KR101371954B1 - 신규 방법 - Google Patents

신규 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101371954B1
KR101371954B1 KR1020087019203A KR20087019203A KR101371954B1 KR 101371954 B1 KR101371954 B1 KR 101371954B1 KR 1020087019203 A KR1020087019203 A KR 1020087019203A KR 20087019203 A KR20087019203 A KR 20087019203A KR 101371954 B1 KR101371954 B1 KR 101371954B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
gene
thymidine
thf
coli
Prior art date
Application number
KR1020087019203A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080093118A (ko
Inventor
데이비드 마틴 앤더슨
앤드류 존 콜리스
린 리우
세르게이 포드코비로프
크리스토퍼 프레스톤
Original Assignee
글락소 그룹 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 글락소 그룹 리미티드 filed Critical 글락소 그룹 리미티드
Publication of KR20080093118A publication Critical patent/KR20080093118A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101371954B1 publication Critical patent/KR101371954B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C12P19/385—Pyrimidine nucleosides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

DNA 구조물 숙주 세포 조합을 비롯한 신규 유기체가 개시되어 있다. 유기체는 dUMP의 dTMP로의 전환을 위한 단일 탄소 단위의 공급을 촉진하는 효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 전사 단위 (예를 들어, 오페론)을 포함한다. 예로는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자, 예를 들어 T4 frd; 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 유전자, 예를 들어 glyA; 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제 유전자, 예를 들어 serA; 및 THF 신타제 유전자, 예를 들어 ADE3을 들 수 있다. 유기체는 상당히 감소된 수준의 우리딘으로 티미딘을 제조하는 생물학적 방법에서 사용된다.
티미딘, 우리딘, dUMP, dTMP, 전사 단위

