BR112021005791A2 - controle de insetos coleópteros - Google Patents

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Abstract

CONTROLE DE INSETOS COLEÓPTEROS. São proporcionados aqui métodos para usar moléculas de RNAi direcionadas a um gene Inibidor da Apoptose para controle de insetos coleópteros, métodos para produzir moléculas de RNAi direcionadas a IAP, e composições compreendendo moléculas de RNAi direcionadas a IAP.

Description

“CONTROLE DE INSETOS COLEÓPTEROS” PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica o benefício sob o 35 U.S.C. § 119(e) do Número do Pedido US Provisório 62/737,041, depositado em 26 de setembro de 2018, cujo conteúdo é incorporado aqui para fins de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O besouro-da-batata-do-Colorado (Leptinotarsa decemlineata) é a principal praga do cultivo de batata. Estima-se que os custos anuais do controle do besouro-da-batata-do-Colorado estejam em dezenas de milhões de dólares, com custos anuais projetados de perda de safra chegando a bilhões de dólares se o besouro-da-batata-do-Colorado não for controlado. Além disso, o controle do besouro-da-batata-do-Colorado é complicado devido à sua resistência a diversas substâncias químicas e inseticidas. Consequentemente, novas formas de se controlar o besouro-da-batata-do-Colorado são necessárias.
SUMÁRIO
[003] A presente revelação proporciona, em alguns aspectos, composições, construções gênicas, e métodos para controlar a infestação pelo besouro-da-batata- do-Colorado. Ara reduzir nossa dependência de inseticidas químicos de amplo espectro e seus problemas relacionados, são necessários pesticidas de risco reduzido. Uma nova tecnologia que oferece a promessa de uma abordagem de risco reduzido para o controle de insetos-pragas é a interferência por RNA (RNAi). Em algumas modalidades, a presente revelação proporciona tecnologias baseadas em RNAi capazes de atenuar os danos causados pelo besouro-da-batata-do-Colorado por meio da distribuição de moléculas de interferência (RNAi) de ácido ribonucleico (RNA) que se direcionam a (por exemplo, se ligam a) e interferem no RNA mensageiro (mRNA) de um gene Inibidor da Apoptose do besouro-da-batata-do- Colorado.
[004] A apoptose é uma via evolucionária conservada de suicídio celular que é crucial para o desenvolvimento normal das células e a homeostase. Os reguladores-chaves da apoptose são os IAPs. Os IAPs foram descobertos em baculovírus de insetos (vírus da granulose de Cydia pomonella e vírus da poliedrose nuclear de Orgyia pseudotsugata), e desde então foram identificados em diversos outros organismos, tais como vírus iridescentes do mosquito, insetos, levedura e humanos. Muitos IAPs bloqueiam a apoptose quando superexpressos em células de outras espécies. A redução da expressão por “knockdown” dos IAPs através da interferência por RNA tipicamente induz a apoptose. Consulte, por exemplo, Pridgeon JW et al. J Med Entomol 2008; 45(3): 414-420.
[005] Estudos laboratoriais confirmaram que a distribuição oral de moléculas de RNA cujo modo de ação se dá através do processo de RNAi (por exemplo, RNA de fita dupla (dsRNA)) é eficaz para diversas espécies de insetos, e, portanto, o dsRNA tópico é considerado uma forma de distribuição adequada. Entretanto, hoje em dia não existe tecnologia de controle de insetos-pragas por dsRNA por pulverização. Custo da produção do dsRNA a um custo relativamente baixo representa um enorme desafio para a indústria de biotecnologia agrícola. Para pragas agrícolas, plantas transgênicas que podem expressas dsRNA inseticida podem proteger as plantas de herbívoros insetos. Entretanto, nem todos os países estão receptivos a culturas modificadas geneticamente, e aplicação por pulverização do dsRNA está sendo considerada como um método de proteção de distribuição alternativo.
[006] Para identificar alvos para redução da expressão por RNAi, toda a informação do genoma foi usada para identificar a sequência gênica apropriada para IPA na espécie alvo (Leptinotarsa decemlineata), que, quando silenciada seletivamente, controla essas pragas-chaves, sem afetar adversamente espécies diferentes do alvo no ecossistema da agricultura de batata. Dada uma sequência de
DNA de interesse e um conjunto de regras de critérios de design para as sequências de saída, um algoritmo computacional proprietário foi combinado com ferramentas de design de RNAi publicamente disponíveis, para criar sequências de saída que atendam a esses critérios. A região original/inicial selecionada para projetar o dsRNA foi identificada pesquisando bancos de dados de sequências abrangentes em busca de genomas de Tribolium e Drosófilas (por exemplo, Flybase, SnapDragon, Beetlebase, etc.). A ferramenta E-RNAi publicamente disponível, que pode ser usada para projetar dsRNA usando uma abordagem baseada em siRNA predita, foi combinada com algoritmos proprietários para criar o fluxo de trabalho de design.
Este fluxo de trabalho de design foi então usado para criar sequências de dsRNA longas específicas de um (a) comprimento desejado, (b) percentual de identidade desejado com a sequência original (por meio da introdução de mutações aleatórias), e (c) seccionando a sequência gênica de IPA inicial em múltiplos fragmentos.
[007] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi compreendem RNA de fita simples (ssRNA), e em algumas modalidades, as moléculas de RNAi compreendem RNA de fita dupla (dsRNA) ou parcialmente dsRNA. Em ainda outras modalidades, as moléculas de RNAi podem ser moléculas de RNA de fita simples com estrutura secundária contendo caráter de fita dupla significativo, tal como, mas não limitado a RNA em grampo. A presente revelação proporciona RNA, por exemplo, RNA de fita simples (ssRNA), RNA interferente pequeno (sRNA), micro- RNA (miRNA), RNA mensageiro (mRNA), RNA em grampo curto (shRNA) ou RNA de fita dupla (dsRNA) para direcionar ao mRNA IAP.
[008] O RNA IAP, em algumas modalidades, é eficaz na redução da expressão de IAP em um inseto, raquitismo de larvas, inibição do crescimento, reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade) e/ou reparação do inseto, extermínio das larvas ou do inseto, e diminuição da alimentação do inseto.
Consequentemente, um aspecto da presente revelação proporciona um método para controle de um inseto compreendendo distribuir (por exemplo, por em contato) uma quantidade eficaz de um RNA de direcionamento ao IAP a uma planta e/ou um inseto. O RNA IAP é particularmente útil para controlar um inseto coleóptero (por exemplo, besouro-da-batata-do-Colorado), dessa forma reduzindo e/ou prevenindo a infestação de certas plantas (por exemplo, uma batata), que são uma importante fonte alimentícia para humanos.
[009] Alguns aspectos da presente revelação também proporcionam métodos livres de células para produção de RNA de direcionamento ao IAP, o método compreendendo: (a) incubar, em uma mistura de reação, RNA celular, e uma ribonuclease sob condições apropriadas para a produção de 5′ nucleosídeos monofosfatos (5′ NMPs); (b) eliminar a ribonuclease; e (c) incubar a mistura de reação, ou em uma segunda mistura de reação, os 5’ NMPs, uma polifosfato quinase, um polifosfato, uma polimerase, e um DNA (também chamado de DNA molde) sob condições apropriadas para a produção do RNA de direcionamento ao IAP a partir do DNA.
[010] Também são proporcionadas aqui composições compreendendo um RNA de direcionamento ao IAP. Em algumas modalidades, a composição compreendendo um RNA de direcionamento ao IAP adicionalmente compreende um aditivo, por exemplo, uma substância química, um pesticida, um tensoativo, um produto biológico, ou outro ingrediente que não seja de pesticida. Em algumas modalidades, o RNA de direcionamento ao IPA é proporcionado em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, um RNA de direcionamento ao IAP é proporcionado em uma planta ou célula vegetal.
[011] Deve-se entender que uma “molécula de RNAi direcionando ao IAP” engloba “moléculas de RNAi direcionando ao mRNA codificado por IAP”. Uma molécula de RNAi é considerada como direcionando a um gene de interesse se a molécula de RNAi se ligar a (por exemplo, se ligar de forma temporária a) e inibir
(reduzir ou bloquear) a translação do mRNA, por exemplo, devido à degradação do mRNA. Em algumas modalidades, se houver alterações epigenéticas, uma molécula de RNAi pode inibir a expressão do mRNA codificado pelo gene de interesse. Deve- se entender ainda que, em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA de fita dupla (por exemplo, dsRNA GS3) que inibe a expressão de uma região de codificação do gene (por exemplo, IAP). Em outras modalidades, o polinucleotídeo é uma sequência de DNA que codifica um dsRNA. Em ainda outras modalidades, o polinucleotídeo é um RNA antissenso (antisense). Deve-se entender que as sequências aqui reveladas como sequências de DNA podem ser convertidas a partir de uma sequência de DNA para uma sequência de RNA substituindo-se cada timidina por uma uracila.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[012] As FIGs. 1A a 1B incluem gráficos ilustrando o percentual de mortalidade de besouros-da-batata-do-Colorado (CPBs) (FIG. 1A) e o percentual de consumo de disco de folha por CPBs (FIG. 1B) após uma exposição de nove dias dos CPBs tanto a uma composição RNAi IAP (GS3) da presente revelação (contendo um RNA de fita dupla (dsRNA) direcionando ao mRNA IAP) quanto a uma composição de RNAi controle (GS4) (concentração de 10 μg/cm2 de RNAi).
[013] As FIGs. 2A a 2B incluem gráficos ilustrando o percentual de mortalidade de besouros-da-batata-do-Colorado (CPBs) (FIG. 2A) e o percentual de consumo de disco de folha por CPBs (FIG. 2B) após um decurso temporal de dose- tentativa de oito dias em CPBs expostos, pelos primeiros três (3) dias, tanto a uma composição de IAP RNAi da presente revelação (GS3 a 1,0 μg/cm2, 0,1 μg/cm2, 0,01 μg/cm2, ou 0,001 μg/cm2) quanto a uma composição de RNAi controle (GS4 a 1,0 μg/cm2).
[014] As FIGs. 3A a 3B incluem gráficos mostrando o número de larvas de CPB vivas por planta (FIG. 3A) e o percentual de desfolhação plantar (FIG. 3B) após o tratamento da folha ou com uma composição de RNAi IAP da presente revelação (GS3), ou uma composição RNAi IAP seguido de irrigação (aproximadamente 500 mL de água por planta, simulando ½ polegada de chuva), uma composição de controle (controle +), ou nenhuma tratamento (não tratado).
[015] A FIG. 4 inclui um gráfico ilustrando o percentual de desfolhação plantar após o tratamento da folha em ensaios em campo com uma composição de RNAi IAP da presente revelação (GS3), uma composição controle (controle +, por exemplo, CORAGEN®), e nenhum tratamento (não tratado).
[016] A FIG. 5 inclui um gráfico ilustrando o percentual de mortalidade de besouros-da-batata-do-Colorado (CPBs) nove dias após a exposição oral a uma composição de RNAi que inclui um RNA de fita dupla (dsRNA) que direciona a um mRNA IAP codificado por uma região terminal 5’ do DNA IAP (GS167), uma composição de RNAi que inclui um dsRNA que direciona a um mRNA IAP codificado por uma região central do DNA IAP (GS168), uma composição de RNAi que inclui um dsRNA que direciona a um mRNA IAP codificado por uma região terminal 3’ do DNA IAP (GS169), ou uma composição de RNAi de controle negativo (GS4) (n=2)
[017] As FIGs. 6A a 6B incluem gráficos ilustrando o percentual de mortalidade dos CPBs nove dias após a exposição oral a uma composição de RNAi que inclui um dsRNA que direciona ao mRNA IAP. O dsRNA variou de tamanho, com GS3 tendo um comprimento de 432 nucleotídeos, GS176 tendo um comprimento de 200 nucleotídeos, GS177 tendo um comprimento de 150 nucleotídeos, G178 tendo um comprimento de 100 nucleotídeos (FIG. 6A), GS179 tendo um comprimento de 74 nucleotídeos, com 50 nucleotídeos complementares, e GS193 tendo um comprimento de 49 nucleotídeos com 25 nucleotídeos complementares (FIG. 6B). Uma composição de RNAi de controle negativo (GS4) foi adicionalmente avaliada.
[018] A FIG. 7 inclui um gráfico ilustrando o percentual de mortalidade dos CPBs nove dias após a exposição oral a uma composição de RNAi que inclui um dsRNA que é 70% (GS170), 75% (GS171), 80% (GS172), 85% (GS173), 90% (GS174), ou 95% (GS175) complementar a um mRNA IAP ao longo de uma região com um comprimento de 432 nucleotídeos (GS3). Uma composição de RNAi de controle negativo (GS4) foi adicionalmente avaliada.
[019] A FIG. 8 inclui um gráfico ilustrando o nível de expressão relativa de mRNA IAP de larvas de CPB de primeiro ínstar alimentadas em GS3 e GS4 a 0,1 µg/cm2 por três dias e coletadas após três dias. A expressão relativa foi normalizada usando o gene RP4 de controle endógeno e calculada usando o método 2-ddCt.
[020] As FIGs. 9A a 9C incluem gráficos ilustrando o percentual de desfolhação plantar após o tratamento de folha em ensaios em campo com uma composição de RNAi IAP da presente revelação (GS3), composições controle positivo (padrões, por exemplo, CORAGEN®, ENTRUST®, NOVODOR®), e nenhum tratamento (controle não-tratado). Durante um período de vinte e um (21) dias.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[021] De acordo com alguns aspectos da presente revelação, moléculas de RNAi (por exemplo, dsRNAs) direcionadas ao IAP são eficazes em interferir no mRNA codificado por um gene IAP em células de insetos coleópteros, dessa forma reduzindo ou eliminando a tradução do mRNA (por exemplo, em sua proteína correspondente). Por conseguinte, em alguns aspectos, a presente revelação proporciona composições e métodos para controlar infestações por coleópteros colocando qualquer parte de uma planta (por exemplo, raiz, tubérculos, caule, galhos, folhas, flor, etc.), solo (por exemplo, solo, lama, grama, etc.), inseto coleóptero e/ou dieta (por exemplo, comida e/ou água ingerida) do inseto em contato com uma molécula de RNAi tal como oferecida aqui. Também são proporcionados aqui métodos livres de células para sintetizar moléculas de RNAi que direcionam a produtos gênicos IAP (mRNA).
[022] Um inseto coleóptero, como usado aqui, refere-se a um inseto coleóptero em qualquer estágio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, o inseto coleóptero é um ovo de inseto. Em algumas modalidades, o inseto coleóptero é uma larva de inseto. Em algumas modalidades, o inseto coleóptero é uma pupa de inseto. Em algumas modalidades, o inseto coleóptero é um inseto adulto.
