温：25～30℃。鸟苷标准品购于sigma公司。摇瓶结果如下表所示：

表1两株工程菌摇瓶发酵产鸟苷评估结果(三次重复均值)

表1的鸟苷摇瓶发酵结果显示，通过敲除了嘌呤启动子-193～-29bp片段，破坏了嘌呤启动子的转录衰减区和阻遏蛋白结合区的鸟苷工程菌

Bacillus amyloliquefaciens XH-Δpo摇瓶产鸟苷能力比初始菌提高了10％，在该工程菌的基础上突变了purF基因的217位核苷酸位点，其所受产物腺苷酸，鸟苷酸的反馈抑制大致被解除，摇瓶产鸟苷能力提高了18％，说明通过嘌呤操纵子启动子片段区域的改造和purF基因定点突变脱敏，能提高解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensXH积累鸟苷的能力，为工业化生产选育更高产量菌株提供思路。

序列表

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 华南理工大学

 

<120>  一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法

 

<130> 

 

<160>  10   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  765

<212>  DNA

<213>  解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

 

<400>  1

atgacaaagc caaaaaagaa acggtttgaa gtaacggaac atgaaacgat cgacaccatt       60

 

ctcgctttaa tgaaggaaga ggggtatatg cccgtccggc ggatggaaga gccgatcttt      120

 

acagaaaaga aagaaaatgg atcaattcaa gtcgttcctt gcgggagaaa aatcgtattt      180

 

gaagggaaat tgatctaaac acgaacatta aaagaaagaa tttttatatc gttcgataat      240

 

gtcgttgaca ttatccaagt ccgttgttaa gataaacatg aaatcaaaac acgacctcat      300

 

ataatcttgg gaataaacaa agcatgagaa ggtgggaaca gaatgcagcc gctagcagga      360

 

atcatcatgg gaagcacctc cgattgggag acaatgaaac atgcatgcga catacttgac      420

 

gaacttcaca ttccttatga aaaacaggtg gtatccgcgc atcggacgcc tgatttgatg      480

 

tttgaatatg cagaaagcgc caggagcaga ggcttaaaag tcattattgc cggagccgga      540

 

ggagcggcgc atctgccggg aatgacggcg gccaaaacga cactgccggt gatcggtgtt      600

 

ccggttcaga caaaatcgct taacgggctt gattctcttt tgtctatcgt acagatgccc      660

 

ggcggcgtgc cggtcgcgac gacagcgatc ggaaaagcgg gcgcagtgaa cgcgggtctg      720

 

ttagccgcgc aaattttgtc ggcatttgac gatgacattg cggat                      765

 

 

<210>  2

<211>  1431

<212>  DNA

<213>  解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

 

<400>  2

atgcttgctg aaatcaaagg cctgaatgaa gaatgcggtg tgtttggcat ctgggggcat       60

 

gaagaggctc cgcagattac gtattacggc ctgcacagcc tgcagcacag agggcaggag      120

 

ggcgccggca tcgtggcgac cgacggccaa aaactgacgg ctcataaagg gcaggggctt      180

 

attaccgagg tttttcaaaa cggcgaactg agcaaagtga aaggcaaagg cgcgatcggt      240

 

cacgtccgct atgcgacggc cggcggcggc ggatatgaaa atgtccagcc gctcctgttc      300

 

cgttcgcaaa acaacggcag tctcgcgctc gcccataacg gcaacctggt caatgccaca      360

 

caattgaaac agcagcttga aaaccaaggg agcatctttc agacttcctc cgatacggaa      420

 

gtgctggctc atctgattaa acgcagcggc cacttttcac tgaaggatca gatcaaaaat      480

 

tcgctatcca tgctgaaagg cgcttacgcc tttttaatca tgacagaaac agaaatgatt      540

 

gtagcgcttg acccgaacgg actcagaccg ctttcactcg gcatgctcgg cgacgcttac      600

 

gtcgtcgcat cagaaacatg cgcatttgat gtggtcggcg ccacgtacat tcgtgacgta      660

 

gaaccgggcg aaatgcttat cataaacgat gaaggcttga aatcagagcg tttctccatg      720

 

aatatcaacc gttctatctg cagcatggag tatatctatt tttcccgtcc ggacagcaat      780

 