Description

신규 방법 {NOVEL PROCESS}
본 발명은 티미딘의 생물학적 제조에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전자 변형된 생물학적 물질의 사용 방법에 관한 것이다. 유전자 변형된 생물학적 물질은 티미딘-생성 유기체, 예컨대 박테리아 또는 하나 이상의 DNA 구조물, 예를 들어 플라스미드를 포함할 수 있으며, 이는 적합한 숙주 세포와 함께 적절한 배양 배지에서 성장시 티미딘의 생물학적 생성을 야기할 것이다.
피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 티미딘은 제약 중간체로서 유용하다. 이는 지도비딘 또는 아지도티미딘이라고도 공지된 AZT의 화학적 합성에 특히 중요하다. 이는 상표가 레트로비르인 뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NRTI) 부류의 항레트로바이러스 약물이며, HIV 감염의 치료에 허가된 첫번째 약물이다.
HIV/AIDS는 통상적으로 3종 이상의 항레트로바이러스 약물의 조합에 의해 치료된다 (문헌 [De Clercq, Med. Chem. Res. 13: 439-478, 2004]). AZT는 조합 요법의 주요 성분으로서 중요하고 폭넓은 역할을 하며, 레트로비르, 지도비르, 비로-Z, 아비로-Z 및 지도-H를 비롯한 여러 상표로 판매되고 있다.
AZT는 NRTI 약물 3TC (라미부딘)과 조합되는 경우 특히 가치가 있다. 이들 두가지 약물은 상표 콤비비르 및 듀오비르로 단일 환제로 제제화되어 시판되고 있 다. AZT, 3TC 및 아바카비르의 삼중 NRTI 조합은 상표 트리지비르로 판매되고 있다. AZT와 함께 사용되는 다른 NRTI 약물로는 디다노신, 엠트리시타빈 및 잘시타빈을 들 수 있다.
AZT는 암프레나비르, 아타자나비르, 인디나비르, 리토나비르 및 사퀴나비르를 비롯한 HIV 프로테아제 억제제 약물과의 조합, 및 델라비르딘, 에파비렌즈 및 네비라핀을 비롯한 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 (NNRTI)와의 조합에 또한 유용하다.
AZT는 임신중 사용에 승인된 유일한 항-HIV 약물이다 (문헌 [Lyall, et al., HIV Med. 2: 314-334, 2001]). 1997년에 약 600,000명의 어린이가 아기 전달로 엄마에 의해 전염된 AIDS로 숨졌다. 임신의 마지막 3분기에 섭취된 AZT는 바이러스 전달의 위험을 67%만큼 감소시킬 수 있다 (문헌 [Mitchla & Sharland, Expert Opin. Pharmacother. 1: 239-248, 2000]).
발효 기술은 AZT 제조에 필요한 다량의 티미딘의 상업적 제조를 위한 화학적 합성의 매력적인 대안이다. 발효 공정은 생물학적 분자, 예컨대 항생제, 아미노산 및 비타민을 대규모로 상대적으로 저비용으로 제조하는 수단으로서 산업에 잘 확립되어 있다 (문헌 [Atkinson, & Mavituna, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd Edition, New York, Stockton Press, 1991]).
그러나, 티미딘은 통상적으로 천연에서 그의 "유리" 형태로 발견되지 않으며, 모노포스페이트 티미딜산으로서 생성되고 트리포스페이트로서 DNA에 도입된다. 생물학적 시스템은 상당량의 티미딘을 자연적으로 생성하지는 않으며, 따라서 돌연 변이체 또는 조작된 유기체가 필요하다.
제EP 0,344,937호에는 호기성 배양에서 티미딘을 생성하도록 선택된 브레비박테륨(Brevibacterium)의 균주가 개시되어 있다. 또한, 티미딘을 함유하는 다당류의 발효 제조에 있어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtlis)의 돌연변이체 균주의 용도를 교시하는 일본 특허 공보 제39-16345호를 언급할 수 있다.
그 전문이 본원에 참고로 도입되고 독자에게 구체적으로 언급된 제US 5,213,972호 (맥캔들리스(McCandliss) & 앤더슨(Anderson))에는 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 (PdN), 예컨대 티미딘 및 2'-데옥시우리딘의 제조 방법이 개시되어 있다. PdN 모노포스페이트를 PdN으로 전환시키는 PdN 포스포히드롤라제를 코딩하는 DNA 서열을 도입하여 발현하는 복제가능한 미생물이 교시되어 있다.
보다 구체적으로, 상기 맥캔들리스 & 앤더슨의 특허에는 바실러스 서브틸리스 박테리오파지 PBS1로부터의 데옥시티미딜레이트 포스포히드롤라제 (dTMPase)의 발현을 포함하는, 티미딘의 제조에 사용될 수 있는 발효 공정이 기재되어 있다. 자신의 DNA에 티미딘 대신에 PdN, 예컨대 2'-데옥시우리딘 또는 5-히드록시메틸-2'-데옥시우리딘을 도입하는 박테리오파지에 의해 발현된 상기 유형의 효소가 천연에서 발견된다.
제US 5,213,972호에 기재된 티미딘 발효에서는, 티미딘을 분해하는 효소 (티미딘 포스포릴라제 및 우리딘 포스포릴라제)가 돌연변이에 의해 제거되어, 티미딘이 축적된다. 따라서, dTMPase 효소의 사용은 티미딘 합성을 허용하는 경로를 만드는 것을 보조한다. 그러나, dTMPase 단독의 발현은 상업적으로 실용가능한 수준 의 티미딘을 제조하게 할 수 없다.
그 전문이 또한 본원에 참고로 도입되고 독자에게 또한 구체적으로 언급된 제WO 01/02580호에는 dTMPase를 발현하는 세포에 의한 티미딘의 향상된 생성을 야기하는 개선이 기재되어 있다.
그러나, 생물학적으로 생성된 티미딘의 제조에서의 문제점은 발효 공정에서의 2'-데옥시우리딘 (UdR)의 동반 생성이다. 상기 두가지 분자는 단일 메틸기에 의해 구조가 상이할 뿐 유사한 특성을 가지므로, 하류 공정 도중 분리하는 것이 어렵고 고비용이다. AZT의 합성과 같은 제약적 적용을 위해, UdR 수준이 낮은 고순도 티미딘이 필요로 될 수 있다.
발효에 의해 생물학적으로 생성된 티미딘이 현재 방법에 비해 상당히 감소된 수준의 UdR을 제공하여 상기 물질을 제거하기 위한 하류 정제의 요건이 최소화되거나 또는 제거된다면 이로울 것이다.
상당히 감소된은 UdR의 (오염) 수준이 발효된 티미딘 생성물의 25% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 보다 더 바람직하게는 5% 미만 내지 4%, 3% 및 2%, 1% 이하의 수준을 차지하는 것을 의미한다.
이상적으로, "고"수준의 티미딘이 얻어져야 한다. 티미딘의 수준은 측정값이 유도한 지 4 내지 6시간 후에 결정되는 "비(比)생산성(specific productivity)" 값으로서 제공될 수 있다. 5 mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량 초과, 보다 특히 10 mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량 초과의 수준이 바람직하며, 15 내지 20 및 25 초과의 비생산성 값이 보다 바람직하다.
이들 수준은 가장 바람직하게는 상기 기재된 UdR의 감소된 수준으로 얻어져야 하며, 따라서 상기 값은 예를 들어 5% 미만의 UdR을 함유하는 5 g/l의 TdR 역가가 얻어지도록 조합될 수 있다.
사실상, 제WO 01/02580호에 개시된 바와 같이 숙주 균주 CMG2451에서 플라스미드 pCG532를 사용하는 선행 기술 방법은 진탕 플라스크 시험에서 34.5%의 평균 UdR 함량을 제공한다. 이러한 높은 수준에서 UdR로부터 티미딘을 분리하는 하류 방법은 어렵고 고비용이다.
본 발명의 목적은 티미딘-생성 유기체를 변형시켜, 유기체가 UdR의 유의한 동반 생성 없이 티미딘을 생성하게 하는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "유기체"는 그의 염색체에서 코딩된 DNA (예를 들어, 제EP 0344937호에 개시된 바와 같음) 또는 그를 숙주로 하는 DNA (예를 들어, 제US 5,213,972호 및 제WO 01/02580호에 개시된 바와 같음)의 발현을 통해 티미딘을 생성할 수 있는 유기체를 포함한다. 상기 숙주 DNA는 예를 들어, 하나 이상의 플라스미드와 같은 하나 이상의 DNA 구조물로서 존재할 수 있다.
특히, 제WO 01/02580호에 개시된 구조물/숙주 조합에 비해 생성된 티미딘의 양의 개선을 제공하는 것이 목적이다.
구조물에 대해 만들어진 임의의 유전자 변형이 안정하여, 구조물이 숙주 세포로 도입되고 그 조합이 성장하는 경우, 숙주가 존재하는 구조물 없이 그 자체로는 증식할 수 없도록, 즉 구조물이 손실되면 유기체가 사멸하도록 하게 하는 것이 추가 목적이다.
<발명의 요약>
예상치 못하게, dUMP의 dTMP로의 전환 주변에서 일어나는, 티미딘의 생성에서 중요한 속도 제한 단계가 있다는 것이 밝혀졌으며, 이는 dUMP가 동시에 UdR의 생성을 향해 지시될 수 있도록 하게 한다. 상기 제한은 전환 반응을 촉매하는 효소 티미딜레이트 신타제의 단순한 과다발현에 의해서는 완화될 수 없다. 그러나, 출원인은 공여체 메틸기의 용이한 공급의 이용가능성을 확실하게 함으로써 오염 UdR의 수준이 유의적으로 감소되게 하면서 (약 35%로부터 5% 미만까지 및 몇몇의 경우 1% 미만) 티미딘을 제조할 수 있다고 확인하였다.
본 발명의 제1 측면에 따라, 유기체의 DNA, 또는 유기체의 성장에 필요한 몇몇 염색체외 DNA에 대한 하나 이상의 유전자 변형을 포함하고, dUMP의 dTMP로의 전환을 위한 단일 탄소 단위의 이용가능성을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형의 결과로서 UdR을 손실하고 TdR을 우선적으로 생성하는 티미딘 생합성 경로를 야기하는 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양 배지에서 성장시 티미딘을 생성할 수 있는 유기체가 제공된다.
하나 이상의 변형은 바람직하게는 dUMP의 dTMP로의 전환을 위해 티미딜레이트 신타제에 이용가능한 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 (CH2-THF)의 양을 증가시키는 변형이다. CH2-THF는 두가지 공지된 부류의 티미딜레이트 신타제 (EC 2.1.1.45 및 EC 2.1.1.148)를 위한 공통적인 일-탄소 단위 공여체이다. 이들 두가지 효소에 의해 촉매되는 반응은 도 2에서 비교된다.
대부분의 경우, 공여체 분자의 메틸렌기를 메틸기로 환원시키는데 필요한 수소 원자는 CH2-THF 자체에 의해 제공되어, dUMP의 dTMP로의 전환은 CH2-THF의 디히드로폴레이트 (DHF)로의 동시 전환을 필요로 하게 된다. 상기 형태의 효소는 EC 2.1.1.45라고 지칭되며, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)의 thyA 유전자 또는 박테리오파지 T4의 td 유전자에 의해 코딩된다.
EC 2.1.1.148이라고 지칭되고, 예를 들어 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 thyX 유전자에 의해 코딩되는 대안적 형태의 효소에서, 2개의 수소 원자가 플라빈 뉴클레오티드의 환원된 형태, 예컨대 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)에 의해 제공된다. 상기 경우에, 티미딜레이트 신타제 반응에서 CH2-THF는 테트라히드로폴레이트 (THF)로, FADH2는 FAD로 전환된다 (문헌 [Myllykallio, H. et al., Science 297: 105-107, 2002]).
CH2-THF는 통상적으로 일-탄소 단위가 THF로 전달됨으로써 재생성된다. EC 2.1.1.45 티미딜레이트 신타제를 사용하는 유기체에서는, 예를 들어 이. 콜라이 folA 유전자 또는 T4 frd 유전자에 의해 발현된 디히드로폴레이트 리덕타제 (EC 1.1.5.3)의 작용에 의한 DHF의 THF로의 전환이 제1 단계로서 존재해야 한다. EC 2.1.1.148 형태의 티미딜레이트 신타제의 경우에는 상기 단계는 필요하지 않다.