[023] Um inseto coleóptero pode ser qualquer inseto coleóptero da ordem Coleoptera. Exemplos de insetos da ordem Coleoptera incluem, mas não se limitam a Chrysomelidae (besouro crisomelídeo), Curculionidae (gorgulho), Meloidae (besouro-da-bolha), Tenebrionidae (tenébrio), Scarabaeidae (besouro-do-esterco), Cerambycidae (besouro serrador de pinheiro japonês), Curculionidae (besouro do pinheiro-branco chinês), Nitidulidae (pequeno besouro das colmeias), Chrysomelidae (besoura das folhas de ombro largo), Cerambycidae (besouro de chifre longo da amora), Phyllotreta (besouro-pulga), Diabrotica (lagarta-da-raiz do milho) Chrysomela (besouro da folha do Álamo), Hypothenemus (broca-do-café), Sitophilus (erva-de-santa-maria), Epitrix (pulga do fumo), E. cucumeris (pulga-da-batata), P.
pusilla (pulga negra do ocidente); Anthonomus (gorgulho-da-pimenta), Hemicrepidus (larvas de elaterídeo), Melanotus (larva de elaterídeo), Ceutorhychus (pulgão-da- couve), Aeolus (larva de elaterídeo), Horistonotus (larva de elaterídeo da areia), Sphenophorus (gorgulho do milho), S. zea (gorgulho de Timothy), S. parvulus (gorgulho do pasto azul), S. callosus (gorgulho do milho do sul); Phyllophaga (larvas brancas), Chaetocnema (pulgão-do-milho), Popillia (besouro-japonês), Epilachna (besouro do feijão mexicano), Cerotoma (besouro da folha do feijão), Epicauta (besouro-da-bolha), Chrysomelidae (besouro crisomelídeo Agasicles hygrophila) e qualquer combinação dos mesmos.
[024] Além disso, o inseto coleóptero pode ser qualquer espécie de Leptinotarsa. A espécie Leptinotarsa inclui, mas não está limitada a Leptinotarsa decemlineata (besouro-da-batata-do-Colorado), Leptinotarsa behrensi, Leptinotarsa collinsi, Leptinotarsa defecta, Leptinotarsa haldemani (besouro da batata verde de Haldeman), Leptinotarsa heydeni, Leptinotarsa juncta (falso besouro-da-batata), Leptinotarsa lineolata (besouro da folha de Hymenoclea salsola), Leptinotarsa peninsularis, Leptinotarsa rubiginosa, Leptinotarsa texana, Leptinotarsa tlascalana, Leptinotarsa tumamoca e Leptinotarsa typographica.
Molécula de RNAi Direcionando ao Inibidor da Apoptose (IAP)
[025] Moléculas de RNAi direcionando ao IAP foram identificadas através do exame do mRNA IAP e testes in vivo (por exemplo, em plantas / em campo). Tais moléculas de RNAi direcionando ao IAP são úteis para controlar insetos coleópteros (por exemplo, besouros-da-batata-do-Colorado), por exemplo, inibindo ou reduzindo a expressão do IAP, e, consequentemente, aumentando a mortalidade dos insetos, bem como reduzindo o crescimento, reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade) e/ou alimentação (por exemplo, alimentação e/ou bebida) dos insetos coleópteros.
[026] A expressão de um gene em uma célula (por exemplo, célula de inseto), por exemplo, é considerada como sendo inibida ou reduzida através do contato com uma molécula de RNAi se o nível do mRNA e/ou proteína codificada pelo gene for reduzido na célula em pelo menos 10% em relação a uma célula de controle que não foi colocada em contato com a molécula de RNAi. Por exemplo, a distribuição para uma célula (por exemplo, colocar uma célula em contato) com uma molécula de RNAi (por exemplo, dsRNA) direcionando para IAP pode resultar em uma redução (por exemplo, em pelo menos 10%) na quantidade de transcrição de RNA e/ou proteína (por exemplo, codificada pelo gene IAP) comparado a uma célula que não é colocada em contato com uma molécula de RNAi direcionando para IAP.
[027] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi da presente revelação inibem especificamente a expressão de um gene IAP sem efeitos fora do alvo biologicamente significativos ou biologicamente relevantes (nenhuma alteração relevante ou significativa na expressão de genes não-IAP). Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi inibe especificamente (reduz ou bloqueia) a tradução de uma proteína IAP por meio da inibição específica da expressão de (por exemplo, degradação) um mRNA IAP (por exemplo, mRNA IAP da SEQ ID NO: 19) que codifica a proteína IAP. A inibição específica de um gene IAP inclui uma redução mensurável na expressão do gene IAP (por exemplo, expressão do mRNA IAP e/ou expressão de proteína IAP) ou uma ausência completa de expressão gênica detectável (por exemplo, expressão de mRNA IAP e/ou expressão de proteína IAP).
[028] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi da presente revelação inibem especificamente a expressão de um gene IAP sem efeitos fora do alvo biologicamente significativos ou biologicamente relevantes (nenhuma alteração relevante ou significativa na expressão de genes não-IAP). Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi inibe especificamente a expressão de uma proteína IAP por meio da inibição específica de um mRNA que codifica uma proteína IAP (por exemplo, mRNA IAP da SEQ ID NO: 19). A inibição específica de um gene IAP envolve uma redução mensurável na expressão do gene IAP (por exemplo, expressão do mRNA IAP e/ou expressão de proteína IAP) ou uma ausência completa de expressão gênica detectável (por exemplo, expressão de mRNA IAP e/ou expressão de proteína IAP).
[029] As moléculas de RNAi direcionando para IAP proporcionadas aqui, em algumas modalidades, são projetadas para ter complementaridade ao mRNA IAP de um inseto coleóptero, por exemplo, um besouro-da-batata-do-Colorado. Um exemplo de uma sequência de DNA codificando para IAP do besouro-da-batata-do-Colorado é proporcionado na sequência da SEQ ID NO: 1. Um exemplo de uma sequência de mRNA codificando para IAP do besouro-da-batata-do-Colorado é proporcionado na sequência da SEQ ID NO: 1. 19. Exemplos de sequências de mRNA IAP do besouro-da-batata-do-Colorado direcionadas por uma molécula de RNAi da presente revelação codificando são proporcionados nas sequências da SEQ ID NO: 19 a 21 e 23 a 26. Exemplos de uma molécula de RNA direcionando para IAP são proporcionados nas sequências da SEQ ID NO: 37 a 39 e 41 a 54.
[030] Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando para IAP proporcionada aqui é projetada para ter complementaridade ao mRNA IAP de um inseto coleóptero, por exemplo, um Chrysomelidae (um besouro crisomelídeo), um Curculionidae (um gorgulho), Meloidae (besouro-da-bolha), Tenebrionidae (tenébrio), Scarabaeidae (besouro-do-esterco), Cerambycidae (besouro serrador de pinheiro japonês), Curculionidae (besouro do pinheiro-branco chinês), Nitidulidae (pequeno besouro das colmeias), uma Chrysomelidae (besoura das folhas de ombro largo), uma Cerambycidae (besouro de chifre longo da amora), C. scripta (besouro da folha do Álamo), H. hampei (broca-do-café), S. Zeamais (erva-de-santa-maria), f. hirtipennis (pulga do fumo), F. cucumeris (pulga-da-batata), P. cruciferae (pulgão das crucíferas) e P. pusilla (pulga negra do ocidente), A. eugenii (gorgulho-da-pimenta), H. memnonius (larvas de elaterídeo), M. communis (larva de elaterídeo), C. assimilis (pulgão-da-couve), P. striolata (pulgão listrado), A. mellillus (larva de elaterídeo), A.
mancus (larva de elaterídeo do trigo), H. uhlerii (larva de elaterídeo da areia), S.
maidis (gorgulho do milho), S. zeae (gorgulho de Timothy), S. parvulus (gorgulho do pasto azul), e S. callosus (gorgulho do milho do sul), Phyllophaga spp. (Larvas brancas), C. pulicaria (pulgão-do-milho), P. japonica (besouro-japonês), F. varivestis (besouro do feijão mexicano), C. trifurcate (besouro da folha do feijão), F. pestifera e F. lemniscata (besouro-da-bolha), Oulema melanapus (besouro-da-folha de cereal), Hypera postica (gorgulho-da-Alfafa), Dendroctonus (besouro do pinheiro da montanha), Agrilus (broca cinza-esmeralda), Hylurgopinus (besouro da casca do olmo nativo), Scolytus (besouro da casca do olmo europeu) e/ou um Chrysomelidae (besouro crisomelídeo de Agasicles hygrophila).
[031] Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando para IAP proporcionada aqui é projetada para ter complementaridade com o mRNA IAP de um inseto Leptinotarsa, por exemplo, um Leptinotarsa decemlineata (um besouro-da- batata-do-Colorado), um Leptinotarsa behrensi, um Leptinotarsa collinsi, um Leptinotarsa defecta, um Leptinotarsa haldemani (um besouro-da-batata-verde de Haldeman), um Leptinotarsa heydeni, um Leptinotarsa juncta (um falso besouro-da- batata), um Leptinotarsa lineolata (um besouro da folha de Hymenoclea salsola), um Leptinotarsa peninsularis, um Leptinotarsa rubiginosa, um Leptinotarsa texana, um Leptinotarsa tlascalana, um Leptinotarsa tumamoca, e/ou um Leptinotarsa typographica.
[032] Um RNA de fita dupla (dsRNA) da presente revelação, em algumas modalidades, compreende uma primeira fita que se liga (por exemplo, é pelo menos parcialmente complementar a ou é totalmente complementar a) um RNA mensageiro (mRNA) codificado por um gene IAP de coleóptero, e uma segunda fita que é complementar à primeira fita.
[033] O dsRNA pode compreender fitas de RNA que possuem o mesmo comprimento ou comprimentos diferentes. Em algumas modalidades, um dsRNA compreende uma primeira fita (por exemplo, uma fita antissenso) que tem o mesmo comprimento que uma segunda fita (por exemplo, uma fita senso). Em algumas modalidades, um dsRNA compreende uma primeira fita (por exemplo, uma fita antissenso) que tem um comprimento diferente de uma segunda fita (por exemplo, uma fita senso). Uma primeira fita pode ser aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20% ou mais de 20% maior do que uma segunda fita. Uma primeira fita pode ser de 1 a 5, 2 a 5, 2 a 10, 5 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 20 ou mais de 20 nucleotídeos maior do que uma segunda fita.
[034] As moléculas de dsRNA também podem ser montadas a partir de um único oligonucleotídeo em uma estrutura em haste-alça, em que as regiões senso e antissenso autocomplementares da molécula de RNA são ligadas por meio de um ou mais conectores (linker) à base de ácido nucleico ou que não são à base de ácido nucleico, bem como o RNA de fita simples circular possuindo duas ou mais estruturas em alça e uma haste compreendendo fitas senso e antissenso autocomplementares, em que o RNA circular pode ser processado tanto in vivo quanto in vitro para gerar uma molécula de RNAi ativa capaz de mediar o RNAi.
Uma molécula de RNAi pode compreender uma protrusão 3' em uma extremidade da molécula. A outra extremidade pode ser cega ou também pode ter uma protrusão (5' ou 3') Quando a molécula de RNAi compreende uma protrusão em ambas as extremidades da molécula, o comprimento das protrusões pode ser igual ou diferente.
[035] Um RNA de fita simples da presente revelação, em algumas modalidades, compreende uma fita que se liga a um mRNA codificado por um gene IAP de coleópteros.
[036] As moléculas de RNAi direcionando para IAP, como proporcionadas aqui, podem variar quanto a seu comprimento. Deve-se entender que, em algumas modalidades, embora uma molécula de RNA longo (por exemplo, dsRNA ou ssRNA) seja aplicada (por exemplo, a uma planta) como o inseticida, após entrar nas células, este dsRNA é clivado pela enzima Dicer em fragmentos de RNA de fita dupla mais curtos com um comprimento de, por exemplo, 15 a 25 nucleotídeos. Assim, as moléculas de RNAi da presente revelação podem ser distribuídas como 15 a 25 fragmentos de nucleotídeos, por exemplo, ou podem ser distribuídas como ácidos nucleicos de fita dupla mais longos (por exemplo, de pelo menos 100 nucleotídeos).
[037] Assim, em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando para IAP compreendem de 15 a 1564 nucleotídeos (ssRNA) ou pares de bases de nucleotídeos (dsRNA). Por exemplo, uma molécula de RNAi da presente revelação compreende de 15 a 1000, 15 a 950, 15 a 900, 15 a 850, 15 a 800, 15 a 750, 15 a
700, 15 a 650, 15 a 600, 15 a 500, 15 a 450, 15 a 400, 15 a 350, 15 a 300, 15 a 250,
15 a 200, 15 a 150, 15 a 100, 15 a 50, 19 a 1000, 18 a 950, 18 a 900, 18 a 850, 18 a
800, 18 a 750, 18 a 700, 18 a 650, 18 a 600, 18 a 500, 18 a 450, 18 a 400, 18 a 350,
18 a 300, 18 a 250, 18 a 200, 18 a 180, 18 a 100, 18 a 50, 19 a 1000, 19 a 950, 19 a
900, 19 a 850, 19 a 800, 19 a 750, 19 a 700, 19 a 650, 19 a 600, 19 a 500, 19 a 450,
19 a 400, 19 a 350, 19 a 300, 19 a 250, 19 a 200, 19 a 190, 19 a 100, 19 a 50, 20 a
1000, 20 a 950, 20 a 900, 20 a 850, 20 a 800, 20 a 750, 20 a 700, 20 a 650, 20 a
600, 20 a 500, 20 a 450, 20 a 400, 20 a 350, 20 a 300, 20 a 250, 20 a 200, 20 a 200,
20 a 100, 20 a 50, 15211000, 21 a 950, 21 a 900, 21 a 850, 21 a 800, 21 a 750, 21 a
700, 21 a 650, 21 a 600, 21 a 500, 21 a 450, 21 a 400, 21 a 350, 21 a 300, 21 a 250,
21 a 210, 21 a 210, 21 a 100, 21 a 50, 22 a 1000, 22 a 950, 22 a 900, 22 a 850, 22 a
800, 22 a 750, 22 a 700, 22 a 650, 22 a 600, 22 a 500, 22 a 450, 22 a 400, 22 a 350, 22 a 300, 22 a 250, 22 a 220, 22 a 220, 22 a 100, 22 a 50, 23 a 1000, 23 a 950, 23 a
900, 23 a 850, 23 a 800, 23 a 750, 23 a 700, 23 a 650, 23 a 600, 23 a 500, 23 a 450,
23 a 400, 23 a 350, 23 a 300, 23 a 250, 23 a 230, 23 a 230, 23 a 100, 23 a 50, 24 a
1000, 24 a 950, 24 a 900, 24 a 850, 24 a 800, 24 a 750, 24 a 700, 24 a 650, 24 a
600, 24 a 500, 24 a 450, 24 a 400, 24 a 350, 24 a 300, 24 a 250, 24 a 240, 24 a 240,
24 a 100, 24 a 50, 25 a 1000, 25 a 950, 25 a 900, 25 a 850, 25 a 800, 25 a 750, 25 a
700, 25 a 650, 25 a 600, 25 a 500, 25 a 450, 25 a 400, 25 a 350, 25 a 300, 25 a 250,
25 a 250, 25 a 250, 25 a 100 ou 25 a 50 nucleotídeos ou pares de bases de nucleotídeos.
Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem em pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900 ou pelo menos 1000 nucleotídeos ou pares de bases de nucleotídeos.
