CN111465701A - 用于三磷酸核苷和核糖核酸生成的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

在一些实施方案中，本文中提供了用于生成三磷酸核苷和核糖核酸的方法和组合物。

Description

用于三磷酸核苷和核糖核酸生成的方法和组合物
相关申请
本申请要求2017年10月11日提交的美国临时申请号62/571,071的35U.S.C.§119(e)下的权益，其通过引用完整并入本文。
发明背景
核糖核酸(RNA)包含核糖核苷酸的重复单元，并在关键的细胞过程中起作用，包括基因表达和蛋白质合成。因此，RNA是用于调控细胞基本过程的有吸引力的靶标，例如，诱导细胞免疫应答的RNA疫苗。然而，以商业规模(例如，克至千克)低成本生成RNA部分由于起始材料(例如，三磷酸核苷(NTP))和反应成分(例如，DNA模板和聚合酶)的成本而是挑战性的。以商业相关规模提供高质量RNA需要NTP和RNA两者的有成本效益的生成。
发明概述
本文中提供了利用生物合成途径来低成本生成(生物合成)NTP和/或RNA的系统、方法、组合物(例如细胞、细胞裂解物、试剂和反应混合物)和试剂盒，所述生物合成途径开发为利用低成本底物(例如细胞RNA、核碱基、核苷、单磷酸核苷(NMP)和/或二磷酸核苷(NDP))、重组和/或内源酶(例如激酶和/或聚合酶)和能源(例如NTP、多磷酸盐和/或焦磷酸盐)。在一些实施方案中，NTP和/或RNA的生成是使用体外和/或无细胞的裂解物系统实现的，所述裂解物系统被设计为最小化(例如减少，抑制和/或去除)不想要的酶促活性，从而提高了过程效率和期望的终产物的产率。
本文中所述的生物合成途径通常利用多磷酸激酶和多磷酸盐作为内源途径酶和磷酸盐源的替代物。
因此，本公开内容的一些方面提供了用于生成NTP的方法和组合物，其包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育NDP(例如，ADP、CDP、GDP和/或UDP)、多磷酸激酶(例如，PPK2)和多磷酸盐(例如六偏磷酸盐)。如图2A所示，PPK将磷酸盐从多磷酸盐转移到ADP、CDP、GDP和UDP，从而生成ATP、CTP、GDP和UTP。在一些实施方案中，此反应混合物进一步包含NDP激酶(例如，ndk)。
本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育NMP(例如5′-NMP，例如5′-AMP、5′-CMP、5′-GMP和/或
Figure BDA0002524284760000021
)、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NMP激酶或NDP激酶(例如，ndk)。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NMP激酶(例如，adk、cmk、gmk和/或pyrH)和NDP激酶(例如，ndk)。
本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括在适合于生成NTP的条件在反应混合物中温育核苷(例如，腺苷、胞苷、鸟苷和/或尿苷)、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶或NDP激酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和NDP激酶。
本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育核碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和/或尿嘧啶)、磷酸核糖转移酶、磷酸核糖基焦磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶或NDP激酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和NDP激酶
在一些实施方案中，从细胞RNA生成用于NTP的生物合成的起始材料(例如，NMP、NDP和/或核苷)。因此，本公开内容的一些方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括(a)在适合于生成二磷酸核苷(NDP)的条件下在反应混合物中温育细胞RNA(例如，获自单细胞或多细胞生物体)、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)和无机磷酸盐；(b)消除PNP酶(并任选消除其他不想要的酶促活性)；(c)在适合于生成NTP的条件下在所得反应混合物中温育NDP、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，步骤(c)的反应混合物进一步包含NDP激酶。或者，方法可包括(a)在反应混合物中在适合于生成二磷酸核苷的条件下温育细胞核糖核酸(RNA)、PNP酶、无机磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐(任选地，其中反应混合物进一步包含NDP激酶)；(b)消除PNP酶；并且(c)在适合于生成NTP的条件下温育反应混合物。在一些实施方案中，所需的途径酶(例如，多磷酸激酶和/或NDP激酶)能经受住消除条件(例如，暴露于高温或化学抑制剂)，从而它们在暴露于用于消除(例如，减少，抑制和/或去除)PNP酶的条件后保留其活性(例如，至少50％的其活性)。
本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括(a)在适合于生成NMP(例如5′-NMP)的条件下在第一反应混合物中温育细胞RNA和核糖核酸酶(RNA酶，例如RNA酶R或核酸酶P1)；(b)消除RNA酶(和任选地其他不想要的酶促活性)；并且(c)在适合于生成NTP的条件下在所得反应混合物中温育NMP、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，步骤(c)的反应混合物进一步包含NMP激酶、NDP激酶或NMP激酶和NDP激酶两者。或者，方法可以包括：(a)在反应混合物中在适合于生成NMP(例如5′-NMP)的条件下温育细胞RNA、RNA酶、多磷酸激酶和多磷酸盐；(b)消除RNA酶；并且(c)在适合于生成NTP的条件下温育反应混合物。
在一些实施方案中，本文中生成的NTP用于生成RNA(例如，mRNA或双链RNA)。如本文所述，这可以例如通过将DNA模板和聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)添加到用于生成NTP的任何反应混合物中来实现。或者，可以将NTP分离并在单独的反应混合物中与DNA模板和聚合酶组合以生成RNA。因此，本公开内容还提供了用于生成RNA的方法和组合物。
在本文所述的任何生物合成途径中，当用作起始底物时，核碱基、核苷、NMP、NDP或NTP可以是化学合成的，发酵产物或通过其他手段生成的。
在本文中描述的系统、反应混合物和方法中使用的多磷酸激酶可以选自表2或12中列出的任何多磷酸激酶。在一些实施方案中，多磷酸激酶包含来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
多磷酸盐可以是充当途径酶的底物的任何多磷酸盐。在一些实施方案中，多磷酸盐是六偏磷酸盐。
在使用细胞RNA的实施方案中，细胞RNA包括例如核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。细胞RNA可以来自单细胞生物体(例如细菌或酵母)或多细胞生物体(例如植物)。
本公开内容中有用的生物合成途径的酶可以获自(分离和/或纯化)(至少一种)细胞裂解物，所述细胞裂解物从例如表达该途径的酶(例如核酸酶(例如RNA酶和/或PNP酶)、多磷酸激酶、NMP激酶、NDP激酶和/或聚合酶)的细胞(例如工程化细胞)制备。本文描述了用于制备这些细胞裂解物的示例性方法。或者，反应混合物可包含从表达途径酶的细胞(例如，工程化细胞)制备的细胞裂解物(单细胞裂解物或细胞裂解物的混合物)。也就是说，可以在细胞裂解物或细胞裂解物的混合物中进行完全反应，所述细胞裂解物或细胞裂解物的混合物包含途径的重组酶和/或内源酶以及生成NTP所需的其他反应成分(例如，多磷酸盐)。在一些实施方案中，将(至少一种)纯化的途径酶添加至反应混合物。
对于包括细胞裂解物或从细胞裂解物获得的酶的反应混合物，使用本文所述的任何消除方法消除不想要的天然酶促活性可以是有利的。不想要的天然酶促活性包括例如磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。在一些实施方案中，经由遗传修饰、从细胞的酶分泌、定位(例如周质靶向)和/或蛋白酶靶向消除天然酶促活性。在其他实施方案中，经由温度、pH、盐、去污剂、醇或其他溶剂和/或化学抑制剂消除天然酶促活性。在其他实施方案中，经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除天然酶促活性。
在所附的实施例、附图和发明详述中阐明了本发明的几个实施方案的细节。通过说明书和权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将变得明显。
附图简述
图1A显示了使用核苷酸起始材料生成三磷酸核苷(NTP)和下游核糖核酸(RNA)的生物合成途径。图1B显示了高能磷酸盐策略的例子，其中将多磷酸盐进料到反应混合物中。图1C显示了其他高能磷酸盐策略的例子。
图2A显示了使用二磷酸核苷(NDP)作为起始材料生成NTP和下游RNA的生物合成途径。图2B显示了使用5′单磷酸核苷(5′-NMP)作为起始材料生成NTP和下游RNA的生物合成途径。图2C显示了使用核苷作为起始材料生成NTP和下游RNA的生物合成途径。图2D显示了使用核碱基作为起始材料生成NTP和下游RNA的生物合成途径。图2E显示了使用核碱基和核糖作为起始材料生成NTP和下游RNA的生物合成途径。
图3A显示了使用细胞RNA作为起始材料生成NTP和下游RNA的生物合成途径。在该途径中，使用多核苷酸磷酸化酶将细胞RNA降解为NDP。图3B显示了使用细胞RNA作为起始材料生成NTP和下游RNA的生物合成途径。在该途径中，使用核糖核酸酶将细胞RNA降解为NMP。
图4A显示了仅使用多磷酸激酶生成NTP和下游RNA的生物合成途径。图4B显示了使用多磷酸激酶(例如，PPK2)和ATP/ADP依赖性激酶(例如，NMP激酶，例如adk、cmk、gmk和/或pyrH和/或NDP激酶，如ndk)生成NTP和下游RNA的生物合成途径。
图5显示了从5′-NMP开始生成RNA的生物合成途径。
图6显示了从细胞RNA开始生成RNA的生物合成途径。该示意图显示了一个例子，其中在RNA生成反应期间添加模板、激酶和聚合酶。
图7显示了从细胞RNA开始生成RNA的生物合成途径。该示意图显示了一个例子，其中可以在解聚阶段或RNA生成阶段期间添加模板，可以在解聚阶段或RNA生成阶段期间添加激酶，并且可以在解聚阶段或RNA生成阶段期间添加聚合酶。
图8A显示了在使用过表达的RNA酶R从大肠杆菌裂解物中解聚RNA期间随时间生成的酸溶性核苷酸(mM)的图。通过UV吸光度测量酸溶性核苷酸。
图8B显示了在反应中生成的RNA产物的琼脂糖凝胶，所述反应包含RNA聚合酶和通过解聚生成的NMP(-NMP)或纯化的NMP(+NMP，各4mM)。缩写：–2log：2-log DNA梯(NewEngland Biolabs)，NMP：
Figure BDA0002524284760000051
等摩尔混合物，RNA Pol：热稳定性T7 RNA聚合酶，模板1：线性DNA模板，模板2：质粒DNA模板。
图9A显示了在使用1mg/mL纯化的RNA酶R的纯化的RNA解聚期间随时间生成的酸溶性核苷酸(mM)的图。通过UV吸光度测量酸溶性核苷酸。
图9B显示了在反应中生成的RNA产物的琼脂糖凝胶，所述反应包含RNA聚合酶和通过纯化的RNA解聚生成的NMP。作为阴性对照，在不存在RNA聚合酶的情况下进行反应。缩写：–2log：2-log DNA梯(New England Biolabs)，NMP：5'-单磷酸核苷的等摩尔混合物，RNAPol：热稳定性T7 RNA聚合酶，模板1：线性DNA模板，模板2：质粒DNA模板。
图10显示了在37℃使用野生型聚合酶(W)或热稳定性聚合酶突变体(T)通过无细胞RNA合成生成的RNA产物的琼脂糖凝胶。缩写：–2log：2-log DNA梯(New EnglandBiolabs)，W：野生型T7 RNA聚合酶(New England Biolabs)，T：热稳定性T7 RNA聚合酶，模板1：线性DNA模板，模板2：质粒DNA模板。
图11A显示了包含DgPPK2作为唯一激酶或5-酶裂解物系统的反应的响应因子(以感兴趣的dsRNA的面积与商品化dsRNA内部标准品的面积的比率计算)的图。
图11B显示了在包含DgPPK2裂解物、5-酶裂解物系统和没有T7 RNA聚合酶的阴性对照的反应中生成的dsRNA产物的HPLC层析图。
图12A显示了在使用纯化的RNA酶R或核酸酶P1解聚各种RNA来源期间随时间生成的酸溶性核苷酸(mM)的图。通过UV吸光度测量酸溶性核苷酸。
图12B显示了在使用核酸酶P1从大肠杆菌或酵母中解聚RNA期间随时间生成的可用5′-NMP的百分比的图。通过LC-MS测定可用的5′-NMP的百分比。
图13显示了在来自GL17-109的裂解物的不同温度间RNA解聚的核子概况图(nucleomic profile plot)。显示了20种分析物的累积浓度。核苷以白色斑点的模式显示，并且以最小程度生成。收集50℃的数据，但未显示。
图14是通过乙酸盐的循环磷酸化从焦磷酸盐生成ATP的酶促途径的示意图。缩写的含义如下：AcK1＝第一乙酸激酶，AcK2＝第二乙酸激酶，PPi＝无机焦磷酸盐，Pi＝无机磷酸盐，ATP＝三磷酸腺苷，ADP＝二磷酸腺苷，并且乙酰-P＝乙酰磷酸盐。
图15A-15B是用于从柠檬酸盐生成ATP的酶促途径的示意图。图15A显示了从柠檬酸盐和焦磷酸盐生成ATP的三种酶促反应。图15B显示了整个化学反应。缩写的含义如下：PPi＝无机焦磷酸盐，PEP＝磷酸烯醇丙酮酸盐，CO2＝二氧化碳，Pi＝无机磷酸盐，ATP＝三磷酸腺苷，并且AMP＝单磷酸腺苷。
图16是从亚硫酸盐生成ATP的酶促途径的示意图。缩写的含义如下：ATP＝三磷酸腺苷，AMP＝单磷酸腺苷，APS＝5'-磷酸硫酸腺苷(adenosine5’-phosphosulfate)，PPi＝无机焦磷酸盐。
图17是显示无论核苷酸来源如何，dsRNA的无细胞合成产生类似产物滴度的图。
图18是显示在嗜温(mesophilic)反应温度下dsRNA的无细胞合成导致与野生型和热稳定性突变体RNA聚合酶相当的产物滴度的图。
图19是显示无论核苷酸来源如何，在48℃温育1小时后，NTP的无细胞合成产生相似的NTP滴度。对于每种核苷酸来源(细胞RNA、纯化的NMP或纯化的NDP)，将足以提供约4mM每种核苷酸的底物添加到反应中。例如，具有NDP的反应包括各4mM ADP、CDP、GDP和UDP。
发明详述
在某些方面，本公开内容提供了用于生成NTP和/或RNA的生物合成途径，其利用了有成本效益的反应成分，例如细胞RNA底物或单体底物，例如核碱基、核苷、NMP或NDP、重组和/或或纯化的途径酶(例如，磷酸核糖转移酶、核苷磷酸化酶、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶、核酸酶、多磷酸激酶、NMP激酶、NDP激酶、核苷激酶、RNA聚合酶)、高能磷酸盐(例如，多磷酸盐)来源和/或DNA模板。
反应成分
细胞RNA。细胞RNA包括例如从细胞材料(生物质)获得的信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。细胞RNA可以从任何细胞材料来源，包括但不限于单细胞生物体(例如细菌和酵母)和多细胞生物体(例如植物和动物)，从发酵或从工艺废物流获得，例如从表达酶(例如，激酶)的裂解物获得的细胞RNA。
核碱基。核碱基是核苷或核苷酸的含氮碱基成分。核碱基发挥遗传密码的基本单位的功能。核碱基包括腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。核碱基包括经修饰的核碱基，包括但不限于假尿苷(Ψ)、二氢尿苷(D)和7-甲基鸟苷(m7G)。
核苷。核苷是与五碳糖(例如核糖)连接的核碱基。核苷的例子包括腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷。
核苷酸。核苷酸包括核苷和磷酸根基团。具有一个磷酸根基团的核苷是单磷酸核苷(NMP)，其包括单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸胞苷(CMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)和单磷酸尿苷(UMP)。具有两个磷酸根基团的核苷是二磷酸核苷(NDP)，其包括二磷酸腺苷(ADP)、二磷酸胞苷(CDP)、二磷酸鸟苷(GDP)、二磷酸胸苷(TDP)和二磷酸尿苷(UDP)。具有三个磷酸根基团的核苷是三磷酸核苷(NTP)，其包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胸苷(TTP)和三磷酸尿苷(UTP)。
磷酸核糖转移酶。磷酸核糖转移酶(如腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT酶))参与细胞中的核苷酸挽救途径，其为核苷酸生物合成提供备选途径。APRT酶催化嘌呤核苷酸挽救途径中的以下反应：腺嘌呤+磷酸核糖焦磷酸盐(PRPP)→5'单磷酸腺苷(AMP)+焦磷酸盐(PPi)。
核糖激酶。核糖激酶是一种将磷酸盐从高能磷酸盐源(例如ATP或多磷酸盐)转移至D-核糖，形成D-核糖-5-磷酸的酶。例子包括大肠杆菌的rbsK基因产物和栖热菌属种(Thermus sp.)2.9的QT17_05185基因产物。
磷酸戊糖变位酶。磷酸戊糖变位酶是一种在核糖-磷酸分子内转移磷酸的酶。具体而言，磷酸核糖核酸酶催化D-核糖-1-磷酸和D-核糖-5-磷酸的可逆相互转化。例子包括大肠杆菌的deoB基因产物和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的TM0167基因产物。
核苷磷酸化酶。核苷磷酸化酶是催化以下可逆反应的酶：核碱基+D-核糖-1-磷酸←→核苷+无机磷酸盐。嘌呤核苷磷酸化酶催化与嘌呤核碱基(例如腺嘌呤，鸟嘌呤)和嘌呤核苷(例如腺苷，鸟苷)的此类反应。嘧啶核苷磷酸化酶催化与嘧啶核碱基(例如胞嘧啶，尿嘧啶)和嘧啶核苷(例如胞苷，尿苷)的此类反应。核苷磷酸化酶的例子包括大肠杆菌的deoD、xapA和udp基因产物，以及嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27的TtPNPI、TtPNPII和TtPyNP。
多核苷酸磷酸化酶。多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)是一种具有磷酸解3'至5'外切核糖核酸酶活性和3'端寡核苷酸聚合酶活性的双功能酶。PNP酶能够催化使用无机磷酸盐作为共底物将RNA降解为5'二磷酸核苷(NDP)。在使用PNP酶降解RNA的情况下使用高浓度的无机磷酸盐可以同时驱动PNP酶活性，而减少由于反应混合物中可能存在的磷酸酶活性引起的潜在NDP产率损失，因为已知无机磷酸盐抑制此类不需要的活性。在一些实施方案中，任选地与一种或多种解旋酶结合使用PNP酶，以催化RNA降解成NDP。添加解旋酶可以通过改善结构化RNA的可及性来改善PNP酶介导的细胞RNA解聚。
核酸酶。核酸酶是在DNA(DNA酶)或RNA(RNA酶)的主链上切割磷酸二酯键的酶。因此，核糖核酸酶(RNA酶)能够催化RNA降解成单磷酸核苷(NMP)。表1中提供了可用于解聚RNA的酶的非限制性例子，如本文中提供。在一些实施方案中，在反应混合物中使用超过一种核酸酶来解聚RNA。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的核酸酶。
表1.用于RNA解聚的酶的例子
Figure BDA0002524284760000091
激酶。通常，激酶是催化磷酸根基团从高能供磷酸盐的分子(例如，ATP、GTP、UTP、CTP或聚合物中含n个磷酸根基团的多磷酸盐)转移到特定底物/分子的酶。该过程产生磷酸化底物和高能供磷酸盐的分子(例如，ADP、GDP、UDP、CDP或聚合物中含n-1个磷酸根基团的多磷酸盐)的去磷酸化形式。如本文提供的使用的激酶的非限制性例子包括NMP激酶、NDP激酶、核苷激酶和多磷酸激酶。
多磷酸激酶。多磷酸激酶是一种催化磷酸根基团从高能供磷酸盐的分子(例如多磷酸盐(PolyPn))转移到特定底物/分子的酶。该过程称为磷酸化，其中底物获得磷酸根基团，而高能供磷酸盐的分子贡献磷酸根基团。该酯交换生成磷酸化的底物和缺少贡献的磷酸根基团的供磷酸盐的分子，例如PolyPn-1。在一些实施方案中，本公开内容的多磷酸激酶将核苷转化为NMP，将NMP转化为NDP，和/或将NDP转化为NTP。表2中提供了多磷酸激酶的非限制性例子。在一些实施方案中，在反应混合物中使用超过一种多磷酸激酶。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的多磷酸激酶。
表2.多磷酸激酶的例子
Figure BDA0002524284760000101
Figure BDA0002524284760000111
核苷激酶。核苷激酶催化从高能供磷酸盐的分子(例如三磷酸核苷酸)到R-OH受体的磷酰基转移，所述R-OH受体通常是核苷(例如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)的糖部分的5’-羟基基团。此过程将核苷转化为NMP(例如AMP、CMP、GMP、UMP)。在一些实施方案中，核苷激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向腺苷的转移以产生单磷酸腺苷(AMP)。在一些实施方案中，核苷激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向胞苷的转移以产生单磷酸胞苷(CMP)。在一些实施方案中，核苷激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向鸟苷的转移以产生单磷酸鸟苷(GMP)。在一些实施方案中，核苷激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向尿苷的转移以产生单磷酸尿苷(UMP)。表3中提供了核苷激酶的非限制性例子。在一些实施方案中，在反应混合物中使用了超过一种核苷激酶。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5个不同的核苷激酶。
表3.核苷激酶的例子
Figure BDA0002524284760000121
NMP激酶。单磷酸核苷激酶(NMP激酶)是一种催化末端磷酰基基团从三磷酸核苷(NTP)(通常为ATP)转移到单磷酸核苷(例如AMP、CMP、GMP、UMP)上的磷酰基基团的酶。此过程将NMP转化为NDP(例如ADP、CDP、GDP、UDP)。在一些实施方案中，NMP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向AMP的转移以产生二磷酸腺苷(ADP)。在一些实施方案中，NMP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向CMP的转移以产生二磷酸胞苷(CDP)。在一些实施方案中，NMP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向GMP的转移以产生二磷酸鸟苷(GDP)。在一些实施方案中，NMP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向UMP的转移以产生二磷酸尿苷(UDP)。表4中提供了NMP激酶的非限制性例子。在一些实施方案中，在反应混合物中使用了超过一种NMP激酶。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的NMP激酶。
表4A.AMP激酶的例子
Figure BDA0002524284760000131
表4B.CMP激酶的例子
Figure BDA0002524284760000141
表4C.UMP激酶的例子
Figure BDA0002524284760000151
表4D.GMP激酶的例子
Figure BDA0002524284760000161
NDP激酶。二磷酸核苷激酶(NDP激酶)是一种以可逆方式催化不同NDP(例如ADP、CDP、GDP、UDP)和三磷酸核苷(NTP)之间的末端磷酸交换，从而产生NTP(例如ATP、CTP、GTP、UTP)的酶。在一些实施方案中，NDP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向ADP的转移以产生三磷酸腺苷(ATP)。在一些实施方案中，NDP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向CDP的转移以产生胞苷三磷酸(CTP)。在一些实施方案中，NDP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向GDP的转移以产生三磷酸鸟苷(GTP)。在一些实施方案中，NDP激酶催化磷酸盐从供磷酸盐的分子向UDP的转移以产生三磷酸尿苷(UTP)。表5中提供了NDP激酶的非限制性例子。在一些实施方案中，在反应混合物中使用了超过一种NDP激酶。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的NDP激酶。
表5.NDP激酶的例子
Figure BDA0002524284760000171
Figure BDA0002524284760000181
将NDP转化为NTP的激酶的非限制性例子包括二磷酸核苷激酶、多磷酸激酶和丙酮酸激酶。如本文所讨论，本公开内容涵盖前述酶的热稳定性变体。在一些实施方案中，一种或多种NDP激酶获自风产液菌。
在一些实施方案中，经由多磷酸盐依赖性激酶途径发生NMP磷酸化成NTP，其中经由多磷酸激酶(PPK)将高能磷酸盐从多磷酸盐转移至ADP。在一些实施方案中，多磷酸激酶属于多磷酸激酶1(PPK1)家族，其将高能磷酸盐从多磷酸盐转移至ADP以形成ATP。随后，该ATP被NMP激酶(例如AMP激酶、UMP激酶、GMP激酶和CMP激酶)所使用，以将NMP转化为其关联的二磷酸核糖核苷酸(NDP)。此外，随后二磷酸核苷酸激酶使用ATP将NDP转化为NTP。
在一些实施方案中，多磷酸激酶属于多磷酸激酶2(PPK2)家族。在一些实施方案中，多磷酸激酶属于I类PPK2家族，其将高能磷酸盐从多磷酸盐转移至NDP以形成NTP。该系统产生的ATP用作高能磷酸盐供体以将NMP转化为NDP。在一些实施方案中，多磷酸激酶属于III类PPK2家族，其将高能磷酸盐从多磷酸盐转移至NMP和NDP以形成NTP。在一些实施方案中，单独使用III类PPK2以从NMP产生NTP。在其他实施方案中，III类PPK2与其他激酶组合使用。III类PPK2从ADP、AMP和多磷酸盐产生ATP，其随后被NMP和NDP激酶使用以将NMP转化为NTP。
表2中列出了如本文提供的使用的PPK2酶的非限制性例子。因此，在一些实施方案中，PPK2酶是热稳定的。例如，PPK2酶可以是热稳定的III类PPK2酶，它比多磷酸盐聚合更有利于ATP的合成，并将ADP和AMP两者都转化为ATP。在一些实施方案中，使用PPK2酶以例如范围为每小时10至800mM的速率(例如每小时10,15,20,25,50,75,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,或800mM)将多磷酸盐如六偏磷酸盐转化为ATP。
多磷酸盐和其他高能磷酸盐。高能磷酸盐分子(供磷酸盐的分子)在高能键水解时释放能量，从而为生化反应提供能量来源。如本文所述，多磷酸盐(PolyPn)和其他高能磷酸盐分子可以用作磷酸盐源，用于NTP的生成和RNA的下游生成。例如，PolyPn包含通过共享的氧原子连接在一起的磷酸根(PO4)的重复单元。本公开内容的激酶对特定底物/分子的磷酸化涉及从PolyPn贡献磷酸根基团，从而产生PolyPn-1。
本公开内容不受多磷酸盐中磷酸根基团的数目的限制。在一些实施方案中，PolyPn包含至少3个磷酸根基团(PolyP3)。在一些实施方案中，PolyPn包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个磷酸根基团。在一些实施方案中，PolyPn是六偏磷酸盐。
高能磷酸盐分子的其他例子包括但不限于NTP(例如ATP)、NDP(例如ADP)、NMP(例如AMP)、磷酸烯醇丙酮酸盐、1,3-双磷酸甘油酸盐、磷酸肌酸盐、磷酸烯醇丙酮酸盐、葡萄糖1-磷酸盐、果糖6-磷酸盐和葡萄糖6-磷酸盐。在一些实施方案中，在反应混合物中使用超过一种高能磷酸盐。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的高能磷酸盐。
模板。DNA模板包括与编码期望RNA产物的核苷酸序列和任选地转录终止子可操作连接的启动子，任选地是诱导型启动子。尽管可以使用其他模板形式(例如，通过聚合酶链式反应(PCR)、化学合成或本领域已知的其他手段产生的线性DNA模板)，但是通常在载体如质粒上提供DNA模板。在一些实施方案中，在反应混合物中使用超过一种DNA模板。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的DNA模板。
启动子或终止子可以是天然序列或工程化序列。在一些实施方案中，工程化序列经修饰而增强转录活性。在一些实施方案中，启动子是天然序列。在其他实施方案中，启动子是工程化序列。在一些实施方案中，终止子是天然序列。在其他实施方案中，终止子是工程化序列。
聚合酶。聚合酶是合成核酸聚合物的酶。本公开内容的聚合酶包括DNA依赖性RNA聚合酶和RNA依赖性RNA聚合酶。表6中提供了聚合酶的非限制性例子。在一些实施方案中，聚合酶是RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶。在一些实施方案中，在反应混合物中使用超过一种聚合酶。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2、3、4或5种不同的聚合酶。
表6.RNA聚合酶的例子
Figure BDA0002524284760000201
RNA产物。通过本文提供的方法产生的RNA可以是任何形式的RNA，包括单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)。单链RNA的非限制性例子包括信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和反义RNA。本文中的双链RNA包括不含单链区域(例如，环或突出端)的完全双链分子，以及包含双链区域和单链区域(例如，环或突出端)的部分双链分子。因此，可以通过本公开内容的方法产生短发夹RNA(shRNA)。
通过本文提供的方法产生的RNA可以如本文所述进行修饰。在一些实施方案中，根据本文描述的方法产生RNA，然后进行修饰。在一些实施方案中，根据本文描述的方法，使用经修饰的起始材料产生RNA。在一些实施方案中，经修饰的起始材料是经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的起始材料是经修饰的核苷。在一些实施方案中，经修饰的起始材料是经修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的RNA包含主链修饰。在某些情况下，由于减少的核酸酶介导的降解，主链修饰导致更长的RNA半衰期。这继而导致更长的半衰期。合适的主链修饰的例子包括但不限于硫代磷酸酯修饰、二硫代磷酸酯修饰、对乙氧基修饰、膦酸甲酯修饰、硫代磷酸甲酯修饰、烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中带电荷的膦酸酯氧被烷基或芳基取代)、烷基磷酸三酯(其中带电的氧部分被烷基化)、肽核酸(PNA)主链修饰、锁定核酸(LNA)主链修饰等。这些修饰可以彼此组合使用和/或与磷酸二酯主链连接组合使用。