THF로부터 CH2-THF를 재생성하는 일차 대사 경로는 탄수화물 대사에서 중간체인 3-포스포글리세레이트로부터 출발하여, 아미노산 세린 및 글리신을 통한 경로 이다. 상기 세린-글리신-C1 경로는 도 3에 나타낸다. 제1 개입 단계는 예를 들어, 이. 콜라이의 serA 유전자에 의해 코딩되는 포스포글리세레이트 데히드로게나제의 작용에 의한 3-포스포히드록시피루베이트의 생성이다.
CH2-THF는 상기 경로에서 2 단계로 생성된다: 첫번째는 예를 들어, 이. 콜라이 glyA 유전자에 의해 코딩되는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제의 작용에 의한 L-세린의 글리신으로의 전환이다. 두번째는 4개 이상의 유전자의 생성물인 글리신 절단 효소 복합체에 의한 글리신의 이산화탄소 및 암모니아로의 전환이다.
많은 유기체에서, CH2-THF는 또한 도 4에 나타낸 바와 같이 탄소 원자를 제공하는 포르메이트를 사용하는 3 단계로 THF로부터 생성될 수 있다. 포르메이트는 중추 대사 중간체 피루베이트로부터 유도될 수 있다. 진핵 유기체에서, 세가지 요구되는 효소 활성은 예를 들어 효모 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 ADE3 유전자에 의해 코딩되는 단일 삼기능성 단백질에 존재할 수 있다.
CH2-THF의 이용가능성을 증진하는 티미딘-생성 유기체에서의 염색체 또는 염색체외 DNA의 유전자 변형은 상당히 감소된 수준의 UdR과 함께 양호한 수율의 티미딘의 생성을 야기한다. 상기 유형의 유전자 변형을 사용하여 UdR의 증가를 역전시킬 수 있으며, 이는 제US 5,213,972호 및 제WO 01/02580호에 교시된 바와 같은 유전자 변형을 이용하여 총 PdN 생성이 증가되는 경우, UdR 불순도의 허용되지 않는 증가없이 공정 수율을 개선하게 할 수 있다.
바람직하게는 (그러나 필수적은 아님), 유기체는 박테리아, 보다 바람직하게는 이. 콜라이이다. 그러나, 상기 확인된 선행 기술 문헌에 개시된 바와 같은 브레비박테륨 및 바실러스 종, 및 다른 티미딘-생성 유기체, 예를 들어 박테리아 코리네박테륨(Corynebacterium) 또는 효모는 기재된 발명에 따라 선택되고 변형될 수 있다. 티미딘-생성 유기체에서 CH2-THF의 이용가능성을 증가시킬 수 있는 여러 방법이 있으며, 가장 효과적인 것은 각각의 경우에 유기체의 유전자 백그라운드에 따라 달라질 것이라는 것이 이해될 것이다.
또한 유기체는 바람직하게는 티미딜레이트 신타제, 예를 들어, td 또는 thyA 유전자에 의해 코딩되는 티미딜레이트 신타제를 과다발현할 수 있는 전사 단위 (염색체 또는 염색체외일 수 있음), 및 티미딘이 dTMP로부터 생성되도록 하는 하나 이상의 유전자, 예컨대 데옥시티미딜레이트 포스포히드롤라제, 예를 들어 dTMPase 유전자에 의해 코딩되는 데옥시티미딜레이트 포스포히드롤라제를 포함할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 티미딜레이트 신타제가 DHF를 생성하는 EC 2.1.1.45 유형인 경우, 유기체는 발현 시에 DHF의 THF로의 전환을 촉진하는 유전자를 포함한다. 이는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자, 예컨대 folA 또는 frd일 수 있다. 바람직한 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자는 박테리오파지 유전자, 보다 바람직하게는 T 짝수 파지 유전자, 및 가장 바람직하게는 T4 박테리오파지 유전자 frd이다.
디히드로폴레이트 리덕타제 유전자는 유기체의 염색체 DNA에 직접 도입되거 나, 유기체에 의해 다시 숙주화될 수 있는 DNA 구조물에 혼입될 수 있다. 바람직하게는, DNA 구조물은 벡터, 예컨대 플라스미드, 바이러스, 트랜스포손 또는 미니-염색체이다.
DNA를 숙주 세포로 도입하는데 DNA 구조물을 사용하는 경우, 상기 구조물이 그의 의도된 숙주에서 안정하게 유지되도록 설계되게 하는 것이 바람직하다.
특히 바람직한 실시양태 및 가장 최선의 방식에서, 유기체는 제WO 01/02580호 개시된 pCG532로부터 유래된 플라스미드 pCG609를 보유하는, 제WO 01/02580호에 개시된 균주 CMG2451로부터 유래된 이. 콜라이 숙주 균주 CMG2576이다. 그의 조성에 대한 충분히 자세한 내용은 실시예 3 및 4에서 제공된다. 상기 조합은 플라스미드가 "비-유도" 조건하 성장 중에 숙주 균주 내에 유지되도록 이중으로 안정화되었다.
TMPase 유전자는 박테리오파지 람다 PL 프로모터와 커플링된 숙주 염색체에 삽입된다. 플라스미드는 제WO 01/02580호에 개시된 숙주 균주의 염색체로부터 재위치된, 그 자신의 프로모터의 제어하에 박테리오파지 람다 cI857 온도 민감성 레프레서를 운반한다. 플라스미드가 손실되는 경우 레프레서는 생성되지 않으며, TMPase 유전자가 발현되어, TMP는 티미딘으로 전환되고 유기체는 사멸한다.
출원인은 상기 안정화 메카니즘이, 필요한 많은 세대의 성장을 이용하는 대규모 배양에 사용하기에는 불충분하다고 결정하였는데, 이는 염색체상 위치된 TMPase 유전자의 동시 불활성화에 의해 동반되는 플라스미드 손실이 플라스미드-비 함유 유도체를 성장하도록 하기에 충분히 자주 생기는 사건이기 때문이다. 성장 및 생존에 필수적인 유전자가 염색체로부터 결실되고 플라스미드에 재위치된 경우, 제2 안정화 메카니즘이 추가되었다. CMG2576 및 pCG609 조합에서, 이 유전자는 lac 프로모터의 제어하에 플라스미드로 클로닝된 Thy A이다.
기능성 Thy A 유전자없이 세포는 TMP를 생성할 수 없으며, 따라서 DNA의 합성을 위한 TTP를 생성할 수 없어서 사멸한다. 이 메카니즘은 유전자가 용이하게 돌연변이되어 기능을 상실할 수 있기 때문에 특히 효과적이나, 완전하게 상실된 기능을 재생성하는 것은 매우 어렵다. 또한, 상실 효소의 생성물은 기능성 세포 밖으로 및 플라스미드-보유 유전자가 상실된 세포로 통과함으로써 "교차-공급"할 수 없는 인산화된 화합물이다.
본 발명의 보다 일반적인 측면을 설명하기 위해, 추가 실시예 (항상 직접적으로 비교가능하진 않음)가 상세한 설명에 기재되어 있다. 진탕 플라스크 시험 데이타는 종종 제2 플라스미드의 "시험 유전자"의 도입을 포함한다. 그러나, 이러한 다중 플라스미드 시스템은 규모 시험으로 처리되지 않았으며, 대규모 배양에 대한 그의 유전적 안정성은 결정되지 않았다.
본 발명의 제2 측면에 따라, 유기체의 DNA, 또는 유기체의 성장에 필요한 몇몇 염색체외 DNA에 대한 하나 이상의 유전자 변형을 포함하고, dUMP의 dTMP로의 전환을 위한 단일 탄소 단위의 이용가능성을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형의 결과로서 UdR을 손실하고 TdR을 우선적으로 생성하는 티미딘 생합성 경로를 야기하는 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 유기체를 배양 배지에 서 성장시키는 것을 포함하는 티미딘의 제조 방법이 제공된다.
바람직하게는, UdR 함량은 티미딘 함량의 5% 미만이다.
바람직하게는, 비생산성에 의한 티미딘 함량은 5 mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량 초과, 보다 바람직하게는 7.5 초과 내지 2.5 차이의 10 내지 25 mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량 및 그 이상이다.
본 발명의 제3 측면에 따라, 본 발명의 유기체를 위한 성장 및 티미딘 생성을 지지할 수 있는 배양 배지가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따라, 본 발명의 방법에 따라 생성된 티미딘으로부터 제조된 지도비딘이 제공된다.
<본 발명의 바람직한 실시양태>
제1 및 바람직한 실시양태에서, 유전자는 염색체외 DNA로서 가장 바람직하게는 플라스미드의 형태로 유기체에 간접적으로 도입된다 (염색체로 직접 도입되기 보다는). 바람직한 유전자는 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP)를 티미딘 모노포스페이트 (dTMP)로 전환시키는 티미딜레이트 신타제 효소 (예를 들어, EC 2.1.1.45, EC 2.1.1.148)에게, 대부분의 dUMP가 (2'-데옥시우리딘 (UdR)로 전환되는 것과는 대조적으로) dTMP로 메틸화되게 하는 메틸기의 용이한 공급이 제공되도록 할 수 있는 효소를 발현하는 유전자이다.
상기 바람직한 실시양태에서, 바람직한 티미딜레이트 신타제 효소는 EC 2.1.1.45 유형의 효소이며, 바람직한 유전자는 디히드로폴레이트 (DHF)의 테트라히드로폴레이트 (THF)로의 전환을 보조하는 유전자이다. 적합한 유전자는 디히드로 폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자이다. 이는 야생형 또는 탈조절된 박테리아 유전자 또는 박테리오파지 유전자일 수 있다. 특히 바람직한 유전자, 및 본 발명을 예시하는데 사용되는 유전자는 박테리오파지 T4의 frd 유전자 (T4frd)이다.
대안적 실시양태에서, 유전자 변형은 THF의 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 (CH2-THF)로의 전환을 보조하도록 제조된다. 이들 유전자 변형 모두는 dUMP가 UdR에 우선하여 dTMP로 전환하도록 강제하는 공통 목적을 갖는다.
바람직한 변형 또는 이들의 조합에 대한 대안으로서 작용하는 것으로 나타난 유전자 변형은 하기를 포함한다:
● THF의 CH2-THF로의 전환을 직접 수행하는 효소에 대한 변형의 제조. 이러한 변형 중 하나는 L-세린을 글리신으로 전환시키는 동시에 THF의 CH2-THF로의 전환을 촉매하는 효소 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 발현하는 유전자, 예를 들어 이. 콜라이의 glyA를 도입하는 것이다. 또한, 이러한 변형은 THF의 CH2-THF로의 전환을 촉매하는 동시에 글리신의 이산화탄소 및 암모니아로의 전환을 촉매하는 글리신 절단 효소 복합체의 하나 이상의 성분을 발현하는 유전자 또는 유전자들, 예를 들어 이. 콜라이의 gcvT, gcvH, gcvP 및 lpd 유전자의 도입을 포함할 것이다.
● 필요한 일-탄소 단위를 제공하는 포르메이트를 사용하여 THF의 CH2-THF로의 전환을 직접 수행하는 유전자 변형의 제조. 이러한 변형 중 하나는 효소 활성 포르밀-THF 신타제, 메테닐-THF 시클로히드롤라제 및 CH3-THF 데히드로게나제를 발 현하는 유전자 또는 유전자들을 도입하는 것이다. 한 예는 이들 활성 모두를 갖는 삼기능성 단백질을 코딩하는 효모 ADE3 유전자일 것이다. 추가의 예는 단지 포르밀-THF 신타제를 코딩하는 유전자를 이. 콜라이에 도입하는 것이며, 상기 전환에 필요한 다른 효소는 이미 존재한다.
● THF의 CH2-THF로의 전환을 수행하는 반응을 위한 기질의 이용가능성을 증가시키는 유전자 변형의 제조. 이러한 경우 중 하나는 탄수화물로부터 L-세린으로의 경로 중 제1 단계를 촉매하는 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제를 발현하는 이. 콜라이 serA와 같은 유전자의 도입을 통한 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제에 대한 기질로서 L-세린의 이용가능성의 증진이다. 추가의 예로는 3-포스포-D-글리세레이트로부터 L-세린의 생성과 관련된 후기 효소를 발현하는 유전자, 예컨대 이. 콜라이의 serC 및 serB의 도입, 또는 효모 ADE3 유전자에 의해 코딩되는 효소 복합체에 대한 포르메이트의 이용가능성을 증가시키는 임의의 유전자 변형이 포함될 것이다.