[038] Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando para IAP compreende ou consiste de uma sequência que é complementar a um mRNA ou um segmento de um mRNA codificado por um gene IAP de coleóptero. Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando para IAP compreende ou consiste de uma sequência que é complementar a um mRNA ou um segmento de um mRNA codificado por qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 ou 5 a 18. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando para IAP compreende ou consiste de uma sequência que é complementar a um mRNA codificado por uma sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[039] Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando para IAP compreende ou consiste de uma sequência que é complementar a um mRNA codificado por uma região ou segmento de um DNA IAP de coleóptero. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direciona a um mRNA codificado por uma região ou segmento 5’ de um DNA IAP de coleóptero. Uma região 5’ de um DNA IAP de coleóptero pode compreender ou consistir de qualquer sequência abrangida pelos nucleotídeos de 1 a 600, pelos nucleotídeos de 10 a 600, pelos nucleotídeos de 25 a 600, pelos nucleotídeos de 50 a 600, pelos nucleotídeos de 100 a 600, pelos nucleotídeos de 150 a 600, pelos nucleotídeos de 200 a 600, pelos nucleotídeos de 250 a 600, pelos nucleotídeos de 300 a 600, pelos nucleotídeos de 350 a 600, pelos nucleotídeos de 400 a 600, pelos nucleotídeos de 450 a 600, ou pelos nucleotídeos de 500 a 600 do DNA IAP (por exemplo, nucleotídeos de 1 a 600 da SEQ ID NO: 1).
Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direciona a um mRNA codificado por uma região ou segmento central de um DNA IAP de coleóptero. Uma região central de um DNA IAP de coleóptero pode compreender ou consistir de qualquer sequência abrangida pelos nucleotídeos de 400 a 1200, pelos nucleotídeos de 450 a 1200, pelos nucleotídeos de 500 a 1200, pelos nucleotídeos de 550 a 1200, pelos nucleotídeos de 600 a 1200, pelos nucleotídeos de 650 a 1200, pelos nucleotídeos de 700 a 1200, pelos nucleotídeos de 850 a 1200, pelos nucleotídeos de 900 a 1200, pelos nucleotídeos de 950 a 1200, pelos nucleotídeos de 1000 a 1200, pelos nucleotídeos de 1050 a 1200, ou pelos nucleotídeos de 1100 a 1200 do DNA IAP (por exemplo, nucleotídeos de 400 a 1200 da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direciona a um mRNA codificado por uma região ou segmento 3’ de um DNA IAP de coleóptero. Uma região 3’ de um DNA IAP de coleóptero pode compreender ou consistir de qualquer sequência abrangida pelos nucleotídeos 1000 a 1564, pelos nucleotídeos de 1050 a 1564, pelos nucleotídeos de 1100 a 1564, pelos nucleotídeos de 1150 a 1564, pelos nucleotídeos de 1200 a 1564, pelos nucleotídeos de 1250 a 1564, pelos nucleotídeos de 1300 a 1564, pelos nucleotídeos de 1350 a 1564, pelos nucleotídeos de 1400 a 1564, pelos nucleotídeos de 1450 a 1564, pelos nucleotídeos de 1—0 a 1564, do DNA IAP (por exemplo, nucleotídeos de 1000 a 1564 da SEQ ID NO: 1).
[040] Deve-se entender que o termo gene abrange ácido nucleico codificante e não-codificante. Assim, em algumas modalidades, um gene IAP codifica um mRNA que compreende uma região não-traduzida 5’, um quadro de leitura aberto e uma região não-traduzida 3’, Assim, uma molécula de RNAi aqui, em algumas modalidades, se liga a uma região não-traduzida 5’, a um quadro de leitura aberto e/ou uma região não-traduzida 3’ de um mRNA.
[041] Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando a IAP compreende ou consiste de uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 37 a 39 ou 41 a 54. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando a IAP compreende ou consiste de uma sequência de RNA da SEQ ID NO: 37.
[042] Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando a IAP compreende ou consiste de uma sequência que é complementar a uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19 a 21 ou 23 a 36. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando para IAP compreende ou consiste de uma sequência que é complementar a uma sequência de RNA da SEQ ID NO:
19.
[043] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de (pelo menos uma) sequência contígua que tem identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA codificada por um gene IAP de coleóptero. Em algumas modalidades, o gene IAP compreende uma sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de (pelo menos uma) sequência contígua que tem identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 ou 5 a 18.
[044] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de (pelo menos uma) sequência contígua que é 70% a 100% complementar (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar) a uma sequência de RNA codificada por um gene IAP de coleóptero. Em algumas modalidades, o gene IAP compreende uma sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de (pelo menos uma) sequência contígua que é 70% a 100% complementar (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA codificada por uma sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 3 ou 5 a 18.
[045] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de (pelo menos uma) sequência contígua que tem identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 37 a 39 ou 41 a 54.
Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de uma sequência contígua que tem identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA da SEQ ID NO: 37.
[046] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de (pelo menos uma) sequência contígua que é 70% a 100% complementar (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar) a uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19 a 21 ou 23 a 26. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de uma sequência contígua que é 70% a 100% complementar (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar) a uma sequência de RNA da SEQ ID NO: 19.
[047] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850, pelo menos 900, pelo menos 950, ou pelo menos 1000 nucleotídeos ou pares de bases de nucleotídeos possuindo identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 37 a 39 ou 41 a 54. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850, pelo menos 900, pelo menos 950, ou pelo menos 1000 nucleotídeos ou pares de bases de nucleotídeos possuindo identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%,
75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA da SEQ ID NOS: 37.
[048] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850, pelo menos 900, pelo menos 950, ou pelo menos 1000 nucleotídeos ou pares de bases de nucleotídeos de 70% a 100% complementar (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% complementar) a uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19 a 21 ou 23 a 36. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 500, pelo menos 550, pelo menos 600, pelo menos 650, pelo menos 700, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 850, pelo menos 900, pelo menos 950, ou pelo menos 1000 nucleotídeos ou pares de bases de nucleotídeos possuindo complementaridade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou
100% complementar) a uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA da SEQ ID NOS: 19.
[049] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de 10 a 25, 10 a 24, 10 a 23, 10 a 22, 10 a 21, 10 a 20, 11 a 25, 11 a 24, 11 a 23, 11 a 22, 11 a 21, 11 a 20, 12 a 25, 12 a 24, 12 a 23, 12 a 22, 12 a 21, 12 a 20, 13 a 25, 13 a 24, 13 a 23, 13 a 22, 13 a 21, 13 a 20, 14 a 25, 14 a 24, 14 a 23, 14 a 22, 14 a 21, 14 a 20, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 16 a 25, 16 a 24, 16 a 23, 16 a 22, 16 a 21, 16 a 20, 17 a 25, 17 a 24, 17 a 23, 17 a 22, 17 a 21, 17 a 20, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21 ou 18 a 20 nucleotídeos contíguos possuindo identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 37 a 39 ou 41 a 54.
Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de 10 a 25, 10 a 24, 10 a 23, 10 a 22, 10 a 21, 10 a 20, 11 a 25, 11 a 24, 11 a 23, 11 a 22, 11 a 21, 11 a 20, 12 a 25, 12 a 24, 12 a 23, 12 a 22, 12 a 21, 12 a 20, 13 a 25, 13 a 24, 13 a 23, 13 a 22, 13 a 21, 13 a 20, 14 a 25, 14 a 24, 14 a 23, 14 a 22, 14 a 21, 14 a 20, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 16 a 25, 16 a 24, 16 a 23, 16 a 22, 16 a 21, 16 a 20, 17 a 25, 17 a 24, 17 a 23, 17 a 22, 17 a 21, 17 a 20, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21 ou 18 a 20 nucleotídeos contíguos possuindo identidade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade) com uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA da SEQ ID NO: 37.
[050] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de 10 a 25, 10 a 24, 10 a 23, 10 a 22, 10 a 21, 10 a 20, 11 a 25, 11 a 24, 11 a 23, 11 a 22, 11 a 21, 11 a 20, 12 a 25, 12 a 24, 12 a 23, 12 a 22, 12 a 21, 12 a 20, 13 a 25, 13 a 24, 13 a 23, 13 a 22, 13 a 21, 13 a 20, 14 a 25, 14 a 24, 14 a 23, 14 a 22, 14 a 21, 14 a 20, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 16 a 25, 16 a 24, 16 a 23, 16 a 22, 16 a 21, 16 a 20, 17 a 25, 17 a 24, 17 a 23, 17 a 22, 17 a 21, 17 a 20, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21 ou 18 a 20 nucleotídeos contíguos possuindo complementaridade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de complementaridade) a uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19 a 21 ou 23 a 36. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem ou consistem de 10 a 25, 10 a 24, 10 a 23, 10 a 22, 10 a 21, 10 a 20, 11 a 25, 11 a 24, 11 a 23, 11 a 22, 11 a 21, 11 a 20, 12 a 25, 12 a 24, 12 a 23, 12 a 22, 12 a 21, 12 a 20, 13 a 25, 13 a 24, 13 a 23, 13 a 22, 13 a 21, 13 a 20, 14 a 25, 14 a 24, 14 a 23, 14 a 22, 14 a 21, 14 a 20, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 16 a 25, 16 a 24, 16 a 23, 16 a 22, 16 a 21, 16 a 20, 17 a 25, 17 a 24, 17 a 23, 17 a 22, 17 a 21, 17 a 20, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21 ou 18 a 20 nucleotídeos contíguos possuindo complementaridade de 70% a 100% (por exemplo, 70% a 100%, 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100%, 96% a 100%, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de complementaridade) a uma sequência de RNA ou segmento de uma sequência de RNA da SEQ ID NO: 19.
[051] O “percentual de identidade” de duas sequências de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de RNAi direcionando a IAP proporcionadas aqui e qualquer uma, por exemplo, das SEQ ID NOS: 1, 19 ou 37) pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica. As variantes proporcionadas aqui, em algumas modalidades, contêm mutações inseridas aleatoriamente com os quatro nucleotídeos (A, U, G, C) selecionados em uma probabilidade aproximadamente igual para uma dada mutação. Em algumas modalidades, essas mutações poderiam ser distribuídas ou por uma pequena região da sequência, ou amplamente distribuídas por todo o comprimento da sequência. Em algumas modalidades, o percentual de identidade de duas sequências de ácido nucleico é determinado usando o algoritmo de Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como em Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77,
1993. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. As buscas por nucleotídeos em BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, score=100, wordlength-12 para obter sequências-guias homólogas a um ácido nucleico alvo. Quando existem espaços (gaps) entre duas sequências, o Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.
[052] Os polinucleotídeos proporcionados aqui, tais como moléculas de RNAi direcionando para IAP, em algumas modalidades, são projetadas para ter pelo menos um elemento de silenciamento complementar (por exemplo, totalmente (100%) ou parcialmente (menos de 100%, por exemplo, 90% a 99%) complementar) a um segmento de uma sequência de mRNA IAP de um inseto coleóptero, por exemplo, um besouro-da-batata-do-Colorado. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos compreendem pelo menos um elemento de silenciamento que é essencialmente idêntico ou essencialmente complementar ao mRNA IAP de um inseto coleóptero. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos compreendem de 2 a 5, 2 a 10, 2 a 20, 2 a 20, 2 a 40 ou 2 a 50 elementos de silenciamento. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45 ou pelo menos 50 elementos de silenciamento.
[053] As moléculas de RNAi direcionando a IAP proporcionadas aqui podem ser de qualquer forma de RNA, inclusive RNA de fita simples (ssRNA) e RNA de fita dupla (dsRNA). Exemplos não-limitantes do RNA de fita simples incluem mRNA, micro-RNA (miRNA) (por exemplo, miRNA artificial (amiRNA)), pequeno RNA interferente (siRNA), RNA de interação com a proteína Piwi (piRNA), e RNA antissenso. O RNA de fita dupla inclui moléculas de fita inteiramente dupla que não contêm uma região de fita simples (por exemplo, um laço ou protrusão), bem como moléculas parcialmente de fita dupla que contêm uma região de fita dupla e uma região de fita simples (por exemplo, um laço ou protrusão). Adicionalmente, as moléculas de RNAi podem ser moléculas de RNA de fita simples com estrutura secundária contendo caráter de fita dupla significativo, tal como, mas não limitado a RNA em grampo. Assim, as moléculas de RNAi direcionando a IAP, em algumas modalidades, podem ser RNA em grampo curto (shRNA).
[054] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem dsRNA, ssRNA, siRNA, miRNA (por exemplo, amirRNA), piRNA, mRNA, ou shRNA. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem mais de uma forma de RNA. Por exemplo, as moléculas de RNAi direcionando a IAP podem compreender ssRNA e dsRNA. Em algumas modalidades, as moléculas de RNA direcionando a IAP compreendem um híbrido com RNA e DNA. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP compreendem amiRNAs processados a partir de um transcrito precursor longo do RNA não-codificador de proteína, que é parcialmente autocomplementar para mediar o silenciamento dos mRNAs alvos. Os amiRNAs são projetados, em algumas modalidades, substituindo-se as sequências de miRNA de 21 nucleotídeos maduras dentro do pré-miRNA por 21 fragmentos longos de nucleotídeos derivados do gene alvo (Frontiers in Plant Science, Sebastian et al., 2017). Um amiRNA pode ter um comprimento de, por exemplo, pelo menos 18 a 500 nucleotídeos, pelo menos 21 a 500 nucleotídeos, pelo menos 50 a 500 nucleotídeos, pelo menos 100 a 500 nucleotídeos, ou pelo menos 200 a 500 nucleotídeos.
[055] Moléculas de RNAi direcionando a IAP podem ser proporcionadas como uma mistura de moléculas de RNAi direcionando a IAP, por exemplo, uma mistura de moléculas de RNAi direcionando a IAP possuindo sequências diferentes.
Qualquer número de moléculas de RNAi distintas direcionando a IAP pode ser proporcionado em uma mistura de moléculas de RNAi direcionando a IAP. Em algumas modalidades, a mistura de moléculas de RNAi direcionando a IAP compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, ou pelo menos 10 moléculas de RNAi distintas (possuindo diferentes sequências/composições de nucleotídeos) direcionando a IAP.
[056] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP são proporcionadas como uma mistura de moléculas de RNAi que são complementares (total ou parcialmente) para diferentes segmentos de um mRNA codificado por um gene IAP (por exemplo, compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP são proporcionadas como uma mistura de moléculas de RNAi que são complementares (total ou parcialmente) para diferentes segmentos de uma sequência de RNA da SEQ ID NO: 19). Qualquer número de moléculas de RNAi direcionando a IAP que são complementares a diferentes segmentos de um mRNA (por exemplo, codificando uma sequência da SEQ ID NO: 19) codificado por um gene IAP (por exemplo, compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 1) pode ser proporcionado em uma mistura de moléculas de RNAi direcionando a IAP. Em algumas modalidades, a mistura de moléculas de RNAi direcionando a IAP compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, ou pelo menos 10 moléculas de RNAi direcionando a IAP. Em algumas modalidades, a mistura de moléculas de RNAi direcionando a IAP compreende de 2 a 5, ou de 2 a 10 moléculas de RNAi direcionando a IAP.