或者/另外，RNA可以包含其他修饰，包括在碱基或糖部分的修饰。例子包括具有与在3'位置处的羟基以外和在5'位置处的磷酸根基团以外的低分子量有机基团共价附着的糖的RNA(例如2'-O-烷基化核糖)、含有诸如阿拉伯糖的糖而不是核糖的RNA。RNA进一步包括取代的嘌呤和嘧啶，例如C-5丙炔修饰的碱基(Wagner et al.,Nature Biotechnology14:840-844,1996)。其他嘌呤和嘧啶包括但不限于5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤。其他此类修饰是本领域技术人员公知的。
NTP生成途径
本文提供了经由各种不同的酶促途径生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，每种途径利用如本文所述的能源以及反应混合物中的低成本起始材料。在一些实施方案中，通过向反应混合物添加DNA模板和聚合酶，这些酶促途径可以扩展至RNA(例如mRNA或双链RNA)的生成(参见例如图1)。
应当理解，本文中所述的任何途径酶(例如，核酸酶、激酶和/或聚合酶)可以获自未修饰的(天然)或工程化的细胞。在一些实施方案中，途径酶是从细胞分泌的(例如，细胞经工程化改造而分泌酶)。在其他实施方案中，途径酶获自细胞的细胞裂解物。在一些实施方案中，途径酶是细胞的细胞裂解物的成分，在这种情况下，将细胞裂解物添加至生物合成反应中的反应混合物或充当生物合成反应中的反应混合物。在细胞裂解物用于反应混合物或充当反应混合物的情况下，可以在生成感兴趣产物(NTP和/或RNA)之前将细胞裂解物暴露于消除不想要的酶促活性的条件，如下文描述。
NDP至NTP的转化。在一些方面，如图2A中描绘，使用NDP作为底物来生成NTP。例如，NTP生成方法可包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育NDP、(例如1、2、3或4种)多磷酸激酶和(例如1、2、3或4种)多磷酸盐。在一些实施方案中，用于NTP生成的反应混合物包括NDP激酶(参见例如表5)。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物也可包含核苷激酶。
NMP至NTP的转化。在一些方面，如图2B中描绘，使用5’NMP作为底物来生成NTP。例如，NTP生成方法可以包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育5’-NMP、(例如1、2、3或4种)多磷酸激酶和(例如1、2、3或4种)多磷酸盐。在一些实施方案中，用于NTP生成的反应混合物包括NMP激酶(参见例如表4)和/或NDP激酶(参见例如表5)。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物也可包含核苷激酶。
核苷至NTP的转化。在一些方面，如图2C中描绘，使用核苷作为底物生成NTP。例如，NTP生成方法可包括在适合于NTP生成的条件下在反应中温育(例如1、2、3或4种)多磷酸激酶和(例如1、2、3或4种)多磷酸盐。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物还可以包含核苷激酶(参见例如表3)和/或NMP激酶(参见例如表4)和/或NDP激酶(参见例如表5)。
核碱基至NTP的转化。在一些方面，如图2D中描绘，使用核碱基作为底物生成NTP。例如，NTP生成方法可包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育核碱基、(例如1、2、3或4种)磷酸核糖转移酶、磷酸核糖焦磷酸盐、(例如1、2、3或4)多磷酸激酶和(例如1、2、3或4)多磷酸盐。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物还可以包含NMP激酶(参见例如表4)和/或NDP激酶(参见例如表5)。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物也可包含核苷激酶。
在一些实施方案中，通过首先将细胞RNA解聚为NDP或首先将细胞RNA解聚为NMP，用于生成NTP和/或RNA的生物合成途径可以使用细胞RNA作为底物。
核碱基和核糖至NTP的转化。在一些方面，如图2E中描绘，使用核碱基作为底物生成NTP。例如，NTP生成方法可以包括在适合于生成NTP的条件下在反应中温育核碱基、D-核糖、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶、至少一种(例如1、2、3或4种)核苷磷酸化酶、至少一种(例如1、2、3或4种)多磷酸激酶和至少一种(例如1、2、3或4种)多磷酸盐。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物还可包含至少一种NMP激酶(参见例如表3)和/或至少一种NDP激酶(参见例如表4)和/或核苷激酶。
经由NDP将细胞RNA转化为NTP。在一些方面，如图3A中描绘，通过首先将细胞RNA分解(降解/解聚)成NDP，然后将NDP转化成NTP，使用细胞RNA作为底物来生成NTP。例如，NTP生成方法可包括在反应混合物中在适于生成NDP的条件下温育细胞RNA、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)和磷酸盐。为了进行NTP的生成，在一些实施方案中，反应混合物进一步包含多磷酸激酶和多磷酸盐。因此，该方法进一步包括在适合于生成NTP的条件下温育反应混合物。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NDP激酶。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物还可包含核苷激酶。
经由NMP将细胞RNA转化为NTP。在一些方面，如图3B中描绘，通过首先将细胞RNA分解成5’-NMP，然后将NMP转化为NDP并且将NDP转化为NTP，使用细胞RNA作为底物来生成NTP。例如，NTP生成方法可以包括在反应混合物中在适合于生成5’-NMP的条件下温育细胞RNA和核糖核酸酶。为了进行NTP的生成，在一些实施方案中，反应混合物还包含多磷酸激酶和多磷酸盐。因此，该方法进一步包括在适合于生成NTP的条件下温育反应混合物。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NDP激酶。在一些实施方案中，NTP生成反应混合物进一步包含核苷激酶。或者，NTP生成方法可包括在反应混合物中在适合于生成核苷的条件下温育细胞RNA、将RNA切割成3’-NMP的核糖核酸酶和合适的磷酸酶(例如碱性磷酸酶或其他)。然后，在进行NTP的生成之前将消除磷酸酶。
RNA生成途径
如图1所示，可以经由各种不同的酶促途径产生RNA(例如，mRNA或双链RNA)，每种途径利用如本文所述的能源以及反应混合物中的低成本起始材料。因此，本文提供了用于生成RNA的系统、方法、组合物和试剂盒。
NDP至RNA的转化。在一些方面，如图2A所描绘，使用NDP作为底物生成RNA。例如，RNA生成方法可以包括在适合于RNA生成的条件下在反应混合物中温育NDP、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含NDP激酶(参见例如表5)。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含核苷激酶
NMP至RNA的转化。在一些方面，如图2B中描绘，使用5’NMP作为底物生成RNA。例如，RNA生成方法可以包括在反应混合物中在适合于RNA生成的条件下温育5’NMP、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含NMP激酶(参见例如表4)和/或NDP激酶(参见例如表5)。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含核苷激酶。
核苷至RNA的转化。在一些方面，如图2C中描绘，使用核苷作为底物生成RNA。例如，RNA生成方法可包括在适合于生成RNA的条件下在反应混合物中温育核苷、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含核苷激酶(参见例如表3)和/或NMP激酶(参见例如表4)和/或NDP激酶(参见例如表5)。
经由NDP将细胞RNA转化为RNA。在一些方面，如图3A中描绘，通过首先将细胞RNA分解成NDP，使用细胞RNA作为底物来生成RNA。例如，RNA生成方法可包括在反应混合物中在适合于生成NDP的条件下温育细胞RNA、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)和磷酸盐。在进行RNA生成之前，消除PNP酶以避免降解终产物可以是有利的。因此，方法可以进一步包括消除PNP酶，并且在适合于生成RNA的条件下，在反应混合物或第二反应混合物中温育NDP、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NDP激酶。在一些实施方案中，RNA产生反应混合物还可包含核苷激酶。
在一些实施方案中，这些途径酶能够经受住消除条件，如下所讨论，因此，所有反应成分都包含在单一(一步式)反应混合物中。例如，RNA生成方法可以包括(a)在适合于生成NDP的条件下，在反应混合物中温育细胞RNA、PNP酶、磷酸盐、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和聚合酶(任选地，其中反应混合物进一步包含NDP激酶)，(b)消除PNP酶，和(c)在适合于生成RNA的条件下温育反应混合物。
经由NMP将细胞RNA转化为RNA。在一些方面，如图3B中描绘，通过首先将细胞RNA分解成5’NMP，使用细胞RNA作为底物来生成RNA。例如，RNA生成方法可包括在反应混合物中在适合于生成5’NMP的条件下温育细胞RNA和核糖核酸酶。在进行RNA生成之前，消除核糖核酸酶以避免降解终产物可以是有利的。因此，方法可进一步包括消除核糖核酸酶，并在适合于生成RNA的条件下，在反应混合物中或在第二反应混合物中温育5’NMP、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NMP激酶和/或NDP激酶。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含核苷激酶。
在一些实施方案中，这些途径酶能够经受住消除条件，如下所讨论，因此，所有反应成分都包含在单一(一步式)反应混合物中。例如，RNA生成方法可包括(a)在适合于生成NMP的条件下在反应混合物中温育细胞RNA、核糖核酸酶、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和聚合酶(任选地，其中反应混合物进一步包含NMP激酶和/或NDP激酶)，(b)消除核糖核酸酶，和(c)在适合于生成RNA的条件下温育反应混合物。
核碱基至RNA的转化。在一些方面，如图2D中描绘，使用核碱基作为底物生成RNA。例如，RNA生成方法可包括在适合于生成RNA的条件下在反应混合物中温育核碱基、(例如1、2、3或4种)磷酸核糖转移酶、磷酸核糖基焦磷酸盐、多磷酸激酶、多磷酸盐、DNA模板和RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含NMP激酶(参见例如表4)和/或NDP激酶(参见例如表5)。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含核苷激酶。
核碱基和核糖至RNA的转化。在一些方面，如图2E中描绘，使用核碱基作为底物生成RNA。例如，RNA生成方法可包括在适合于生成RNA的条件下在反应混合物中温育核碱基、D-核糖、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶、至少一种(例如1、2、3或4种)核苷磷酸化酶、至少一种多磷酸激酶、至少一种多磷酸盐、至少一种DNA模板和至少一种RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA生成反应混合物还可包含至少一种NMP激酶(参见例如表3)和/或至少一种NDP激酶(参见例如表4)和/或核苷激酶。
酶来源
本文中提供的任何(例如，一种、两种、三种或更多种)途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)可以是由细胞表达的内源(未修饰的)酶或重组酶。在一些实施方案中，以细胞裂解物的成分提供途径酶，其包括在反应混合物中。在一些实施方案中，从反应混合物中包含从细胞裂解物纯化的途径酶。在一些实施方案中，以细胞裂解物的成分提供途径酶，并且从细胞裂解物中纯化途径酶。在一些实施方案中，途径酶是分泌的并且任选地从细胞肉汤中纯化。
在一些实施方案中，途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)是从细胞纯化的内源酶，并且包括作为纯化的酶的反应混合物。在一些实施方案中，途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)是作为包括在反应混合物中的细胞裂解物的成分提供的内源酶。在一些实施方案中，途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)是从细胞纯化的重组酶，并且包括作为纯化的酶的反应混合物。在一些实施方案中，途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)是作为包含在反应混合物中的细胞裂解物的成分提供的重组酶。在一些实施方案中，途径酶是分泌的并且任选地从细胞肉汤中纯化。
本公开内容还涵盖由细胞分泌的内源酶和重组酶。因此，在一些实施方案中，途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)是从细胞分泌的内源酶。在一些实施方案中，途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)是从细胞分泌的重组酶。
消除不想要的酶促活性
在本文提供的各种实施方案中，在用于生成NTP和/或RNA的反应混合物中使用从表达途径酶的细胞或细胞的裂解物制备的酶。在这些细胞或细胞裂解物中，存在可对NTP和/或RNA生成具有有害效应的酶。此类酶的非限制性例子包括磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和/或水解酶，例如由大肠杆菌细胞表达的酶。磷酸酶去除磷酸根基团(例如，将NMP转化为核苷，将NDP转化为NMP或将NTP转化为NDP)，这由于核苷酸磷酸化/去磷酸化的无效循环而降低NTP生成。核酸酶将核酸切割成单体或寡聚物，其导致RNA产物降解(例如，通过RNA酶)和/或DNA模板降解(例如，通过DNA酶)。蛋白酶将蛋白质切割成氨基酸或肽，这降解途径酶。脱氨酶去除氨基基团，这通过将途径中间体转化为无用的底物(例如黄嘌呤和次黄嘌呤)来降低NTP浓度，并可导致RNA产物突变(例如C至U)。水解酶(例如核苷水解酶或核苷酸水解酶)将核苷或核苷酸切割成碱基和糖部分，这由于核苷酸的不可逆降解而降低NTP浓度。氧化还原酶催化电子从一个分子(氧化剂)转移到另一个分子(还原剂)。氧化和/或还原反应可以例如破坏DNA和/或RNA中的核碱基，导致转录和/或翻译错误，或破坏蛋白质或酶，导致功能丧失。
因此，在许多实施方案中消除酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中的这些天然酶促活性或其他不想要的酶促活性是有利的。在本文中，酶促活性的“消除”可以是不想要的酶促活性的部分的(例如，消除至少30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％的活性)或完全的(消除100％的活性)。如本文所讨论的，酶促活性可以通过遗传修饰、条件失活和/或物理分离来消除。也可以使用其他消除方法。不想要的酶促活性可源于至少一种(例如1、2、3、4或5种)天然(内源)酶，包括但不限于磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和/或水解酶。
在一些实施方案中，在酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中消除不想要的磷酸酶活性。在一些实施方案中，在酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中消除不想要的核酸酶活性。在一些实施方案中，在酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中消除不想要的蛋白酶活性。在一些实施方案中，在酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中消除不想要的脱氨酶活性。在一些实施方案中，在酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中消除不想要的水解酶活性。
可以使用遗传、条件或分离方法消除不想要的(例如天然的)酶促活性。在一些实施方案中，使用遗传方法去除不想要的酶促活性。因此，在一些实施方案中，修饰细胞以减少或消除不想要的酶促活性。可以用来减少或消除不想要的酶促活性的遗传方法的例子包括但不限于分泌、基因敲除和蛋白酶靶向。在一些实施方案中，使用条件方法来去除不想要的酶促活性。因此，在一些实施方案中，表现出不想要活性的不想要的酶保留在酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中，并被选择性失活。可用于减少或消除不想要的酶促活性的条件方法的例子包括但不限于温度、pH、盐、去污剂、有机溶剂(例如，醇)的变化以及化学抑制剂的使用。在一些实施方案中，使用分离/纯化方法去除不想要的酶促活性。因此，在一些实施方案中，从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中物理除去表现出不想要的活性的不想要的酶。可用于减少或消除不想要的酶促活性的分离方法的例子包括但不限于沉淀、固定化、过滤和层析。
遗传方法。在一些实施方案中，修饰表达NTP和/或RNA生成途径的酶和/或DNA模板的细胞以减少或消除不想要的酶促活性。在一些实施方案中，从细胞中删除编码表现出不想要的活性的酶的基因。在一些实施方案中，使编码表现出不想要的活性的酶的基因突变，使得所得的基因产物是非功能的。在一些实施方案中，修饰表现出不想要的活性的酶以在其蛋白质序列中包括位点特异性蛋白酶识别序列，使得该酶可以被“靶向”并切割以失活(参见例如美国公开文本号2012/0052547 A1，于2012年3月1日公布；国际公开文本号WO2015/021058 A2，于2015年2月12日公布；和国际公开文本号WO 2012/030980，于2012年3月8日公布，其各自通过引用并入本文)。
含有位点特异性蛋白酶识别序列的酶的切割源自与关联位点特性蛋白酶的接触，所述位点特性蛋白酶在细胞生长阶段(例如，培养工程化细胞)期间在细胞的周质中隔离(与靶酶分离)并在ATP生成阶段期间(例如，在细胞裂解以产生细胞裂解物后)与酶接触。因此，在一些实施方案中，本公开内容的工程化细胞包含(i)编码表现出不想要的活性的酶的工程化核酸，并且在该酶的蛋白质序列中包括位点特异性蛋白酶识别序列，和(ii)编码位点特异性蛋白酶的工程化核酸，所述蛋白酶切割酶的位点特异性蛋白酶识别序列并包括周质靶向序列。此周质靶向序列负责将位点特异性蛋白酶隔离至细胞周质空间，直到将细胞裂解。周质靶向序列的例子是已知的。
可以根据本公开内容使用的蛋白酶的例子包括但不限于丙氨酸羧肽酶、虾红素、细菌亮氨酰氨肽酶、癌促凝血剂、组织蛋白酶B、梭菌蛋白酶，胞质溶胶丙氨酰氨肽酶、弹性蛋白酶、内蛋白酶Brg-C、肠激酶、胃亚蛋白酶(gastricsin)、明胶酶，Gly-X羧肽酶、甘氨酰内肽酶，人鼻病毒3C蛋白酶、hypodermin C、Iga特异性丝氨酸内肽酶、亮氨酰氨肽酶、亮氨酰内肽酶、lysC、溶酶体X羧肽酶原、赖氨酰氨肽酶、甲硫氨酰氨肽酶、粘球菌(myxobacter)、nardilysin、胰内肽酶E、picornain 2B、picornain 3C、内肽酶原(proendopeptidase)、脯氨酰氨肽酶、前蛋白转化酶I、前蛋白转化酶II、russellysin、糖胃蛋白酶(saccharopepsin)、semenogelase，T-纤溶酶原激活物、凝血酶、组织激肽释放酶、烟草蚀刻病毒(TEV)、togavirin、色氨酰氨肽酶、U-纤溶酶原激活物、V8、venombin B、venombin BB和Xaa-氨肽酶原。
条件方法。在一些实施方案中，酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物包含表现出不想要的活性的酶，该酶被选择性失活。在一些实施方案中，通过将酶暴露于消除条件(例如，高温或低温、酸性或碱性pH值、高盐或低盐、去污剂和/或有机溶剂)来选择性使表现出不想要活性的酶失活。
在一些实施方案中，将酶制备物、酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物暴露于暂时或不可逆使表现出不想要活性的酶失活的温度。“温度失活”是指将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物加热或冷却至足以使天然靶酶失活(或至少部分失活)的温度的过程。通常，温度失活的过程涉及有害酶的变性(解折叠)。酶变性的温度在生物体间变化。例如，在大肠杆菌中，酶通常在高于41℃的温度变性。对于其他生物体，变性温度可以高于或低于41℃。如本文提供，可以在0℃至95℃或更高的温度将细胞裂解物的酶进行温度失活。在一些实施方案中，在0-90℃、0-80℃、0-70℃、0-60℃、0-50℃、0-40℃、0-30℃、0-20℃、0-10℃、或0-5℃的温度将细胞裂解物的酶进行温度失活。在一些实施方案中，在5-95℃、10-95℃、20-95℃、30-95℃、40-95℃、50-95℃、60-95℃、70-95℃、80-95℃、或90-95℃的温度将细胞裂解物的酶进行温度失活。例如，可以在约40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、或95℃的温度使细胞裂解物的酶进行温度失活。在一些实施方案中，在50-80℃的温度将细胞裂解物的酶进行温度失活。在一些实施方案中，在约70℃的温度将细胞裂解物的酶进行温度失活。在一些实施方案中，在约60℃的温度将细胞裂解物的酶进行温度失活。
在一些实施方案中，将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物暴露于暂时或不可逆使表现出不想要的活性的酶失活的酸或碱(pH的变化)。“酸或碱失活”是指将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物调节至足以使酶失活(或至少部分失活)的pH的过程。通常，酸或碱失活过程涉及酶的变性(解折叠)。酶变性的pH值在生物体间变化。例如，在大肠杆菌中，天然酶通常在高于7.5或低于6.5的pH变性。变性pH可以高于或低于其他生物体的变性pH。可以在7.5-14或更高的pH将如本文提供的酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行碱失活。在一些实施方案中，在pH 8-14、8.5-14、9-14、9.5-14、10-14、10.5-14、11-14、11.5-14、12-14、12.5-14、13-14、或13.5-14将细胞裂解物的酶进行碱失活。在一些实施方案中，在pH 7.5-13.5、7.5-13、7.5-12.5、7.5-12、7.5-11.5、7.5-11、7.5-10.5、7.5-10、7.5-9.5、7.5-9、7.5-8.5、或7.5-8将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行碱失活。例如，可以在约pH约7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、或14将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行碱失活。可以在6.5-0或更低的pH将如本文所提供的酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行酸失活。在一些实施方案中，在pH 6.5-0.5、6.5-1、6.5-1.5、6.5-2、6.5-2.5、6.5-3、6.5-3.5、6.5-4、6.5-4.5、6.5-5或6.5-6将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行酸失活。在一些实施方案中，在pH6-0、5.5-0、5-0、4.5-0、4-0、3.5-0、3-0、2.5-0、2-0、1.5-0、1-0、或0.5-0将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行酸失活。例如，可以在pH约6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5、或0将酶制备物、细胞裂解液和/或反应混合物的酶进行酸失活。
在一些实施方案中，将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物暴露于暂时或不可逆地使表现出不想要的活性的酶失活的高盐或低盐(盐浓度的变化)。“盐失活”是指将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物调节至足以使酶失活(或部分失活)的盐浓度的过程。通常，盐失活的过程涉及酶的变性(解折叠)。酶变性的盐浓度在生物体中变化。例如，在大肠杆菌中，天然酶通常在高于600mM的盐浓度变性。变性盐浓度可以高于或低于其他生物体的变性盐浓度。盐是阴离子和阳离子的组合。阳离子的非限制性例子包括锂、钠、钾、镁、钙和铵。阴离子的非限制性例子包括乙酸根、氯化物、硫酸根和磷酸根。可以在600-1000mM或更高的盐浓度将如本文所提供的酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。在一些实施方案中，在700-1000mM、750-1000mM、800-1000mM、850-1000mM、900-1000mM、950-1000mM的盐浓度将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。在一些实施方案中，在600-950mM、600-900mM、600-850mM、600-800mM、600-750mM、600-700mM、或600-650mM的盐浓度将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。例如，可以在约600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、850mM、900mM、950mM、或1000mM的盐浓度将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。可以在400-0mM或更低的盐浓度将如本文提供的酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。在一些实施方案中，在350-0mM、300-0mM、250-0mM、200-0mM、150-0mM、100-0mM、或50-0mM的盐浓度将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。在一些实施方案中，在400-50mM、400-100mM、400-150mM、400-200mM、400-250mM、400-300mM、或400-350mM的盐浓度将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。例如，可以在约400mM、350mM、300mM、250mM、200mM、150mM、100mM、50mM、或0mM的盐浓度将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的酶进行盐失活。
在一些实施方案中，将有机溶剂添加至酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中以失活表现出不想要的活性的酶。有机溶剂的非限制性例子包括乙醇、甲醇、醚、二恶烷、丙酮、甲基乙基甲酮、乙腈、二甲基亚砜和甲苯。
在一些实施方案中，将去污剂添加至酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物，以失活表现出不想要的活性的酶。去污剂的非限制性例子包括十二烷基硫酸钠(SDS)、乙基三甲基溴化铵(ETMAB)、月桂基三甲基溴化铵(LTAB)和月桂基三甲基氯化铵(LTAC)。
在一些实施方案中，将化学抑制剂添加至酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物，以失活表现出不想要的活性的酶。化学抑制剂的非限制性例子包括原钒酸钠(蛋白磷酸酪氨酰磷酸酶的抑制剂)、氟化钠(磷酸丝氨酰基和磷酸苏氨酰磷酸酶的抑制剂)、焦磷酸钠(磷酸酶抑制剂)、磷酸钠和/或磷酸钾。在一些实施方案中，化学抑制剂选自化学抑制剂文库。
对于本文中使用的任何条件方法，应当理解，细胞裂解液或反应混合物中存在的任何途径酶也可以暴露于消除条件(例如高温或低温、酸性或碱性pH值、高盐或低盐、洗涤剂和/或有机溶剂)。因此，在一些实施方案中，途径酶(例如，多磷酸激酶、NMP激酶、NDP激酶和/或聚合酶)能经受住消除条件。若酶在暴露于消除条件后仍保留至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)其酶促活性(相对于暴露于失活条件之前的酶促活性)，则认为该酶经受住消除条件。
例如，当将酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物的天然酶进行热失活(例如，暴露于至少40℃或40-95℃的温度，持续至少2分钟或2-60分钟)时，途径酶可以是热稳定性酶。因此，在一些实施方案中，多磷酸激酶、NMP激酶、NDP激酶、核苷激酶、磷酸核糖转移酶、核苷磷酸化酶、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶和聚合酶中的至少一种是热稳定的。若酶(a)在暂时暴露于使天然酶变性的高温后仍保留活性，或(b)在暂时暴露于天然酶以较低速率发挥功能的中等温度至高温后以较高速率发挥功能，则认为该酶(例如激酶或聚合酶)是热稳定的。已知热稳定性酶，并且使用的热稳定性酶的非限制性例子如本文提供。本文还提供了能经受住消除条件的途径酶的其他非限制性例子。
分离方法。在一些实施方案中，从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中物理除去表现出不想要的活性的天然酶。在一些实施方案中，从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中沉淀表现出不想要的活性的酶。在一些实施方案中，从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中过滤表现出不想要的活性的酶(例如，基于大小)。在一些实施方案中，经由捕获和/或层析法(例如，通过对固定相的不同亲和力)从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中除去表现出不想要活性的酶。
在一些实施方案中，经由亲和层析法从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中除去表现出不想要活性的酶。亲和层析的例子包括但不限于蛋白A层析、蛋白G层析、金属结合层析(例如镍层析)、凝集素层析和GST层析。
在一些实施方案中，经由离子交换层析法从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中除去表现出不想要活性的酶。阴离子交换层析法(AEX)的例子包括但不限于二乙基氨基乙基(DEAE)层析、季氨基乙基(QAE)层析法和季胺(Q)层析法。阳离子交换层析的例子包括但不限于羧甲基(CM)层析、磺乙基(SE)层析、磺丙基(SP)层析、磷酸盐(P)层析和磺酸盐(S)层析。
在一些实施方案中，经由疏水相互作用层析(HIC)从酶制备物、细胞裂解物和/或反应混合物中除去表现出不想要活性的酶。疏水相互作用层析的例子包括但不限于苯基Sepharose层析、丁基Sepharose层析、辛基Sepharose层析、Capto苯基层析、Toyopearl丁基层析、Toyopearl苯基层析、Toyopearl己基层析、Toyopearl醚层析和Toyopearl PPG层析。以上详述的任何化学方法可备选用于固定化或捕获途径酶。