본 발명의 각 측면은 제US 5,213,972호 및 제WO 01/02580호 둘 모두의 교시내용보다 상당히 진보된 것이며, 개선된 DNA 구조물, 및 티미딘의 상업적 제조에 사용하기 위한 상기 구조물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또한, 이들은 다른 티미딘-생성 유기체의 변형에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 기재로부터 명확하게 될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 것이며 예시만을 위한 것 이라는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 취지 및 범위 내의 여러 변형 및 변화가 당업자에게 명확하게 될 것이다.
본 발명의 구조물은 염색체일 수 있거나, 또는 보다 바람직하게는 염색체외, 예를 들어 벡터 상에 위치될 수 있다.
본 발명의 벡터로는 플라스미드, 바이러스 (파지 포함), 트랜스포손, 및 미니-염색체, 바람직하게는 플라스미드를 들 수 있다.
벡터는 당업자에게 공지된 임의의 편리한 방법, 예를 들어 P1 형질도입, 전기천공 또는 형질전환에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
본 발명에 유용한 적합한 숙주 세포로는 진핵생물 (예를 들어, 진균) 및 원핵생물 (예를 들어, 박테리아)을 들 수 있다. 원핵생물로는 이. 콜라이, 살모넬라(Salomonella), 슈도모나스(Pseudomonas), 브레비박테륨, 바실러스, 균주 및 그의 돌연변이체를 들 수 있다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 예컨대 람다 PL, 오퍼레이터, 액티베이터, 레프레서, 예컨대 람다 레프레서, 특히 온도 민감성 변이체, 및/또는 인핸서), 적절한 종결 서열, 개시 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 벡터는 선별가능한 마커를 추가로 포함할 수 있다. 대안으로, 조절 요소 (특히, 람다 레프레서)는 숙주 세포 염색체 상에 위치될 수 있다.
본 발명에 따라 변형된 숙주 세포는 티미딘의 상업적 제조에 특히 유용하다. 본 발명의 특히 이로운 사용에서, 본 발명에 따라 (특히, 제US 5,213,972호 또는 제WO 01/02580호의 교시내용과 함께) 변형된 플라스미드를 포함하는 (보유하거나 또는 혼입하는) 이. 콜라이 숙주 세포는 티미딘의 상업적 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 변형된 숙주 세포는 예를 들어 PBS1로부터 유래된 dTMPase, 및 제US 5,213,972호에 교시된 돌연변이, 예를 들어 deoA, tdk-1 및 udp-1을, 제WO 01/02580호에 교시된 구조물, 예를 들어 T4 nrdCAB, T4 td, dcd 및 udk에 대한 추가의 개선과 함께 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 발효 방법은 제WO 01/02580호에 교시된 바와 같이 사용되며, 이는 적합한 용기에 함유된 배양 배지에 세포를 침지하는 것을 포함한다. 적절한 조건하에 배양한 후, 생성된 티미딘은 수거되고 정제되며 (풍부화), 필요하다면 표준 프로토콜에 따라 제약 등급으로 정제된다. 그 후, 정제된 티미딘은 AZT와 같은 의약, 예를 들어 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 도면과 관련하여 오직 예만에 의해 예시된다:
도 1은 티미딘 생합성 경로를 예시하고;
도 2는 티미딜레이트 신타제 반응 (dUMP의 dTMP로의 전환)을 예시하고;
도 3은 L-세린 및 글리신으로부터의 CH2-THF의 재생성을 예시하고;
도 4는 포르메이트로부터의 CH2-THF의 재생성을 예시하고;
도 5는 CH2-THF의 재생성을 개선시키는 접근법을 요약하고;
도 6은 플라스미드 pCG532에 대한 지도를 예시하고 (선행 기술 교시);
도 7은 플라스미드 pCG609에 대한 지도를 예시하고;
도 8은 플라스미드 pCG376에 대한 지도를 예시하고;
도 9는 많은 숙주/플라스미드에서의 티미딘 제조를 비교한다.
도 1은 예로서 TMPase 유전자가 첨가된 이. 콜라이 K12를 사용하는, 티미딘 생합성 경로 및 관련된 유전학의 복잡성을 예시한다. 도표의 오른쪽 아래에서 티미딘은 TdR이고, 2'-데옥시우리딘은 UdR이다. UdR은 단일 메틸기가 없다는 점에서 화학적으로 TdR과 상이하다. 상기 화합물 간의 구조적 유사성으로 인해 정제가 어렵고 비용이 고가이다. 본 발명은 UdR의 생성을 손실하고 TdR의 우선적 형성에 영향을 주는 유전자 변형의 제조에 관한 것이다.
출원인은 예를 들어 티미딜레이트 신타제 유전자 (예를 들어, td, thyA 또는 thyX)로부터의 티미딜레이트 신타제의 발현에 의해 촉매되는, dUMP의 dTMP로의 방법 단계에, 예를 들어 CH2-THF로서 일-탄소 단위의 증가된 공급이 제공되도록 함으로써 UdR에 비해 TdR의 수준이 효과적으로 제어될 수 있다는 것을 확인하였다.
이는 주로 dUMP의 dTMP로의 전환에 의해 생성되는 고갈된 일-탄소 공여체 분자가 CH2-THF로서 그의 활성 상태로 빠르게 재순환되게 함으로써 성취된다. 도 2는 티미딜레이트 신타제에 대한 두가지 대안적 메카니즘을 나타내며, 각각은 상이한 고갈된 일-탄소 공여체를 생성한다. 티미딜레이트 신타제가 예를 들어 thyA 또는 td 유전자에 의해 코딩되는 유형 EC 2.1.1.45인 경우, 고갈된 공여체는 DHF이다. 효소가 예를 들어 thyX 유전자에 의해 코딩되는 EC 2.1.1.148 유형인 경우, 고갈된 공여체는 THF이다.
CH2-THF의 직접적 전구체가 THF이기 때문에, EC 2.1.1.45 티미딜레이트 신타제를 사용하는 유기체, 예를 들어 이. 콜라이에서, 제1 단계가 DHF의 THF로의 전환이어야 한다는 것은 명백할 것이다. 상기 전환을 촉매하는 효소를 코딩하는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자를 이러한 유기체에 도입함으로써, 출원인은 실시예 6에 예시된 바와 같이 오염 UdR의 수준을 상당히 감소시키고, 추가로 티미딘 생산성을 증가시킬 수 있었다.
상기 접근법은 제US 5,213,972호 및/또는 제WO 01/02580호에 의해 교시된 원리에 따라 티미딘 발효 공정 수율이 추가로 개선되도록 한다. 총 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드를 증가시키는 예전 유전자 변형이 주로 UdR의 증가된 수준을 가져오는 경우, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자를 도입함으로써 상기 추가 생성물은 실시예 7에 의해 예시되는 바와 같이 TdR로 지시될 수 있다.
실시예 8에서, 상기 접근법은 추가 변형과 조합되어, 디히드로폴레이트 리덕타제를 운반하는 플라스미드 구조물 및 TdR 제조에 필요한 다른 클로닝된 유전자가 그의 적절한 이. 콜라이 숙주 균주에서 안정하게 유지되도록 하였다. 이는 제WO 01/02580호에 의해 교시된 선행 기술 방법보다 개선된 현재 최상의 방식을 나타내나, 결코 본 발명으로부터 예상될 수 있는 한계에 도달하는 것은 아니다.
디히드로폴레이트 리덕타제 유전자의 도입을 통한 DHF의 THF로의 전환의 증가가 티미딘-생성 유기체에서 CH2-THF의 재생성의 원하는 증가를 제공하도록 이루어질 수 있는 유전자 변형임은 도 2로부터 명백할 것이다. 그러나, 상기 접근법은 유형 EC 2.1.1.148 티미딜레이트 신타제를 함유하는 유기체에는 적용될 수 없다. CH2-THF의 재생성에서 제한 단계인 DHF의 THF로의 전환이 없거나, 또는 더이상 없는 경우와 같이 이러한 경우에도, UdR의 낮은 수준과 함께 TdR 제조의 원하는 성과를 성취하는데 적용될 수 있는 여러 대안적 또는 추가 유전자 변형이 있다.
이러한 대안적 변형은 THF를 CH2-THF로 생물학적으로 전환시키는 경로, 예를 들어 도 3에 나타낸 바와 같이 L-세린 및 글리신을 통한 경로, 또는 도 4에 나타낸 바와 같이 포르메이트를 통한 경로를 고려함으로써 명백하게 될 것이다. 각종 가능한 해결책은 도 5에 요약되어 있다. 일반적으로, 적합한 변형은 CH2-THF의 합성의 전체 속도를 증가시키거나, THF를 CH2-THF로 전환시키는 일-탄소 단위의 공급 속도를 개선시킬 것이다.
출원인은 이들 접근법의 많은 예를 시험하였다. 실시예 9에서는, L-세린의 글리신으로의 전환을 통해 THF를 CH2-THF로 전환시킬 수 있는 효소가 과다발현된다. 실시예 10에서, 다른 효소는 도 3에 나타낸 세린/글리신 경로로의 대사물질의 흐름을 증가시킴으로써 THF의 CH2-THF로의 전환을 위한 일-탄소 단위의 공급을 개선시킬 목적으로 과다발현된다. 실시예 11 및 12는 일-탄소 공여체로서 포르메이트를 사용하는 THF의 CH2-THF로의 전환을 위한 비-천연 경로를 이. 콜라이에 도입하는 상이한 방법을 사용한다.
각각의 경우, i) UdR 수준의 적은 감소, ii) UdR의 상대적 증가가 없는 TdR의 소량 증가, 또는 iii) 둘 모두의 조합이 있다. 실시예 6, 7 및 8에 나타낸 디히드로폴레이트 리덕타제 첨가의 효과와 비교시, 개선은 상대적으로 적으나, 각각은 대안적 또는 추가로 개선된 티미딘-생성 유기체에서 보다 중요할 수 있으므로, 본 발명의 유효한 실시예라는 것이 이해될 것이다.
실시예 1 (비교)
선행 기술 구조물/균주
본 발명의 이점은 비교로서 제WO 01/02580호에 개시된 선행 기술 구조물/균주를 사용하여 나타낼 것이다. 도 6은 구조물 pCG532를 예시하고, 표 1은 이. 콜라이 숙주 균주 CMG2451의 유전자형을 제공한다. 그러나, 티미딜레이트 신타제 유전자 (td, 플라스미드 상) 및 TMPase (염색체로 통합됨)의 존재가 그의 바람직한 실시양태에 중요하지만, 본원에 개시된 모든 유전자가 본 발명의 필수적 부분을 형성하는 것은 아니라는 것이 이해될 것이다.
선행 기술 숙주 균주 CMG2451의 유전자형
균주 유전자형
CMG2451 hsdR-2 supE thi deoA-75 tdk-1 (λ cI857 ΔBAM ΔH1)
nic bio Δ(chlD-pgl) nadA-50::Tn10 udp-1
chr::Tn5::dTMPase AZTR FUdRR
실시예 2
티미딘 생성에 대한 진탕-플라스크 시험
실시예 1에 언급된 구조물 및 균주를 하기 방법에 따라 배양 배지 (표 2)에서 성장시켰다. 데이타는 TdR 생성의 속도 및 UdR 불순도의 상대적 양 (TdR의 백분율로서 나타냄) 모두에 대해 비교 목적으로 얻었다.
모든 실험은 시험된 균주 당 7 내지 12개의 플라스크로 250 mL 용량의 진탕 플라스크에서 수행하였다. LB 배지에서 성장된 신선한 시드 배양물을 사용하여, 플라스크 당 배지 20 mL를 약 2.5% 부피로 접종하였다. 배양물을 31℃에서 OD 600 nm = 5까지 성장시켰다. 그 후, 플라스크를 다른 진탕기로 이동시킴으로써 온도를 35.7℃로부터 36.8℃로 이동시켰다. 온도 유도 후 4 내지 6시간에 분석을 위해 샘플을 취하였다.
풍부화된 진탕 플라스크 배지 제제화
성분 양 g/L
이염기 인산칼륨
일염기 인산칼륨
황산마그네슘 칠수화물
황산암모늄
시트르산삼나트륨 이수화물
암베렉스(Amberex) 695, 센시엔트(sensient) 또는 Hy-Yest 412, 퀘스트(Quest)
암버펌(Amberferm) 4015 AG, 센시엔트
소르비톨
탄산칼슘
미량 원소 1000X 용액
페놀 레드		 8.0
8.0
0.4
2.0
0.5
10