[057] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP proporcionadas aqui podem ter um ou mais pareamentos errôneos comparado com a sequência correspondente do mRNA IAP (por exemplo, SEQ ID NO: 19). Uma região de complementaridade da molécula de RNAi direcionando a IAP pode ter até 1, até 2, até 3, até 4, etc. pareamentos errôneos, contanto que ela mantenha a capacidade de formar pares de bases complementares com mRNA IAP sob condições apropriadas de hibridização. Como alternativa, uma região de complementaridade nas moléculas de RNAi direcionando a IAP pode ter não mais do que 1, não mais do que 2, não mais do que 3 ou não mais do que 4 pareamentos errôneos, contanto que ela mantenha a capacidade de formar pares de bases complementares com o mRNA IAP sob condições de hibridização apropriadas. Em algumas modalidades, se houver mais de um pareamento errôneo em uma região de complementaridade, elas podem ser posicionadas consecutivamente (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais em uma fileira), ou entremeadas por toda a região de complementaridade, contanto que a molécula de RNAi direcionando a IAP mantenha a capacidade de formar pares de bases complementares com o mRNA IAP sob condições de hibridização apropriadas.
[058] As moléculas de RNAi direcionando a IAP podem ser modificadas de diversas maneiras para melhorar ou controlar a especificidade, estabilidade, distribuição, biodisponibilidade, degradação, resistência à degradação da nuclease,
propriedades de pareamento de bases, distribuição do RNA e captação celular, e outros aspectos relevantes a seu uso. Vide, por exemplo, Bramsen et al., Nucleic Acids Res., 2009, 37, 2867-2881; Bramsen and Kjems, Frontiers in Genetics, 3 (2012): 1-22. Consequentemente, em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP podem incluir uma ou mais (pelo menos uma) modificações adequadas. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi modificada direcionando a IAP tem uma modificação em sua base, açúcar (por exemplo, ribose, desoxirribose) ou grupo fosfato.
[059] As moléculas de RNAi direcionando a IAP produzidas pelos métodos proporcionados aqui podem ser modificadas como descrito aqui. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP são produzidas de acordo com um método descrito aqui e subsequentemente modificadas. Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi direcionando a IAP são produzidas de acordo com um método descrito aqui usando um material de partida modificado.. Em algumas modalidades, o material de partida modificado é uma nucleobase modificada. Em algumas modalidades, o material de partida modificado é um nucleosídeo modificado. Em algumas modalidades, o material de partida modificado é um nucleotídeo modificado.
[060] Em algumas modalidades, as moléculas de RNAi modificadas direcionando a IAP compreendem uma modificação na cadeia principal (“backbone”).
Em algumas modalidades, a modificação na cadeia principal resulta em uma meia- vida mais longa para o RNA devido à degradação reduzida (por exemplo, degradação mediada por nuclease). Isto, por sua vez, resulta em uma meia-vida mais longa. Exemplos de modificações adequadas da cadeia principal incluem, mas não se limitam a modificações no fosforotioato, modificações no fosforoditioato, modificações no p-etóxi, modificações no metilfosfonato, modificações no metilfosforotioato, fosfatos de alquila e arila (nos quais o oxigênio fosfonato carregado é substituído por um grupo alquila ou arila), alquilfosfotriésteres (nos quais a porção de oxigênio carregado é alquilada), modificações na cadeia principal do ácido nucleico bloqueado (LNA). Essas modificações podem ser usadas em combinação uma com as outras e/ou em combinação com ligações da cadeia principal de fosfodiéster.
[061] Como alternativa ou adicionalmente, as moléculas de RNAi direcionando a IAP podem compreender outras modificações, incluindo modificações na base ou na porção açúcar. Exemplos incluem RNA contendo açúcares que são ligados de forma covalente a grupos orgânicos de baixo peso molecular diferentes de um grupo hidroxila na posição 3' e diferentes de um grupo fosfato na posição 5' (por exemplo, uma ribosa 2'-O-alquilada), ou RNA contendo açúcares, tal como arabinose em vez de ribose. O RNA também abrange purinas e pirimidinas substituídas, tais como bases modificadas com propina C-5 (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996). Outras purinas e pirimidinas incluem, sem a isto se limitar, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, e hipoxantina. Outras tais modificações são bem conhecidas pelos versados na técnica.
[062] Moléculas de RNAi que compreendem uma sequência de nucleotídeo complementar a todas ou a um segmento da sequência alvo podem ser projetadas e preparadas usando quaisquer métodos adequados. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi pode ser projetada com assistência de bancos de dados de sequências abrangentes, tais como as conhecidas para a genética de Tribolium e Drosófilas (por exemplo, Flybase, SnapDragon, Beetlebase, etc.). Em algumas modalidades, um banco de dados de sequências é utilizado para determinar efeitos fora do alvo de uma molécula de RNAi designada (por exemplo, como em Arziman, Z., Horn, T., & Boutros, M. (2005). E-RNAi: a web application to design optimized
RNAi constructs. Nucleic Acids Research, 33 (Web Server issue), W582–W588.
doi:10.1093/nar/gki468.) Métodos de Uso
[063] Os aspectos da presente revelação, em algumas modalidades, proporcionam métodos para controlar uma infestação de insetos coleópteros compreendendo distribuir, a uma planta ou inseto coleóptero (por exemplo, o besouro-da-batata-do-Colorado), uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando a IAP (ou uma composição compreendendo uma molécula de RNAi direcionando a IAP). Em algumas modalidades, o método de distribuição compreende aplicar, a uma superfície de uma planta ou inseto coleóptero, uma composição compreendendo a molécula de RNAi. Em algumas modalidades, uma composição compreendendo uma molécula de RNAi direcionando a IAP é um sólido ou líquido (por exemplo, solução, suspensão ou emulsões). Exemplos não-limitantes incluem concentrados emulsificáveis, soluções concentradas, soluções de baixa concentração, soluções de concentração de baixíssimo volume, soluções concentradas hidrossolúveis, soluções líquidas hidrossolúveis, iscas (em pasta, gel, líquido, sólido ou injetável), fumaça, neblina, emulsões invertidas, suspensões concentradas, aerossóis, misturas homogêneas e não-homogêneas, suspensões (à base de água e óleo), poeira, pós (molháveis ou solúveis), grânulos (dispersíveis em meio aquoso ou suspensões concentradas secas), precipitados, cápsulas, acaricidas, formulações encapsuladas ou de micro-encapsulação, ou quaisquer combinações dos mesmos.
[064] Em algumas modalidades, uma composição compreendendo uma molécula de RNAi direcionando a IAP pode ser aplicada como um concentrado, spray (após diluição ou concentrado), névoa, em sulco, tratamento de semente, ensopamento, gotejamento, dieta de inseto, isca, ou quaisquer outras formas adequadas para aplicação a um sulco. A molécula de RNAi direcionando a IAP descrita aqui pode ser distribuída a qualquer parte de uma planta, incluindo, mas sem a isto se limitar, folha, caule, flor, fruto, broto, semente, tubérculo, antera, estame e/ou pólen. Em algumas modalidades, o RNAi é distribuído mecanicamente, através de pulverização sob alta pressão ou jateamento de areia. Em algumas modalidades, uma composição compreende uma molécula de RNAi e pelo menos um aditivo selecionado a partir de adjuvantes, atrativos, agentes esterilizantes, substâncias reguladoras do crescimento, veículos ou diluentes, estabilizadores e/ou agente(s) pesticida(s) (por exemplo, inseticidas, fungicidas e/ou herbicidas). Agentes pesticidas incluem, por exemplo, outro DSRNA direcionando genes distintos do IAP, patatinas, lectinas vegetais, fitoecdisteróides, proteínas Cry, proteínas inseticidas vegetativas (vip), proteínas citolíticas (cyt), proteínas de ligação à biotina, inibidores da protease, quitinases, compostos orgânicos e quaisquer combinações dos mesmos. Agentes não-pesticidas também podem ser usados (por exemplo, adjuvantes, tais como agentes antiespumantes, tampões, agentes de compatibilidade, aditivos de controle de deriva, emulsificantes, extensores, emulsificantes invertidos, penetrantes vegetais, protetores químicos, espalhadores, aglutinantes, tensoativos, espessantes e agentes umectantes).
[065] Uma composição, em algumas modalidades, inclui uma mistura de uma molécula de RNAi direcionando para IAP e pelo menos um de uma variedade de substâncias químicas agrícolas, inseticidas, acaricidas, fungicidas, agentes pesticidas e/ou agentes biopesticidas (por exemplo, microbianos, PIP, e/ou bioquímicos), tal como Espiromesifeno, Espirodiclofeno, Espirotetramato, Piridabeno, Tebufenpirad, Tolfenpirad, Fenpiroximato, Flufenerima, Pirimidifeno, Fenazaquina, Rotenona, Cienopirafeno, Hidrametilnona, Acequinocil, Fluacripirim, Fosfeto de alumínio, Fosfeto de cálcio, Fosfina, Fosfeto de zinco, Cianeto, Diafentiurona, Azocuclotina, Cihexatina, Óxido de Fenbutatina, Propargito, Tetradifona, Bensultap, Tiociclam, Tiosultap-sódico, Flonicamida, Etoxazol, Clofentezina, Diflovidazina,
Hexitiazox, Clorfluazurona, Bistriflurona, Diflubenzurona, Flucicloxurona,
Flufenoxurona, Hexaflumurona, Lufenurona, Novalurona, Noviflumurona,
Teflubenzurona, Triflumurona, Buprofezina, Ciromazina, Hidropreno, Cinoprene,
Metopreno, Fenoxicarb, Piriproxifeno, Pimetrozina, Porifluquinazona, Clorfenapir,
Tralopiril, brometo de metila e/ou outros haletos de alquila, Cloropicrina, Fluoreto de sulfurila, Benclotiaz, quinometionato, Criolite, Metulneodecanamida, Benzoximati,
Cimiazol, Fluensulfona, Azadiractina, Bifenazato, Amidoflumeto, Dicofol, Plifenato,
Ciflumetofen, Piridalil, Beauveria bassiana GHA, Sulfoxaflor, Spinetoram, Spinosad,
Spinosad, Benzoato de emamectina, Lepimectina, Milbemectina, Abamectina,
Metoxifenozida, Cromafenozida, Halofenozida, Tebufenozida, Amitraz,
Clorantraniliprol, Ciantraniliprol, Flubendiamida, alfa-endosulfano, Clordano,
Endosulfano, Fipronil, Acetoprol, Etiprol, Pirafluprol, Piriprol, Indoxacarb,
Metaflumizona, Acrinatrina, Aletrina, Aletrina-cis-trans, Aletrina-trans, beta-Ciflutrina,
beta-Cipermetrina, Bifentrina, Bioaletrina, Bioaletrina S-ciclopentenil, Bioresmetrina,
Cicloprotrina, Ciflutrina, Cialotrina, Cipermetrina, Cifenotrina [(1R)-trans-isômetros], Dimeflutrina, Empentrina [(EZ)-(1R)-isômetros], Esfenvalerato, Etofenproxi,
Fempropatrina, Fenvalerato, Flucitrinato, Flumetrina, Gama-cialotrina, lâmbda-
Cialotrina, Meperflutrina, Metoflutrina, Permetrina, Fenotrina [(1R)-trans-isômero],
Praletrina, Proflutrina, Protrifenbuto, Resmetrina, Silafluofeno, tau-Fluvalinato,
Teflutrina, Tetrametrina, Tetrametrina [(1R)-isômeros], Tetrametilflutrina, theta-
Cipermetrina, Tralometrina, Transflutrina, zeta-Cipermetrina, alfa-Cipermetrina,
Deltametrina, DDT, Metoxicloro, Tiodicarbe, Alanicarbe, Aldicarbe, Bendiocarbe,
Benfuracarbe, Butoxicarboxim, Carbaril, Carbofurano, Carbossulfano, Etiofencarbe,
Fenobucarbe, Formetanato, Furatiocarbe, Isoprocarbe, Metiocarbe, Metomil,
Metolcarbe, Oxamil, Pirimicarbe, Propoxur, Tiofanox, Triazamato, Trimetacarbe,
XMC, Xililcarbe, Clorpirifos, Malationa, Acefato, Azametifos, Azinfos-etil, Azinfos-
metila, Cadusafos, Cloretoxifos, Clorfenvinfos, Clormefos, Clorpirifos-metila,
Coumafos, Cianofos, Demeton-S-metila, Diazinona, Diclorvos/DDVP, Dicrotofos,
Dimetoato, Dimetilvinfos, Dissulfotom, EPN, Etiona, Etoprofos, Fanfur, Fenamifos,
Fenitrotiona, Fentiona, Fonofos, Fostiazato, Imiciafos, Isofenfos-metila, Mecarbame,
Metamidofos, Metidationa, Mevinfos, Monocrotofos, Nalede, Ometoato, Oxidemeton-
metil, Parationa, Parationa-metílica, fentoato, Forato, Fosalona, Fosmete, Fosfamidona, Foxima, Pirimifos-etílico, Profenofos, Propafos, Propetanfos, Protiofos,
Piraclofos, Piridafentiona, Quinalfos, Sulfotepe, Tebupirinfos, Temefos, Terbufos,
Tetraclorvinfos, Tiometona, Triazofos, Triclorfon, Vamidotion Imidacloprida,
Tiametoxam, Acetamiprida, Clotianidina, Dinotefurano, Nitenpiram, Nitiozina,
Nicotina, Tiaclopride, cantraniliprole, carbamatos, organofosfates, compostos organoclorados de ciclodieno, fenilporazóis (fipróis), piretróides, piretinas,
Metoxicloro DDT, Neonicotinóides, Nicotina, Sulfoximinas, Butenolidas, Mesoionicos,
Espinosinas, Avermectinas, Milbernicinas, Análogos do hormônio juvenil,
Fenoxicarbe, Piriproxifem, Haletos de alquila, Cloropicrina, Fluoretos, Boratos,
Tártaro emético, Geradores de isotiocianato de metila, derivados de piridina azometina, Piropenos, Clofentezina, Diflovidazina, Hexitiazoxi, Etoxazol,
Diafentiurona, Acaricidas organoestânicos, Propargito, Tetradifona, Pirróis,
Dinitrofenóis, Sulfuramida, análogos de Nereistoxina, Benzoilureias, Buprofezina,
Ciromazina, Diacilhidrazinas, Amitraz, Hidrametilnona, Acequinocil, Fluacripirim,
Bifenazato, acaricidas e inseticidas METI, Rotenona, Oxadiazinas, Semicarbazonas,
derivados de ácido Tetrônico e Tetrâmico, Fosfetos, Cianetos, derivados de Beta-
cetonitrila, Carboxanilidas, Diamidas, Flonicamida, Meta-diamidas Isoxazolinas,
Granulovírus (GVs), Nucleopoliedrovírus (NPVs), peptídeo HXTX-Hv1a GS-
ômega/capa, Azadiractina, Benzoximato, Bromopropílato, quinometionato, Dicofol,
calda sulfocálcica, Mancozeb, Piridalil, Enxofre, Benzimidazóis, Dicarboximidas,
Piridinas, Pirimidinas, Triazóis, Acilalaninas, Piridina carboxamidas, Anilino-
pirimidinas, Inibidores de Quinona Externa (fungicidas QoI), Fenilpirróis, Quinolinas,
Hidroxianilidas, Toluamidas, Cianoacetamida-oximas, Critibatis de dinitrofenila,
Fosfonatos, Amidas de Ácido Carboxílico (fungicidas CAA), M1 inorgânico,