热稳定性酶
本文提供的任何途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)可以是热稳定性酶。热稳定性是指在较高或较低温度抵抗变性的酶的性质。例如，如果酶在42℃的温度变性(失活)，则如果具有相似活性(例如激酶活性)的酶在42℃不变性，则认为它是“热稳定的”。
如果酶(a)在暂时暴露于使其他天然酶变性的高温后仍保留活性，或(b)在暂时暴露于天然酶以较低速率发挥功能的中等温度至高温后以较高速率发挥功能，则认为该酶(例如激酶或聚合酶)是热稳定的。
如果酶在暂时暴露于使其他天然酶变性的低温仍保留活性，或(b)在暂时暴露于天然酶以较低速率发挥功能的中等温度至低温后以较高速率发挥功能，则认为该酶(例如激酶或聚合酶)也是热稳定的。
在一些实施方案中，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较高的温度(例如，对于从大肠杆菌获得的激酶高于41℃，对于许多RNA聚合酶高于37℃)之后，热稳定性酶保留大于10％的活性。在一些实施方案中，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较高的温度后，热稳定性酶保留10-100％，25-100％或50-100％的活性。例如，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较高的温度后，热稳定性酶可以保留10-90％、10-85％、10-80％、10-75％、10-70％、10-65％、10-60％、10-55％、25-90％、25-85％、25-80％、25-75％、25-70％、25-65％、25-60％、25-55％、50-90％、50-85％、50-80％、50-75％、50-70％、50-65％、50-60％或50-55％。在一些实施方案中，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较高的温度后，热稳定性酶保留10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的活性。
在一些实施方案中，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较低的温度(例如，对于从大肠杆菌获得的激酶低于32℃，对于许多RNA聚合酶低于32℃)之后，热稳定性酶保留大于50％的活性。在一些实施方案中，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较低的温度后，热稳定性酶保留50-100％的活性。例如，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较低的温度后，热稳定性酶可保留50-90％、50-85％、50-80％、50-75％、50-70％、50-65％、50-60％或50-55％的活性。在一些实施方案中，在暂时暴露于在其它情况下会使相似的(非热稳定的)天然酶变性的相对较低的温度后，热稳定性酶保留25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，在暂时暴露于中等温度至高温(例如42-80℃)之后，热稳定性酶的活性大于相似(非热稳定性)天然酶的活性(例如比它大25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)。
在一些实施方案中，在暂时暴露于中等温度至低温(例如32-0℃)之后，热稳定性酶的活性大于相似(非热稳定性)天然酶的活性(例如比它大25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％)。
例如，热稳定性激酶的活性可以通过该激酶能够磷酸化的NMP或NDP的量来测量。因此，在一些实施方案中，在相对较高温度(例如42℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于50％的NMP转化为NDP，或将大于50％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较高温度(例如42℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于60％的NMP转化为NDP，或将大于60％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较高温度(例如42℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于70％的NMP转化为NDP，或将大于70％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较高温度(例如42℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于80％的NMP转化为NDP，或将大于80％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较高温度(例如42℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于90％的NMP转化为NDP，或将大于90％的NDP转化为NTP。
在一些实施方案中，在相对较低温度(例如32℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于50％的NMP转化为NDP，或将大于50％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较低温度(例如32℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于60％的NMP转化为NDP，或将大于60％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较低温度(例如32℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于70％的NMP转化为NDP，或将大于70％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较低温度(例如32℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于80％的NMP转化为NDP，或将大于80％的NDP转化为NTP。在一些实施方案中，在相对较低温度(例如32℃)，热稳定性激酶在于37℃完成相似转化所需的相同时间量内将大于90％的NMP转化为NDP，或将大于90％的NDP转化为NTP。
例如，基于保真度和聚合动力学(例如，聚合速率)评估热稳定性聚合酶的活性。因此，例如，一个单位的热稳定性T7聚合酶可以在高于37℃的温度(例如50℃)在30分钟内将10nmol的NTP掺入酸不溶性材料中。在另一个例子中，一个单位的热稳定性T7聚合酶可以在低于32℃的温度(例如，在25℃)在30分钟内将10nmol的NTP掺入酸不溶性材料中。
在一些实施方案中，热稳定性酶(例如激酶或聚合酶)可以在42℃至80℃或更高的温度保留活性(能够催化反应)。在一些实施方案中，热稳定性酶在42-80℃、42-70℃、42-60℃、42-50℃、50-80℃、50-70℃、50-60℃、60-80℃、60-70℃或70-80℃的温度保留活性。例如，热稳定性酶可以在42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃的温度保留活性。热稳定性酶可以在相对较高温度保留活性15分钟至48小时或更长。例如，热稳定性酶可以在相对较高温度保留活性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、36、42或48小时。
在一些实施方案中，热稳定性酶(例如激酶或聚合酶)可以在32℃至0℃或更低的温度保留活性(能够催化反应)。在一些实施方案中，热稳定性酶在32-5℃、32-10℃、32-20℃、32-25℃、32-30℃、30-0℃、25-0℃、20-0℃、10-0℃或5-0℃的温度保留活性。例如，热稳定性酶可以在32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃或0℃的温度保留活性。热稳定性酶可以在相对相对较低温度保留活性15分钟至48小时或更长。例如，热稳定性酶可以在相对较低温度保留活性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、36、42或48小时。
表4A-4D中列出了热稳定性NMP激酶的非限制性例子。其他热稳定性激酶包括热稳定性二磷酸核苷激酶(参见例如表5)、热稳定性丙酮酸激酶和热稳定性多磷酸激酶(参见例如表2)。本公开内容涵盖其他热稳定性激酶。
在表6中列出RNA聚合酶的非限制性例子。本公开内容涵盖其他RNA聚合酶，包括热稳定的RNA聚合酶。
可以通过修饰野生型酶来制备热稳定性RNA聚合酶。此类修饰(例如，突变)是已知的。例如，变体热稳定性T7 RNA聚合酶可包括以下点突变中的一种或多种：V426L、A702V、V795I、S430P、F849I、S633P、F880Y、C510R和S767G(EP2377928和EP1261696A1，每篇通过引用并入本文)。在一些实施方案中，变体热稳定性T7 RNA聚合酶包括V426L、A702V和V795I突变。在一些实施方案中，变体热稳定性T7 RNA聚合酶包括S430P、F849I、S633P和F880Y突变。在一些实施方案中，变体热稳定性T7 RNA聚合酶包括F880Y、S430P、F849I、S633P、C510R和S767G突变。在一些实施方案中，变体热稳定性T7 RNA聚合酶包括Y639V、H784G、E593G和V685A突变。在一些实施方案中，变体热稳定性T7 RNA聚合酶包括S430P、N433T、S633P、F849I和F880Y突变。本公开内容涵盖其他变体和重组热稳定性聚合酶。
在一些实施方案中，使用热稳定性T7聚合酶来产生感兴趣RNA。例如，可以使用具有0.1-5％总蛋白浓度的热稳定性T7聚合酶(例如，在37-60℃的温度温育)来以大于1g/L/hr(或例如1g/L/hr–20g/L/hr)的速率合成感兴趣的RNA。
应当理解，尽管本公开内容的许多实施方案描述了热稳定性聚合酶/酶的使用，但是可以使用其他酶/聚合酶。在一些实施方案中，可以将聚合酶外源添加到热失活的细胞裂解物中，例如，以补偿热稳定性酶的活性的任何降低或损失。
融合酶
本文提供的任何途径酶(例如，核酸酶、激酶、聚合酶等)可以是单独的酶、具有多种活性的酶、或融合酶。融合酶可以通过连接两个或更多个编码单独蛋白质的基因或基因片段而创建。此融合基因的翻译产生具有源自每个原始蛋白质的功能特性的单个或多个多肽，例如，作用为核酸酶，作用为激酶和/或作用为聚合酶的融合蛋白。其他酶也可以表达为融合蛋白。
自然界中存在的某些酶是多功能的(例如CMP-UMP激酶)。因此，术语“酶”涵盖“酶促活性”，而不管如何提供它们。
如果酶表现出核酸酶活性(切割或解聚核酸；例如，RNA酶R)，则认为该融合酶“作用为核酸酶”。如果酶表现出激酶活性(催化磷酸根基团从一个分子转移到另一分子；例如，多磷酸激酶)，则认为该融合酶“作用为激酶”。如果酶表现出聚合酶活性(装配核苷酸以产生核酸；例如RNA聚合酶)，则认为该融合酶“作用为聚合酶”。
能量来源
存在有可用于生成NTP和/或RNA的多种能量来源和磷酸盐来源，如本文所提供的。磷酸盐来源的非限制性例子包括NTP(例如，ATP、GTP、UTP、CTP)、多磷酸盐(例如六偏磷酸盐)和焦磷酸盐(PPi)。在一些实施方案中，无论是化学合成的，发酵产物还是从天然来源提取的，在反应混合物中包含NTP以生成RNA。在一些实施方案中，在反应混合物中包含多磷酸盐和多磷酸激酶以生成NTP和/或RNA。在一些实施方案中，在反应混合物中包含乙酸盐、ADP、焦磷酸盐和至少两种乙酸激酶(例如，乙酸激酶(二磷酸盐)EC2.7.2.12和乙酸盐激酶(磷酸化)EC.7.2.1)以生成NTP和/或RNA。在一些实施方案中，在反应混合物中包含柠檬酸、AMP、焦磷酸盐、柠檬酸裂合酶(柠檬酸裂合酶复合物)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)以生成NTP和/或RNA。在一些实施方案中，在反应混合物中包含亚硫酸盐、AMP、焦磷酸盐、腺苷酰硫酸还原酶和硫酸腺苷酰转移酶以生成NTP和/或RNA。本公开内容还涵盖其他能量来源。
在一些实施方案中，能量来源是从焦磷酸盐通过乙酸盐的循环磷酸化，从焦磷酸盐和柠檬酸盐，或从焦磷酸盐和亚硫酸盐产生的ATP。本文描述了从以上途径产生ATP的方法。下表7中提供了ATP生成途径和途径酶的概述。
表7：示例性ATP生成途径和酶的概述
Figure BDA0002524284760000371
通过乙酸磷酸化/去磷酸化循环从焦磷酸盐和ADP生成ATP
本公开内容的一些方面使用用于经由乙酸酯化磷酸化/去磷酸化循环从焦磷酸盐(高能磷酸盐供体)和ADP(最终能量/磷酸盐受体)生成ATP的方法(参见例如图14)。第一乙酸激酶(AcK1；EC 2.7.2.12)使用无机焦磷酸盐(PPi)磷酸化乙酸盐，这生成乙酰磷酸盐和无机磷酸盐(Pi)。然后，乙酰磷酸盐被第二乙酸激酶(AcK2；EC 2.7.2.1)去磷酸化，该激酶将高能磷酸根基团从乙酰磷酸盐转移到ADP并生成ATP和乙酸盐。然后，将所得乙酸盐是游离的，再次被AcK1磷酸化，从而完成反应循环。
在一些实施方案中，从焦磷酸盐和ADP生成ATP的方法包括培养经工程化改造以表达第一乙酸激酶、第二乙酸激酶或两种不同乙酸激酶的细胞。在一些实施方案中，该方法包括培养经工程化改造以表达第一乙酸激酶和第二乙酸激酶的细胞。在一些实施方案中，将第一乙酸激酶和第二乙酸激酶表达为单一融合(嵌合)蛋白。
在一些实施方案中，至少一种酶是热稳定性酶。在一些实施方案中，至少两种酶是热稳定性酶。在一些实施方案中，所有酶都是热稳定性酶。因此，在一些实施方案中，该方法包括培养经工程化改造以表达热稳定性乙酸激酶的细胞。在其他实施方案中，该方法包括培养经工程化改造以表达第一热稳定性乙酸激酶和第二热稳定性乙酸激酶的细胞。
在一些实施方案中，经由乙酸盐的循环磷酸化从焦磷酸盐生成ATP的方法包括裂解(例如，热、渗透、机械(例如，超声处理)、化学或酶促裂解)培养的细胞以产生至少一种(例如，至少两种)细胞裂解物。应当理解的是，如所提供的，可以在酶促反应中使用多种细胞裂解物(因此，例如来自同一生物体(例如细菌)或来自不同生物体(例如细菌、酵母和/或植物)的多个细胞群体)。例如，一个细胞群体可以经工程化改造以表达ATP生成途径的第一乙酸激酶，而另一个细胞群体可以经工程化改造以表达ATP生成途径的第二乙酸激酶。因此，在一些实施方案中，方法包括培养经工程化改造以表达乙酸激酶的细胞群体，和/或培养经工程化改造以表达至少一种另外的乙酸激酶的细胞群体。在细胞裂解后，将细胞裂解物组合以使酶在单一细胞裂解物/反应混合物中存在。
在一些实施方案中，经由乙酸盐的循环磷酸化由焦磷酸盐生成ATP的方法进一步包括将细胞裂解物(或细胞裂解物混合物)加热至使天然酶促活性失活但不使ATP生成途径的任何热稳定性酶失活的温度，以产生热失活的裂解物。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热到至少50℃的温度。例如，可以将细胞裂解物加热到至少55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、8℃C、8℃C或90℃的温度。在一些实施方案中，当天然酶(或其他非热稳定性酶)的活性水平降低至少50％时，认为它是无活性的。在一些实施方案中，当天然酶(或其他非恒温酶)的活性水平降低至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，则认为它是无活性的。
可以将细胞裂解物加热足以使细胞的天然酶(或其他非热稳定性酶)失活的时间段。例如，可以将细胞裂解物加热至少2、3、4或至少5分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热长于5分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热长于15分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热少于2分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热足以使天然酶(或其他非温稳定性酶)的活性降低至少50％(例如，至少60％、70％、80％或90％)的时间段。
在热失活之后，在一些实施方案中，可以将至少一种(例如，至少两种或至少三种)纯化的酶添加到细胞裂解物/反应混合物中。因此，在一些实施方案中，反应混合物可以包含存在于细胞裂解物中的酶(由工程化宿主细胞表达)和至少一种纯化的酶的组合。至少一种纯化的酶可以是第一乙酸激酶和/或第二乙酸激酶。在一些实施方案中，在添加纯化的酶之前，可以在热失活步骤之后将细胞裂解物冷却(例如，至50℃)。
在一些实施方案中，经由乙酸盐的循环磷酸化从焦磷酸盐生成ATP的方法还包括在存在乙酸盐、二磷酸腺苷(ADP)和无机磷酸盐的情况下温育热失活的裂解物以生成ATP。无机磷酸盐可以是例如焦磷酸盐。可以使用其他无机磷酸盐和/或正磷酸盐聚合物，包括但不限于三多磷酸盐、四多磷酸盐、五多磷酸盐、六偏磷酸盐及其混合物。
本文还包括用于经由乙酸盐的循环磷酸化从焦磷酸盐生成ATP的细胞和细胞裂解物。因此，本公开内容的工程化细胞(例如细菌细胞、酵母细胞和/或植物细胞)或细胞裂解物可包含至少一种(例如至少两种)乙酸激酶。在一些实施方案中，本公开内容的工程化细胞(例如细菌细胞、酵母细胞和/或植物细胞)或细胞裂解物包含至少一种(例如至少两种)热稳定性乙酸激酶。
表8：示例性乙酸激酶
Figure BDA0002524284760000391
从焦磷酸盐、AMP和柠檬酸盐生成ATP
本公开内容的一些方面使用从焦磷酸盐、AMP和柠檬酸盐生成ATP的方法(参见例如图15A-15B)。图15A中显示了三步酶促途径。在第一步中，柠檬酸裂合酶将柠檬酸盐转化为乙酸盐和草乙酸盐。在第二步中，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)将第一步中生成的焦磷酸盐和草乙酸盐转化为磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)、二氧化碳(CO2)和无机磷酸盐(Pi)。在第三步中，丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)将第二步中生成的无机焦磷酸盐(PPi)、AMP和PEP转化为丙酮酸盐、Pi和ATP。组合的化学反应使用1摩尔柠檬酸盐、1摩尔AMP和2摩尔PPi以产生1摩尔乙酸盐、1摩尔丙酮酸盐、1摩尔CO2、2摩尔Pi和1摩尔ATP(图15B)。或者，可以使用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)催化PEP羧化为草乙酸盐，其在某些条件下可以是可逆的。
在一些实施方案中，这些方法包括培养经工程化改造以表达柠檬酸裂合酶、PEPCK(或至少一种PEPC)、PPDK或至少两种或至少三种前述酶的组合的细胞。在一些实施方案中，将柠檬酸裂合酶和PEPCK(或PEPC)、PEPCK(或PEPC)和PPDK、或柠檬酸裂合酶和PPDK表达为单一融合(嵌合)蛋白。
在一些实施方案中，至少一种酶是热稳定性酶。在一些实施方案中，至少两种或至少三种酶是热稳定性酶。在一些实施方案中，所有酶都是热稳定性酶。因此，在一些实施方案中，方法包括培养经工程化改造以表达热稳定性柠檬酸裂合酶、热稳定性PEPCK、PPDK或至少两种或至少三种前述热稳定性酶的组合的细胞。
在一些实施方案中，从柠檬酸盐生成ATP的方法包括裂解(例如，热、渗透、机械(例如，超声处理)、化学或酶促裂解)培养的细胞以产生至少一种(例如，至少两种或三种)细胞裂解物。应当理解，如本文中提供，多种细胞裂解物(因此，例如来自同一生物体(例如，细菌)或来自不同生物体(例如，细菌、酵母和/或植物细胞)的多个细胞群体)可用于酶促反应。例如，一个细胞群体可以经工程化改造以表达ATP生成途径的一种或多种酶，而另一个细胞群体(或几种其他细胞群体)可以经工程化改造以表达ATP生成途径的另一种(至少一种)酶。因此，在一些实施方案中，该方法包括培养经工程化改造以表达柠檬酸裂合酶的细胞群体，培养经工程化改造以表达PEPCK(热稳定性PEPCK)的细胞群体，和/或培养经工程化改造以表达PEPCK的细胞群体。细胞裂解后，组合细胞裂解物，使得酶存在于单一细胞裂解物/反应混合物中。
在一些实施方案中，从柠檬酸盐生成ATP的方法进一步包括将细胞裂解物(或细胞裂解物混合物)加热至使天然酶促活性失活但不使ATP生成途径的任何热稳定性酶失活的温度，以产生热失活的裂解物。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热到至少50℃的温度。例如，可以将细胞裂解物加热到至少55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃的温度。在一些实施方案中，当天然酶(或其他非热稳定性酶)的活性水平降低至少50％时，认为它是无活性的。在一些实施方案中，当天然酶(或其他非热稳定性酶)的活性水平降低至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，认为它是无活性的。
可以将细胞裂解物加热足以使细胞的天然酶(或其他非热稳定性酶)失活的时间段。例如，可以将细胞裂解物加热至少2、3、4或至少5分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热长于5分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热足以使天然酶(或其他非热稳定性酶)的活性降低至少50％(例如，至少60％、70％、80％、或90％)的时间段。
在热失活之后，在一些实施方案中，可以将至少一种(例如，至少两种或至少三种)纯化的酶添加到细胞裂解物/反应混合物中。因此，在一些实施方案中，反应混合物可以包含存在于细胞裂解物中的酶(由工程化宿主细胞表达)和至少一种纯化的酶的组合。至少一种纯化的酶可以选自柠檬酸裂合酶、PEPCK(或PEPC)和PPDK。在一些实施方案中，在添加纯化的酶之前，可以在热失活步骤之后将细胞裂解物冷却(例如，至50℃)。
在一些实施方案中，从柠檬酸盐生成ATP的方法还包括在存在柠檬酸盐、单磷酸腺苷(AMP)和无机磷酸盐的存在下温育热失活的裂解物以产生ATP。无机磷酸盐可以是例如焦磷酸盐。可以使用其他无机磷酸盐和/或正磷酸盐聚合物，包括但不限于三多磷酸盐、四多磷酸盐、五多磷酸盐、六偏磷酸盐及其混合物。
本文还包括用于从柠檬酸盐生成ATP的细胞和细胞裂解物。因此，本公开内容的工程化细胞(例如细菌细胞、酵母细胞和/或植物细胞)或细胞裂解物可以包含选自下组的至少一种(例如，至少两种或至少三种)酶：柠檬酸裂合酶、PEPCK(或PEPC)和PPDK。在一些实施方案中，本公开内容的工程化细胞(例如细菌细胞、酵母细胞和/或植物细胞)或细胞裂解物包括选自下组的至少一种(例如，至少两种或至少三种)酶：热稳定性柠檬酸裂合酶、热稳定性PEPCK(或热稳定性PEPC)和热稳定性PPDK。
表9.从焦磷酸盐和柠檬酸盐途径酶的示例性ATP生成
Figure BDA0002524284760000421
从焦磷酸盐、AMP和亚硫酸盐的ATP生成
本公开内容的一些方面使用用于从焦磷酸盐、AMP和亚硫酸盐生成ATP的方法(参见例如图16)。在第一步中，腺苷酰硫酸还原酶在消耗亚硫酸盐的情况下将单磷酸腺苷(AMP)转化为5'-磷酸硫酸腺苷(APS)。在第二步中，硫酸腺苷酰转移酶在ATP生成和焦磷酸盐消耗的情况下催化APS向硫酸盐的转化。
在一些实施方案中，从焦磷酸盐、AMP和亚硫酸盐生成ATP的方法包括培养经工程化改造以表达腺苷酰硫酸还原酶、硫酸腺苷酰转移酶或腺苷酰硫酸还原酶和硫酸腺苷酰转移酶的组合的细胞。在一些实施方案中，将腺苷酰硫酸还原酶和硫酸腺苷酰转移酶表达为单一融合(嵌合)蛋白或双功能性蛋白。
在一些实施方案中，可以添加充当电子冷阱(electron sink)的还原剂。此类还原剂的例子包括但不限于以下：二硫苏糖醇(DTT)或谷胱甘肽或铁氰化物或二硫赤藓糖醇或三-2-羧基乙基膦盐酸盐(TCEP)。尽管个别酶在其辅因子偏好上会有所不同，但是可以存在如下的情况，其中酶可以使用生物辅因子诸如NAD+、NADP+、NADH或NADPH来吸收这些电子。在这些情况下，也可以包括诸如这些的辅因子。
在一些实施方案中，至少一种酶是热稳定性酶。在一些实施方案中，至少两种酶是热稳定性酶。在一些实施方案中，所有酶都是热稳定性酶。因此，在一些实施方案中，方法包括培养经工程化改造以表达热稳定性腺苷酰硫酸还原酶和热稳定性硫酸腺苷酰转移酶的细胞。
在一些实施方案中，从亚硫酸盐生成ATP的方法包括裂解(例如，热、渗透、机械(例如，超声处理)、化学或酶促裂解)培养的细胞以生成至少一种(例如2、3、4或5)细胞裂解物。应当理解，多种细胞裂解物(因此，例如来自同一生物体(例如，细菌)或来自不同生物体(例如，细菌、酵母和/或植物)的多个细胞群体可用于酶促反应，如本文中提供。例如，一个细胞群体可以经工程化改造以表达腺苷酰硫酸还原酶，而另一个细胞群(或几个其他细胞群体)可以经工程化改造以表达硫酸腺苷酰转移酶。因此，在一些实施方案中，方法包括培养经工程化改造以表达腺苷酰硫酸还原酶的细胞群体，和/或培养经工程化改造以表达硫酸腺苷酰转移酶的细胞群体。细胞裂解后，组合细胞裂解物，使得酶存在于单一细胞裂解物/反应混合物中。
在一些实施方案中，从亚硫酸盐生成ATP的方法还包括将一种或多种细胞裂解物(或细胞裂解物混合物)加热至使天然酶促活性失活但不使ATP生成途径的任何热稳定性酶失活的温度，以产生热失活的裂解物。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热到至少50℃的温度。例如，可以将细胞裂解物加热到至少55℃、60℃、65℃、00℃、75℃、80℃、85℃或90℃的温度。在一些实施方案中，当天然酶(或其他非热稳定性酶)的活性水平降低至少50％时，认为它是无活性的。在一些实施方案中，当天然酶(或其他非热稳定性酶)的活性水平降低至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％时，则认为它是无活性的。
可以将一种或多种细胞裂解物加热足以使细胞的天然酶(或其他非热稳定性酶)失活的时间段。例如，可以将细胞裂解物加热至少2、3、4或至少5分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热长于5分钟。在一些实施方案中，将细胞裂解物加热足以使天然酶(或其他非热稳定性酶)的活性降低至少50％(例如，至少60％、70％、80％、或90％)的时间段。
在热失活之后，在一些实施方案中，可以将至少一种(例如，至少两种或至少三种)纯化的酶添加到细胞裂解物/反应混合物。因此，在一些实施方案中，反应混合物可以包括细胞裂解物、存在于细胞裂解物中的酶(由工程化宿主细胞表达)和至少一种纯化的酶的组合。至少一种纯化的酶可以是第一乙酸激酶和/或第二乙酸激酶。在一些实施方案中，在添加纯化的酶之前，可以在热失活步骤之后将细胞裂解物冷却(例如，至50℃)。
在一些实施方案中，从亚硫酸盐生成ATP的方法还包括在存在亚硫酸盐、单磷酸腺苷(AMP)和无机磷酸盐的情况下温育热失活的裂解物以生成ATP。例如，无机磷酸盐可以是焦磷酸盐。可以使用其他无机磷酸盐和/或正磷酸盐聚合物，包括但不限于三多磷酸盐、四多磷酸盐、五多磷酸盐、六偏磷酸盐及其混合物。
本文还涵盖用于生成ATP的细胞和细胞裂解物。因此，本公开内容的工程化细胞(例如细菌细胞、酵母细胞和/或植物细胞)或细胞裂解物可以包含至少一种(例如至少两种)腺苷酰硫酸还原酶和/或至少一种硫酸腺苷酰转移酶。在一些实施方案中，本公开内容的工程化细胞(例如细菌细胞、酵母细胞和/或植物细胞)或细胞裂解物包含至少一种(例如至少两种、至少三种或至少四种)热稳定性腺苷酰硫酸还原酶和/或至少一种热稳定性硫酸腺苷酰转移酶。
表10.从焦磷酸盐、AMP和亚硫酸盐途径酶的示例性ATP生成
Figure BDA0002524284760000451
细胞RNA解聚
在一些实施方案中，细胞RNA充当生成NTP和/或RNA的底物。细胞RNA的解聚(降解)产生合并物，其包含二磷酸核苷(NDPs)或5’-单磷酸核苷(5’-NMP)，取决于用于解聚的酶。
在一些实施方案中，使用例如多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)将细胞RNA解聚为NDP(参见例如表1)。在一些实施方案中，在反应混合物中使用的PNP酶的浓度是0.001-10mg/mL(例如0.001,0.01,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,5,或10mg/mL)。在一些实施方案中，反应混合物中PNP酶的浓度为0.5-5mg/mL。在一些实施方案中，反应混合物中PNP酶的浓度为5mg/mL。在一些实施方案中，反应混合物中PNP酶的浓度大于10mg/mL。
在其他实施方案中，使用例如核酸酶(例如，RNA酶R或P1核酸酶)将细胞RNA解聚为NMP(参见例如表1)。取决于酶，RNA的酶促解聚可以产生3’-NMP、5’-NMP或3’-NMP和5’-NMP的组合。由于不可能聚合3’-NTP(从3’-NDP转化，所述3’-NDP从3’-NMP转化)，产生5’-NMP(其然后转化为5’-NDP，然后转化为5’-NTP)的酶(例如RNA酶R和/或P1核酸酶)是优选的。在一些实施方案中，在反应混合物中使用的核酸酶(例如，RNA酶R和/或P1核酸酶)的浓度为0.001-10mg/mL(例如，0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、5或10mg/mL)。在一些实施方案中，反应混合物中核酸酶的浓度为0.0.5-5mg/mL。在一些实施方案中，反应混合物中核酸酶的浓度为5mg/mL。在一些实施方案中，反应混合物中核酸酶的浓度大于10mg/mL。
在一些实施方案中，PNP酶和/或RNA酶获自表达PNP酶和/或RNA酶的细胞的细胞裂解物或是表达PNP酶和/或RNA酶的细胞的细胞裂解物的成分。
合成感兴趣的RNA产物所需的细胞RNA的量可以例如随RNA产物的期望长度和产率以及相对于细胞RNA起始材料的核苷酸组成的RNA产物的核苷酸组成而变化。通常，例如对于细菌细胞或酵母细胞，细胞RNA含量范围为总细胞质量的5-50％。例如，可以使用以下等式计算总细胞质量的百分比：(RNA千克(kg)/干细胞重量千克)x 100％。
适合于生成NMP的条件和适合于生成NDP的条件是本领域已知的，或者可以由本领域普通技术人员考虑例如核酸酶(例如RNA酶)活性的最佳条件来确定，所述最佳条件包括pH值(例如pH值3-8)、温度(例如15℃至70℃)、时间长度(例如5分钟至72小时)和盐浓度(例如浓度5mM至1M的氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾)以及任何外源辅因子。在一些实施方案中，例如将缓冲剂添加至细胞裂解物，以实现特定的pH值和/或盐浓度。缓冲剂的例子包括但不限于磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、MOPS缓冲剂、HEPES缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、苹果酸缓冲剂、MES缓冲剂、组氨酸缓冲剂、PIPES缓冲剂、bis-tris缓冲剂和乙醇胺缓冲剂。
在一些实施方案中，将RNA解聚反应期间的反应混合物在37℃的温度温育24小时。在一些实施方案中，将RNA解聚反应期间的反应混合物在37℃的温度温育5-30分钟。在一些实施方案中，RNA解聚反应期间的反应混合物具有7.0的pH，并在37℃的温度温育15分钟。在一些实施方案中，RNA解聚反应期间的反应混合物可以在导致RNA至NDP或RNA至5’-NMP的大于65％转化的条件下温育。在一些实施方案中，RNA以(或至少)50mM/hr、100mM/hr或200mM/hr的速率转化为NDP或5’-NMP。在其他实施方案中，如实施例5中，将RNA解聚反应期间的反应混合物在较高温度(例如50℃-70℃)温育。
RNA产物的聚合
在一些实施方案中，在生物合成途径中使用通过本文提供的方法产生或从商业来源提供的NTP以生成感兴趣RNA产物。设计为编码RNA产物的DNA充当RNA合成的模板。在某些情况下，可以对DNA模板进行工程化改造以具有选择性驱动感兴趣RNA转录的转录启动子。RNA的聚合需要NTP、包含转录启动子的DNA模板和对转录启动子特异性的聚合酶(例如RNA聚合酶)。通常，如本文提供的使用的聚合酶是单一亚基聚合酶，对其关联转录启动子是高度选择性的，具有高保真度并且是高效的。