5-10
20
10
1 mL
0.024
배지를 NaOH에 의해 pH 7.0로 조절한 후, 121℃에서 25분 동안 오토클레이브하였다. 냉각한 후, 비오틴 (1 mg/L 최종 농도), 티아민 (10 mg/L) 및 니코틴산 (10 mg/L)을 필요하다면 임의의 항생제, 암피실린 (100 mg/L), 클로람페니콜 (30 mg/L), 카나마이신 (15 mg/L) 및 테트라사이클린 (25 mg/L)와 함께 첨가하였다. 결과는 하기 표 3에 예시한다.
풍부화된 배지에서의 균주에 대한 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 UdR % 코멘트
CMG2451 pCG532 8.92 34.5 23개의 실험의 평균
실시예 3
CMG2451로부터의 개선된 숙주 이. 콜라이 균주 CMG2576의 발생
하기 표 4에 나열된 바와 같은 일련의 단계를 통해 숙주 균주를 변형시켰다. 전체적으로 세가지 유의한 변화가 있었으나, 이들 중 어떠한 것도 본 발명의 필수적 부분을 형성하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 하기 실시예에서, 최종 균주 CMG2576 뿐만 아니라 중간체 균주 CMG2549 및 CMG2560을 본 발명의 측면을 나타나는데 사용하였다.
균주 CMG2549는 염색체 ndk 유전자가 삽입적으로 불활성화된 ndk::kan으로의 대체에 의해 녹아웃되었다는 점에서 CMG2451과 상이하였다. 이러한 변화는 제US 5,213,972호에 의해 교시된 원리에 따라 피리미딘 뉴클레오시드의 전체 생성을 개선시키도록 제조되었으며, 실시예 7에 상세하게 기재되어 있는 본 발명의 유용성의 표시에 중요하다.
CMG2560은 비오틴 및 니코틴산에 대한 요건을 야기하는 돌연변이를 복구함과 동시에 염색체로부터 람다 프로파지를 제거함으로써 제작되었다. 이러한 변화는 람다 cI857 온도 민감성 레프레서를 운반하는 플라스미드의 존재하에 일으켰고, 상기 플라스미드가 없으면, 염색체에 삽입되어 람다 PL 프로모터로부터 발현되는 dTMPase 유전자가 활성되어, 유기체가 dTMP를 분해하고 DNA를 생성할 수 없어서 사멸하게 된다.
최종적으로, CMG2576은 염색체 thyA 유전자가 삽입적으로 불활성화된 thyA748::TnlO으로 대체되었다는 점에서 CMG2560과 상이하다. 이러한 변화는 람다 cI857 레프레서 및 클로닝된 thyA 둘 모두를 운반하는 플라스미드의 존재하에 제조하였다. 플라스미드-보유 thyA 유전자가 없다면 유기체는 dTMP를 합성할 수 없고, 따라서 DNA를 생성할 수 없어서 사멸한다.
염색체상 위치된 람다 레프레서를 제거하고 숙주 thyA 유전자를 불활성화하도록 만들어진 변화에 대한 이유는 실시예 8에 제공된다.
CMG2451로부터의 개선된 숙주 이. 콜라이 균주 CMG2576의 유도
균주 유전자형 유도a
CMG2451 표 1 참조 제WO 01/02580호에 상세히 개시됨
CMG2532 NA7623 zff-208::Tn10 CAG18481b로부터의 zff-208::Tn10
CMG2533 CMG2451 ndk::kan zff-208::Tn10 CMG2532로부터의 ndk::kan zff-208::Tn10
CMG2549 CMG2533 λTn10tets CMG2533 및 tetSc의 Tn10 결실
CMG2560 CMG2549/pCG195 λ-nic+bio+ nic+ & bio+로의 P1 형질도입 CMG2549/pCG195
CMG2576 CMG2560/pCG596 thyA748::Tn10 KL742로부터의 thyA748::Tn10 (CGSC6212d)
a 돌연변이는 파지 P1 형질도입에 의해 이. 콜라이 균주로 도입되었다. 돌연변이가 선별적인 마커를 갖는다면, 직접적 P1 형질도입을 사용하였다. 돌연변이가 선별적인 마커를 갖지 않는다면, 근접 Tn10 삽입에 의한 P1 동반-형질도입을 사용하였다.
b 문헌 [Singer et al. Microbiol. Rev. 53: 1-24, 1989]
c 이. 콜라이 균주를 클로르테트라사이클린 배지 상에서 성장시킴으로써 Tn10 결실을 제조하였다 (문헌 [Maloy & Nunn J Bacteriol. 145: 1110-1112, 1981]).
d 모든 CGSC 균주는 미국 코네티컷주 06520-8104 뉴 헤이븐 피오. 박스 208104 소재의 예일 대학교의 이. 콜라이 유전자 스톡 센터로부터 수득할 수 있다.
실시예 4
pCG532로부터의 개선된 구조물 pCG609의 발생
하기 요약된 바와 같이 일련의 단계를 통해 구조물을 변형하였다.
Figure 112008056235452-pct00001
보다 구체적으로, 유전자를 하기 표 5에 예시된 바와 같이 유도하였다. 플라스미드 pCG532 및 pCG609는 각각 도 6 및 7에 의해 예시되고, 여기서 주요 특징이 비교될 수 있다.
구조물에 제조된 세가지 변화 중 T4 frd 유전자만이 본 발명의 한 실시양태의 필수적 부분을 형성한다. 상기 변형의 효과는 하기 실시예 6 및 7에 의해 예시된다. 나머지 변화는 하기 실시예 8에 상세히 기재된 바와 같이 숙주 균주로부터의 플라스미드의 손실을 방지하도록 제조하였다.
선행 기술 구조물 pCG532로부터의 pCG609의 발생
플라스미드 첨가된 유전자 유도
pCG532 선행 기술 구조물은 T4 nrdCAB, td, (λPL 프로모터) 이. 콜라이 udk, dcd를 포함한다. 제WO 01/02580호에 상세히 개시됨
pCG590 pCG532로 클로닝된 T4 frd pCG581로부터 서브클로닝된 T4 frd (실시예 5 참조)
pCG596 pCG590으로 클로닝된 λ cI857 숙주 균주 염색체로부터 이동됨
pCG609 pCG596으로 클로닝된 thyA PCR에 의해 클로닝된 이. 콜라이의 천연 thyA
실시예 5
pCG376으로부터의 시험 구조물의 발생
확립된 숙주 균주/플라스미드 조합체에 추가 유전자를 첨가하는 것의 효과를, 이들을 제2 플라스미드에 도입함으로써 시험하였다. 제2 플라스미드는 pCG532 및 그의 유도체와 상용성이 있도록 설계하였으며, 이에 따라 둘 모두는 단일 이. 콜라이 숙주 내에 안정하게 유지될 수 있었다. pCG532는 궁극적으로 천연 플라스미드 ColE1로부터 유래하였다: 그의 상세한 이력은 제WO 01/02580호에 개시되어 있다. 제2 플라스미드는 천연 플라스미드 p15A로부터 유래되고 ColE1과 상용성이 있는 클로닝 벡터 pACYC177 (문헌 [Chang & Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141-1156, 1978])에 기초한다.
상기 시스템은 상기 실시예 4에 기재된 복합체 구조물을 추가로 변형시킬 필요 없이 유전자 첨가를 시험할 수 있다는 이점을 갖는다. 그러나, 상기 시스템이 선택적인 항생제 없이는 불안정할 수 있으며, 따라서 공업적 발효 공정에서 대규모 사용에 적합하지 않다는 것이 인식된다.
제2 플라스미드를 사용하여 시험된 유전자는 그의 전체 뉴클레오티드 서열을 보고하는 참조문헌과 함께 표 6에 나열되어 있다. 모두는 표준 프로토콜에 따라 PCR에 의해 클로닝된 잘 특징화된 유전자이었다. 각각을 박테리오파지 람다 PL 프로모터로부터 발현하였으며, 이에 따라 제1 플라스미드 상의 클로닝된 유전자 및 숙주 이. 콜라이 염색체로 통합된 dTMPase와 함께 cI857 온도 민감성 레프레서에 의해 제어할 수 있었다.
pCG376으로부터의 시험 구조물의 발생
플라스미드 첨가된 유전자 유도/참조문헌
pCG376 제WO 01/02580호에 개시됨
pCG601 이. 콜라이 K12로부터의 glyA 문헌 [Plamann et al., Nucleic Acids Res. 11: 2065-2075, 1983]
pCG844 이. 콜라이 K12로부터의 serA 문헌 [Tobey & Grant, J. Biol. Chem. 261:12179-12183, 1986]
pCG870 사카로미세스 세레비시아에로부터의 ADE3 문헌 [Staben & Rabinowitz, J. Biol. Chem. 261:4629-4637, 1986]
pCG881 클로스트리디움 아시디-우리시(C. acidi-urici)로부터의 fhs 문헌 [Whitehead & Rabinowitz, J. Bacteriol. 170: 3255-3261, 1988]
실시예 6
클로닝된 T4 frd 유전자를 선행 기술 숙주 균주/구조물에 첨가하는 것의 효과
실시예 4에 기재된 pCG590은, T4 디히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 박테리오파지 T4로부터의 frd 유전자를 첨가한 것만이 선행 기술 구조물 pCG532와 상이하였다. T4 효소는 잘 특징화되고 이. 콜라이에서 용이하게 발현하였다 (문헌 [Purohit et al. J. Biol. Chem. 256: 9121-9125, 1981]).
상기 유전자를 람다 PL 프로모터로부터 발현된 "오페론"에 첨가하였고, 따라서 온도가 증가되어 람다 cI857 레프레서가 불활성화될 때 dTMPase (염색체에서) 및 T4 유전자 nrdC, nrdA, nrdB 및 td (플라스미드 상)와 함께 유도된다.
실시예 2에 기재된 방법을 이용하여, 플라스미드 pCG590를 보유하는 선행 기술 숙주 균주 CMG2451에 대해 진탕 플라스크 데이타를 얻고, 동일한 숙주 및 선행 기술 플라스미드 pCG532로 실시예 2에서 얻어진 것과 비교된 결과를 얻었다. 결과는 하기 표 7에 제공된다.
발현된 T4 frd 유전자의 존재 및 비존재의 풍부화된 배지에서의 균주에 대한 진탕 플라스크 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 UdR % 코멘트
CMG2451 pCG532 8.92 34.5 실시예 1로부터의 데이타
23개의 실험의 평균
pCG590 9.43 7.02 590 = 532 + T4 frd 유전자
4개의 실험의 평균
명백한 것은 T4 frd 유전자의 첨가가 생성된 UdR의 수준을 크게 감소시키고, 이에 의해 실질적으로 순수한 TdR의 발효에 의한 생성을 간편화시킨다는 것이다. dUMP의 UdR로의 전환보다는 dUMP의 dTMP로의 개선된 전환이 또한 감소된 UdR 뿐만 아니라 추가의 티미딘을 야기한다는 것이 예상되며, 이 경우 진실인 것으로 보인다.
실시예 7
클로닝된 T4 frd 유전자를 ndk 돌연변이체 숙주 균주에 첨가하는 것의 효과
실시예 3에 기재된 숙주 균주 CMG2549는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제를 코딩하는 ndk 유전자에서 돌연변이시킨 것이 선행 기술 숙주 균주 CMG2451과 상이하였다. 상기 유전자의 돌연변이는 이. 콜라이에서 dCTP 및 dTTP의 세포내 풀을 증가시키는 것으로 보고되었다 (문헌 [Lu et al. J. Mol. Biol., 254: 337-341, 1995]). 제US 5,213,972호에 교시된 원리에 따라, 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생합성 경로에서의 이러한 돌연변이의 도입은 적절하게 조작된 유기체에서 TdR 및 UdR의 전체 합성을 증가시키는데 사용될 수 있다.
실시예 2의 방법을 이용하여, 각각 pCG532 또는 pCG590와 조합된 두가지 숙주 균주 CMG2451 및 CMG2549에 대한 진탕 플라스크 데이타를 얻었다. 상기 방법에서, ndk 돌연변이의 효과 및 T4 frd의 첨가는 독립적으로 및 조합으로 비교하였다. 결과는 하기 표 8에 나타낸다.
ndk 돌연변이의 존재 또는 비존재 및 클로닝된 T4frd의 존재 또는 비존재의 풍부화된 배지에서의 균주에 대한 진탕 플라스크 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 UdR % 코멘트
CMG2451
(ndk+)		 pCG532 6.01 38.1 각 결과는 9개의 복제 진탕-플라스크의 평균이다.
12시간 결과는 6시간에서 pCG590 구조물에 대해 검출가능한 UdR을 측정할 수 없었기 때문에 나타낸다 (비생산성은 6시간보다 12시간에서 더 낮음).
pCG590
(T4frd)		 6.67 10.2
CMG2549
(ndk-)		 pCG532 11.44 36.7
pCG590
(T4frd)		 19.64 1.48
놀랍게도, T4 frd의 첨가는 ndk 돌연변이를 운반하는 이. 콜라이 숙주로 도입되는 경우 UdR 수준을 감소시키는데 보다 효과적이었다. ndk 돌연변이는 선행 기술에 따라 이. 콜라이 균주의 데옥시리보뉴클레오시드 합성 능력을 명백히 증가시키지만, 이러한 개선이 순수한 티미딘의 비용-효과적인 제조에서 활용되기에는 UdR 함량이 너무 높았다. 본 발명에 따라 CH2-THF의 적절한 공급을 제공함으로써, ndk 돌연변이체에 의해 생성된 추가 dUMP는 dTMP를 향해 지시될 수 있으며, 이에 의해 UdR로 전환되기 보다는 티미딘으로 전환된다. 결과는 티미딘 생산성 및 낮은 UdR 함량의 측면에서 선행 기술보다 매우 실질적인 개선이었다.
실시예 8
티미딘 제조에 대한 플라스미드 안정화의 효과
pCG590를 숙주 균주 CMG2451 또는 그의 ndk 돌연변이체 유도체 CMG2549에서 시험하는 경우, 출원인은 얻어진 이. 콜라이 균주를 배양할 때 플라스미드 손실을 관찰하였다. 이러한 명백한 불안정성은 먼저 파지 람다 cI857 온도 민감성 레프레서를 염색체 (숙주 균주 CMG2451 및 그의 전구체에서)로부터 플라스미드 (구조물 pCG596 및 그의 유도체에서)로 재위치시킴으로써 처리되었다.
31℃ 이하의 온도에서, cI857 레프레서는 염색체로 통합된 dTMPase 유전자의 발현을 방지하는 작용을 하며, 이는 람다 PL 프로모터로 클로닝하였다. 레프레서가 플라스미드 상에 위치하는 경우, 상기 플라스미드의 손실은 dTMPase의 발현을 야기하고, dTMP의 후속적 분해는 플라스미드-비함유 세포에 대한 생존율의 감소를 가져왔다. 이 원리를 이용하여, pCG596은 실시예 4에 기재된 바와 같이 제작하고, 그의 숙주 균주 CMG2560은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제작하였다. 얻어진 균주 CMG2560/pCG596을 실시예 2의 진탕-플라스크 프로토콜에 따라 시험하는 경우, 표 9에 나타낸 바와 같이, 균주 CMG2451/pCG590에 대한 티미딘의 합성 속도의 소량 증가가 관찰되었다.
그러나, 출원인은 이 메카니즘이 플라스미드의 손실을 방지하는데 완전히 효과적인 것은 아니라고 결정하였다. dTMPase 유전자를 불활성화시키는 돌연변이와 동시에 플라스미드 손실은 생존가능한 플라스미드-비함유 세포의 선택을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 플라스미드의 안정한 유전을 확실하게 하는 추가 또는 대안적 메카니즘이 필요하였다.