M2inorgânico, M3 ditiocarbamatos, M4 ftalimidas, óleo parafínico, óleos hortícolas à base de petróleo, óleo palmítico, óleo estérico, óleo linoleico, óleos oleicos, óleo de canola, óleo de soja, óleo de orégano, óleo de tagetes, óleo de abeto de bálsamo, óleo de pimenta-do-reino, óleo de menta, óleo de cedro, óleo de peixe, óleo de jojoba, óleo de lavanda, óleo de rícino, óleo de eucalipto, óleo de alfavaca, óleo de patchuli, óleo de citrino, óleo de artemísia, óleo de cânfora, óleo de gaultéria, óleo de metil eugenol, óleo de timol, óleo de gerânio, óleo de sésamo, óleo de linhaça, óleo de algodão, óleo de capim-limão, óleo de bergamota, óleo de mostarda, óleo de laranja, óleo de citronela, óleo de melaleuca, óleo de nim, óleo de algo, Bacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis (por exemplo, Bacillus thuringiensis var. aizawai,
Bacillus thuringiensis var. israelensis, Bacillus thuringiensis var. kurstaki, Bacillus thuringiensis var. sphaericus, Bacillus thuringiensis var. tenebrionensis) e as proteínas inseticidas que eles produzem (por exemplo, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fa, Cry1A.105, Cry2Ab, Vip3A, mCry3A, Cry3Ab, Cry3Bb, Cry34Ab1/Cr35Ab1),
Paenibacillus popilliae, Serratia entomophila, vírus de poliedrose nuclear, vírus de granulose, baculovírus não-ocluídos, Beauveria spp, Metarhizium, Entomophaga,
Zoopthora, Paecilomyces fumosoroseus, Normuraea, Lecanicillium lecanii, Nosema,
Thelohania, Vairimorpha, Steinernema spp, Heterorhabditis spp ou qualquer combinação dos mesmos, que pode adicionalmente compreender um ingrediente ativo selecionado a partir do grupo consistindo em azinfos-metílico, acefato,
isoxationa, isofenfos, etiona, etrimfós, oxidemeton-metil, oxideprofós, quinalfós,
clorpirifós, clorpirifós-metila, clorfenvinfós, cianofós, dioxabenzofós, diclorvós,
dissulfotom, dimetilvinfós, dimetoato, sulprofós, diazinona, tiometona, tetraclorvinfós,
temefós, tebupirimfós, terbufós, nalede, vamidotiona, piraclofós, piridafentiona,
pirimifós-metila, fenitrotiona, fentiona, fentoato, flupirazofós, protiofós, propapóss,
profenofos, foxima, fosalona, fosmete, formotiona, forato, malationa, mecarbame,
mesulfenfós, metamidofós, metidationa, parationa, parationa metílica, monocrotofós,
triclorfom, EPN, isazofós, isamidofós, cadusafós, diamidafós, diclofentiona,
thionazina, fenamifós, fostiazato, fostietano, fosfocarb, DSP, etoprofós, alanicarbe,
aldicarbe, isoprocarbe, etiofencarbe, carbarila, carbossulfano, xililcarbe, tiodicarbe, pirimicarbe, fenobucarbe, furatiocarbe, propoxur, bendiocarbe, benfuracarbe,
metomil, metolcarbe, XMC, carbofurano, aldoxicarbe, oxamil, acrinatrina, aletrina,
esfenvalerato, empentrina, cicloprotrina, cialotrina, gama-cialotrina, lâmbda-
cialotrina, ciflutrina, beta-ciflutrina, cipermetrina, alfa-cipermetrina, zeta-ciper-metrina,
silafluofeno, tetrametrina, teflutrina, deltametrina, tralometrina, bifentrina, fenotrina,
fenvalerato, fenpropatrina, furametrina, praletrina, flucitrinato, fluvalinato,
flubrocitrinato, permetrina, resmetrina, etofenproxi, cartape, tiocyclam, bensultape,
acetamiprid, imidacloprid, clotianidina, dinotefurano, tiacloprid, tiametoxam,
nitenpiram, clorfluazurona, diflubenzurona, teflubenzurona, triflumurona, novalurona,
noviflumurona, bistrifluorona, fluazurona, flucicloxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, cromafenozida, tebufenozida, halofenozida, metoxifenozida, diofenolano,
ciromazina, piriproxifen, buprofezina, metopreno, hidropreno, cinopreno, triazamato,
endossulfam, clorfenson, clorobenzilato, dicofol, bromopropilato, acetoprol, flpronil,
etiprol, piretrina, rotenona, sulfato de nicotina, Espinosade, finpronil, espirotetramato abamectina, acequinocil, amidoflumet, amitraz, etoxazol, quinometionato,
clofentezina, óxido de fenbutatina, dienoclor, cihexatina, espirodiclofeno,
espiromesifeno, tetradifona, tebufenpirad, binapacril, bifenazato, piridabeno,
pirimidifeno, fenazaquina, fenotiocarbe, fenpiroximato, fluacripirim, fluazinam,
flufenzina, hexitiazoxi, propargita, complexo de polinactina, milbemectina,
lufenurona, mecarbamo, metiocarbe, mevinfós, halfenproxi, azadiractina,
diafentiurona, indoxacarbe, benzoato de emamectina, oleato de potássio, oleato de sódio, clorfenapir, tolfenpirad, pimetrozina, fenoxicarbe, hidrametilnona, hidróxi propil amido, piridalil, flufenerim, flubendiamida, flonicamida, metaflumizol, lepimectina,
TPIC, albendazol, oxibendazol, oxfendazol, triclamida, fensulfotiona, fenbendazol,
cloridrato de levamisol, tartarato de morantel, dazomet, metam-sódico, triadimefona,
hexaconazol, propiconazol, ipconazol, procloraz, triflumizol, tebuconazol,
epoxiconazol, difenoconazol, flusilazol, triadimenol, ciproconazol, metconazol, fluquinconazol, bitertanol, tetraconazol, triticonazol, flutriafol, penconazol,
diniconazol, fenbuconazol, bromuconazol, imibenconazol, simeconazol, miclobutanil,
himexazol, imazalil, furametpir, tifluzamida, etridiazol, oxpoconazol, fumarato de oxpoconazol, pefurazoato, protioconazol, pirifenoxi, fenarimol, nuarimol, bupirimato,
mepanipirim, ciprodinil, pirimetanil, metalaxil, mefenoxam, oxadixil, benalaxil,
tiofanato, tiofanate-metila, benomila, carbendazim, fuberidazol, tiabendazol, manzeb,
propineb, zineb, metiram, maneb, ziram, tiuram, clorotalonil, etaboxam, oxicarboxina,
carboxina, flutolanil, siltiofam, mepronil, dimetomorfo, fenpropidina, fenpropimorfo,
espiroxamina, tridemorfo, dodemorfo, flumorfo, azoxistrobina, cresoxim-metila,
metominostrobina, orisastrobina, fluoxastrobina, trifloxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, iprodiona, procimidona, vinclozolina, clozolinato,
flussulfamida, dazomet, isotiocianato de metila, cloropicrina, metassulfocarb,
hidroxiisoxazol, hidroxiisoxazl hidroxiisoxazol potássico, ehlomezol, D-D,carbamo,
cloreto de cobre básico, sulfato de cobre básico, nonilfenolsulfonato de cobre, oxina-
cobre, DBEDC, sulfat de cobre anidro, pentaidrato sulfato de cobre, hidróxido cúprico, enxofre inorgânico, enxofre molhável, calda sulfocálcia, sulfato de zinco,
fentina, hidrogenocarbonato de sódio, hidrogenocarbonato de potássio, hipocloreto de sódio, prata, edifenfós, tolclofós-metila, fosetil, iprobenfós, dinocap, pirazofós,
carpropamida, ftalida, triciclazol, piroquilona, diclocimet, fenoxanila, kasugamicina,
validamicina, polioxinas, blasticiden S, oxitetraciclina, mildiomicina, estreptomicina,
óleo de colza, óleo de máquina, bentiavalicarb isopropílico, iprovalicarbe,
propamocarbe, dietofencarbe, fluoroimida, fludioxanila, fenpiclonila, quinoxifeno,
ácido oxolínico, clorotalonil, captano, folpet, probenazol, acibenzolar-S-metila, tia-dinil, ciflufenamide, fenhexamide, diflumetorim, metrafenona, picobenzamida, proquinazida, famoxadona, ciazofamida, fenamidona, zoxamida, boscalida, cimoxanil, ditianona, fluazinam, diclofluanida, triforina, isoprotiolano, ferimzona, diclomezina, tecloftalam, pencicuron, quinometionato, acetato de iminoctadina, albesilato de iminoctadina, ambam, policarbamato, tiadiazina, cloroneb, dimetilditiocarbamato de níquel, guazatina, acetato de dodecilguanidina, quintozeno, tolilfluanida, anilazina, nitrotalisopropil, fenitropan, dimetirimol, bentiazol, flumetover, mandipropamida e pentiopirad, ou quaisquer combinações dos mesmos.
[066] Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando ao IAP é fornecido na dieta de um inseto coleóptero. Por exemplo, uma molécula de RNAi direcionando ao IAP pode ser aplicada por via tópica a uma planta, ou sementes (por exemplo, via embebimento, recobrimento, polvilhamento ou pulverização), ou as células de uma planta podem ser modificadas geneticamente para expressar a molécula de RNAi. As moléculas de RNAi também podem ser fornecidas em outra fonte alimentícia ou de água.
[067] A planta pode ser qualquer planta que seja sujeita à infestação por um inseto coleóptero. Em algumas modalidades, a planta é uma planta solanácea (por exemplo, família Solanaceae). Exemplos de plantas solanáceas incluem, mas não se limitam a plantas de batata (Solanum tuberosum), plantas de beladona (Solanum rostratum), plantas de berinjela (Solanum melongena), plantas do tomate (Solanum lycopersicum), plantas de tabaco (Nicotiana tabacum), plantas de pimenta (Capsicum annum) e plantas de dulcamara (Solanum dulcamara).
[068] Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem distribuir, a uma planta (por exemplo, uma planta de batata) com uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, por exemplo, em uma quantidade eficaz para suprimir a infestação da planta por um inseto coleóptero (por exemplo, besouro-da-batata-do-
Colorado). Assim, em algumas modalidades, os métodos compreendem distribuir, a uma planta (por exemplo, uma planta de batata) com uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, por exemplo, em uma quantidade eficaz para suprimir a infestação da planta por um inseto coleóptero (por exemplo, besouro-da-batata-do- Colorado). Em ainda outras modalidades, os métodos compreendem distribuir, a uma planta de berinjela com uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, por exemplo, em uma quantidade eficaz para suprimir a infestação da planta por um inseto coleóptero (por exemplo, besouro-da-batata-do-Colorado). Em ainda outras modalidades, os métodos compreendem distribuir, a uma planta de tomate com uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, por exemplo, em uma quantidade eficaz para suprimir a infestação da planta por um inseto coleóptero (por exemplo, besouro- da-batata-do-Colorado). Em modalidades adicionais, os métodos compreendem distribuir, a uma planta de tabaco, uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, por exemplo, em uma quantidade eficaz para suprimir a infestação da planta por um inseto coleóptero (por exemplo, besouro-da-batata-do-Colorado). Em modalidades adicionais, os métodos compreendem distribuir, a uma planta de pimenta, uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, por exemplo, em uma quantidade eficaz para suprimir a infestação da planta por um inseto coleóptero (por exemplo, besouro- da-batata-do-Colorado).
[069] A distribuição de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma planta (por exemplo, uma parte de uma planta) e/ou inseto coleóptero pode incluir, por exemplo, aplicar (por exemplo, embeber, revestir ou polvilhar) a molécula de RNAi ou uma composição compreendendo a molécula de RNAi por via tópica a qualquer parte de uma planta (por exemplo, raízes, tubérculos, caule, ramos, flor, etc.), solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.), inseto e/ou dieta do inseto. Uma etapa de distribuição também pode incluir modificar geneticamente células de uma planta para expressar a molécula de RNAi. Uma etapa de distribuição também pode incluir expor uma planta ou inseto coleóptero a um organismo (por exemplo, vírus, bactéria, fungo, etc.) que foi geneticamente modificado para expressar e/ou distribuir a molécula de RNAi à planta ou inseto coleóptero.
[070] Uma quantidade eficaz é a quantidade de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP necessária para conferir um efeito benéfico sobre a infestação (por exemplo, morte, cessação da alimentação, inibição do crescimento, desenvolvimento ou reprodução) por um inseto coleóptero, seja isoladamente ou em combinação com um ou mais outros aditivos. Efeitos benéficos incluem uma redução na infestação, por exemplo, de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% em relação a um controle. Em algumas modalidades, o controle é a ausência de um inseticida e/ou pesticida. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP elimina completamente a infestação por insetos coleópteros (por exemplo, besouro-da- batata-do-Colorado) de uma planta.
[071] As quantidades eficazes variam, como reconhecido pelos versados na técnica, dependendo da planta em questão, da gravidade da infestação, da duração da infestação, da exposição anterior a inseticidas, e de fatores semelhantes dentro do conhecimento e experiência de um profissional. Esses fatores são bem conhecidos pelos versados na técnica e podem ser abordados tão somente com experimentação de rotina. Em geral, prefere-se que concentrações eficazes inferiores sejam usadas, ou seja, a menos concentração que propicia controle de um inseto, para aumentar a eficiência e diminuir o custo.
[072] Uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP também pode variar, dependendo do método de distribuição.
[073] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP é expressa como microgramas (µg) de molécula de RNAi direcionando ao IAP por centímetro quadrado (cm2) de uma superfície de uma planta ou solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.), isto é,µg/cm2. Assim, em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP compreende de 0,001 µg/cm2 a 10 µg/cm2. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando a IAP compreende de
0.001 µg/cm2 a 9 µg/cm2, 0.001 µg/cm2 a 8 µg/cm2, 0.001 µg/cm2 a 7 µg/cm2, 0,001 µg/cm2 a 6 µg/cm2, 0,001 µg/cm2 a 5 µg/cm2, 0,001 µg/cm2 a 4 µg/cm2, 0,001 µg/cm2 a 3 µg/cm2, 0,001 µg/cm2 a 2 µg/cm2, 0,001 µg/cm2 a 1 µg/cm2, 0,001 µg/cm2 a 0,1 µg/cm2, ou 0,001 µg/cm2 a 0,01 µg/cm2. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP compreende de 0,01 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 0,1 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 1 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 2 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 3 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 4 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 5 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 6 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 7 µg/cm2 a 10 µg/cm2, 8 µg/cm2 a 10 µg/cm2 ou 9 µg/cm2 a 10 µg/cm2.