在一些实施方案中，反应混合物中DNA模板的浓度为0.001-10μg/μl。在一些实施方案中，反应混合物中DNA模板的浓度为0.001μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl、0.5μg/μl、1.0μg/μl、5μg/μl或10μg/μl。
适合于生成RNA的条件是本领域已知的，或者可以由本领域普通技术人员考虑例如聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)活性的最佳条件来确定，所述最佳条件包括pH值(例如pH值3-8)、温度(例如15℃至70℃)、时间长度(例如5分钟至72小时)和盐浓度(例如浓度5mM至1M的氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾)以及任何外源辅因子。在一些实施方案中，例如将缓冲剂添加至细胞裂解物，以实现特定的pH值和/或盐浓度。缓冲剂的例子包括但不限于磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、MOPS缓冲剂、HEPES缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、苹果酸缓冲剂、MES缓冲剂、组氨酸缓冲剂、PIPES缓冲剂、bis-tris缓冲剂和乙醇胺缓冲剂。
在一些实施方案中，将RNA聚合反应期间的反应混合物在37℃的温度温育0.5-24小时。在一些实施方案中，将RNA聚合反应期间的反应混合物在50℃的温度温育0.5-24小时。
细胞和细胞裂解物
在一些实施方案中，本公开内容的细胞表达细胞RNA、使RNA解聚的酶(例如RNA酶)、途径酶(例如重组酶如多磷酸激酶)和/或聚合酶(例如RNA聚合酶)。在一些实施方案中，工程化细胞包含DNA模板，所述DNA模板含有与编码感兴趣RNA产物的核苷酸序列可操作连接的启动子和任选地转录终止子。
在一些实施方案中，细胞是工程化细胞。工程化细胞是包含工程化(例如，重组或合成)核酸的细胞，或者以其他方式被修饰使得它们在结构上和/或功能上与其天然存在的对应物不同的细胞。因此，认为含有工程化核酸的细胞是“工程化细胞”。
如果在细胞中产生由核酸(例如，工程化核酸)编码的产物，则细胞“表达”产物。在本领域中已知基因表达是指使用核酸形式的遗传指令来合成产物，例如蛋白质(例如，酶)的过程。
细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或其他类型的细胞。
本公开内容的工程化细菌细胞包括但不限于埃希氏菌属种(Escherichia spp.)、链霉菌属种(Streptomyces spp.)、Zymonas属种、醋杆菌属种(Acetobacter spp.)、柠檬酸杆菌属种(Citrobacter spp.)、集胞藻属种(Synechocystis spp.)、根瘤菌属种(Rhizobium spp.)、梭菌属种(Clostridium spp.)、棒状杆菌属种(Corynebacteriumspp.)、链球菌属种(Streptococcus spp.)，黄单胞菌属种(Xanthomonas spp.)、乳杆菌属种(Lactobacillus spp.)、乳杆菌属种(Lactococcus spp.)、芽孢杆菌属种(Bacillusspp.)、产碱杆菌属种(Alcaligenes spp.)、假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)、气单胞菌属种(Aeromonas spp.)、固氮菌属种(Azotobacter spp.)、丛毛平胞菌属种(Comamonasspp.)、分枝杆菌属种(Mycobacterium spp.)、红球菌属种(Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌属种(Gluconobacter spp.)、罗尔斯通氏菌属种(Ralstonia spp.)、酸硫杆状菌属种(Acidithiobacillus spp.)、小月菌属种(Microlunatus spp.)、地杆菌属种(Geobacterspp.)、土芽孢杆菌属种(Geobacillus spp.)、节杆菌属种(Arthrobacter spp.)、黄杆菌属种(Flavobacterium spp.)、沙雷菌属种(Serratia spp.)、糖多孢菌属种(Saccharopolyspora spp.)、栖热菌属种(Thermus spp.)、狭长平胞属种(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌属种(Chromobacterium spp.)、大豆根瘤菌属种(Sinorhizobium spp.)、糖多孢菌属种(Saccharopolyspora spp.)、土壤杆菌属种(Agrobacterium spp.)、泛菌属种(Pantoea spp.)和产钠弧菌。
本公开内容的工程化酵母细胞包括但不限于工程化酵母属种(Saccharomycesspp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。
在一些实施方案中，本公开内容的工程化细胞是大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)细胞或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)细胞。在一些实施方案中，本公开内容的工程化细胞是大肠杆菌细胞。
通常，培养工程化细胞。培养是指细胞在受控条件下，通常在其自然环境之外培养的过程。例如，细胞如细菌细胞可以作为液体营养肉汤，也称为液体培养基中的细胞悬浮液培养。
常用的细菌大肠杆菌生长培养基的例子包括但不限于LB(溶源性肉汤)Miller肉汤(1％NaCl)：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl；LB(溶源性肉汤)Lennox肉汤(0.5％NaCl)：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％NaCl；SOB培养基(Super Optimal Broth)：2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4；SOC培养基(具有分解代谢阻遏物的Super Optimal Broth)：SOB+20mM葡萄糖；2x YT肉汤(2x酵母提取物和胰蛋白胨)：1.6％蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％NaCl；TB(Terrific Broth)培养基：1.2％蛋白胨、2.4％酵母提取物、72mM K2HPO4、17mM KH2PO4和0.4％甘油；和SB(SuperBroth)培养基：3.2％蛋白胨、2％酵母提取物和0.5％NaCl和/或Korz培养基(Korz，DJ等人，1995)。
高密度细菌大肠杆菌生长培养基的例子包括但不限于DNAGroTM培养基、ProGroTM培养基、AutoXTM培养基、DetoXTM培养基、InduXTM培养基、和SecProTM培养基。
在一些实施方案中，在导致酶或核酸表达的条件下培养细胞。此种培养条件可取决于所表达的特定产物和期望的产物量。
在一些实施方案中，细胞在30℃至40℃的温度培养。例如，工程化细胞可以在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃的温度培养。通常，细胞如工程化的大肠杆菌在37℃的温度培养。
在一些实施方案中，将细胞培养12小时至72小时或更长的时间段。例如，可以将工程化细胞培养12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时的时间段。通常，将细胞如工程化细菌细胞培养12至24小时的时间段。在一些实施方案中，将细胞在37℃的温度培养12至24小时。
在一些实施方案中，将细胞培养(例如，在液体细胞培养基中)到5至200的在600nm波长测量的光密度(OD600)。在一些实施方案中，将细胞培养至5、10、15、20、25、50、75、100、150或200的OD600。
在一些实施方案中，将细胞培养至1x 108(OD600<1)至2x 1011(OD～200)个活细胞/ml细胞培养基的密度。在一些实施方案中，将细胞培养至1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、5x108、6x 108、7x 108、8x 108、9x 108、1x 109、2x 109、3x 109、4x 109、5x 109、6x 109、7x 109、8x 109、9x 109、1x 1010、2x 1010、3x 1010、4x 1010、5x 1010、6x 1010、7x 1010、8x 1010、9x1010、1x 1011或2x 1011个活细胞/ml的密度(转换因子：OD 1＝8x 108个细胞/ml)。
在一些实施方案中，在生物反应器中培养细胞。生物反应器简单地指培养细胞的容器，例如培养瓶、皿或可以是一次使用(一次性)、可高压灭菌或可灭菌的袋。生物反应器可以由玻璃制成，或者它可以是基于聚合物的，或者它可以由其他材料制成。
生物反应器的例子包括但不限于搅拌罐(例如，良好混合的)生物反应器和管状(例如，活塞流)生物反应器、空气提升生物反应器、膜搅拌罐、旋转过滤搅拌槽、振动混合器(vibromixer)、流化床反应器和膜生物反应器。操作生物反应器的方式可以是分批或连续过程，并且将取决于所培养的工程化细胞。当连续补料并且从系统取出进料和产物流时，生物反应器是连续的。分批生物反应器可以具有连续的再循环流动，但是无营养物或产物收获物的连续补料。对于间歇-收获和补料-分批(或分批补料)培养物，将细胞以较低的活细胞密度在培养基中接种，所述培养基在组成上类似于分批培养基。允许细胞在基本上没有外部操作的情况下指数生长，直到营养物略微消减并且细胞接近稳定的生长期。在此点时，对于间歇收获分批-补料过程，可以收获细胞和产物的部分，并用新鲜培养基补充取出的培养基。可以将此过程重复几次。为了生成重组蛋白和抗体，可以使用补料-分批方法。虽然细胞以指数生长，但营养物在消减，连续或间歇地添加浓缩的补料培养基(例如，10-15倍浓缩的基础培养基)以提供额外的营养物，允许细胞浓度和生产阶段长度的进一步增加。可以在不取出培养基(肉汤)的情况下与细胞浓度成比例添加新鲜培养基。为了容纳培养基添加，以比生物反应器的全容量(例如，最大体积的约40％至50％)低得多的体积开始补料分批培养。
本公开内容的一些方法涉及RNA(例如mRNA)的大规模(商业规模)生产。对于大规模生产方法，细胞可以在5升(L)至250,000L或更多体积的液体培养基中培养。在一些实施方案中，细胞可以在大于(或等于)10L、100L、1000L、10000L或100000L的体积的液体培养基中培养。在一些实施方案中，细胞在5L、10L、15L、20L、25L、30L、35L、40L、45L、50L、100L、500L、1000L、5000L、10000L、100000L、150000L、200000L、250000L或更多体积的液体培养基中培养。在一些实施方案中，细胞可以在5L至10L、5L至15L、5L至20L、5L至25L、5L至30L、5L至35L、5L至40L、5L至45L、10L至15L、10L至20L、10L至25L、20L至30L、10L至35L、10L至40L、10L至45L、10L至50L、15L至20L、15L至25L、15L至30L、15L至35L、15L至40L、15L至45L、or 15至50L的体积的液体培养基中培养。在一些实施方案中，细胞可以在100L至300000L，100L至200000L，或100L至100000L的体积的液体培养基中培养。
通常，培养细胞之后裂解细胞。裂解是指通过例如病毒、加热、化学、酶促、机械或渗透机制破坏细胞的过程。细胞裂解物是指含有裂解细胞(例如裂解的工程化细胞)内容物的流体，所述内容物包括例如细胞器、膜脂、蛋白质、核酸和倒置膜囊泡。如本文提供的，可以通过裂解任何工程化细胞群体来产生本公开内容的细胞裂解物。
细胞裂解可以干扰仔细控制的细胞环境，导致蛋白质降解和通过不受调节的内源蛋白酶和磷酸酶的修饰。因此，在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂和/或核酸酶抑制剂和/或水解酶抑制剂和/或脱氨酶抑制剂可以在裂解前添加到细胞裂解物或细胞，或者可以通过热失活、基因失活或蛋白酶靶向除去这些活性。
在一些实施方案中，细胞裂解物可以与营养物组合。例如，细胞裂解物可以与Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4、CaCl2组合。其他营养素的实例包括但不限于硫酸镁、氯化镁、乳清酸镁、柠檬酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、硫酸铵、氯化铵和氢氧化铵。
在一些实施方案中，细胞裂解物可以与至少一种辅因子组合。例如，细胞裂解物可以与二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或酶活性所需的其他非蛋白质化合物(例如无机离子和辅酶)组合。
用于单个反应的细胞裂解物的体积可以变化。在一些实施方案中，细胞裂解物的体积为0.001至250m3。
核酸
术语“核酸”指共价连接在一起的至少两个核苷酸，并且在一些情况下可以含有磷酸二酯键(例如，磷酸二酯“主链”)。核酸(例如，核酸的组分或部分)可以是天然存在的或工程化的。“天然存在的”核酸存在于自然界中在没有人为干预的情况下存在的细胞中。“工程化核酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”指通过连接核酸分子(例如，来自相同物种或来自不同物种)构建并且通常可以在活细胞中复制的分子。“合成核酸”指以生物合成，以化学方式或通过其它手段合成或扩增的分子。合成核酸包括以化学方式或以其它方式修饰但可与天然存在的核酸分子碱基配对的那些分子。重组和合成核酸还包括由前述任一种的复制产生的那些分子。工程化核酸可以含有天然存在的核酸的部分，但是作为整体，工程化核酸不天然存在并且需要人为干预。在一些实施方案中，编码本公开内容的产物的核酸是重组核酸或合成核酸。在其它实施方案中，编码产物的核酸是天然存在的。
如本文提供的，编码RNA的工程化核酸可以与启动子可操作地连接，所述启动子是核酸的控制区，在该控制区处控制核酸的剩余部分的转录起始和速率。启动子驱动其调节的核酸的表达或驱动该核酸的转录。
启动子可以是与基因或序列天然相关的启动子，其可以通过分离位于给定基因或序列的编码区段上游的5'非编码序列而获得。此类启动子可称为内源的。
在一些实施方案中，编码核酸序列可以位于重组或异源启动子的控制下，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与编码序列相关的启动子。此类启动子可包括其他基因的启动子；从任何其他细胞分离的启动子；和非“天然存在”的合成启动子或增强子，诸如例如含有不同转录调节区的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法得到的改变表达的突变的那些。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括聚合酶链式反应(PCR)产生序列。
当启动子相对于其调节的核苷酸序列处于正确功能位置和取向以控制(“驱动”)该核苷酸序列的转录起始和/或表达时，认为启动子与核苷酸序列是可操作连接的。
本公开内容的工程化核酸可含有组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子或诱导型启动子与编码序列和任选地一种或多种转录终止子可操作连接。在一些实施方案中，编码序列编码蛋白质或RNA产物。“组成型启动子”是指在细胞中始终有活性的启动子。“诱导型启动子”是指当在诱导剂或诱导试剂的存在下，受到诱导剂或诱导试剂影响或由诱导剂或诱导试剂接触，或在不存在引起抑制的因子的情况下活化时起始或增强转录活性的启动子。根据本公开内容使用的诱导型启动子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于化学/生物化学调节和物理调节的启动子，例如有机溶剂调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、发病机制调节的启动子、温度/热诱导型、磷酸盐调节的(例如，PhoA)和光调节的启动子。
如本文中提供的编码RNA的工程化DNA模板也可以与一种或多种转录终止子可操作连接。所述转录终止子是引起聚合酶停止转录和与DNA模板解离的核酸控制区。
终止子可以是与基因或序列天然相关的一个或多个序列，如通过分离位于给定基因或序列的编码片段下游的3'-非编码序列所获得的。此类终止子可以是内源的，或者可以工程化改造以实现改善的终止效率。可以串联添加来自一个或多个来源的内源和/或工程化的终止子序列以实现改善的终止效率。
编码RNA的环状DNA模板可以包含一个或多个转录终止子，以最小化或防止非模板DNA序列(例如，作为质粒主链的部分的序列)的转录。
可以使用本领域已知的任何手段将工程化核酸引入宿主细胞，包括但不限于转化、转染(例如化学(例如磷酸钙、阳离子聚合物或脂质体)或非化学(例如电穿孔、声穿孔、impalefection、光学转染、流体动力转染)和转导(例如病毒转导)。
由天然存在的细胞内核酸编码的酶或其他蛋白质可以称为“内源酶”或“内源蛋白质”。
组成
在一些实施方案中，用于生成三磷酸核苷(NTP)的反应混合物包含二磷酸核苷(NDP)、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成NTP的反应混合物包含5’单磷酸核苷、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成NTP的反应混合物包含核苷、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成NTP的反应混合物包含核碱基、磷酸核糖转移酶、磷酸核糖基焦磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成NTP的反应混合物包含核碱基、D-核糖、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶、核苷磷酸化酶、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成核糖核酸(RNA)的反应混合物包含二磷酸核苷(NDP)、多磷酸激酶、多磷酸盐、脱氧核糖核酸(DNA)模板和聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMO激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成RNA的反应混合物包含5’单磷酸核苷、多磷酸激酶、多磷酸盐、脱氧核糖核酸(DNA)模板和聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成RNA的反应混合物包含核苷、核苷激酶、多磷酸激酶、多磷酸盐、脱氧核糖核酸(DNA)模板和聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成RNA的反应混合物包含核碱基、磷酸核糖转移酶、磷酸核糖基焦磷酸盐、多磷酸激酶、多磷酸盐、脱氧核糖核酸(DNA)模板和聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
在一些实施方案中，用于生成RNA的反应混合物包含核碱基、D-核糖、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶、核苷磷酸化酶、多磷酸激酶、多磷酸盐、脱氧核糖核酸(DNA)模板和聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
附加实施方案
以下标号的段落涵盖了本公开内容的其他实施方案。
1.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育二磷酸核苷(NDP)、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶和/或NDP激酶。
2.段落1的方法，其中所述NDP包含ADP、GDP、CDP和/或UDP。
3.段落1或2的方法，其中所述NDP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。
4.段落1-3中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
5.段落4的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌(Deinococcusgeothermalis)的III类多磷酸激酶2。
6.段落1-5中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
7.段落1-6中任一项的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶。
8.段落1-7中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述多磷酸激酶、核苷激酶和/或NDP激酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
9.段落8的方法，其中已经消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
10.段落9的方法，其中已经经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
11.段落9或10的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
12.段落9-11中任一段的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析法消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
13.段落9-12中任一段的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
14.段落1-13中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶能经受住消除条件。
15.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NTP的条件下，在反应混合物中温育5’单磷酸核苷(5’NMP)、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
16.段落15的方法，其中所述5’NMP包括5’AMP、5’GMP、5’CMP和/或5’UMP。
17.段落15或16的方法，其中所述5’NMP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。
18.段落15-17中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
19.段落18的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
20.段落15-19中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
21.段落15-20中任一段的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶。
22.段落15-21中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
23.段落22的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
24.段落23的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
25.段落23或24的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
26.段落23-25中任一段的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
27.段落23-26中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
28.段落15-27中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶能经受住消除条件。
29.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育核苷、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
30.段落29的方法，其中所述核苷包含腺苷、鸟苷、胞苷和/或尿苷。
31.段落29或30的方法，其中所述核苷是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取。
32.段落29-31中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
33.段落32的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
34.段落29-33中任一段的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
35.段落29-34中任一段的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶。
36.段落29-35中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
37.段落36的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
38.段落37的方法，其中已经经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
39.段落37或38的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
40.段落37-39中任一段的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
41.段落37-40中任一段的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
42.段落29-41中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶能经受住消除条件。
43.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育核碱基、磷酸核糖转移酶、磷酸核糖基焦磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
44.段落43的方法，其中所述核碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和/或尿嘧啶。
45.段落43或44的方法，其中核碱基是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取。
46.段落43-45中任一段的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
47.段落46的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
48.段落43-47中任一段的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
49.段落43-48中任一段的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶。
50.段落43-49中任一段的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
51.段落50的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
52.段落51的方法，其中已经经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
53.段落51或52的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
54.段落51-53中任一段的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
55.段落51-54中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
56.段落43-55中任一段的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶能经受住消除条件。
57.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育核碱基、核糖、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶、核苷磷酸化酶、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
58.段落57的方法，其中所述核碱基包括腺嘌呤，胍，胞嘧啶和/或尿嘧啶。
59.段落57或58的方法，其中所述核碱基是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。
60.段落57-59中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
61.段落60的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
62.段落57-61中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
63.段落57-62中任一项的方法，其中从表达所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶。
64.段落57-63中任一项的方法，其中所述反应混合物包含由表达所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备的裂解物。
65.段落64的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
66.段落65的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
67.段落65或66的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
68.段落65-67中任一项的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
69.段落65-68中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
70.段落57-69中任一项的方法，其中将所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶和/或所述核苷激酶修饰以经受住消除条件。
71.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NDP和NTP的条件下在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、无机磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶和/或NDP激酶。