lac 프로모터로부터 발현된 이. 콜라이의 thyA 유전자를 pCG596에 첨가하여, pCG609를 형성하였다. 그 후, 염색체 thyA 유전자는 상기 플라스미드를 보유하는 숙주 균주에서 결실할 수 있었다. thyA로부터의 티미딜레이트 신타제의 발현은 성장 및 생존에 필수적인데, 이는 세포가 dTMP를 합성할 수 있는 다른 방법이 없기 때문이다. dTMP 그 자체는 세포벽을 통과할 수 없으며, 플라스미드를 갖는 thyA+ 세포로부터 플라스미드가 손실된 thyA 세포로 "교차-공급"을 할 수 없다. 유전자가 쉽게 돌연변이 되어 효소 활성을 불활성화시킬 수 있으나, 손실된 활성을 재생성시키는 것은 어렵기 때문에, 필수적 유전자 및 교차 공급되지 않는 대사물질을 사용하는 이러한 메카니즘이 특히 효과적이다.
pCG609의 구조물은 실시예 4에 기재되어 있으며, thyA- 숙주 균주 CMG2576의 구조물은 실시예 3에 기재되어 있다. 얻어진 조합인 균주 CMG2576/pCG609를 실시예 2의 진탕-플라스크 발효 프로토콜에 따라 시험하였으며, 표 9에 나타낸 바와 같이 CMG2560/pCG596과 비교하여 티미딘 생성 속도의 추가의 소량 증가가 관찰되었다.
플라스미드의 유전자 안정화의 존재 및 비존재의 풍부화된 배지에서의 균주에 대한 진탕 플라스크 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 코멘트
CMG2549 pCG590 25.8 결과 각각은 6 내지 8개의 플라스크 각각의 다중 복제 진탕-플라스크 시험의 평균이다.
4-6 시간의 결과를 나타낸다.
CMG2560
(λ-)		 pCG596
(λ cI857)		 29.7
CMG2576
(λ-, thyA)		 pCG609
(λ cI857, thyA)		 31.8
이들 결과는 도 9에서 선행 기술 균주 CMG2451/pCG532 및 그의 ndk 돌연변이체 유도체와 비교하였다. UdR의 낮은 수준으로 티미딘을 제공하는 본 발명의 이점은 추가의 유전자 물질이 유기체가 배양시 안정하게 유지될 형태로 제공되는 경우 티미딘의 개선된 수율에 의해 향상되는 것을 알 수 있다.
실시예 9
클로닝된 glyA 유전자를 첨가하는 것의 효과
본 실시예는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 클로닝된 이. 콜라이 glyA 유전자를 선행 기술 구조물 및 숙주 균주에 첨가하는 것의 효과를 예시한다. 상기 효소는 THF로부터의 CH2-THF의 재생성에 연관된 세린의 글리신으로의 전환을 촉매한다 (도 3 참조). 숙주 균주가 glyA 유전자를 이미 운반하고 발현시키고, 플라스미드-보유 유전자가 온도 유도 중에 발현되는 경우 상기 유전자 변형의 효과가 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제의 수준을 간단히 증강하는 것임이 인식될 것이다.
상기 실시예 5에 논의된 바와 같이 pCG532와 상용성이 있는 플라스미드 벡터 pCG376으로 glyA 유전자를 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드 pCG601은 람다 PL 프로모터를 갖는 glyA 유전자를 운반하였다. 실시예 2에 기재된 진탕-플라스크 시험을 이용하여, pCG532 및 pCG601 둘 모두를 보유하는 CMG2451을 pCG532만을 보유하는 선행 기술 CMG2451과 비교하였다.
결과는 표 10에 제공하였으며, 선행 기술 숙주 균주 및 구조물에 T4 frd를 첨가하는 것의 효과를 나타내는 실시예 6에 제공된 결과와 비교할 수 있었다. UdR이 과다발현된 glyA 유전자의 첨가에 의해 상당히 감소되었다는 것이 명백하였다. 그러나, 감소의 정도는 T4 frd에 대해 관찰된 것보다 적었으며, TdR의 유의한 증가는 없었다.
과다발현된 이. 콜라이 glyA 유전자의 존재 및 비존재의 풍부화된 배지에서의 균주에 대한 진탕 플라스크 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 UdR % 코멘트
CMG2451 pCG532 8.92 34.5 pCG376은 pCG532와 상용성이 있는 클로닝 벡터이다.
pCG601 = pCG376 + glyA
pCG532 + pCG601 8.79 22.07
본 발명을 나타내는데 사용된 이. 콜라이 시스템에 대해, dUMP의 dTMP로의 전환을 위한 CH2-THF의 공급은 THF의 CH2-THF로의 전환 속도보다는 DHF의 THF로의 전환 속도에 의해 제한된다는 결론을 내릴 수 있었다. 이는 T4frd가 glyA보다 UdR을 감소시키는데 훨씬 더 효과적인 이유를 설명한다. 그러나, 본 발명의 목적을 성취하는 상이한 접근법의 상대적 효과, 즉 티미딜레이트 신타제에 이용가능한 CH2-THF의 공급의 증가는 본 발명이 적용되는 티미딘-생성 유기체의 유전적 백그라운드에 매우 의존적인 것으로 예상된다.
CH2-THF 합성의 속도 제한 단계가, 상이한 또는 추가의 첨가된 유전자 및 돌연변이를 갖는 이. 콜라이 균주에서 및 다른 티미딘-생성 유기체에서는 다른 곳에 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 사실상, 티미딘-생성 유기체가 제US 5,213,972호 및 제WO 01/02580호에 교시된 원리에 따라 계속 개선된다면, 속도 제한 단계는 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 반응으로 이동할 수 있으며, 클로닝된 glyA 유전자의 첨가는 본 발명의 원리에 따라 티미딘 중 UdR의 수준을 감소시키는데 보다 극적인 이점을 나타낸다.
실시예 10
클로닝된 serA 유전자를 첨가하는 것의 효과
본 실시예는 세린-글리신 경로에서 효소의 발현의 증가에 의한 THF로부터의 CH2-THF의 재생성의 개선 효과를 예시한다 (도 3). 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제는 상기 경로의 제1 단계를 촉매하는 효소이며, 이는 이. 콜라이를 비롯한 많은 유기체에서 CH2-THF의 주요 공급원이다. CH2-THF는 두가지 연속적 반응으로 재생성된다: 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제에 의해 촉매되는 L-세린의 글리신으로의 전환, 및 글리신 절단 효소 복합체에 의해 촉매되는 글리신의 이산화탄소 및 물로의 전환.
실시예 5에 상세히 기재된 바와 같이 제2 플라스미드 시험 시스템을 이용하여 클로닝된 이. 콜라이 serA 유전자를 첨가함으로써, 천연 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제의 수준을 증가시켰다. 상기 신규 유전자 변형에 대한 출발점은 ndk 돌연변이, T4 frd 유전자 및 유전학적으로 안정화된 구조물을 비롯한 최선의 방식의 숙주 균주 및 구조물 CMG2576/pCG609이었다. THF로부터의 CH2-THF의 합성을 위한 능력을 증가시키는 것의 이점이 DHF의 THF로의 전환을 위한 능력이 개선된 경우 상기 백그라운드에서 최상으로 시험되었다는 것이 이유이다.
실시예 5에 논의된 바와 같이 serA 유전자를 플라스미드 벡터 pCG376으로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드 pCG844는 람다 PL 프로모터를 갖는 serA 유전자를 운반하였다. 실시예 2에 기재된 진탕-플라스크 시험을 이용하여, pCG376 또는 pCG844와 조합된 pCG609를 보유하는 CMG2576 유도체를 비교하였다. 결과는 하기 표 11에 제공된다.
UdR 대 TdR의 매우 낮은 비율에서 명백한 변화는 없었으나, TdR의 생성 속도에서 약간의 증가가 있었다. 실시예 6에 의해 예시된 T4 frd 유전자의 효과와 비교하여, 이러한 개선은 상대적으로 적었다. 그러나, 과다발현된 serA 유전자를 첨가하는 것의 효과가 높은 수준의 UdR을 생성하는 상이한 유전적 백그라운드를 갖는 유기체에서 보다 극적일 수 있었다는 것이 이해될 것이다.
L-세린의 축적은 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제를 억제하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 실시예에서, 상기 경우인 것으로 생각되지 않는다. 그러나, 상기 경우가 야기된다면, 아미노산 서열의 단일 변화 (asn346의 ala로의 변화)는 억제를 파괴하기 때문에 클로닝된 serA 유전자를 변형시키는 것이 바람직할 것이다 (문헌 [Al-Rabiee et al., J. Biol. Chem. 271: 23235, 1997]).
과다발현된 이. 콜라이 serA 유전자의 존재 및 비존재의 풍부화된 배지에서의 균주에 대한 진탕 플라스크 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 UdR % 코멘트
CMG2576 pCG609 + pCG376 26.9 1.46 pCG376은 pCG532와 상용성이 있는 클로닝 벡터이다.
pCG844 = pCG376 + serA
pCG609 + pCG844 31.7 1.40
실시예 11
클로닝된 효모 ADE3 유전자를 첨가하는 것의 효과
본 실시예는 티미딘-생성 유기체에 CH2-THF의 재생성을 제공하는 추가 경로를 첨가하는 것의 효과를 예시한다. 본 발명을 예시하는데 선택된 이. 콜라이 시스템에서, 필요한 일-탄소 단위의 공급원으로서 포르메이트를 사용하는 CH2-THF의 재생성은 통상적인 대사 경로가 아니다. 그러나, 상기 메카니즘은 효모 사카로미세스 세레비시아에를 비롯한 원핵생물에 존재하며, 여기서 단일 유전자가 상기 경로에 의한 THF의 CH2-THF로의 전환에 필요한 세가지 효소 활성을 나타내는 삼기능성 단백질을 코딩할 수 있다 (도 4 참조).
출원인은 상기 삼기능성 단백질을 코딩하는 효모로부터의 ADE3 유전자를, T4 frd를 비롯한 유전학적으로 안정화된 구조물을 갖는 ndk 돌연변이체 이. 콜라이 숙주 균주의 조합에 첨가하는 것의 효과를 시험하였다. 람다 PL 프로모터를 갖는 ADE3을 실시예 5에 기재된 바와 같이 pCG376으로 클로닝하여, 구조물 pCG870을 생성하였다.
실시예 2 프로토콜을 이용하는 진탕-플라스크 발효 시험에서, pCG609 단독 또는 pCG609 및 pCG870 둘 모두를 보유하는 CMG2576 유도체를 비교하였다. pGC609 및 벡터 pCG376 둘 모두를 보유하는 CGM2576은 또한 제2 플라스미드의 효과에 대한 대조군으로 시험에 포함시켰다. 결과는 하기 표 12에 나타낸다. TdR 생산성에 대한 유의한 효과는 없었으나, UdR 함량은 매우 낮은 수준으로부터 추가로 더 감소되었다. 이점은 본 실시예의 유전적 백그라운드에서 극적이지 않았으나, 이는 상이한 또는 추가의 첨가된 유전자 및 돌연변이를 갖는 이. 콜라이 균주 또는 실제로 다른 티미딘-생성 유기체에서 보다 잘 실현될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
포르메이트는 이. 콜라이와 같은 진핵생물 유기체에서 CH2-THF를 위한 일-탄소 단위의 통상적인 공급원이 아니므로, 본 발명의 상기 측면은 그의 최대 효과를 갖기 위해 추가의 유전자 변형을 필요로 할 수 있다는 것이 추가로 인식될 것이다. 예를 들어, 피루베이트로부터 포르메이트를 생성하는 피루베이트 포르메이트 분해효소(lyase)는 과다발현되어, THF의 메틸화를 위한 포르메이트의 이용가능성을 증가시킬 수 있다 (도 5 참조).
발현된 효모 ADE3 유전자의 존재 및 비존재의 풍부화된 배지에서의 균주에 대한 진탕 플라스크 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 UdR % 코멘트
CMG2576 pCG609 27.2 1.22 4-6 시간의 결과
pCG376은 pCG609와 상용성이 있는 클로닝 벡터이다.
pCG870 = pCG376 + ADE3
pCG609 + pCG376 29.9 1.28
pCG609 + pCG870 27.2 0.71
실시예 12
클로닝된 클로스트리디움 아시디-우리시(Clostridium acidi - urici) fhs 유전자를 첨가하는 것의 효과
본 실시예는 포르메이트를 이용하여 CH2-THF를 재생성하는 경로를 이. 콜라이에 도입하는 대안적 메카니즘을 예시한다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 반응을 촉매하는데 세가지 효소가 필요하다. 이. 콜라이는 이들 효소 중 첫번째 효소, 포르밀테트라히드로폴레이트 신세타제 (EC 6.3.4.3)가 결핍되어 있기 때문에 상기 경로를 이용할 수 없다. 나머지 두가지 효소는 folD 유전자에 의해 코딩되는 이기능성 단백질로서 존재한다.
세가지 효소 활성 모두를 코딩하는 효모 ADE3 유전자에 대한 대안으로서, 출원인은 포르메이트 경로에서 필요한 효소의 세트와 경쟁하는 포르밀테트라히드로폴레이트 신세타제만을 코딩하는 클로스트리디움 아시디-우리시의 fhs 유전자를 이. 콜라이의 티미딘-생성 균주에 도입하였다. ADE3에 대해, 제2 플라스미드 벡터를 사용하는 숙주 균주 CMG2576 및 구조물 pCG609의 최선의 조합에서 상기 유전자 변화를 시험하였다.
람다 PL 프로모터를 갖는 fhs를 실시예 5에 기재된 바와 같이 pCG376으로 클로닝하여, 구조물 pCG881을 생성시켰다. 실시예 2 프로토콜을 이용하는 진탕-플라스크 발효 시험에서, pCG881 또는 pCG376과 함께 pCG609를 보유하는 CMG2576 유도체를 비교하였다. 결과는 하기 표 13에 나타낸다.
상기 ADE3 실시예와는 대조적으로, 상기 최선의 방식의 균주 및 구조물에서 매우 낮은 수준의 UdR에서 감소는 없었다. 그러나, TdR 생산성의 명백한 약간의 증가가 있었다. 상기 실시예로부터, 상이한 유전적 백그라운드를 갖는 티미딘-생성 유기체에서, 또는 THF의 CH2-THF로의 전환을 위한 포르메이트의 이용가능성에 영향을 미치는 다른 변화와 조합된 유기체에서 보다 잘 실현될 수 있다는 것이 본 발명의 한 측면임이 이해될 것이다.
발현된 클로스트리디움 아시디-우리시 fhs 유전자의 존재 및 비존재의 풍부화된 배지에서의 균주에 대한 진탕 플라스크 평균 비생산성 (mg TdR/L/hr/g 건조 세포 중량)
숙주 균주 플라스미드 비생산성 UdR % 코멘트
CMG2576 pCG609 + pCG376 19.3 0.294 12 시간의 결과, 3개의 실험의 평균.
pCG881 = pCG376 + fhs
pCG609 + pCG881 23.7 0.361