[074] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP é expressa como gramas (g) de molécula de RNAi direcionando ao IAP por acre (ac.) de uma superfície de uma planta ou solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.), isto é, g/ac. Assim, em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP compreende de 0,01 g/ac. A 100 g/ac. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP compreende de 0,01 g/ac. a 90 g/ac., 0,01 g/ac. a 80 g/ac., 0,01 g/ac. a 70 g/ac., 0,01 g/ac. a 60 g/ac., 0,01 g/ac. a 50 g/ac., 0,01 g/ac. a 40 g/ac., 0,01 g/ac. a 30 g/ac., 0,01 g/ac. a 20 g/ac., 0,01 g/ac. a 10 g/ac., 0,01 g/ac. a 1 g/ac., ou 0,01 g/ac. a 0,1 g/ac. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP compreende de 0,1 g/ac. a 100 g/ac., 1 g/ac. a 100 g/ac., 10 g/ac. a 100 g/ac., 20 g/ac. a 100 g/ac., 30 g/ac. a 100 g/ac., 40 g/ac. a 100 g/ac., 50 g/ac. a 100 g/ac., 60 g/ac. a 100 g/ac., 70 g/ac. a 100 g/ac., 80 g/ac. a 100 g/ac., ou 90 g/ac. a 100 g/ac.
[075] Em algumas modalidades, a eficácia de uma molécula de RNAi em controlar insetos coleópteros pode ser determinada usando a capacidade da molécula de RNAi em matar ou causar a morte de um inseto ou população de insetos. A taxa de mortalidade em uma população de insetos pode ser determinada pelo percentual de mortalidade (por exemplo, percentual de mortalidade ao longo do tempo). Em geral, o percentual de mortalidade de uma população de insetos reflete o percentual de insetos na dita população que morreram em decorrência da molécula de RNAi (por exemplo, uma mortalidade de 75% indica que uma molécula de RNAi matou 75% da população total de insetos). Em algumas modalidades, o percentual de mortalidade é medido ao longo do tempo (por exemplo, no decurso de uma exposição de múltiplos dias dos insetos a uma molécula de RNAi). Em algumas modalidades, o percentual de mortalidade é medido após pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 dias de exposição. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi causa um percentual de mortalidade de pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de uma população de insetos coleópteros. Em algumas modalidades, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 100% de uma população de insetos coleópteros são mortos por uma molécula de RNAi que direciona ao IAP.. Em algumas modalidades, o percentual de mortalidade de uma molécula de RNAi é comparado com um controle (por exemplo, uma molécula controle ou condições não tratadas). Em algumas modalidades, o percentual de mortalidade de uma molécula de RNAi é pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, ou 200% maior do que um controle (por exemplo, uma molécula controle ou condições não tratadas).
[076] Em algumas modalidades, a eficácia de uma molécula de RNAi em controlar insetos coleópteros pode ser determinada usando a capacidade da molécula de RNAi em limitar o consumo do disco de folha de um inseto coleóptero ou de uma população de insetos. O consumo de disco de folha refere-se à quantidade (por exemplo, percentual) de material vegetal (por exemplo, uma folha de berinjela) que é consumida ou ingerida por um inseto ou população de insetos. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi causa uma redução de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 100% no consumo de disco de folha por um inseto ou população de insetos. Em algumas modalidades, a capacidade de uma molécula de RNAi em diminuir o consumo de disco de folha é comparada em relação a um controle (por exemplo, uma molécula de controle ou condições não tratadas). Em algumas modalidades, o consumo de disco de folha é medido ao longo do tempo (por exemplo, no decurso de uma exposição de múltiplos dias dos insetos a uma molécula de RNAi). Em algumas modalidades, o consumo de disco de folha é medido após 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias de exposição.
[077] Em algumas modalidades, a eficácia de uma molécula de RNAi em controlar insetos coleópteros pode ser determinada usando a capacidade da molécula de RNAi em diminuir o percentual de desfolhação plantar por um inseto coleóptero ou de uma população de insetos. O percentual de desfolhação plantar refere-se à porcentagem de material vegetal (por exemplo, uma folha de berinjela) que é destruído (por exemplo, consumido) por um inseto ou população de insetos.
Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi causa uma redução de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 100% no percentual de desfolhação plantar por um inseto ou população de insetos. Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi faz com que o percentual de desfolhação plantar se reduza a menos de 40%, 30, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 3% ou 1%. Em algumas modalidades, o percentual de desfolhação plantar permanece abaixo de 40%, 30, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 3% ou 1% por pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 dias após a exposição dos insetos a uma molécula de RNAi. Em algumas modalidades, a capacidade de uma molécula de RNAi em diminuir o percentual de desfolhação plantar é comparada em relação a um controle (por exemplo, uma molécula de controle ou condições não tratadas). Em algumas modalidades, o percentual de desfolhação plantar é medido ao longo do tempo (por exemplo, no decurso de uma exposição de múltiplos dias dos insetos a uma molécula de RNAi). Em algumas modalidades, o percentual de desfolhação plantar é medido após 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias de exposição.
[078] Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando ao IAP pode ser formada em uma solução (por exemplo, que é aplicada a uma superfície do inseto coleóptero e/ou direta (por exemplo, alimento e/ou água ingerida), uma planta ou solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.)). Em algumas modalidades, a quantidade eficaz da molécula de RNAi direcionando ao IAP na solução é expressa como nanoramas (ng) ou microgramas (µg) de molécula de RNAi direcionando ao IAP por mililitro (mL) da solução, isto é, ng/mL. Assim, em algumas modalidades, uma solução compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 10 ng/ml a 100 µg/ml. Em algumas modalidades, uma solução compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 10 ng/ml a 100 µg/ml, 100 ng/ml a 100 µg/ml, 250 ng/ml a 100 µg/ml, 750 ng/ml a 100 µg/ml, 1000 ng/ml a 100 µg/ml, 10 µg/ml a 100 µg/ml, 25 µg/ml a 100 µg/ml, 50 µg/ml a 100 µg/ml ou 75 µg/ml a 100 µg/ml. Em algumas modalidades, uma solução compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 10 ng/ml a 100 µg/ml, 10 ng/ml a 75 µg/ml, 10 ng/ml a 50 µg/ml, 10 ng/ml a 25 µg/ml, 10 ng/ml a 10 µg/ml, 10 ng/ml a 1000 ng/ml, 10 ng/ml a 1000 ng/ml, 10 ng/ml a 750 ng/ml, 10 ng/ml a 500 ng/ml, 10 ng/ml a 250 ng/ml, 10 ng/ml a 100 ng/ml, 10 ng/ml a 75 ng/ml, 10 ng/ml a 50 ng/ml, ou 10 ng/ml a 25 ng/ml.
[079] Uma solução, em algumas modalidades, compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP e pelo menos um aditivo adicional (por exemplo, um pesticida, tensoativo ou outro agente não-pesticida). Em algumas modalidades, tal mistura compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 0,0001 µg/ml a 10 µg/ml (por exemplo, que é aplicada a uma superfície de uma planta e/ou solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.)). Em algumas modalidades, tal mistura compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 0,0001 µg/ml a 9 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 8 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 7 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 6 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 5 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 4 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 3 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 2 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 1 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 0,1 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 0,01 µg/ml de ou 0,0001 µg/ml a 0,001 µg/ml. Em algumas modalidades, tal mistura compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 0,0001 µg/ml a 9 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 8 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 7 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 6 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 5 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 4 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 3 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 2 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 1 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 0,1 µg/ml, 0,0001 µg/ml a 0,01 µg/ml ou 0,0001 µg/ml a 0,001 µg/ml.
[080] Em algumas modalidades, uma molécula de RNAi direcionando ao IAP é fornecida em uma dieta de um inseto. Assim, em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP é expressa como microgramas (µg) de molécula de RNAi direcionando ao IAP por mililitro (mL) da dieta do inseto, isto é, µg/ml. Em algumas modalidades, a dieta de um inseto compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 0,001 µg/mL a 10 µg/mL. Em algumas modalidades, a dieta de um inseto compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 0,001 µg/ml a 9 µg/ml, 0,001 µg/ml a 8 µg/ml, 0,001 µg/ml a 7 µg/ml, 0,001 µg/ml a 6 µg/ml, 0,001 µg/ml a 5 µg/ml, 0,001 µg/ml a 4 µg/ml, 0,001 µg/ml a 3 µg/ml, 0,001 µg/ml a 2 µg/ml, 0,001 µg/ml a 1 µg/ml, 0,001 µg/ml a 0,1 µg/ml, ou 0,0001 µg/ml a 0,01 µg/ml. Em algumas modalidades, a dieta de um inseto compreende uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma concentração de 0,01 µg/ml a 10 µg/ml, 0,1 µg/ml a 10 µg/ml, 1 µg/ml a 10 µg/ml, 2 µg/ml a 10 µg/ml, 3 µg/ml a 10 µg/ml, 4 µg/ml a 10 µg/ml, 5 µg/ml a 10 µg/ml, 6 µg/ml a 10 µg/ml, 7 µg/ml a 10 µg/ml, 8 µg/ml a 10 µg/ml, ou 9 µg/ml a 10 µg/ml.
[081] A etapa de distribuir a qualquer parte de uma planta (por exemplo, raízes, tubérculos, caule, falhos, folhas, flores, etc.), solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.), inseto e/ou dieta do inseto com uma molécula de RNAi direcionando ao IAP pode incluir uma única aplicação (contato único) ou múltiplas aplicações (múltiplos contatos) da molécula de RNAi direcionando ao IAP à planta, solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.), inseto e/ou dieta do inseto. A distribuição a uma parte de uma planta, inseto e/ou direta do inseto pode ser na forma de um spray (por exemplo, spray pressurizado/aerossolizado, bomba), sólido, (por exemplo, pó, microgrânulo, isca), ou líquido (por exemplo, misturas homogêneas, tais como soluções e misturas não-homogêneas, tais como suspensões (à base de água e óleo), colóides, micelas e emulsões). O período de tempo de contato pode variar.
Em algumas modalidades, a distribuição compreende uma exposição de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP com uma parte de uma planta e/ou um inseto coleóptero por um período de tempo suficiente para redução do crescimento, reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade) e/ou alimentação do inseto coleóptero e/ou morte do inseto coleóptero, se houver.
[082] Em algumas modalidades, a distribuição de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP com uma planta e/ou inseto coleóptero é seguida da ingestão e/ou absorção da molécula de RNAi direcionando ao IAP pela planta e/ou inseto coleóptero. Em algumas modalidades, a ingestão da molécula de RNAi direcionando ao IAP pelo inseto coleóptero altera uma função biológica do inseto coleóptero, dessa forma controlando a infestação pelo inseto coleóptero. Exemplos de função biológica alterada do inseto coleóptero incluem, sem a isto se limitar, redução do crescimento, redução da reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade),
alimentação reduzida, movimento reduzido, diminuição do desenvolvimento, diminuição do reparo celular e/ou aumento da mortalidade.
[083] Em algumas modalidades, a distribuição compreende aplicar uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma parte da superfície de uma planta e/ou uma superfície com qual por um inseto coleóptero entra em contato (por exemplo, solo (por exemplo, solo, terra, grama, etc.)). Em algumas modalidades, aplicar uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a uma parte de uma superfície compreende pulverizar, revestir e/ou polvilhar a superfície ou parte da mesma. Em algumas modalidades, a aplicação de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP RNA a uma parte de uma superfície compreende encharcar o solo ou aplicar a molécula de RNAi como uma formulação granulada ou em pó ao solo adjacente às raízes da planta.
[084] Uma molécula de RNAi direcionando ao IAP pode ser aplicada a qualquer parte de uma planta (por exemplo, raízes, tubérculos, caule, ramos, folhas, flor, etc.). Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando ao IAP é colocada em contato com uma parte acima do solo de uma planta (por exemplo, uma folha) e/ou com uma parte abaixo do solo de uma planta (por exemplo, uma raiz), que pode incluir pelo menos uma formulação no sulco de plantio selecionada a partir do grupo consistindo em um pó, grânulo, microgrânulo (pellet), cápsula, concentrado líquido solúvel, spray (após a diluição ou concentrado), névoa, em sulco de plantio, tratamento de semente, dieta de inseto, isca, ensopamento, irrigação por gotejamento, ou quaisquer outras formas adequadas para aplicação a um sulco de plantio. Partes de uma planta que podem entrar em contato com a molécula de RNAi direcionando ao IAP descrita aqui incluem, sem a isto se limitar, folha, caule, flor, fruto, broto, semente, tubérculo, antera, estame e/ou pólen. Em algumas modalidades, o RNAi é distribuído mecanicamente, através de pulverização sob alta pressão ou jateamento de areia.
[085] Em algumas modalidades, a distribuição compreende fornecer uma molécula de RNAi direcionando ao IAP para ingestão dietética pelo inseto coleóptero. Em algumas modalidades, o ato de colocar em contato compreende fornecer uma molécula de RNAi direcionando ao IAP que pode ser inserida ou de alguma outra forma absorvida internamente pelo inseto coleóptero. Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando ao IAP é fornecida em uma dieta para ingestão dietética pelo inseto coleóptero. Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando ao IAP é fornecida em/sobre uma planta ou parte da planta, ou aplicada de forma tópica a uma planta ou parte da planta (por exemplo, embebimento, recobrimento, polvilhamento). Em algumas modalidades, a molécula de RNAi direcionando ao IAP é expressa em uma planta ou parte da planta.
[086] Em algumas modalidades, a distribuição de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP a um inseto coleóptero inibe a expressão de (reduz ou inibe a expressão de) uma sequência de nucleotídeos complementar endógena (por exemplo, sequência de RNA) no inseto coleóptero. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos complementar endógena é uma sequência IAP endógena.
[087] As consequências da inibição podem ser confirmadas por qualquer ensaio apropriado para avaliar uma ou mais propriedades de um inseto, ou por técnicas bioquímicas que avaliam moléculas indicativas da expressão de IAP (por exemplo, RNA, proteína). Em algumas modalidades, a extensão à qual uma molécula de RNAi direcionando ao IAP fornecida aqui reduz os níveis de expressão do IAP é avaliada comparando-se os níveis de expressão (por exemplo, mRNA ou níveis de proteína do IAP) com um controle apropriado (por exemplo, um nível de expressão de IAP em uma célula ou população de células às quais uma molécula de RNAi direcionando ao IAP não foi distribuída ou às quais um controle negativo foi distribuído). Em algumas modalidades, um nível de controle apropriado de expressão de IAP pode ser um nível ou valor predeterminado, de modo que um nível de controle não precise ser medido todas as vezes. O nível ou valor predeterminado pode assumir uma variedade de formas. Em algumas modalidades, um nível ou valor predeterminado por ser um único valor de corte, tal como uma mediana ou média.
[088] Em algumas modalidades, a distribuição de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, como descrito aqui, resulta em uma redução no nível da expressão de IAP em uma célula de um inseto. Em algumas modalidades, a redução nos níveis da expressão de IAP pode ser uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% em relação a um nível de controle. Em algumas modalidades, o nível de controle é um nível de expressão de IAP em uma célula de inseto similar (ou nível médio entre uma população de células) que não entrou em contato com a molécula de RNAi. Em algumas modalidades, o nível de controle é um nível de expressão de IAP em uma célula de inseto similar (ou nível médio entre uma população de células) que não entrou em contato com a molécula de RNAi direcionando um gene não expresso pela célula de inseto, por exemplo, proteína verde fluorescente (GFP).