72.段落71的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。
73.段落61或72的方法，其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
74.段落71-73中任一段的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
75.段落74的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
76.段落71-75中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
77.段落71-76中任一项的方法，其中从表达所述PNP酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述PNP酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶。
78.段落71-77中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述PNP酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
79.段落78的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
80.段落79的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
81.段落79或80的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
82.段落79-81中任一项的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
83.段落79-82中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
84.段落79-83中任一段的方法，其中所述PNP酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶和/或NDP激酶能经受住消除条件。
85.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
(a)在适合于生成5’NMP和NTP的条件下，在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)、核糖核酸酶、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
86.段落85的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。
87.段落85或86的方法，其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
88.段落85-87中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
89.段落88的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
90.段落85-89中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
91.段落85-90中任一段的方法，其中从表达所述核糖核酸酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述核糖核酸酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶。
92.段落85-91中任一段的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述核糖核酸酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
93.段落92的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
94.段落93的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
95.段落93或94的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
96.段落93-95中任一段的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
97.段落93-96中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
98.段落93-97中任一项的方法，其中所述核糖核酸酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶和/或所述NDP激酶能经受住消除条件。
99.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
在适合于生成感兴趣RNA的条件下在反应混合物中温育二磷酸核苷(NDP)、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和RNA聚合酶，任选地，其中所述反应混合物进一步包括核苷激酶和/或NDP激酶。
100.根据段落99的方法，其中所述NDP包括ADP、GDP、CDP和/或UDP。
101.段落99或段落100的方法，其中所述NDP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。
102.段落99-101中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
103.段落102的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
104.段落99-103中任一段的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
105.段落99-104中任一段的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述DNA模板、所述聚合酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述DNA模板、所述聚合酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶。
106.段落99-105中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述多磷酸激酶、所述DNA模板、所述聚合酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
107.段落106的方法，其中已经消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
108.段落107的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
109.段落107或108的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
110.段落107-109中任一段的方法，其中经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
111.段落107-110中任一段的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
112.段落99-111中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述聚合酶、所述核苷激酶和/或所述NDP激酶能经受住消除条件。
113.段落99-112中任一项的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
114.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
在适合于生成感兴趣RNA的条件下，在反应混合物中温育5’单磷酸核苷(5’NMP)、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和聚合酶，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
115.段落114的方法，其中所述5’NMP包括5’AMP、5’GMP、5’CMP和/或5’UMP。
116.段落114或115的方法，其中所述5’NMP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。
117.段落114-116中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
118.段落117的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
119.段落114-118中任一段的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
120.段落114-119中任一项的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
121.段落114-120中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
122.段落121的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
123.段落122的方法，其中已经经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
124.段落122或123的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
125.段落122-124中任一段的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
126.段落段122-125中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
127.段落114-126中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶和/或所述聚合酶能经受住消除条件。
128.段落114-127中任一项的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
129.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
在适合于生成感兴趣RNA的条件下在反应混合物中温育核苷、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和/或聚合酶，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
130.段落129的方法，其中所述核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷和/或尿苷。
131.段落129或130的方法，其中所述核苷是化学合成的，发酵产物或从天然来源提取的。
132.段落129-131中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
133.段落132的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
134.段落129-133中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
135.段落129-134中任一项的方法，其中从表达至少一种多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述多磷酸盐、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
136.段落129-135中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述至少一种多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
137.段落136的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
138.段落137的方法，其中已经经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
139.段落137或138的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
140.段落137-139中任一项的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
141.段落137-140中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
142.段落129-141中任一项的方法，其中所述至少一种多磷酸激酶、所述多磷酸盐、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶和/或所述聚合酶能经受住消除条件。
143.段落129-142中任一项的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
144.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
在适合于生成感兴趣RNA的条件下在反应混合物中温育核碱基、磷酸核糖转移酶、磷酸核糖焦磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和/或聚合酶，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
145.段落144的方法，其中所述核碱基包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和/或尿嘧啶。
146.段落144或145的方法，其中所述核碱基是化学合成的，发酵产物或从天然来源提取的。
147.段落144-146中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
148.段落148的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
149.段落144-148中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
150.段落144-149中任一项的方法，其中从表达所述磷酸核糖转移酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备所述磷酸核糖转移酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
151.段落144-150中任一项的方法，其中所述反应混合物包含来自表达所述磷酸核糖转移酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物。
152.段落151的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
153.段落152的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
154.段落152或153的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
155.段落152-154中任一项的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
156.段落152-155中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
157.段落144-156中任一项的方法，其中所述磷酸核糖转移酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶和/或所述聚合酶能经受住消除条件。
158.段落144-157中任一项的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
159.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
在适合于生成感兴趣RNA的条件下在反应混合物中温育核碱基、核糖、核糖激酶、磷酸戊糖变位酶、核苷磷酸化酶、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和聚合酶，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或至少一种NDP激酶。
160.段落159的方法，其中所述核碱基包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和/或尿嘧啶。
161.段落159或160的方法，其中所述核碱基是化学合成的，发酵产物或从天然来源提取的。
162.段落159-161中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
163.段落162的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
164.段落159-163中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
165.段落159-164中任一项的方法，其中所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶来自从工程化细胞制备的至少一种裂解物，所述工程化细胞经修饰而表达所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
166.段落159-165中任一项的方法，其中所述反应混合物是从表达所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶，所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备的裂解物。
167.段落166的方法，其中已经消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
168.段落167的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
169.段落167或168的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
170.段落167-169中任一项的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
171.段落167-170中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
172.段落159-171中任一项的方法，其中所述核糖激酶、所述磷酸戊糖变位酶、所述核苷磷酸化酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶和/或所述聚合酶经修饰而经受住消除条件。
173.段落159-172中任一项的方法，其中所述至少一种聚合酶包括至少一种RNA聚合酶。
174.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
(a)在适合于生成二磷酸核苷(NDP)的条件下，在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)和无机磷酸盐；
(b)消除PNP酶；和
(c)在适合于生成感兴趣RNA的条件下，在反应混合物或第二反应混合物中温育NDP、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和聚合酶，任选地，其中步骤(c)的反应混合物进一步包含核苷激酶和/或NDP激酶。
175.段落174的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。
176.段落174或175的方法，其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
177.段落174-176中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
178.段落177的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
179.段落174-178中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
180.段落174-179中任一项的方法，其中从表达所述PNP酶的细胞制备所述PNP酶。
181.段落174-180中任一项的方法，其中(a)的反应混合物包含从表达PNP酶的细胞制备的细胞裂解物。
182.段落181的方法，其中步骤(b)包括经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除PNP酶。
183.段落181或182的方法，其中步骤(b)包括通过以下方式消除PNP酶，其中已经通过分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
184.段落174-183中任一项的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
185.段落174-183中任一项的方法，其中步骤(c)的反应混合物包含从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或聚合酶的细胞制备的细胞裂解物。
186.段落185的方法，其中已经消除步骤(c)的所述细胞裂解物中的酶的天然酶促活性。
187.段落186的方法，其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
188.段落186或187的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
189.段落186-188中任一项的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
190.段落186-189中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
191.段落186-190中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶和/或所述聚合酶能经受住消除条件。
192.段落174-191中任一项的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
193.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
(a)在适合于生成二磷酸核苷的条件下在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)、无机磷酸盐、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和聚合酶，任选地其中所述反应混合物进一步包含核苷激酶和/或NDP激酶；
(b)消除PNP酶；和
(c)在适合于生成感兴趣RNA的条件下温育所述反应混合物。
194.段落193的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。
195.段落193或194的方法，其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
196.段落193-195中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
197.段落196的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
198.段落193-197中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
199.段落193-198中任一项的方法，其中从表达所述PNP酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备所述PNP酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
200.段落193-199中任一段的方法，其中(a)的反应混合物包括从表达所述PNP酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备的细胞裂解物。
201.段落200的方法，其中步骤(b)包括经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中的PNP酶和天然酶促活性。
202.段落200或201的方法，其中步骤(b)包括经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物中的PNP酶和天然酶促活性。
203.段落200-202中任一段的方法，其中步骤(b)包括经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中的天然酶促活性。
204.段落201-203中任一段的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
205.段落201-204中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NDP激酶和/或所述聚合酶能经受住消除条件。
206.段落193-205中任一项的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
207.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
(a)在适合于生成5’单磷酸核苷(5’NMP)的条件下在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)和核糖核酸酶；
(b)消除核糖核酸酶；和
(c)在适合于生成感兴趣RNA的条件下，在反应混合物或第二反应混合物中温育5’NMP、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和聚合酶，任选地其中步骤(c)的反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
208.段落207的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。
209.段落207或208的方法，其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
210.段落207-209中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
211.段落210的方法，其中所述多磷酸激酶包括来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
212.段落207-211中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
213.段落207-212中任一项的方法，其中从表达所述核糖核酸酶的细胞制备所述核糖核酸酶。
214.段落207-213中任一项的方法，其中(a)的反应混合物包含从表达所述核糖核酸酶的细胞制备的细胞裂解物。
215.段落214的方法，其中步骤(b)包括经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述核糖核酸酶。
216.段落214或215的方法，其中步骤(b)包括经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述核糖核酸酶。
217.段落207-216中任一项的方法，其中从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
218.段落207-216中任一项的方法，其中步骤(c)的反应混合物包含从表达所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备的细胞裂解物。
219.段落218的方法，其中已经消除步骤(c)的细胞裂解物中的酶的天然酶促活性。
220.段落219的方法，其中已经经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
221.段落219或220的方法，其中已经经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
222.段落219-221中任一项的方法，其中已经经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
223.段落219-222中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
224.段落219-223中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶，所述NDP激酶和/或所述聚合酶能经受住消除条件。
225.段落207-224中任一项的方法，其中所述聚合酶包含至少一种RNA聚合酶。
226.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
(a)在适合于生成5’单磷酸核苷(5’NMP)的条件下在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)、核糖核酸酶、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的DNA模板和聚合酶；
(b)消除所述核糖核酸酶；和
(c)在适合于生成感兴趣RNA的条件下温育反应混合物。
227.段落226的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。
228.段落226或214的方法，其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
229.段落226-228中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶。
230.段落229的方法，其中所述多磷酸激酶包含来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。
231.段落226-230中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
232.段落226-231中任一项的方法，其中从表达所述核糖核酸酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备所述核糖核酸酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶。
233.段落227-232中任一项的方法，其中(a)的反应混合物包含从表达所述核糖核酸酶、所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶、所述DNA模板和/或所述聚合酶的细胞制备的细胞裂解物。
234.段落233的方法，其中步骤(b)包括经由温度、pH、盐、去污剂、醇和/或化学抑制剂消除所述细胞裂解物中的核糖核酸酶和天然酶促活性。