atcgacggca ttaacgtgca cagcgcccgg aagagcctcg ggaaaatgct tgcccaagag      840

 

tccgctgttg aagcggatgt cgtcacaggc gtgcctgatt ccagtatttc cgcggccatc      900

 

ggctatgccg aggcaacggg cattccgtac gaactcggtc tcattaaaaa ccgttacgtc      960

 

ggcagaacgt ttatccagcc gtctcaagct cttcgtgagc aaggagtaag aatgaagctg     1020

 

tccgccgtcc gcggtgttgt tgaaggaaaa cgggtcgtca tggttgatga ttccatcgtg     1080

 

cgcgggacga caagccgccg gatcgtcaca atgctccgag aagcgggagc gacagaggtg     1140

 

catgtaaaga tcagttcgcc tccgatcgcc catccttgct tctacggcat cgacacatca     1200

 

acccatgagg agctgatcgc ttcctcgcat tcagtggaag aaatccgcca gattatcggc     1260

 

gccgacacgc tttctttctt aagtgtagac ggattgttaa aaggagtcgg ccgaaaattt     1320

 

gaagacacca attgcggaca atgcctcgct tgttttacgg gcaaatatcc gacggaaatt     1380

 

tatcaggata cagtgcttcc tcacgtaaaa gaagcagtgc tgacaaaata a              1431

 

 

<210>  3

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cgcggggtac cgagtctcgt gctcggcaat c                                      31

 

 

<210>  4

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

atgctttgtt tattcccaag attatatgag gtcgtg                                 36

 

 

<210>  5

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

atcttgggaa taaacaaagc atgagaaggt gggaac                                 36

 

 

<210>  6

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

cgcggactag tccgataagg agcgacctga catcc                                  35

 

 

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

actgacggct cataaaggg                                                    19

 

 

<210>  8

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

ggttctacgt cacgaatgta cgtgg                                             25

 

 

<210>  9

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

cgtacattcg tgacgtagaa ccggg                                             25

 

 

<210>  10

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

aacaagcgag gcattgtcc                                                    19

 

Claims (6)

1.一种提高解淀粉芽孢杆菌生产鸟苷产量的方法，其特征在于包括如下步骤：嘌呤操纵子的启动子部分片段即purE基因前-193～-29bp片段缺失；或是将purF基因的217位氨基酸亮氨酸突变为异亮氨酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述purE基因前-193～-29bp片段缺失，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述purF基因氨基酸序列217位突变，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensXH-Δpo：PCR扩增解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株嘌呤启动子基因的DNA片段，然后通过融合PCR将purE基因前-193～-29bp片段缺失，融合PCR扩增产物连接入pKS2质粒基因，最后将重组的pKS2质粒转化入解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens XH，经过同源重组，得到解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens XH-Δpo；

所述构建解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-△po-purF-217：PCR扩增解淀粉芽孢杆菌DSM7菌株purF基因，然后通过融合PCR将purF基因217位氨基酸突变由原来的亮氨酸突变为异亮氨酸，融合PCR扩增产物连接入pKS2质粒基因，最后将重组的pKS2质粒转化入解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensXH-Δpo，经过同源重组，得到解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens XH7-△po-purF-217。

5.利用权利要求4所得解淀粉芽孢杆菌工程菌生产鸟苷的方法，其特征在于包括以下步骤：将解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens XH7-△po-purF-217在37℃的固体活化培养基中培养24～36h，得到活化的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-△po-purF-217；然后将活化的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens XH7-△po-purF-217以单菌落接入摇瓶种子培养基，37℃培养6～7h，按体积比10％的接种量接种到摇瓶发酵培养基中，37℃发酵60～72h，将发酵液加热、离心，将上清液过0.22μm的膜HPLC检测鸟苷含量。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固体活化培养基成分(重量百分比)：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母抽提物，1％葡萄糖，1.5％琼脂，余量为水；摇瓶种子培养基成分(重量百分比)：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，余量为水，pH7.2；摇瓶发酵培养基成分(重量百分比)：葡萄糖8％，硫酸镁0.6％，酵母粉0.8％，硫酸二氢钾0.15％，硫酸铵1.0％，氯化钾0.15％，味精1.6％，碳酸钙0.3％，余量为水，pH7.2。