[089] Em algumas modalidades, o efeito de distribuir, a uma célula ou inseto, uma molécula de RNAi direcionando ao IAP é avaliado após um período de tempo finito. Por exemplo, os níveis de IAP podem ser determinados em uma célula ou inseto pelo menos 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas; Ou pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou quatorze dias após distribuir, à célula ou inseto, a molécula de RNAi direcionando ao IAP.
[090] Em algumas modalidades, a distribuição de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, como descrito aqui, resulta em uma redução no nível de crescimento, reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade) e/ou alimentação de um inseto. Em algumas modalidades, a redução nos níveis de crescimento, reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade) e/ou alimentação pode ser uma redução em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% em relação a um nível controle. Em algumas modalidades, o nível de controle é um nível de crescimento, reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade) e/ou alimentação de um inseto similar que não teve contato com a molécula de RNAi. Em algumas modalidades, o nível de controle é um nível de crescimento, reprodução (por exemplo, fertilidade e/ou fecundidade) e/ou alimentação de um inseto similar que teve contato com uma molécula de RNAi direcionando um gene não expresso pela célula do inseto, por exemplo, a proteína verde fluorescente (GFP).
[091] Em algumas modalidades, a distribuição de uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, como descrito aqui, resulta em um aumento na mortalidade entre uma população de insetos. Em algumas modalidades, o aumento no nível de mortalidade pode ser um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% em relação a um controle. Em algumas modalidades, o controle é a mortalidade entre uma população de insetos que não teve contato com a molécula de RNAi. Em algumas modalidades, o controle é entre uma população de insetos que teve contato com uma molécula de RNAi direcionando um gene não expresso pela célula do inseto, por exemplo, a proteína verde fluorescente (GFP).
[092] Os aspectos da presente revelação proporcionam plantas que expressam uma molécula de RNAi direcionando ao IAP, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o DNA codificando uma molécula de RNAi direcionando ao IAP proporcionada aqui é fornecido a uma planta (semente ou células de uma planta), de modo que a planta expresse a molécula de RNAi direcionando ao IAP.
Em algumas modalidades, o DNA codificando uma molécula de RNAi direcionando ao IAP é expresso em uma planta por expressão transgênica, por exemplo, por meio da integração estável do DNA codificando uma molécula de RNAi direcionando ao IAP em um genoma de uma planta, de modo que a planta expresse a molécula de RNAi direcionando ao IAP.
Métodos de Produção de Moléculas de RNAi Direcionando ao IAP
[093] As moléculas de RNAi direcionando ao IAP como fornecidas aqui podem ser produzidas por qualquer método adequado conhecido na técnica.
Exemplos de métodos para produzir uma molécula de RNAi direcionando ao IAP incluem, sem a isto se limitar, transcrição in vitro (IVT), síntese química, expressão em um organismo (por exemplo, uma planta), ou expressão em cultura celular (por exemplo, uma cultura de célula vegetal) e fermentação microbiana.
[094] As moléculas de RNAi direcionando ao IAP podem ser produzidas, em algumas modalidades, de acordo com métodos de produção livres de células descritos na Publicação do Pedido Internacional WO 2017/176963 A1, publicada em 12 de outubro de 2017, intitulada “Cell-Free Production of Ribonucleic Acid”; no Pedido US Provisório U.S.S.N. 62/571,071 depositado em 11 de outubro de 2017, intitulado “Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production”; e na Publicação do Pedido Internacional WO 2019/075167 A1, publicada em 18 de abril 2019, intitulada “Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production”; cada uma das quais é incorporada aqui para fins de referência.
[095] Quaisquer moléculas de RNAi de codificação de DNA direcionando ao IAP descritas aqui podem ser usadas nos métodos descritos aqui. Um DNA pode ser um DNA de fita simples (ssDNA) ou um DNA de fita dupla (dsDNA). Em algumas modalidades, um DNA compreende um ou mais cassetes de expressão de DNA que, quando transcritos, produzem uma molécula de RNA de fita simples (ssRNA) (por exemplo, que permanece de fita simples ou se dobra em um grampo de RNA) ou moléculas de ssRNA complementares que fazem o anelamento para produzir a molécula de RNA de fita dupla (dsRNA).
[096] Em algumas modalidades, um DNA compreende um promotor (por exemplo, um promotor induzível) ligado operavelmente a um sequência de nucleotídeos codificando RNA que é complementar a um segmento do IAP, e, opcionalmente, um terminador. Em outras modalidades, um DNA compreende um primeiro promotor (por exemplo, um promotor induzível) operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos codificando RNA que é complementar a um segmento do IAP, e, opcionalmente, um terminador, e um segundo promotor (por exemplo, um promotor induzível) operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos codificando um segundo RNA que é complementar ao primeiro RNA, e, opcionalmente, um terminador. Em ainda outras modalidades, um DNA compreende um promotor (por exemplo, um promotor induzível) operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos codificando uma primeira região de um RNA, seguido de um ou mais nucleotídeos de uma região de alça, seguido de uma segunda região do RNA, e opcionalmente seguido de um terminador, em que a primeira região do RNA é complementar a um segmento do IAP e a segunda região é complementar à primeira região. Em ainda outras modalidades, um DNA compreende uma primeira fita compreendendo um primeiro promotor (por exemplo, um promotor induzível) operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos codificando um primeiro RNA que é complementar que é complementar a um segmento do IAP, e opcionalmente um terminador, e uma segunda fita compreendendo um segundo promotor (por exemplo, um promotor induzível) operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos codificando um segundo RNA que é complementar ao primeiro RNA, e opcionalmente um terminador, em que o primeiro e segundo promotores são operavelmente ligados à sequência de nucleotídeos codificando um RNA de direcionamento ao IAP desejado, e em que a transcrição bidirecional da sequência de nucleotídeos codificando o RNA de direcionamento de IAP desejado resulta em moléculas de RNA complementares que fazem o anelamento para formar a molécula de dsRNA.
[097] Um DNA é tipicamente fornecido em um vetor, tal como um plasmídeo, embora outros formatos de molde possam ser usados (por exemplo, DNA linear gerado por reação em cadeia da polimerase (PCR), síntese química, ou outros meios conhecidos na técnica). Em algumas modalidades, mais de um DNA é usado em uma mistura de reação. Em algumas modalidades, 2, 3, 4, 5 ou mais DNAs diferentes são usados em uma mistura de reação.
[098] Um promotor ou terminador pode ser uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência modificada geneticamente (por exemplo, sintética). Em algumas modalidades, uma sequência modificada geneticamente é modificada para melhorar a atividade transcricional. Em algumas modalidades, o promotor é uma sequência de ocorrência natural. Em outras modalidades, o promotor é uma sequência modificada geneticamente. Em algumas modalidades, o terminador é uma sequência de ocorrência natural. Em outras modalidades, o terminador é uma sequência modificada geneticamente.
EXEMPLOS
[099] De modo que a invenção descrita aqui possa ser entendida mais plenamente, os seguintes exemplos são apresentados. Os Exemplos descritos neste Pedido são oferecidos para ilustrar os métodos, composições e sistemas aqui proporcionados, e não devem ser interpretados de forma alguma como limitando seu escopo.
[0100] As moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) usadas nos Exemplos adiante são como se segue, cujas sequências são apresentadas na Tabela 8.
[0101] GS3: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 21 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 39. GS3 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 750 a 1181 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0102] GS4: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 22 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 40. GS4 direciona ao mRNA codificado por gfp.
[0103] GS167: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 23 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 41. GS167 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 1 a 521 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0104] GS168: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 24 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 42. GS168 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 522 a 1044 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 522.
[0105] GS169: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 25 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 43. GS169 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 1045 a 1564 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0106] GS170: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 26 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 44. GS170 tem 70% de identidade de sequência com GS3, que direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 750 a 1181 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0107] GS171: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 27 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 45. GS171 tem
75% de identidade de sequência com GS3, que direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 750 a 1181 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0108] GS172: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 28 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 46. GS172 tem 80% de identidade de sequência com GS3, que direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 750 a 1181 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0109] GS173: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 29 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 47. GS173 tem 85% de identidade de sequência com GS3, que direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 750 a 1181 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0110] GS174: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 30 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 48. GS174 tem 90% de identidade de sequência com GS3, que direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 750 a 1181 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0111] GS175: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 31 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 49. GS175 tem 95% de identidade de sequência com GS3, que direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 750 a 1181 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0112] GS176: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 32 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 50. GS176 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 909 a 1108 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0113] GS175: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 33 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 51. GS177 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 934 a 1083 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0114] GS178: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 34 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 52. GS178 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 959 a 1058 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0115] GS179: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 35 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 53. GS179 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 984 a 1033 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
[0116] GS180: uma fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 36 ligada a outra fita de RNA consistindo da sequência da SEQ ID NO: 54. GS180 direciona ao mRNA codificado pelos nucleotídeos 996 a 1020 da sequência de DNA da SEQ ID NO: 1.
Exemplo 1: Composição de RNAi IAP mata besouros-da-batata-do-Colorado
[0117] Para avaliar o efeito do polinucleotídeo de RNAi IAP (SEQ ID NOS: 21 e 39) sobre os besouros-da-batata-do-Colorodo (CPBs), uma composição (por exemplo, compreendendo água) compreendendo um polinucleotídeo de RNAi IAP (doravante ”GS3”) foi tratada (a uma concentração de 10 μg/cm2) sobre as folhas de plantas de batata. Até 90% dos CPBs morreram após uma exposição de 9 dias às folhas de planta de batata cobertas com GS3, comparado com menos de 10% dos CPBs que morreram após exposição às folhas de controle negativo (GS4) (FIG. 1A).
Esta mortalidade aumentada em resposta à exposição a GS3 também resulta em uma diminuição do consumo de folhas de batata para aproximadamente 0% (FIG.
1B). O percentual de consumo de folhas de batata refere-se à porcentagem de discos de folha de batata (retirados das folhas de batata) após o tratamento dos discos com a composição de RNAi e exposição subsequente dos discos ao besouro- da-batata-do-Colorado, por exemplo.
[0118] Uma titulação de dose da composição GS3 também foi realizada para determinar se uma concentração inferior do polinucleotídeo de RNAi IAP é igualmente eficaz no controle dos CPBs. Até 90% dos CPBs morreram após uma exposição por três dias ao GS3 a 1,0 μg/cm2 e 0,1 μg/cm2, aproximadamente 70% dos CPBs morreram após uma exposição por três dias ao GS3 a 0,01 μg/cm2, e aproximadamente 15% dos CPBs morreram após uma exposição por três dias ao GS3 a 0,001 μg/cm2 se comparado com uma composição controle (GS4) a 1,0 μg/cm2 (FIG. 2A). O consumo de folhas de batata também diminuiu para aproximadamente 0% quando os CPBs foram expostos ao GS3 a 1,0 μg/cm2 e 0,1 μg/cm2, enquanto que os CPBs expostos ao GS3 a 0,01 μg/cm2 consumiram apenas 20% de folhas de batata, e os CPBs expostos ao GS3 a 0,001 μg/cm2 consumiram em torno de 60% das folhas de batata (FIG. 2B).
[0119] A exposição dos CPBs ao polinucleotídeo de RNAi IAP administrado às folhas de batata a uma concentração tão baixa quanto 0,1 μg/cm2 resulta em uma mortalidade de 90% e um consumo de folhas de batata reduzido em 95% se comparado aos CPBs expostos a um controle. Exemplo 2: Aplicação da composição de RNAi IAP a plantas para o controle de besouros-da-batata-do-Colorado
[0120] A composição compreendendo o polinucleotídeo de RNAi IAP (GS3) do Exemplo 1 foi testada quanto à sua eficácia em controlar o número de besouros- da-batata-do-Colorado (CPBs) em uma planta de batata. Resumidamente, a composição GS3 (por exemplo, 0,06 g/L), uma composição compreendendo CORAGEN® (controle +; um agente conhecido por matar CPBs), ou nenhum tratamento (controle -), foram aplicados às folhas de plantas de batata. O efeito da irrigação (aproximadamente 500 mL de água por planta, simulando ½ polegada de chuva) sobre a eficácia da composição de GS3 também foi testada. O número de larvas de CPB por planta foi diminuído a aproximadamente 90% em plantas de batata tratadas com GS3, independentemente da irrigação, em relação às plantas de batata não tratadas (FIG. 3A). O percentual de desfolhação de plantas de batata também foi diminuído em cerca de 90% quando as plantas foram tratadas com GS3, independentemente da irrigação, em relação às plantas de batata não tratadas (FIG.
3B).
[0121] A exposição dos CPBs ao polinucleotídeo de RNAi IAP na composição de GS3 administrada a plantas de batata diminuiu os números de larvas vivas por planta e a desfolhação plantar em aproximadamente 90% se comparado aos CPBs expostos a plantas de batata que não foram tratadas.
Exemplo 3: Composições de RNAi IAP abrangendo o comprimento do gene IAP são eficazes no controle da Infestação por besouro-da-batata-do-Colorado (CPB)
[0122] Quatro moléculas de dsRNA que se ligam coletivamente a todo o comprimento do RNA mensageiro (mRNA) (SEQ ID NO: 19) codificado por um gene IAP de coleóptero (SEQ ID NO: 1) foram avaliadas quanto à sua eficácia no controle da infestação por besouro-da-batata-do-Colorado (CPB). As moléculas de dsRNA usadas neste Exemplo foram: GS3, GS167, GS168, GS169, e a molécula de controle negativo (GS4).
[0123] Para cada dsRNA, quatro folhas (~20 dias de idade) foram cortadas a partir de uma planta de berinjela, recobertas com 0,5 µg/µL de dsRNA, e secas por cerca de 30 min. Cada uma das quatro folhas foi colocada em quatro placas de Petri diferentes (100 mm x 15 mm) em um papel-filtro de umidade. Para cada placa de petri, cinco larvas de CPB de “segundo ínstar” foram colocadas sobre cada folha e as placas mantidas à temperatura ambiente. No Dia 3 (após 72 horas) e no Dia 6 (após 144 horas), novas folhas tratadas com dsRNA foram colocadas nas placas de Petri. O número total de insetos CPB foi contado em cada experimento nos Dias 3, 6, 7, 8 e 9. Para fins de determinação da mortalidade causada por cada dsRNA, a contagem inicial de insetos CPB vivos foi estabelecida no Dia 2. Assumiu-se que quaisquer insetos CPB que já estavam mortos no Dia 2 estavam mortos devido às condições de manipulação ou às condições de saúde iniciais do inseto. Cada experimento de dsRNA foi duplicado usando diferentes lotes de insetos em diferentes semanadas, cada um compreendendo quatro placas de Petri de folhas diferentes).
[0124] Todas as moléculas de dsRNA testadas (GS3, GS167, GS168 e GS169) que se ligam a um mRNA codificado por um gene IAP de coleóptero causaram mortalidade dependente do tempo significativa em insetos CPB (Tabelas 1 e 2). Após nove dias de exposição, GS3 causou uma mortalidade média de 93% em insetos CPB; GS167 causou uma mortalidade média de 91% em insetos CPB; GS168 causou uma mortalidade média de 83% em insetos CPB; e GS168 causou uma mortalidade média de 69% em insetos CPB. Inversamente, o controle negativo (GS4) causou apenas uma mortalidade média de 26% (FIG. 5).