235.段落233或234的方法，其中步骤(b)包括经由分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物中的核糖核酸酶和天然酶促活性。
236.段落233-235中任一项的方法，其中步骤(b)包括经由遗传修饰、自细胞的酶分泌和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中的天然酶促活性。
237.段落234-236中任一项的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
238.段落234-237中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述核苷激酶、所述NMP激酶、所述NDP激酶和/或所述聚合酶能经受住消除条件。
239.段落226-238中任一项的方法，其中所述聚合酶包括RNA聚合酶。
实施例
实施例1：从裂解物RNA或纯化的大肠杆菌RNA开始的RNA无细胞合成
材料和方法
菌株和裂解物
用编码下列酶的密码子优化形式的pETDuet-1载体转化大肠杆菌BL21(DE3)：来自大肠杆菌的RNA酶R(K544R)(EcRNR)，来自激烈热球菌的UMP激酶(PfPyrH)，来自嗜热栖热菌的CMP激酶(TthCmk)，来自海栖热袍菌的GMP激酶(TmGmk)，来自风产液菌的NDP激酶(AaNdk)和来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2(DgPPK2)。除DgPPK2外，所有酶均含有N端六组氨酸标签。将所得菌株在补充40g/L葡萄糖和50mg/L羧苄青霉素的Korz培养基中于37℃的分批发酵过程中培养，直到OD600＝20，用0.8mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，再培养1小时，之后经由离心收获。收获后，在-80℃储存生物质团粒。
然后将生物质团粒用于制备细胞裂解物。如下制备裂解物：将生物质团粒在冰上解冻，然后重悬于1.5体积的重悬缓冲液中。对于表达EcRNR的菌株，将生物量重悬于58.8mM磷酸氢二钾中。对于表达PfPyrH、TthCmk、TmGmk和AaNdk的菌株，将生物质重悬于具有50mMNaCl的50mM Tris-HCl(pH 8.5)中。对于表达DgPPK2的菌株，将生物质重悬于100mM MOPS-NaOH(pH 7.0)中。对于所有菌株，通过在4℃以15,000psi进行机械均质化的2-3次通过来裂解生物质。然后通过在4℃以16,000x g离心1小时来澄清裂解物。
大肠杆菌RNA的提取和纯化
根据建立的方案(Mohanty,B.K.,Giladi,H.,Maples,V.F.,&Kushner,S.R.(2008).Analysis of RNA decay,processing,and polyadenylation in Escherichiacoli and other prokaryotes.Methods in Enzymology,447,3-29)从高密度大肠杆菌裂解物(蛋白质浓度：40-50mg/mL)中提取并纯化RNA。
蛋白质表达和纯化
用编码具有N端六组氨酸标签的热稳定性突变体T7 RNA聚合酶的pBAD24载体转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。使用添加有50mg/L羧苄青霉素的溶源性肉汤(lysogeny broth，LB)培养基在带挡板的摇瓶中培养所得的菌株。将培养物在37℃摇动下培养直至OD600＝0.6，然后用0.2％(w/v)L-阿拉伯糖诱导并再培养4小时。然后通过离心收集生物质，并在裂解前储存于-80℃。如下制备裂解物：在冰上解冻生物质团粒，重悬于1.5体积的平衡/洗涤缓冲液(20mM磷酸钠pH 7.4、500mM氯化钠、30mM咪唑)中，并在15,000psi和4℃进行机械均质化的2-3次通过。然后通过离心澄清裂解物。使用配备有HisTrap HP柱(GE HealthcareLife Sciences)的AKTAPrime Plus遵循标准方案，通过快速蛋白液相层析(FPLC)纯化重组蛋白。然后组合含有重组蛋白的级分，并通过透析缓冲液交换到补充有5mM DTT和0.01％Triton X-100的2X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。透析后，将蛋白质储液用等体积的甘油稀释并储存于-20℃。
对于大肠杆菌RNA酶R，将培养物培养，诱导表达，并遵循本文所述方案制备裂解物。然后遵循本文描述的方案纯化酶，只是在与甘油混合之前将纯化的酶通过透析缓冲液交换到补充有500mM NaCl的2X PBS中。
DNA模板制备
通过PCR从合成DNA扩增线性DNA模板，并使用顺磁珠上的固相可逆固定化(SPRI)进行纯化。通过将感兴趣序列克隆到合适的质粒载体中，将所得质粒转化到大肠杆菌菌株DH10b中，在LB培养基中培养转化体，并使用质粒Maxi或Giga试剂盒(Qiagen)纯化质粒来制备质粒DNA模板。
从裂解物RNA合成无细胞RNA
将表达EcRNR、TthCmk、PfPyrH、TmGmk、AaNdk和DgPPK2的裂解物各自在50mM Tris，50mM NaCl(pH 7.0)中稀释至42mg/mL，然后按等比例组合。通过在50mM Tris，50mM NaCl(pH 7.0)中添加等体积的3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，并在37℃温育15分钟来启动裂解物中RNA的解聚。通过在260nm处的吸光度定量酸溶性核苷酸来监测解聚。将硫酸镁和六偏磷酸钠添加到裂解物分别至终浓度30mM和1mM，然后将裂解物在70℃温育15分钟以使EcRNR和内源大肠杆菌酶失活。15分钟后，将温度降至50℃，并使用以下组成装配反应：
表11.反应条件
硫酸镁 30mM
六偏磷酸钠 4mM
激酶裂解物 21g/L总蛋白质
精脒 2mM
模板DNA 25mg/L
RNA聚合酶 0.3g/L
将反应在50℃温育2小时，用TURBO DNA酶(Thermo Fisher)处理，并且通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
从纯化的大肠杆菌RNA合成无细胞RNA
通过在含有50mM Tris-HCl(pH 7.0)、50mM氯化钠和2mM硫酸镁的缓冲液中与1g/L纯化的大肠杆菌RNA酶R温育，使纯化的大肠杆菌RNA(约8g/L)解聚。解聚反应在37℃温育30分钟，并通过在260nm处的吸光度定量酸溶性核苷酸监控。30分钟后，将解聚反应与各自在50mM Tris-HCl(pH 7.0)，50mM NaCl中稀释的TthCmk、TmGmk、PfPyrH、AaNdk和DgPPK2裂解物组合，并按等比例混合。然后添加硫酸镁和六偏磷酸钠分别至终浓度30mM和1mM，并将该反应加热至70℃持续15分钟。热失活后，如本文所述用以下组成装配反应：
表12.反应条件
硫酸镁 30mM
六偏磷酸钠 4mM
激酶裂解物 13g/L总蛋白质
精脒 2mM
模板DNA 25mg/L
RNA聚合酶 0.3g/L
结果
使用裂解物RNA作为底物进行RNA的无细胞合成。首先，通过过表达的大肠杆菌RNA酶R(EcRNR)(一种产生5’NMP的外切核酸酶)解聚来自过表达途径酶的合并裂解物的RNA。解聚是迅速的，在15分钟后产生约14mM的酸溶性核苷酸(图8A)。然后将含有途径酶和5'NMP的裂解物混合物进行热处理，以使EcRNR和内源大肠杆菌酶失活，期间使热稳定性途径酶保留活性。热失活后，组装RNA合成反应，在50℃温育，并在琼脂糖凝胶上显现(图8B)。与两种不同模板的反应在琼脂糖凝胶上产生了独特的条带(图8B)，所述模板包括线性PCR产物(模板1)和在质粒上编码的发夹模板(模板2)。在没有RNA聚合酶的条件下没有观察到条带。作为阳性对照，进行反应，其中添加纯化的5'NMP(各4mM AMP、CMP、GMP和UMP)。这些反应以与使用通过解聚RNA产生的NMP的反应产生以相同大小迁移的产物。
还使用纯化的大肠杆菌RNA作为底物进行RNA的无细胞合成。首先将RNA与纯化的大肠杆菌RNA酶R(K544R)温育以释放5'NMP(图9A)。30分钟后，将解聚反应与含有途径酶的裂解物混合物组合，并且进行热处理以使EcRNR和内源大肠杆菌酶失活，期间使热稳定性途径酶保留活性。热失活后，装配RNA合成反应，在50℃温育，并在琼脂糖凝胶上显现(图9B)。与包括线性PCR产物(模板1)和在质粒上编码的发夹模板(模板2)的两种不同模板的反应在琼脂糖凝胶上产生限定的条带，尽管模板2的产率似乎较低(图9B)。同样，在没有RNA聚合酶的条件下没有观察到条带。
这些结果共同证明了无细胞RNA合成可用于从多种NMP来源材料生成感兴趣的RNA，包括高纯度购买的NMP、通过裂解物RNA的酶促解聚产生的NMP和通过纯化的RNA的酶促解聚产生的NMP。
实施例2：使用非热稳定性野生型聚合酶或热稳定性聚合酶突变体，和作为底物的纯化的NMP进行的RNA无细胞合成
材料和方法
如本文所述制备生物质、裂解物、纯化的蛋白质和DNA模板。基本上如实施例1中所述进行RNA的无细胞合成，只是省略了EcRNR，并将各4mM的AMP、CMP、GMP和UMP添加到反应。
结果
使用纯化的NMP作为底物在37℃反应温度进行RNA的无细胞合成。组装含有途径酶的裂解物并进行热处理，以使内源大肠杆菌酶失活，期间使热稳定性途径酶保留活性。在热失活后，使用野生型T7 RNA聚合酶或热稳定突变体装配反应，在37℃温育2小时，并在琼脂糖凝胶上显现(图10)。与包括线性PCR产物(模板1)和在质粒上编码的发夹模板(模板2)的两种不同模板的反应用这两种聚合酶产生独特的条带。在37℃，RNA产率(基于凝胶带强度)用野生型聚合酶比用热稳定突变体似乎更大，尤其在模板2的情况下。在没有RNA聚合酶的条件下未观察到条带。
这些结果证明，用于无细胞RNA合成的RNA聚合酶不需要是热稳定的，并且可以在37℃的反应中使用野生型T7 RNA聚合酶生成RNA。
实施例3：使用来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2(DgPPK2)和作为底物的NMP进行的RNA无细胞合成
材料和方法
基本如实施例2所述用以下组成装配无细胞RNA合成反应：
表13.反应条件
硫酸镁 45mM
六偏磷酸钠 13mM
DgPPK2裂解物 7g/L总蛋白质
模板DNA 50mg/L
精脒 2mM
RNA聚合酶 0.3g/L
作为阳性对照，在根据实施例1-2的反应中使用5-酶裂解物系统，其含有尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶、二磷酸核苷酸激酶和多磷酸激酶。通过适应的RNASwift提取方案纯化反应中合成的dsRNA，并如本文所述(Nwokeji,A.O.,Kilby,P.M.,Portwood,D.E.,&Dickman,M.J.(2016).RNASwift:A rapid,versatile RNA extraction methodfree from phenol and chloroform.Analytical Biochemistry,512,36-46)使用反相离子对层析进行定量。
结果
在包含DgPPK2作为反应中唯一的激酶以及NMP作为底物的反应中进行RNA的无细胞合成。作为阳性对照，在含有尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶、二磷酸核苷酸激酶和多磷酸激酶的5-酶裂解物系统存在下合成RNA。在不存在聚合酶的情况下进行对照反应。
确定每个反应的响应因子。将响应因子计算为感兴趣dsRNA的面积与商品化dsRNA内部标准品物的面积之比。响应因子的比较证明，含有DgPPK2作为唯一激酶的反应合成在含有5-酶裂解物系统的反应中合成的dsRNA的约48％(图11A)。通过HPLC分析在DgPPK2反应和5-酶裂解物系统反应中合成的dsRNA产物。来自反应的dsRNA产物的HPLC层析图是相似的，证明了由仅DgPPK2-系统产生的dsRNA产物与由5-酶系统产生的产物相似(图11B)。
这些结果共同证明，DgPPK2可用作单一激酶，以从NMP或NDP合成无细胞dsRNA。
实施例4：使用纯化的RNA酶R或纯化的核酸酶P1解聚来自各种来源的RNA材料和方法
RNA和核酸酶的提取和纯化
根据建立的方案(Mohanty,B.K.,Giladi,H.,Maples,V.F.,&Kushner,S.R.(2008).Analysis of RNA decay,processing,and polyadenylation in Escherichiacoli and other prokaryotes.Methods in Enzymology,447,3-29)从高密度大肠杆菌裂解物(蛋白质浓度：40-50mg/mL)中提取并纯化RNA。
使用RNASwift方案(Nwokeji,A.O.,Kilby,P.M.,Portwood,D.E.,&Dickman,M.J.(2016).RNASwift:A rapid,versatile RNA extraction method free from phenol andchloroform.Analytical Biochemistry,512,36-46)从产钠弧菌细胞肉汤中纯化来自弧菌的RNA。
酵母衍生的RNA提取物购自商业来源。RNA粉末是约85％至约90％纯的，并且无需进一步纯化。从过表达RNA酶R并培养到高细胞密度的大肠杆菌菌株中纯化RNA酶R。使用连接到AKTAPrime Plus FPLC系统(GE Healthcare)的HisTrap HP柱，通过固定化的金属亲和层析纯化蛋白质。纯化的核酸酶P1(5'磷酸二酯酶)从商业来源获得。
用外源核酸酶解聚RNA
将重悬浮于无核酸酶的水中的大肠杆菌RNA、产钠弧菌RNA、酵母衍生的RNA粉末(RNA含量为11mg/mL)、RNA酶R溶液(在300mM磷酸钾缓冲液pH 7.4、200mM KCl、2mM MgCl2中1mg/mL)和纯化的核酸酶P1(也称为5'磷酸二酯酶)(在100mM磷酸钾缓冲液pH 7.4、1mMZnCl2、10mM MgCl2中1-2mg/mL)于2℃进行预先平衡，然后开始反应。在时间t＝0时，将50μLRNA和50μL核酸酶溶液混合，并通过转移至预热的37℃块启动反应。启动后，将反应在37℃温育，并通过将10μL转移至冰上的酸淬灭溶液(90μL的0.2M硫酸)中进行定期采样。时间过程完成后，通过在2℃以3200x g离心20分钟来澄清淬灭的样品。首先通过酸溶性核苷酸在260nm处的吸光度定量解聚。通过RNA的碱性水解测定总核苷酸合并物(例如100％解聚)：将50μLRNA与150μL的0.2M氢氧化钾组合，然后加热至99℃保持20分钟。然后将碱水解的样品淬灭并如上所述进行分析。还可以通过LC-MS分析5'，2'和3'NMP来定量解聚：将10μL样品在30μL 100％乙腈中淬灭，并稀释到500μL的含有用作内部标准品的10μM己二酸的去离子水中。然后将样品离心，并在LC-MS分析之前通过0.2μm过滤器。
核苷酸分析
使用ABSCIEX API 5000质谱仪和装备有Sequant Zinc-hilic柱(2.1x 50mm，内径3μm)的标准Agilent 1200HPLC，通过质谱法和液相层析进行2'，3'和5'NMP的分析。流动相由在90％乙腈中的20mM乙酸铵(A)和在10％乙腈中的20mM乙酸铵(B)组成。分离方法由以下组成：开始梯度为6％B，然后在600秒内梯度至8.5％B，在400秒内梯度至13％B，然后在60秒内梯度至20％B，在50％B洗涤60秒，最后在6％B再平衡220秒。使用以下质谱跃迁以负模式电喷雾电离(ESI)进行定量：2'3'5'AMP:346.1-134.1,2'3'5'UMP:323.0–97,2'3'5'CMP:322–97,2'3'5'GMP:362.1–211。将峰面积与由纯化化合物(购自Sigma-Aldrich，只是2'和3'CMP、UMP和GMP购自Biolog Life Science Institute)组成的标准曲线进行比较，并相对于在分析前掺加到样品中的内部标准品(己二酸)标准化。为了分析样品，在去离子水中制备标准曲线，用内部标准品稀释并如本文所述的样品制备步骤中进行过滤。
结果
使用纯化的大肠杆菌RNA酶R消化产钠弧菌RNA，并且使用大肠杆菌RNA酶R和核酸酶P1两者消化大肠杆菌RNA和酵母衍生的RNA提取物。通过释放酸溶性核苷酸来监测解聚。用RNA酶R处理大肠杆菌和产钠弧菌RNA显示时间依赖性的RNA至酸溶性核苷酸的转化，温育30分钟后达到约98％至约100％的解聚(图12A)。用核酸酶P1处理酵母衍生的RNA提取物达到约94％的解聚(图12A)。用核酸酶P1处理大肠杆菌RNA也导致约90％的解聚(图12A)。随后通过LC-MS分析揭示了在用核酸酶P1处理的大肠杆菌RNA和酵母衍生的RNA提取物中释放5’NMP(图12B)。
这些结果证明了可以使用不同的核酸酶(例如RNA酶R和核酸酶P1)将不同来源的RNA(例如弧菌RNA，大肠杆菌RNA和酵母RNA)消化成5’NMP。实施例5：温度和裂解物失活对RNA解聚的影响
材料和方法
菌株和裂解物
在本文描述的研究中使用菌株GL17-086(BL21(DE3).ΔtolC.Δph[DE3]1+2*.Δph[285p]*.ΔfhuA*.ΔlamB*.rna::tolC)和菌株GL17-109(BL21(DE3).ΔtolC.Δph[DE3]1+2*.Δph[285p]*.ΔfhuA*.ΔlamB*.Δrna*.ΔphoA*.ΔappA*.Δamn*.ΔnagD*.ΔushA::tolC)。对于这两种菌株，在KORZ培养基(5g/L(NH4)2SO4、15.7g/L K2HPO4、4.2g/LKH2PO4、1.7g/L柠檬酸、0.6g/L MgSO4、0.1％硫胺-HCl、0.01％Pluronic、痕量金属和40g/L葡萄糖)的分批生长条件下培养1L培养物约7小时。培养后，将细胞以6000g离心20分钟，然后在-80℃储存。将冷冻的生物质在1.5倍体积的58.8mM磷酸氢二钾溶液中解冻，并且如下裂解：通过EmulsiFlex C3均质器(Avestin)达3次通过，以15000-20000psi的脉冲再循环。通过在4℃以15000g旋转1小时来澄清裂解物。然后将裂解物在一次性等分试样中储存于-80℃。
在各种温度分析RNA聚合产物
将两种菌株(086和109)的冷冻裂解物在不同温度温育，以剖析RNA解聚产物及其潜在降解。将裂解物等分试样在冰上解冻，然后分配到PCR带管中。然后在间歇采样的情况下将管在40℃、50℃、60℃和70℃温育长达1小时。通过在裂解物仍在冰上的情况下淬灭获得初始t0时间点。对于所有其他时间，将样品在5倍体积的乙腈中淬灭，60μl稀释到500μl在50mM乙酸铵中的50μM己二酸溶液中，然后在LC-QQQ上运行。使用MRM，在每个时间点定量所有四种主要核苷酸及其相关衍生物(ATP、ADP、AMP、腺嘌呤、腺苷、GTP、GDP、GMP、鸟嘌呤、鸟苷、CTP、CDP、CMP、胞苷、胞嘧啶、UTP、UDP、UMP、尿苷和尿嘧啶)。通过将裂解物在3倍体积的0.2M NaOH中于99℃温育20分钟来进行裂解物的碱水解，其中RNA完全水解成NMP。然后，将其用等体积的150mM HCl中和，并将20μl的该溶液稀释到200μl的含50μM己二酸的50mM乙酸铵溶液中。碱水解裂解物值表示100％解聚。在某些条件下，将这些裂解物原样温育，并且在其他条件下，将裂解物与0.5mg/ml核酸酶P1(Sigma N8630)或RNA酶R混合。如下制备RNA酶R：将细胞重悬于1.5倍体积的裂解缓冲液(50mM磷酸钾，pH＝7.4,500mM NaCl，20mM咪唑)，在EmulsiFlex C3均质器(Avestin)中以15000-25000psi通过三次裂解，以16000g，4℃澄清1小时。然后，经由FPLC纯化上清液，然后在2X PBS中透析过夜。通过添加500mM NaCl回收透析后沉淀的蛋白质，与甘油混合以产生50％的甘油溶液，用于等分取样并储存于-20℃。
对RNA解聚分析稀释效应和预热杀伤效应
用如本文所述制备的GL17-109的裂解物进行实验。在一大批条件下制备裂解物。在所有条件下共同的是，反应接受添加的150mM磷酸钾(pH＝7.4)、100mM KCl和0.1mMZnCl2，并且用RNA酶R、核酸酶P1或在未添加外源核酸酶的情况下测试以下所有条件。这两种核酸酶储液如前所述制备。在对水中的80％和50％的裂解物稀释液中进行解聚反应。将它们分别用掺加的0.5或0.31mg/ml的外源核酸酶进行筛选。还如下制备裂解物混合物：通过制备1mg/ml的核酸酶裂解物，并将其混合到非掺加的裂解物中，产生在80％稀释条件中的0.064和0.04mg/ml的核酸酶，或在50％的稀释条件中的0.04和0.025mg/ml核酸酶。最后，对条件进行测试，其中不含添加的核酸酶的裂解物在70℃进行热杀伤15分钟，然后与纯化的核酸酶或仍有活性的1mg/ml核酸酶裂解物混合。将样品在37℃温育30分钟，并且通过在5倍体积的乙腈中淬灭并稀释到1ml的在50mM乙酸铵中的50mM己二酸溶液中进行采样。然后将淬灭溶液向下旋转，过滤通过0.2μm滤板，并且将滤液在LC-QQQ上运行以测量NMP、核苷和核碱基。
结果
已知RNA核酸酶(RNA酶)具有比来自嗜中温(mesophilic)来源的许多其他酶更宽的跨越温度概况的活性概况，尽管起源于进化为于37℃生长的生物体，但有时直至60℃显示活性。为了评估升高的温度对大肠杆菌裂解物中RNA解聚的影响，进行两项不同研究。首先，在添加或不添加两种RNA酶之一——RNA酶R或RNA酶P1的情况下，将来自两种不同菌株的裂解物在1小时的过程内于大于37℃的温度温育。第二项研究涉及消除裂解物以去除有害的酶促活性，并将此种无活性裂解物与活性裂解物混合以研究对RNA解聚的潜在影响，或将外源核酸酶混合到失活的裂解物中。
当将裂解物在60℃和70℃温育时观察到改善的解聚(图13)。解聚以几种方式改进。当RNA解聚时，它主要产生NMP。然而，在活性裂解物中，这些NMP继续被其他酶降解，大量积累两种主要产物——鸟苷和尿嘧啶。即使在未接受外源RNA酶R或核酸酶P1的裂解物中，在60℃和70℃温育裂解物也显著降低这些核碱基的积累(图13)。由于每摩尔核碱基与NMP从RNA中的不可逆丧失相关，这证明了裂解物中改善的NMP稳定性。另外，当在这些温度条件下添加外源核酸酶时，看到净NMP积累的明显改善，如在70℃在添加RNA酶R的情况下在图13中所示。GL17-109裂解物的碱水解显示32.6mM NMP的最大浓度。校正添加的核酸酶的稀释，在70℃用RNA酶R看到的约22mM NMP累积是75％产率。假设tRNA占总RNA合并物的约15％并且它对于这些核酸酶是难以接近的，则这将代表所有可接近的RNA的94％产率。全面地，GL17-086中的解聚比GL17-109更差，这可能是由于更大的磷酸分解活性(数据未显示)。
预热杀伤和裂解物稀释液的影响显示小的益处，但仅在更重度稀释的裂解物下。在这项研究中，制备两种类型的裂解物：一种“试剂”裂解物，其中含有要解聚的RNA；以及一种“催化剂”裂解物，其含有外源核酸酶(RNA酶R或核酸酶P1)。评估了许多不同的条件，如下表14所示，以确定它们对RNA解聚的影响。稀释至仅80％的裂解物显示相似的解聚性能，无论裂解物的各部分被热杀伤与否。然而，当大部分RNA处于失活的裂解物中时，稀释至50％的裂解物表现得稍好。在此稀释度下测试的所有条件中，观察到2.7％的平均解聚产率改善。在这些条件下解聚反应的性能并未显示明显的改善，但是通过等同或仅略微更好地运行，这确实留下对在过程的其他部分需要时进行预解聚热杀伤开放的可能性，例如若在热处理后包括沉淀步骤，则停止可保留在培养物中的任何未裂解细胞的生长或降低裂解物的蛋白质含量。
表14.裂解物、核酸酶和失活裂解物的不同混合物中的RNA解聚产率的汇总。百分比产率基于32.6mM NMP的基准，如通过RNA的裂解物碱水解定量。
Figure BDA0002524284760000831
实施例6：使用各种核苷酸来源的RNA的无细胞生成
材料和方法
将获自商业来源的酵母RNA粉末以45-60g/L溶于水中，并在70℃，pH5.5-5.8，在存在0.05mM氯化锌的情况下，使用1.2g/L P1核酸酶解聚1小时。通过离心使所得的解聚材料澄清，并使用10kDa MWCO过滤器过滤。所得的流包含总浓度约90-100mM的5’单磷酸核苷酸(NMP)(各约20-25mM AMP、CMP、GMP和UMP)。
使用标准技术[Korz,D.J.,Rinas,U.,Hellmuth,K.,Sanders,E.A.,&Deckwer,W.D.(1995).Simple fed-batch technique for high cell density cultivation ofEscherichia coli.Journal of biotechnology,39(1),59-65]用补充有50mg/L羧苄青霉素的Korz培养基发酵培养携带编码个别激酶(TthCmk、PfPyrH、TmGmk、AaNdk和DgPPK2)的pBAD24衍生的载体的大肠杆菌BL21(DE3)衍生物。通过添加L-阿拉伯糖诱导蛋白质表达。收获后，使用高压均质法在60mM磷酸盐缓冲液中制备裂解物，得到约40g/L总蛋白的混合物。
使用标准技术[Phue,J.N.,Lee,S.J.,Trinh,L.,&Shiloach,J.(2008).ModifiedEscherichia coli B(BL21),a superior producer of plasmid DNA compared withEscherichia coli K(DH5alpha).Biotechnology and bioengineering,101(4),831.]，在Korz培养基中发酵培养携带pUC19衍生的载体的大肠杆菌BL21(DE3)衍生物，所述载体含有一个或多个编码524bp双链RNA序列的转录模板(每个模板由T7启动子、靶序列和一个或多个转录终止子组成)。收获后，通过高压均质化创建裂解物，稀释并遵循相似的程序进行热处理。
培养携带编码热稳定性T7 RNA聚合酶的pBAD24衍生的载体的大肠杆菌BL21(DE3)衍生物，诱导酶表达，并使用类似程序制备裂解物。使用两步硫酸铵分级部分纯化聚合酶。
根据表15在30mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中装配反应。
表15.反应条件
Figure BDA0002524284760000841
在装配无细胞反应中，将含有激酶和模板DNA的裂解物稀释，以等比例组合，然后与反应添加剂如硫酸镁和六偏磷酸钠混合。将裂解物在70℃温育15分钟以使其他酶促活性失活，而保留过表达激酶的活性。通过添加RNA聚合酶启动无细胞反应，在48℃温育1小时，并根据建立的方案[Nwokeoji,A.O.,Kilby,P.M.,Portwood,D.E.,&Dickman,M.J.(2016).RNASwift:A rapid,versatile RNA extraction method free from phenol andchloroform.Analytical biochemistry,512,36]进行分析。
结果
使用细胞RNA、5'-单磷酸核苷的等摩尔混合物(AMP、CMP、GMP、UMP)或5'二磷酸核苷的等摩尔混合物(ADP、CDP、GDP、UDP)进行无细胞RNA合成反应。对于每个核苷酸来源，产生了相似滴度的dsRNA产物(图17)。
这些结果证明了本文所述的无细胞反应可用于从多种核苷酸来源，包括细胞RNA、5'-单磷酸核苷和二磷酸核苷合成RNA。
实施例7：使用野生型RNA聚合酶的无细胞生成RNA
材料和方法
培养携带编码六组氨酸标签的热稳定性或野生型T7 RNA聚合酶的pBAD24衍生载体的大肠杆菌BL21(DE3)衍生物，诱导酶表达，并使用本文所述的程序制备裂解物。如本文所述，通过快速蛋白质液相层析(FPLC)纯化聚合酶。如本文所述进行无细胞反应，只是在一定温度范围(37-48℃)进行反应2小时。如本文所述定量dsRNA产物的滴度。
结果
使用野生型T7 RNA聚合酶或热稳定性突变体进行无细胞RNA合成反应(图18)。用热稳定性突变体进行的反应于37℃和48℃产生dsRNA产物。相反，用野生型聚合酶进行的反应在37℃而非48℃产生产物。
这些结果证明，本文所述的无细胞反应不需要热稳定性RNA聚合酶，只要它们在适当的温度温育。
实施例8：使用各种核苷酸来源的NTP的无细胞生成
材料和方法
如实施例6所述进行无细胞反应，只是省略了模板DNA裂解物和RNA聚合酶。使用发表的方法的改编[de Korte,D.,Haverkort,W.A.,Roos,D.,&van Gennip,A.H.(1985).Anion-exchange high performance liquid chromatography method for thequantitation of nucleotides in human blood cells.Clinica chimica acta；international journal of clinical chemistry,148(3),185.]通过HPLC分析核苷酸。
结果
使用细胞RNA、5'-单磷酸核苷的等摩尔混合物(AMP、CMP、GMP、UMP)或5'二磷酸核苷的等摩尔混合物(ADP、CDP、GDP、UDP)进行无细胞反应以生成5’-三磷酸核苷酸(NTP:ATP、CTP、GTP和UTP)。对于每个核苷酸来源产生每种NTP的相似滴度(图19)。
这些结果证明了也可以简单地通过省略RNA聚合酶和DNA模板使用本文所述的无细胞反应来生成NTP。与实施例6中描述的生成RNA的无细胞反应相似，生成NTP的无细胞反应可以利用多种核苷酸来源，包括细胞RNA、5’-单磷酸核苷和二磷酸核苷。
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序列
地热异常球菌DSM 11300PPK2
MQLDRYRVPPGQRVRLSNWPTDDDGGLSKAEGEALLPDLQQRLANLQERLYAESQQALLIVLQARDAGGKDGTVKHVIGAFNPSGVQVSNFKVPTEEERAHDFLWRIHRQTPRLGMIGVFNRSQYEDVLVTRVHHLIDDQTAQRRLKHICAFESLLTDSGTRIVKFYLHISPEEQKKRLEARLADPSKHWKFNPGDLQERAHWDAYTAVYEDVLTTSTPAAPWYVVPADRKWFRNLLVSQILVQTLEEMNPQFPAPAFNAADLRIV(SEQ ID NO:1)
红色亚栖热菌DM 1279PPK2
MGFCSIEFLMGAQMKKYRVQPDGRFELKRFDPDDTSAFEGGKQAALEALAVLNRRLEKLQELLYAEGQHKVLVVLQAMDAGGKDGTIRVVFDGVNPSGVRVASFGVPTEQELARDYLWRVHQQVPRKGELVIFNRSHYEDVLVVRVKNLVPQQVWQKRYRHIREFERMLADEGTTILKFFLHISKDEQRQRLQERLDNPEKRWKFRMGDLEDRRLWDRYQEAYEAAIRETSTEYAPWYVIPANKNWYRNWLVSHILVETLEGLAMQYPQPETASEKIVIE(SEQ ID NO:2)席尔瓦亚栖热菌DSM 9946PPK2
MAKTIGATLNLQDIDPRSTPGFNGDKEKALALLEKLTARLDELQEQLYAEHQHRVLVILQGMDTSGKDGTIRHVFKNVDPLGVRVVAFKAPTPPELERDYLWRVHQHVPANGELVIFNRSHYEDVLVARVHNLVPPAIWSRRYDHINAFEKMLVDEGTTVLKFFLHISKEEQKKRLLERLVEADKHWKFDPQDLVERGYWEDYMEAYQDVLDKTHTQYAPWHVIPADRKWYRNLQVSRLLVEALEGL RMKYPRPKLNIPRLKSELEKM(SEQ ID NO:3)
热稳定性伸长热聚球藻BP-1PPK2
MIPQDFLDEINPDRYIVPAGGNFHWKDYDPGDTAGLKSKVEAQELLAAGIKKLAAYQDVLYAQNIYGLLIIFQAMDAAGKDSTIKHVMSGLNPQACRVYSFKAPSAEELDHDFLWRANRALPERGCIGIFNRSYYEEVLVVRVHPDLLNRQQLPPETKTKHIWKERFEDINHYERYLTRNGILILKFFLHISKAEQKKRFLERISRPEKNWKFSIEDVRDRAHWDDYQQAYADVFRHTSTKWAPWHIIPANHKWFARLMVAHFIYQKLASLNLHYPMLSEAHREQLLEAKALLENEPDED(SEQ ID NO:4)
嗜热厌氧绳菌UNI-1PPK2