Claims (41)

  1. 숙주 균주가 TMPase 및 티미딜레이트 신타제(synthase) 유전자를 가지고,
    이.콜라이의 thyA 유전자 또는 박테리오파지 T4의 td 유전자의 과다 발현을 포함하고, 디히드로폴레이트 리덕타제 (EC 1.5.1.3)를 발현할 수 있는 T4 frd 전사 단위를 포함하며, dTMP로의 전환을 위한 dUMP에 대한 단일 탄소 단위의 이용가능성을 증가시키는 유전자 변형의 결과로서 UdR을 손실하고 TdR을 우선적으로 생성하는 티미딘 생합성 경로를 야기하는 유전자 변형을 포함하는 것을 특징으로 하며,
    뉴클레오시드 디포스페이트 키나제 (EC 2.7.4.6)를 코딩하는 유전자가 녹아웃(knock out)되거나, 또는 다른 경우에는 불활성화되거나 또는 절단된 것인
    배양 배지에서 성장시 티미딘을 생성할 수 있는 박테리아.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
KR1020087019203A 2006-02-06 2007-02-05 신규 방법 KR101371954B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0602339.4 2006-02-06
GBGB0602339.4A GB0602339D0 (en) 2006-02-06 2006-02-06 Novel process
PCT/EP2007/051072 WO2007090810A1 (en) 2006-02-06 2007-02-05 Novel process