MGEAMERYFIKPGEKVRLKDWSPDPPKDFEGDKESTRAAVAELNRKLEVLQERLYAERKHKVLVILQGMDTSGKDGVIRSVFEGVNPQGVKVANFKVPTQEELDHDYLWRVHKVVPGKGEIVIFNRSHYEDVLVVRVHNLVPPEVWKKRYEQINQFERLLHETGTTILKFFLFISREEQKQRLLERLADPAKHWKFNPGDLKERALWEEYEKAYEDVLSRTSTEYAPWILVPADKKWYRDWVISRVLVETLEGLEIQLPPPLADAETYRRQLLEEDAPESR(SEQ ID NO:5)
嗜气暖绳菌DSM 14535PPK2
MDVDRYRVPPGSTIHLSQWPPDDRSLYEGDKKQGKQDLSALNRRLETLQELLYAEGKHKVLIILQGMDTSGKDGVIRHVFNGVNPQGVKVASFKVPTAVELAHDFLWRIHRQTPGSGEIVIFNRSHYEDVLVVRVHGLVPPEVWARRYEHINAFEKLLVDEGTTILKFFLHISKEEQRQRLLERLEMPEKRWKFSVGDLAERKRWDEYMAAYEAVLSKTSTEYAPWYIVPSDRKWYRNLVISHVIINALEGLNMRYPQPEDIAFDTIVIE(SEQ ID NO:6)
Chlorobaculum tepidum TLS PPK2
MKLDLDAFRIQPGKKPNLAKRPTRIDPVYRSKGEYHELLANHVAELSKLQNVLYADNRYAILLIFQAMDAAGKDSAIKHVMSGVNPQGCQVYSFKHPSATELEHDFLWRTNCVLPERGRIGIFNRSYYEEVLVVRVHPEILEMQNIPHNLAHNGKVWDHRYRSIVSHEQHLHCNGTRIVKFYLHLSKEEQRKRFLERIDDPNKNWKFSTADLEERKFWDQYMEAYESCLQETSTKDSPWFAVPADDKKNARLIVSRIVLDTLESLNLKYPEPSPERRKELLDIRKRLENPENGK(SEQ ID NO:7)
深海洋栖热袍菌DSM 14977PPK2
MDVSRYRVPPGSGFDPEAWPTREDDDFAGGKKEAKKELARLAVRLGELQARLYAEGRQALLIVLQGMDTAGKDGTIRHVFRAVNPQGVRVTSFKKPTALELAHDYLWRVHRHAPARGEIGIFNRSHYEDVLVVRVHELVPPEVWGRRYDHINAFERLLADEGTRIVKFFLHISKDEQKRRLEARLENPRKHWKFNPADLSERARWGDYAAAYAEALSRTSSDRAPWYAVPADRKWQRNRIVAQVLVDALEAMDPRFPRVDFDPASVRVE(SEQ ID NO:8)
Roseiflexus castenholzii DSM 13941PPK2
MYAQRVVPGMRVRLHDIDPDANGGLNKDEGRARFAELNAELDVMQEELYAAGIHALLLILQGMDTAGKDGAIRNVMLNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHRVVPRKGMVGVFNRSHYEDVLVVRVHSLVPESVWRARYDQINAFERLLADTGTIIVKCFLHISKEEQEQRLLARERDVSKAWKLSAGDWRERAFWDDYMAAYEEALTRCSTDYAPWYIIPANRKWYRDLAISEALVETLRPYRDDWRRALDAMSRARRAELEAFRAEQHAMEGRPQGAGGVSRR(SEQ IDNO:9)
玫瑰弯菌属种RS-1PPK2
MHYAHTVIPGTQVRLRDIDPDASGGLTKDEGRERFASFNATLDAMQEELYAAGVHALLLILQGMDTAGKDGAIRNVMHNLNPQGCRVESFKVPTEEELAHDFLWRVHKVVPRKGMVGVFNRSHYEDVLVVRVHSLVPEHVWRARYDQINAFERLLTDTGTIIVKCFLHISKDEQEKRLLAREQDVTKAWKLSAGDWRERERWDEYMAAYEEALTRCSTEYAPWYIIPANRKWYRDLAISEVLVETLRPYRDDWQRALDAMSQARLAELKAFRHQQTAGATRL(SEQ ID NO:10)Truepera radiovictrix DSM 17093PPK2
MSQGSAKGLGKLDKKVYARELALLQLELVKLQGWIKAQGLKVVVLFEGRDAAGKGSTITRITQPLNPRVCRVVALGAPTERERTQWYFQRYVHHLPAAGEMVLFDRSWYNRAGVERVMGFCTEAEYREFLHACPTFERLLLDAGIILIKYWFSVSAAEQERRMRRRNENPAKRWKLSPMDLEARARWVAYSKAKDAMFYHTDTKASPWYVVNAEDKRRAHLSCIAHLLSLIPYEDLTPPPLEMPPRDLAGADEGYERPDKAHQTWVPDYVPPTR(SEQ ID NO:11)
嗜热栖热菌AdkMDVGQAVIFLGPPGAGKGTQASRLAQELGFKKLSTGDILRDHVARGTPLGERVRPIMERGDLVPDDLILELIREELAERVIFDGFPRTLAQAEALDRLLSETGTRLLGVVLVEVPEEELVRRILRRAELEGRSDDNEETVRRRLEVYREKTEPLVGYYEARGVLKRVDGLGTPDEVYARIRAALGI(SEQ ID NO:12)
嗜热栖热菌CmkMRGIVTIDGPSASGKSSVARRVAAALGVPYLSSGLLYRAAAFLALRAGVDPGDEEGLLALLEGLGVRLLAQAEGNRVLADGEDLTSFLHTPEVDRVVSAVARLPGVRAWVNRRLKEVPPPFVAEGRDMGTAVFPEAAHKFYLTASPEVRAWRRARERPQAYEEVLRDLLRRDERDKAQSAPAPDALVLDTGGMTLDEVVAWVLAHIRR(SEQ ID NO:13)
激烈火球菌PyrHMRIVFDIGGSVLVPENPDIDFIKEIAYQLTKVSEDHEVAVVVGGGKLARKYIEVAEKFNSSETFKDFIGIQITRANAMLLIAALREKAYPVVVEDFWEAWKAVQLKKIPVMGGTHPGHTTDAVAALLAEFLKADLLVVITNVDGVYTADPKKDPTAKKIKKMKPEELLEIVGKGIEKAGSSSVIDPLAAKIIARSGIKTIVIGKEDAKDLFRVIKGDHNGTTIEP(SEQ ID NO:14)
海栖热袍菌GmkMKGQLFVICGPSGAGKTSIIKEVLKRLDNVVFSVSCTTRPKRPHEEDGKDYFFITEEEFLKRVERGEFLEWARVHGHLYGTLRSFVESHINEGKDVVLDIDVQGALSVKKKYSNTVFIYVAPPSYADLRERILKRGTEKEADVLVRLENAKWELMFMDEFDYIVVNENLEDAVEMVVSIVRSERAKVTRNQDKIERFKMEVKGWKKL(SEQ ID NO:15)
风产液菌NdkMAVERTLIIVKPDAMEKGALGKILDRFIQEGFQIKALKMFRFTPEKAGEFYYVHRERPFFQELVEFMSSGPVVAAVLEGEDAIKRVREIIGPTDSEEARKVAPNSIRAQFGTDKGKNAIHASDSPESAQYEICFIFSGLEIV(SEQ ID NO:16)
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请就各自被引用的主题而言通过引用并入本文，在某些情况下可以涵盖整个文件。
除非明确相反指出，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为表示“至少一个/种”。
还应理解的是，除非明确相反地指出，否则在本文中要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于叙述方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求书以及以上说明书中，所有过渡短语例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等等应理解为开放式的，即意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，仅过渡短语“由……组成”和“基本上由……构成”应分别是封闭的或半封闭的过渡短语。
数值之前的术语“约”和“基本上”是指所述数值的±10％。
在提供值的范围的情况下，本文具体考虑和描述了范围的上端和下端之间的每个值。
序列表
<110> 绿光生物科技股份有限公司（GREENLIGHT BIOSCIENCES, INC.）
<120> 用于三磷酸核苷和核糖核酸生成的方法和组合物
<130> G0830.70025WO00
<140> 尚未分配
<141> 与本文一起
<150> US 62/571,071
<151> 2017-10-11
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> 地热异常球菌
<400> 1
Met Gln Leu Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Gln Arg Val Arg Leu
1 5 10 15
Ser Asn Trp Pro Thr Asp Asp Asp Gly Gly Leu Ser Lys Ala Glu Gly
20 25 30
Glu Ala Leu Leu Pro Asp Leu Gln Gln Arg Leu Ala Asn Leu Gln Glu
35 40 45
Arg Leu Tyr Ala Glu Ser Gln Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu Gln Ala
50 55 60
Arg Asp Ala Gly Gly Lys Asp Gly Thr Val Lys His Val Ile Gly Ala
65 70 75 80
Phe Asn Pro Ser Gly Val Gln Val Ser Asn Phe Lys Val Pro Thr Glu
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Glu Glu Arg Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln Thr Pro
100 105 110
Arg Leu Gly Met Ile Gly Val Phe Asn Arg Ser Gln Tyr Glu Asp Val
115 120 125
Leu Val Thr Arg Val His His Leu Ile Asp Asp Gln Thr Ala Gln Arg
130 135 140
Arg Leu Lys His Ile Cys Ala Phe Glu Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly
145 150 155 160
Thr Arg Ile Val Lys Phe Tyr Leu His Ile Ser Pro Glu Glu Gln Lys
165 170 175
Lys Arg Leu Glu Ala Arg Leu Ala Asp Pro Ser Lys His Trp Lys Phe
180 185 190
Asn Pro Gly Asp Leu Gln Glu Arg Ala His Trp Asp Ala Tyr Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Glu Asp Val Leu Thr Thr Ser Thr Pro Ala Ala Pro Trp Tyr
210 215 220
Val Val Pro Ala Asp Arg Lys Trp Phe Arg Asn Leu Leu Val Ser Gln
225 230 235 240
Ile Leu Val Gln Thr Leu Glu Glu Met Asn Pro Gln Phe Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Phe Asn Ala Ala Asp Leu Arg Ile Val
260 265
<210> 2
<211> 280
<212> PRT
<213> 红色亚栖热菌
<400> 2
Met Gly Phe Cys Ser Ile Glu Phe Leu Met Gly Ala Gln Met Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Arg Val Gln Pro Asp Gly Arg Phe Glu Leu Lys Arg Phe Asp Pro
20 25 30
Asp Asp Thr Ser Ala Phe Glu Gly Gly Lys Gln Ala Ala Leu Glu Ala
35 40 45
Leu Ala Val Leu Asn Arg Arg Leu Glu Lys Leu Gln Glu Leu Leu Tyr
50 55 60
Ala Glu Gly Gln His Lys Val Leu Val Val Leu Gln Ala Met Asp Ala
65 70 75 80
Gly Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg Val Val Phe Asp Gly Val Asn Pro
85 90 95
Ser Gly Val Arg Val Ala Ser Phe Gly Val Pro Thr Glu Gln Glu Leu
100 105 110
Ala Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Gln Gln Val Pro Arg Lys Gly
115 120 125
Glu Leu Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val Val
130 135 140
Arg Val Lys Asn Leu Val Pro Gln Gln Val Trp Gln Lys Arg Tyr Arg
145 150 155 160
His Ile Arg Glu Phe Glu Arg Met Leu Ala Asp Glu Gly Thr Thr Ile
165 170 175
Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu Gln Arg Gln Arg Leu
180 185 190
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195 200 205
Asp Leu Glu Asp Arg Arg Leu Trp Asp Arg Tyr Gln Glu Ala Tyr Glu
210 215 220
Ala Ala Ile Arg Glu Thr Ser Thr Glu Tyr Ala Pro Trp Tyr Val Ile
225 230 235 240
Pro Ala Asn Lys Asn Trp Tyr Arg Asn Trp Leu Val Ser His Ile Leu
245 250 255
Val Glu Thr Leu Glu Gly Leu Ala Met Gln Tyr Pro Gln Pro Glu Thr
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Ala Ser Glu Lys Ile Val Ile Glu
275 280
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<212> PRT
<213> 席尔瓦亚栖热菌
<400> 3
Met Ala Lys Thr Ile Gly Ala Thr Leu Asn Leu Gln Asp Ile Asp Pro
1 5 10 15
Arg Ser Thr Pro Gly Phe Asn Gly Asp Lys Glu Lys Ala Leu Ala Leu
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Leu Glu Lys Leu Thr Ala Arg Leu Asp Glu Leu Gln Glu Gln Leu Tyr
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Ala Glu His Gln His Arg Val Leu Val Ile Leu Gln Gly Met Asp Thr
50 55 60
Ser Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg His Val Phe Lys Asn Val Asp Pro
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Leu Gly Val Arg Val Val Ala Phe Lys Ala Pro Thr Pro Pro Glu Leu
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Glu Arg Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Gln His Val Pro Ala Asn Gly
100 105 110
Glu Leu Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val Ala
115 120 125
Arg Val His Asn Leu Val Pro Pro Ala Ile Trp Ser Arg Arg Tyr Asp
130 135 140
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Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu Gln Lys Lys Arg Leu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Glu Ala Leu Glu Gly Leu Arg Met Lys Tyr Pro Arg Pro Lys Leu
245 250 255
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260 265
<210> 4
<211> 300
<212> PRT
<213> 热稳定性伸长热聚球藻
<400> 4
Met Ile Pro Gln Asp Phe Leu Asp Glu Ile Asn Pro Asp Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Val Pro Ala Gly Gly Asn Phe His Trp Lys Asp Tyr Asp Pro Gly Asp
20 25 30
Thr Ala Gly Leu Lys Ser Lys Val Glu Ala Gln Glu Leu Leu Ala Ala
35 40 45
Gly Ile Lys Lys Leu Ala Ala Tyr Gln Asp Val Leu Tyr Ala Gln Asn
50 55 60
Ile Tyr Gly Leu Leu Ile Ile Phe Gln Ala Met Asp Ala Ala Gly Lys
65 70 75 80
Asp Ser Thr Ile Lys His Val Met Ser Gly Leu Asn Pro Gln Ala Cys
85 90 95
Arg Val Tyr Ser Phe Lys Ala Pro Ser Ala Glu Glu Leu Asp His Asp
100 105 110
Phe Leu Trp Arg Ala Asn Arg Ala Leu Pro Glu Arg Gly Cys Ile Gly
115 120 125
Ile Phe Asn Arg Ser Tyr Tyr Glu Glu Val Leu Val Val Arg Val His
130 135 140
Pro Asp Leu Leu Asn Arg Gln Gln Leu Pro Pro Glu Thr Lys Thr Lys
145 150 155 160
His Ile Trp Lys Glu Arg Phe Glu Asp Ile Asn His Tyr Glu Arg Tyr
165 170 175
Leu Thr Arg Asn Gly Ile Leu Ile Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser
180 185 190
Lys Ala Glu Gln Lys Lys Arg Phe Leu Glu Arg Ile Ser Arg Pro Glu
195 200 205
Lys Asn Trp Lys Phe Ser Ile Glu Asp Val Arg Asp Arg Ala His Trp
210 215 220
Asp Asp Tyr Gln Gln Ala Tyr Ala Asp Val Phe Arg His Thr Ser Thr
225 230 235 240
Lys Trp Ala Pro Trp His Ile Ile Pro Ala Asn His Lys Trp Phe Ala
245 250 255
Arg Leu Met Val Ala His Phe Ile Tyr Gln Lys Leu Ala Ser Leu Asn
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<212> PRT
<213> 嗜热厌氧绳菌
<400> 5
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Val Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Lys His Lys Val Leu Val
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Ile Leu Gln Gly Met Asp Thr Ser Gly Lys Asp Gly Val Ile Arg Ser
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Val Phe Glu Gly Val Asn Pro Gln Gly Val Lys Val Ala Asn Phe Lys
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Val Pro Thr Gln Glu Glu Leu Asp His Asp Tyr Leu Trp Arg Val His
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Lys Val Val Pro Gly Lys Gly Glu Ile Val Ile Phe Asn Arg Ser His
115 120 125
Tyr Glu Asp Val Leu Val Val Arg Val His Asn Leu Val Pro Pro Glu
130 135 140
Val Trp Lys Lys Arg Tyr Glu Gln Ile Asn Gln Phe Glu Arg Leu Leu
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His Glu Thr Gly Thr Thr Ile Leu Lys Phe Phe Leu Phe Ile Ser Arg
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Glu Glu Gln Lys Gln Arg Leu Leu Glu Arg Leu Ala Asp Pro Ala Lys
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Glu Tyr Glu Lys Ala Tyr Glu Asp Val Leu Ser Arg Thr Ser Thr Glu
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Tyr Ala Pro Trp Ile Leu Val Pro Ala Asp Lys Lys Trp Tyr Arg Asp
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<212> PRT
<213> 嗜气暖绳菌
<400> 6
Met Asp Val Asp Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Ser Thr Ile His Leu
1 5 10 15
Ser Gln Trp Pro Pro Asp Asp Arg Ser Leu Tyr Glu Gly Asp Lys Lys
20 25 30
Gln Gly Lys Gln Asp Leu Ser Ala Leu Asn Arg Arg Leu Glu Thr Leu
35 40 45
Gln Glu Leu Leu Tyr Ala Glu Gly Lys His Lys Val Leu Ile Ile Leu
50 55 60
Gln Gly Met Asp Thr Ser Gly Lys Asp Gly Val Ile Arg His Val Phe
65 70 75 80
Asn Gly Val Asn Pro Gln Gly Val Lys Val Ala Ser Phe Lys Val Pro
85 90 95
Thr Ala Val Glu Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Ile His Arg Gln
100 105 110
Thr Pro Gly Ser Gly Glu Ile Val Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu
115 120 125
Asp Val Leu Val Val Arg Val His Gly Leu Val Pro Pro Glu Val Trp
130 135 140
Ala Arg Arg Tyr Glu His Ile Asn Ala Phe Glu Lys Leu Leu Val Asp
145 150 155 160
Glu Gly Thr Thr Ile Leu Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu
165 170 175
Gln Arg Gln Arg Leu Leu Glu Arg Leu Glu Met Pro Glu Lys Arg Trp
180 185 190
Lys Phe Ser Val Gly Asp Leu Ala Glu Arg Lys Arg Trp Asp Glu Tyr
195 200 205
Met Ala Ala Tyr Glu Ala Val Leu Ser Lys Thr Ser Thr Glu Tyr Ala
210 215 220
Pro Trp Tyr Ile Val Pro Ser Asp Arg Lys Trp Tyr Arg Asn Leu Val
225 230 235 240
Ile Ser His Val Ile Ile Asn Ala Leu Glu Gly Leu Asn Met Arg Tyr
245 250 255
Pro Gln Pro Glu Asp Ile Ala Phe Asp Thr Ile Val Ile Glu
260 265 270
<210> 7
<211> 294
<212> PRT
<213> Chlorobaculum tepidum
<400> 7
Met Lys Leu Asp Leu Asp Ala Phe Arg Ile Gln Pro Gly Lys Lys Pro
1 5 10 15
Asn Leu Ala Lys Arg Pro Thr Arg Ile Asp Pro Val Tyr Arg Ser Lys
20 25 30
Gly Glu Tyr His Glu Leu Leu Ala Asn His Val Ala Glu Leu Ser Lys
35 40 45
Leu Gln Asn Val Leu Tyr Ala Asp Asn Arg Tyr Ala Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Phe Gln Ala Met Asp Ala Ala Gly Lys Asp Ser Ala Ile Lys His Val
65 70 75 80
Met Ser Gly Val Asn Pro Gln Gly Cys Gln Val Tyr Ser Phe Lys His
85 90 95
Pro Ser Ala Thr Glu Leu Glu His Asp Phe Leu Trp Arg Thr Asn Cys
100 105 110
Val Leu Pro Glu Arg Gly Arg Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Tyr Tyr
115 120 125
Glu Glu Val Leu Val Val Arg Val His Pro Glu Ile Leu Glu Met Gln
130 135 140
Asn Ile Pro His Asn Leu Ala His Asn Gly Lys Val Trp Asp His Arg
145 150 155 160
Tyr Arg Ser Ile Val Ser His Glu Gln His Leu His Cys Asn Gly Thr
165 170 175
Arg Ile Val Lys Phe Tyr Leu His Leu Ser Lys Glu Glu Gln Arg Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Glu Arg Ile Asp Asp Pro Asn Lys Asn Trp Lys Phe Ser
195 200 205
Thr Ala Asp Leu Glu Glu Arg Lys Phe Trp Asp Gln Tyr Met Glu Ala
210 215 220
Tyr Glu Ser Cys Leu Gln Glu Thr Ser Thr Lys Asp Ser Pro Trp Phe
225 230 235 240
Ala Val Pro Ala Asp Asp Lys Lys Asn Ala Arg Leu Ile Val Ser Arg
245 250 255
Ile Val Leu Asp Thr Leu Glu Ser Leu Asn Leu Lys Tyr Pro Glu Pro
260 265 270
Ser Pro Glu Arg Arg Lys Glu Leu Leu Asp Ile Arg Lys Arg Leu Glu
275 280 285
Asn Pro Glu Asn Gly Lys
290
<210> 8
<211> 269
<212> PRT
<213> 深海洋栖热袍菌
<400> 8
Met Asp Val Ser Arg Tyr Arg Val Pro Pro Gly Ser Gly Phe Asp Pro
1 5 10 15
Glu Ala Trp Pro Thr Arg Glu Asp Asp Asp Phe Ala Gly Gly Lys Lys
20 25 30
Glu Ala Lys Lys Glu Leu Ala Arg Leu Ala Val Arg Leu Gly Glu Leu
35 40 45
Gln Ala Arg Leu Tyr Ala Glu Gly Arg Gln Ala Leu Leu Ile Val Leu
50 55 60
Gln Gly Met Asp Thr Ala Gly Lys Asp Gly Thr Ile Arg His Val Phe
65 70 75 80
Arg Ala Val Asn Pro Gln Gly Val Arg Val Thr Ser Phe Lys Lys Pro
85 90 95
Thr Ala Leu Glu Leu Ala His Asp Tyr Leu Trp Arg Val His Arg His
100 105 110
Ala Pro Ala Arg Gly Glu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu
115 120 125
Asp Val Leu Val Val Arg Val His Glu Leu Val Pro Pro Glu Val Trp
130 135 140
Gly Arg Arg Tyr Asp His Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Ala Asp
145 150 155 160
Glu Gly Thr Arg Ile Val Lys Phe Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu
165 170 175
Gln Lys Arg Arg Leu Glu Ala Arg Leu Glu Asn Pro Arg Lys His Trp
180 185 190
Lys Phe Asn Pro Ala Asp Leu Ser Glu Arg Ala Arg Trp Gly Asp Tyr
195 200 205
Ala Ala Ala Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Arg Thr Ser Ser Asp Arg Ala
210 215 220
Pro Trp Tyr Ala Val Pro Ala Asp Arg Lys Trp Gln Arg Asn Arg Ile
225 230 235 240
Val Ala Gln Val Leu Val Asp Ala Leu Glu Ala Met Asp Pro Arg Phe
245 250 255
Pro Arg Val Asp Phe Asp Pro Ala Ser Val Arg Val Glu
260 265
<210> 9
<211> 290
<212> PRT
<213> Roseiflexus castenholzii
<400> 9
Met Tyr Ala Gln Arg Val Val Pro Gly Met Arg Val Arg Leu His Asp
1 5 10 15
Ile Asp Pro Asp Ala Asn Gly Gly Leu Asn Lys Asp Glu Gly Arg Ala
20 25 30
Arg Phe Ala Glu Leu Asn Ala Glu Leu Asp Val Met Gln Glu Glu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Gly Ile His Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Gly Met Asp
50 55 60
Thr Ala Gly Lys Asp Gly Ala Ile Arg Asn Val Met Leu Asn Leu Asn
65 70 75 80
Pro Gln Gly Cys Arg Val Glu Ser Phe Lys Val Pro Thr Glu Glu Glu
85 90 95
Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Val His Arg Val Val Pro Arg Lys
100 105 110
Gly Met Val Gly Val Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu Val
115 120 125
Val Arg Val His Ser Leu Val Pro Glu Ser Val Trp Arg Ala Arg Tyr
130 135 140
Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Ala Asp Thr Gly Thr Ile
145 150 155 160
Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Glu Glu Gln Glu Gln Arg
165 170 175
Leu Leu Ala Arg Glu Arg Asp Val Ser Lys Ala Trp Lys Leu Ser Ala
180 185 190
Gly Asp Trp Arg Glu Arg Ala Phe Trp Asp Asp Tyr Met Ala Ala Tyr
195 200 205
Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Asp Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile
210 215 220
Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu Ala
225 230 235 240
Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Arg Arg Ala Leu
245 250 255
Asp Ala Met Ser Arg Ala Arg Arg Ala Glu Leu Glu Ala Phe Arg Ala
260 265 270
Glu Gln His Ala Met Glu Gly Arg Pro Gln Gly Ala Gly Gly Val Ser
275 280 285
Arg Arg
290
<210> 10
<211> 282
<212> PRT
<213> 玫瑰弯菌属种
<400> 10
Met His Tyr Ala His Thr Val Ile Pro Gly Thr Gln Val Arg Leu Arg
1 5 10 15
Asp Ile Asp Pro Asp Ala Ser Gly Gly Leu Thr Lys Asp Glu Gly Arg
20 25 30
Glu Arg Phe Ala Ser Phe Asn Ala Thr Leu Asp Ala Met Gln Glu Glu
35 40 45
Leu Tyr Ala Ala Gly Val His Ala Leu Leu Leu Ile Leu Gln Gly Met
50 55 60
Asp Thr Ala Gly Lys Asp Gly Ala Ile Arg Asn Val Met His Asn Leu
65 70 75 80
Asn Pro Gln Gly Cys Arg Val Glu Ser Phe Lys Val Pro Thr Glu Glu
85 90 95
Glu Leu Ala His Asp Phe Leu Trp Arg Val His Lys Val Val Pro Arg
100 105 110
Lys Gly Met Val Gly Val Phe Asn Arg Ser His Tyr Glu Asp Val Leu
115 120 125
Val Val Arg Val His Ser Leu Val Pro Glu His Val Trp Arg Ala Arg
130 135 140
Tyr Asp Gln Ile Asn Ala Phe Glu Arg Leu Leu Thr Asp Thr Gly Thr
145 150 155 160
Ile Ile Val Lys Cys Phe Leu His Ile Ser Lys Asp Glu Gln Glu Lys
165 170 175
Arg Leu Leu Ala Arg Glu Gln Asp Val Thr Lys Ala Trp Lys Leu Ser
180 185 190
Ala Gly Asp Trp Arg Glu Arg Glu Arg Trp Asp Glu Tyr Met Ala Ala
195 200 205
Tyr Glu Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ser Thr Glu Tyr Ala Pro Trp Tyr
210 215 220
Ile Ile Pro Ala Asn Arg Lys Trp Tyr Arg Asp Leu Ala Ile Ser Glu
225 230 235 240
Val Leu Val Glu Thr Leu Arg Pro Tyr Arg Asp Asp Trp Gln Arg Ala
245 250 255
Leu Asp Ala Met Ser Gln Ala Arg Leu Ala Glu Leu Lys Ala Phe Arg
260 265 270
His Gln Gln Thr Ala Gly Ala Thr Arg Leu
275 280
<210> 11
<211> 274
<212> PRT
<213> Truepera radiovictrix
<400> 11
Met Ser Gln Gly Ser Ala Lys Gly Leu Gly Lys Leu Asp Lys Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ala Arg Glu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Glu Leu Val Lys Leu Gln
20 25 30
Gly Trp Ile Lys Ala Gln Gly Leu Lys Val Val Val Leu Phe Glu Gly
35 40 45
Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly Ser Thr Ile Thr Arg Ile Thr Gln Pro
50 55 60
Leu Asn Pro Arg Val Cys Arg Val Val Ala Leu Gly Ala Pro Thr Glu
65 70 75 80
Arg Glu Arg Thr Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Val His His Leu Pro
85 90 95
Ala Ala Gly Glu Met Val Leu Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala
100 105 110
Gly Val Glu Arg Val Met Gly Phe Cys Thr Glu Ala Glu Tyr Arg Glu
115 120 125
Phe Leu His Ala Cys Pro Thr Phe Glu Arg Leu Leu Leu Asp Ala Gly
130 135 140
Ile Ile Leu Ile Lys Tyr Trp Phe Ser Val Ser Ala Ala Glu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Arg Met Arg Arg Arg Asn Glu Asn Pro Ala Lys Arg Trp Lys Leu
165 170 175
Ser Pro Met Asp Leu Glu Ala Arg Ala Arg Trp Val Ala Tyr Ser Lys
180 185 190
Ala Lys Asp Ala Met Phe Tyr His Thr Asp Thr Lys Ala Ser Pro Trp
195 200 205
Tyr Val Val Asn Ala Glu Asp Lys Arg Arg Ala His Leu Ser Cys Ile
210 215 220
Ala His Leu Leu Ser Leu Ile Pro Tyr Glu Asp Leu Thr Pro Pro Pro
225 230 235 240
Leu Glu Met Pro Pro Arg Asp Leu Ala Gly Ala Asp Glu Gly Tyr Glu
245 250 255
Arg Pro Asp Lys Ala His Gln Thr Trp Val Pro Asp Tyr Val Pro Pro
260 265 270
Thr Arg
<210> 12
<211> 186
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌
<400> 12
Met Asp Val Gly Gln Ala Val Ile Phe Leu Gly Pro Pro Gly Ala Gly
1 5 10 15
Lys Gly Thr Gln Ala Ser Arg Leu Ala Gln Glu Leu Gly Phe Lys Lys
20 25 30
Leu Ser Thr Gly Asp Ile Leu Arg Asp His Val Ala Arg Gly Thr Pro
35 40 45
Leu Gly Glu Arg Val Arg Pro Ile Met Glu Arg Gly Asp Leu Val Pro
50 55 60
Asp Asp Leu Ile Leu Glu Leu Ile Arg Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val
65 70 75 80
Ile Phe Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Ala Gln Ala Glu Ala Leu Asp
85 90 95
Arg Leu Leu Ser Glu Thr Gly Thr Arg Leu Leu Gly Val Val Leu Val
100 105 110
Glu Val Pro Glu Glu Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Arg Arg Ala Glu
115 120 125
Leu Glu Gly Arg Ser Asp Asp Asn Glu Glu Thr Val Arg Arg Arg Leu
130 135 140
Glu Val Tyr Arg Glu Lys Thr Glu Pro Leu Val Gly Tyr Tyr Glu Ala
145 150 155 160
Arg Gly Val Leu Lys Arg Val Asp Gly Leu Gly Thr Pro Asp Glu Val
165 170 175
Tyr Ala Arg Ile Arg Ala Ala Leu Gly Ile
180 185
<210> 13
<211> 208
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌
<400> 13
Met Arg Gly Ile Val Thr Ile Asp Gly Pro Ser Ala Ser Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ser Val Ala Arg Arg Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Pro Tyr Leu Ser
20 25 30
Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Ala Ala Ala Phe Leu Ala Leu Arg Ala Gly
35 40 45
Val Asp Pro Gly Asp Glu Glu Gly Leu Leu Ala Leu Leu Glu Gly Leu
50 55 60
Gly Val Arg Leu Leu Ala Gln Ala Glu Gly Asn Arg Val Leu Ala Asp
65 70 75 80
Gly Glu Asp Leu Thr Ser Phe Leu His Thr Pro Glu Val Asp Arg Val
85 90 95
Val Ser Ala Val Ala Arg Leu Pro Gly Val Arg Ala Trp Val Asn Arg
100 105 110
Arg Leu Lys Glu Val Pro Pro Pro Phe Val Ala Glu Gly Arg Asp Met
115 120 125
Gly Thr Ala Val Phe Pro Glu Ala Ala His Lys Phe Tyr Leu Thr Ala
130 135 140
Ser Pro Glu Val Arg Ala Trp Arg Arg Ala Arg Glu Arg Pro Gln Ala
145 150 155 160
Tyr Glu Glu Val Leu Arg Asp Leu Leu Arg Arg Asp Glu Arg Asp Lys
165 170 175
Ala Gln Ser Ala Pro Ala Pro Asp Ala Leu Val Leu Asp Thr Gly Gly
180 185 190
Met Thr Leu Asp Glu Val Val Ala Trp Val Leu Ala His Ile Arg Arg
195 200 205
<210> 14
<211> 225
<212> PRT
<213> 激烈火球菌
<400> 14
Met Arg Ile Val Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asn
1 5 10 15
Pro Asp Ile Asp Phe Ile Lys Glu Ile Ala Tyr Gln Leu Thr Lys Val
20 25 30
Ser Glu Asp His Glu Val Ala Val Val Val Gly Gly Gly Lys Leu Ala
35 40 45
Arg Lys Tyr Ile Glu Val Ala Glu Lys Phe Asn Ser Ser Glu Thr Phe
50 55 60
Lys Asp Phe Ile Gly Ile Gln Ile Thr Arg Ala Asn Ala Met Leu Leu
65 70 75 80
Ile Ala Ala Leu Arg Glu Lys Ala Tyr Pro Val Val Val Glu Asp Phe
85 90 95
Trp Glu Ala Trp Lys Ala Val Gln Leu Lys Lys Ile Pro Val Met Gly
100 105 110
Gly Thr His Pro Gly His Thr Thr Asp Ala Val Ala Ala Leu Leu Ala
115 120 125
Glu Phe Leu Lys Ala Asp Leu Leu Val Val Ile Thr Asn Val Asp Gly
130 135 140
Val Tyr Thr Ala Asp Pro Lys Lys Asp Pro Thr Ala Lys Lys Ile Lys
145 150 155 160
Lys Met Lys Pro Glu Glu Leu Leu Glu Ile Val Gly Lys Gly Ile Glu
165 170 175
Lys Ala Gly Ser Ser Ser Val Ile Asp Pro Leu Ala Ala Lys Ile Ile
180 185 190
Ala Arg Ser Gly Ile Lys Thr Ile Val Ile Gly Lys Glu Asp Ala Lys
195 200 205
Asp Leu Phe Arg Val Ile Lys Gly Asp His Asn Gly Thr Thr Ile Glu
210 215 220
Pro
225
<210> 15
<211> 207
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌
<400> 15
Met Lys Gly Gln Leu Phe Val Ile Cys Gly Pro Ser Gly Ala Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ser Ile Ile Lys Glu Val Leu Lys Arg Leu Asp Asn Val Val Phe
20 25 30
Ser Val Ser Cys Thr Thr Arg Pro Lys Arg Pro His Glu Glu Asp Gly
35 40 45
Lys Asp Tyr Phe Phe Ile Thr Glu Glu Glu Phe Leu Lys Arg Val Glu
50 55 60
Arg Gly Glu Phe Leu Glu Trp Ala Arg Val His Gly His Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Leu Arg Ser Phe Val Glu Ser His Ile Asn Glu Gly Lys Asp Val
85 90 95
Val Leu Asp Ile Asp Val Gln Gly Ala Leu Ser Val Lys Lys Lys Tyr
100 105 110
Ser Asn Thr Val Phe Ile Tyr Val Ala Pro Pro Ser Tyr Ala Asp Leu
115 120 125
Arg Glu Arg Ile Leu Lys Arg Gly Thr Glu Lys Glu Ala Asp Val Leu
130 135 140
Val Arg Leu Glu Asn Ala Lys Trp Glu Leu Met Phe Met Asp Glu Phe
145 150 155 160
Asp Tyr Ile Val Val Asn Glu Asn Leu Glu Asp Ala Val Glu Met Val
165 170 175
Val Ser Ile Val Arg Ser Glu Arg Ala Lys Val Thr Arg Asn Gln Asp
180 185 190
Lys Ile Glu Arg Phe Lys Met Glu Val Lys Gly Trp Lys Lys Leu
195 200 205
<210> 16
<211> 142
<212> PRT
<213> 风产液菌
<400> 16
Met Ala Val Glu Arg Thr Leu Ile Ile Val Lys Pro Asp Ala Met Glu
1 5 10 15
Lys Gly Ala Leu Gly Lys Ile Leu Asp Arg Phe Ile Gln Glu Gly Phe
20 25 30
Gln Ile Lys Ala Leu Lys Met Phe Arg Phe Thr Pro Glu Lys Ala Gly
35 40 45
Glu Phe Tyr Tyr Val His Arg Glu Arg Pro Phe Phe Gln Glu Leu Val
50 55 60
Glu Phe Met Ser Ser Gly Pro Val Val Ala Ala Val Leu Glu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ile Lys Arg Val Arg Glu Ile Ile Gly Pro Thr Asp Ser Glu
85 90 95
Glu Ala Arg Lys Val Ala Pro Asn Ser Ile Arg Ala Gln Phe Gly Thr
100 105 110
Asp Lys Gly Lys Asn Ala Ile His Ala Ser Asp Ser Pro Glu Ser Ala
115 120 125
Gln Tyr Glu Ile Cys Phe Ile Phe Ser Gly Leu Glu Ile Val
130 135 140

Claims (26)

1.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育二磷酸核苷(NDP)、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含一种或多种NDP激酶。
2.权利要求1的方法，其进一步包括：
在适合于生成所述NDP的条件下在反应混合物中温育5’单磷酸核苷(5’NMP)、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含一种或多种NMP激酶。
3.权利要求1或2的方法，其进一步包括：
(a)在适合于生成所述5’NDP的条件下，在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)和多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)以及无机磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含解旋酶；或者
(b)在适合于生成所述5’NMP的条件下，在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)和核糖核酸酶。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其包括：
在适合于生成感兴趣RNA的条件下在反应混合物中温育所述NTP、编码所述感兴趣RNA的DNA模板和RNA聚合酶。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述NDP包含ADP、GDP、CDP和/或UDP。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述NDP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。
7.权利要求2-6中任一项的方法，其中所述5′NMP包含5′AMP、5′GMP、5′CMP和/或5′UMP。
8.权利要求2-7中任一项的方法，其中所述5'NMP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1或PPK2家族酶，任选地其中所述多磷酸激酶(PPK)包含来自地热异常球菌(Deinococcus geothermalis)的III类PPK2(SEQ ID NO.:1)。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中
(a)从表达或生成所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶、所述PNP酶、所述核糖核酸酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶、所述PNP酶、所述核糖核酸酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶；或者
(b)所述反应混合物包含来自表达或生成所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述NDP激酶、所述PNP酶、所述核糖核酸酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物，任选地其中已经消除所述细胞裂解物中的酶的天然酶促活性，并且任选地其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌、蛋白酶靶向、温度、pH、盐、去污剂、醇、化学抑制剂、分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。
12.权利要求11的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、一种或多种NMP激酶和/或一种或多种NDP激酶能经受住消除条件。
14.权利要求3-13中任一项的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA，并且任选地其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
15.用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
(a)在适合于生成5'单磷酸核苷(NMP)的条件下在反应混合物中温育细胞RNA和核糖核酸酶(RNA酶)；
(b)消除所述RNA酶；和
(c)在适合于生成感兴趣RNA的条件下在所述反应混合物或第二反应混合物中温育所述NMP、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码所述感兴趣RNA的脱氧核糖核酸(DNA)模板和RNA聚合酶，任选地其中步骤(c)的反应混合物进一步包含一种或多种NMP激酶和/或一种或多种NDP激酶。
16.一种用于生成核糖核酸(RNA)的方法，其包括：
(a)在适合于生成5’二磷酸核苷(NDP)的条件下在反应混合物中温育细胞RNA、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)和无机磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含解旋酶，
(b)消除所述PNP酶；和
(c)在适合于生成感兴趣RNA的条件下在所述反应混合物或第二反应混合物中温育所述NDP、多磷酸激酶、多磷酸盐、编码感兴趣RNA的脱氧核糖核酸(DNA)模板和RNA聚合酶，任选地其中步骤(c)的反应混合物进一步包含一种或多种NDP激酶。
17.权利要求15的方法，其中所述RNA酶是核酸酶P1或RNA酶R。
18.权利要求15或16的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA，任选地其中所述细胞RNA来自单细胞生物体或多细胞生物体。
19.权利要求15至18中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1或PPK2家族酶，并且任选地其中所述多磷酸激酶(PPK)包含来自地热异常球菌的III类PPK2(SEQ ID NO.1)。
20.权利要求15-19中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。
21.权利要求15至20中任一项的方法，其中从表达所述RNA酶或PNP酶的细胞制备所述RNA酶或PNP酶，或者其中(a)的反应混合物包含从表达所述RNA酶或PNP酶的细胞制备的细胞裂解物或酶制备物。
22.权利要求15-21中任一项的方法，其中步骤(b)包括经由温度、pH、盐、去污剂、醇、化学抑制剂、分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述RNA酶或PNP酶。
23.权利要求15至22中任一项的方法，其中从表达或生成所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶，或其中步骤(a)或步骤(c)的反应混合物包含从表达或生成所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶的细胞制备的细胞裂解物或酶制备物。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中已经消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性，并且任选地其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌、蛋白酶靶向、温度、pH、盐、去污剂、醇、化学抑制剂、分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物或酶制备物中酶的天然酶促活性。
25.权利要求24的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。
26.权利要求15至25中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶和/或所述RNA聚合酶能经受住消除条件。
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