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080093118A KR20080093118A (ko) 2008-10-20
KR101371954B1 true KR101371954B1 (ko) 2014-03-07

Family

ID=36101118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087019203A KR101371954B1 (ko) 2006-02-06 2007-02-05 신규 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8263384B2 (ko)
EP (2) EP2287294A1 (ko)
JP (1) JP5230447B2 (ko)
KR (1) KR101371954B1 (ko)
CN (1) CN101379185B (ko)
ES (1) ES2410857T3 (ko)
GB (1) GB0602339D0 (ko)
SI (1) SI1981972T1 (ko)
WO (1) WO2007090810A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7572065B2 (en) 2007-01-24 2009-08-11 Adc Telecommunications, Inc. Hardened fiber optic connector
EP2431476B1 (en) * 2007-02-19 2014-08-20 Evonik Degussa GmbH Coryneform bacteria with glycine cleavage activity
CN113755416B (zh) * 2020-06-05 2023-08-15 苏州华赛生物工程技术有限公司 具有新合成路径生产β-胸苷的重组微生物及生产β-胸苷的方法
CN111748537B (zh) * 2020-08-04 2021-11-26 浙江华睿生物技术有限公司 一种尿苷磷酸酶突变体及其应用
CN112126666B (zh) * 2020-09-22 2022-04-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 核苷高产菌及其构建方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001002580A1 (en) 1999-07-01 2001-01-11 Glaxo Group Limited Vectors, cells and processes for pyrimidine deoxyribonucleosides production

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68916708T2 (de) 1988-05-31 1994-12-01 Zeneca Ltd Herstellung eines Desoxyribonucleosids.
US5213972A (en) 1989-12-08 1993-05-25 Chemgen Corporation Fermentation process for the production of pyrimidine deoxyribonucleosides
JP3916345B2 (ja) 1999-06-26 2007-05-16 均 西谷 両開きドア

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001002580A1 (en) 1999-07-01 2001-01-11 Glaxo Group Limited Vectors, cells and processes for pyrimidine deoxyribonucleosides production

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Biol Chem, Vol. 259, No. 10, pp. 6261-6266 (1984.05.25.) *

Also Published As

Publication number Publication date
SI1981972T1 (sl) 2013-07-31
EP1981972A1 (en) 2008-10-22
KR20080093118A (ko) 2008-10-20
JP2009525738A (ja) 2009-07-16
CN101379185B (zh) 2012-08-29
CN101379185A (zh) 2009-03-04
GB0602339D0 (en) 2006-03-15
US8263384B2 (en) 2012-09-11
ES2410857T3 (es) 2013-07-03
EP2287294A1 (en) 2011-02-23
WO2007090810A1 (en) 2007-08-16
EP1981972B1 (en) 2013-03-20
US20090081735A1 (en) 2009-03-26
JP5230447B2 (ja) 2013-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114134093B (zh) 生产胞嘧啶的重组微生物及生产胞嘧啶的方法
JP7125477B2 (ja) グリシン生産能が増加された微生物及びこれを用いた発酵組成物の生産方法
CN106754602A (zh) 一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法
CN111465701A (zh) 用于三磷酸核苷和核糖核酸生成的方法和组合物
EP2115120B1 (en) Microorganism producing inosine and method of producing inosine using the same
KR101371954B1 (ko) 신규 방법
TWI223003B (en) Process for producing GDP-fucose
CN116463273A (zh) 增强5’-胞苷酸积累的方法及应用
KR101653245B1 (ko) 대장균에서 대사공학적 방법을 이용한 싸이미딘의 대량생산 방법
CN113564190A (zh) 高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法
US20020128457A1 (en) Vectors, cells and processes for pyrimidine deoxyribonucleosides production
JP3369236B2 (ja) シチジンジリン酸コリンの製造法
CN113025550B (zh) 高产维生素b2枯草芽孢杆菌工程菌株、其构建及应用
US7387893B2 (en) Vectors, cells and processes for pyrimidine deoxyribonucleosides production
WO2007023830A1 (ja) シチジンジリン酸コリンの製造法
CN117897476A (zh) 生产维生素b化合物的微生物细胞工厂
KR100859088B1 (ko) Ｌ-쓰레오닌 생산 변이주 및 이를 이용한 ｌ-쓰레오닌생산 방법
WO2023285585A2 (en) Microbial cell factories producing vitamin b compounds
JPH03210190A (ja) チアミンリン酸類の製造法
EP1806405A2 (en) Vectors, cells and processes for pyrimidine deoxyribonucleosides production
CN117402801A (zh) 一种生产5’-胞苷酸的基因工程菌及其构建方法和应用
KR19990074792A (ko) 유전자 재조합 미생물에 의한 5&#39;-구아닐산의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161229

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171228

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181227

Year of fee payment: 6