Tabela 2. Mortalidade média causada por moléculas de dsRNA que direcionam o comprimento do gene IAP (replicatas combinadas).
no de Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Insetos no e e e e e Dia 2 no Dia 3 no Dia 6 no Dia 7 no Dia 8 no Dia 9 #1:19, #2: GS4 0% 11% 18% 21% 26% 19 #1:12, #2: GS3 20% 73% 85% 89% 93% 20 GS16 #1:15, #2: 13% 76% 76% 81% 91% 7 20 GS16 #1:16, #2: 14% 69% 75% 78% 83% 8 20 GS16 #1:14, #2: 9% 47% 53% 56% 69% 9 18 Exemplo 4: Composições de RNAi IAP de comprimento mínimo (49 a 200 nucleotídeos) são eficazes no controle de besouros-da-batata-do-Colorado
[0125] Cinco moléculas de dsRNA compreendendo sequências de comprimento mínimo (49 a 200 nucleotídeos) que se ligam a um RNA mensageiro (mRNA) (por exemplo, SEQ ID NO: 19) codificado por um gene IAP de coleóptero (por exemplo, SEQ ID NO: 1) foram avaliadas quanto à sua eficácia no controle dos besouros-da-batata-do-Colorado (CPBs). As moléculas de dsRNA avaliadas foram: GS176, GS177, GS178, GS179, GS180, GS3 e o controle negativo (GS4).
[0126] GS176, GS177 e GS178 foram testados com GS4 e GS3 de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3.
[0127] GS179 e GS193 foram testados com GS4 e GS3 a uma concentração de 0,027 µg/µL usando doze folhas de berinjela, cada uma com uma única larva CPB de “segundo ínstar”. GS179 e GS180 compreendiam sequências de complementaridade ao mRNA IAP flanqueadas por um promotor T7 e um sítio de restrição.
[0128] Todas as moléculas de dsRNA testadas compreendendo de 100 a 200 nucleotídeos que se ligam a um mRNA codificado por um gene IAP de coleóptero (GS176, GS177, GS178) causaram mortalidade tempo-dependente significativa em insetos CPB (Tabela 2). Após nove dias de exposição, a molécula de dsRNA de comprimento de 200 nucleotídeos (GS176) causou uma mortalidade média de 89% em insetos CPB; a molécula de dsRNA de comprimento de 150 nucleotídeos (GS177) causou uma mortalidade média de 95% em insetos CPB; e a molécula de dsRNA de comprimento de 100 nucleotídeos (GS178) causou uma mortalidade média de 89% em insetos CPB. Cada uma dessas três moléculas de dsRNA funcionou para controlar/matar insetos CPB a níveis similares aos da molécula de dSRNA de comprimento de 432 nucleotídeos (GS3). Inversamente, o controle negativo (GS4) causou apenas uma mortalidade média de 26% (FIG. 6A).
[0129] As moléculas de dsRNA compreendendo 49 nucleotídeos (GS179) e 74 nucleotídeos (GS193), respectivamente, causaram mortalidade tempo-
dependente em insetos CPB (Tabela 5). Após oito dias de exposição, a molécula de dsRNA de comprimento de 49 nucleotídeos (GS179) causou uma mortalidade média de 56% em insetos CPB; e a molécula de dsRNA de comprimento de 74 nucleotídeos (GS180) causou uma mortalidade média de 60% em insetos CPB. O controle negativo (GS4) causou uma mortalidade média de 10% (FIG. 6B).
Tabela 2. Mortalidade média de duas replicatas biológicas causadas por moléculas de dsRNA compreendendo de 100 a 200 nucleotídeos que direcionam ao gene IAP (replicatas combinadas) comprimento do no de dsRNA Insetos no Dia 3 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9 (nucleotídeos) Dia 2 #1:19, #2: GS4 524 0% 11% 18% 21% 26% 19 #1:12, #2: GS3 432 20% 73% 85% 89% 93% 20 #1:14, #2: GS176 200 25% 73% 78% 85% 89% 20 #1:18, #2: GS177 150 25% 62% 81% 83% 95% 19 #1:15, #2: GS193 100 13% 68% 83% 85% 89% 19 Tabela 3. Mortalidade causada por moléculas de dsRNA compreendendo de 25 a 50 nucleotídeos que se ligam de forma complementar ao gene mRNA IAP alvo comprimento Mortalid Mortalida Mortalida Mortalida no de Insetos no do dsRNA ade de de de Dia 2 (nucleotídeos) no Dia 3 no Dia 6 no Dia 7 no Dia 8 GS4 524 10 0% 0% 10% 10% GS3 432 12 8% 58% 67% 75% GS17 50 9 0% 44% 56% 56% 9 GS19 25 10 0% 30% 40% 60% 3 Exemplo 5: Composições de RNAi IAP compreendendo uma sequência que tem 90% de complementaridade com um mRNA IAP são eficazes no controle dos besouros-da-batata-do-Colorado
[0130] O dsRNA de 432 nucleotídeos (GS3) que se liga a um RNA mensageiro (mRNA) codificado por um gene IAP de coleóptero foi mutado para avaliar a capacidade das moléculas de dsRNA compreendendo emparelhamentos errôneos em controlar / matar insetos CPB. As moléculas de dsRNA avaliadas foram dsRNA: (1) possuindo 70% de identidade de sequência para GS3 (GS170); (2) possuindo 75% de identidade de sequência para GS3 (GS171); (3) possuindo 80% de identidade de sequência para GS3 (GS172); (4) possuindo 85% de identidade de sequência para GS3 (GS173); (5) possuindo 90% de identidade de sequência para GS3 (GS174); e possuindo 95% de identidade de sequência para GS3 (GS175). A sequência de GS170 é 70% complementa a um mRNA codificado por um gene IAP; GS171 é 75% complementa a um mRNA codificado por um gene IAP; GS172 é 80% complementa a um mRNA codificado por um gene IAP; GS173 é 85% complementa a um mRNA codificado por um gene IAP; GS174 é 90% complementar a um mRNA codificado por um gene IAP; e GS175 é 95% complementar a um mRNA codificado por um gene IAP.
[0131] Todas as moléculas de dsRNA foram testadas com GS4 e FS3 de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3.
[0132] GS174 e GS175, que são, respectivamente, 90% e 95% complementares a um mRNA codificado por um gene IAP, causaram mortalidade tempo-dependente em insetos CPB (Tabelas 6 e 7). Após nove dias de exposição, GS174 causou uma mortalidade média de 75% em insetos CPB; e GS175 causou uma mortalidade média de 84% em insetos CPB. Cada uma dessas moléculas de dsRNA funcionou para controlar/matar insetos CPB em níveis similares aos da molécula dsRNA que foi 100% complementar a um mRNA codificado por um gene IAP (GS3) (FIG. 7).
Tabela 4. Mortalidade Média de duas replicatas biológicas caudas por moléculas de dsRNA compreendendo sequências com complementaridade variável a um mRNA codificado por um gene IAP (replicatas combinadas) Compleme No de Dia 3 Dia 6 Dia 9 ntaridade Dia 7 Dia 8 Insetos no Mortalid Mortalid Mortalid ao mRNA Mortalidade Mortalidade Dia 2 ade ade ade
IAP #1:19, #2: GS4 524 0% 11% 18% 21% 26% 19 #1:12, #2: GS3 100% 20% 73% 85% 89% 93% 20 GS17 #1:17, #2: 70% 3% 8% 19% 22% 28% 0 19 GS17 #1:18, #2: 75% 3% 17% 25% 28% 33% 1 18 GS17 #1:20, #2: 80% 5% 33% 44% 44% 49% 2 19 GS17 #1:20, #2: 85% 8% 13% 23% 26% 33% 3 19 GS17 #1:19, #2: 90% 13% 51% 65% 70% 75% 4 18 GS17 #1:19, #2: 95% 17% 67% 81% 81% 84% 5 17 Exemplo 6: Uma composição de RNAi IAP ilustrativa controla besouros-da- batata-do-Colorado em ensaios em campo.
[0133] O dsRNA de 432 nucleotídeos (GS3) que se liga a um RNA mensageiro (mRNA) codificado por um gene IAP de coleóptero foi avaliado quanto à sua capacidade de controlar insetos CPB em três ensaios em campo ao ar livre.
Resumidamente, em cada ensaio em campo, uma composição compreendendo GS3 (2 a 4 gramas/acre), uma ou mais composições de controle positivo (padrões) compreendendo CORAGEN® (73 gramas/acre), ENTRUST® (88 gramas/acre), e/ou NOVODOR™ (161 M Bio En/ha), ou nenhum tratamento (controle negativo) foi aplicado às folhas de plantas de batata ou berinjela em um campo aberto. Cada composição de RNAi (GS3) foi aplicada às folhas, seja em quatro aplicações em um intervalo de cinco dias, ou em três aplicações em um intervalo de sete dias. Os padrões foram aplicados às folhas em três aplicações em intervalos de sete dias (Dias 0, 7 e 14). O percentual de desfolhação das folhas de batata foi avaliado em 2,
6, 13 e 20 dias após a primeira aplicação, e o percentual de desfolhação das folhas de berinjela foi avaliado em 5, 14 e 21 dias após a primeira aplicação.
[0134] No ensaio em campo #1 (FIG. 9A), as plantas de batata que não foram tratadas foram 39% desfolhadas no Dia 20. Por sua vez, as plantas de batata tratadas com GS3 foram 10% desfolhadas no Dia 20; as plantas tratadas com padrões (por exemplo, CORAGEN® e ENTRUST®) foram menos de 5% desfolhadas no Dia 20.
[0135] No ensaio em campo #2 (FIG. 9B), as plantas de batata que não foram tratadas foram 48% desfolhadas no Dia 20. Por sua vez, as plantas de batata tratadas com GS3 foram aproximadamente 10% desfolhadas no Dia 20; as plantas tratadas com padrões (por exemplo, CORAGEN®, ENTRUST®, NOVODOR®) foram menos de 5% desfolhadas no Dia 20.
[0136] No ensaio em campo #3 (FIG. 9C), as plantas de berinjela que não foram tratadas foram 45% desfolhadas no Dia 21. Por sua vez, as plantas de berinjela tratadas com GS3 foram 15% desfolhadas no Dia 21 e as plantas tratadas com padrões (por exemplo, CORAGEN® e ENTRUST®) foram menos de 5% desfolhadas no Dia 21.
[0137] Esses dados demonstram que a aplicação de composições de RNAi IAP da revelação previne a desfolhação das plantas (por exemplo, plantas de batata ou berinjela) quando aplicadas às folhas das plantas em campos abertos (por exemplo, campos de cultivos).
Modalidades Adicionais
[0138] Modalidades adicionais da presente invenção são abrangidas pelos seguintes parágrafos numerados.
[0139] 1. Uma molécula de polinucleotídeo direcionando a um gene Inibidor da Apoptose (IAP) de coleópteros, em que a molécula de polinucleotídeo é selecionada a partir do grupo consistindo em:
[0140] uma molécula de polinucleotídeo que se liga a e inibe a expressão de um RNA mensageiro (mRNA) codificado por um ácido desoxirribonucleico (DNA) compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 1;
[0141] uma molécula de polinucleotídeo que se liga a e inibe a expressão de um mRNA compreendendo uma sequência da SEQ ID NO: 19 ou da SEQ ID NO: 20;
[0142] uma molécula de polinucleotídeo que compreende uma sequência possuindo pelo menos 80% de identidade com uma sequência da SEQ ID NO: 21 ou da SEQ ID NO: 39; e
[0143] uma molécula de polinucleotídeo que compreende um segmento que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos, em que o segmento tem pelo menos 90% de identidade com um segmento de uma sequência da SEQ ID NO: 21 ou da SEQ ID NO: 39.
[0144] 2. A molécula de polinucleotídeo do parágrafo 1, em que a molécula de polinucleotídeo se liga a uma sequência da SEQ ID NO: 21.
[0145] 3. A molécula de polinucleotídeo do parágrafo 1 ou 2, em que a molécula de polinucleotídeo compreende uma sequência que tem pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com uma sequência da SEQ ID NO: 21 ou da SEQ ID NO: 39.
[0146] 4. A molécula de polinucleotídeo do parágrafo 1 ou 2, em que a molécula de polinucleotídeo compreende um segmento que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos, em que o segmento compartilha pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade com uma sequência da SEQ ID NO: 21 ou da SEQ ID NO: 39.
[0147] 5. A molécula de polinucleotídeo do parágrafo 3 ou 4, em que a molécula de polinucleotídeo compreende a sequência da SEQ ID NO: 21 ou da SEQ ID NO: 30.
[0148] 6. A molécula de polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5, em que a molécula de polinucleotídeo é uma molécula de RNA de fita simples (ssRNA), opcionalmente compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 39 ou um segmento da SEQ ID NO: 39.
[0149] 7. A molécula de polinucleotídeo do parágrafo 6, em que a molécula de ssRNA é selecionada a partir do grupo consistindo de pequenos RNAs interferentes (siRNAs), RNAs em grampo curto (shRNAs), microRNAs (miRNAs) e RNAs antissenso.
[0150] 8. A molécula de polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 5, em que a molécula de polinucleotídeo é uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA), opcionalmente compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 21 ou um segmento da SEQ ID NO: 21.
[0151] 9. Um polinucleotídeo que inibe especificamente a expressão de um gene Inibidor da Apoptose (IAP) de coleópteros, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita compreendendo a sequência de qualquer uma da SEQ ID NO: 21 ou 23 a 36.
[0152] 10. Um polinucleotídeo que inibe especificamente a expressão de um gene Inibidor da Apoptose (IAP) de coleópteros, em que o polinucleotídeo compreende uma fita compreendendo a sequência de qualquer uma da SEQ ID NO: 39 ou 41 a 54.
[0153] 11. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 21, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 39.
[0154] 12. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 23,
opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 41.
[0155] 13. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 24, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 42.
[0156] 14. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 25, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 43.
[0157] 15. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 26, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 44.
[0158] 16. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 27, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 45.
[0159] 17. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 28, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 46.
[0160] 18. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 29, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 47.
[0161] 19. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 30, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 48.
[0162] 20. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 31, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 49.
[0163] 21. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 32, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 50.
[0164] 22. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 33, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 51.
[0165] 23. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 34, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 52.
[0166] 24. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 35, opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 53.
[0167] 25. O polinucleotídeo do parágrafo 9, em que o polinucleotídeo compreende uma primeira fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 36,
opcionalmente adicionalmente compreendendo uma segunda fita consistindo da sequência da SEQ ID NO: 54.
[0168] 26. Uma composição compreendendo a molécula de polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 25.
[0169] 27. A composição do parágrafo 26, em que a composição adicionalmente compreende um aditivo selecionado a partir do grupo consistindo em alimentos para inseto, atrativos para inseto, feromônios, proteínas, carboidratos, polímeros e pesticidas.
[0170] 28. Um método para controlar a infestação por coleópteros, o método compreendendo colocar uma planta, solo, um inseto coleóptero, ou uma dieta de um inseto coleóptero em contato com a molécula de polinucleotídeo de acordo com qualquer uma dos parágrafos de 1 a 25 ou com a composição de acordo com os parágrafos 26 ou 27.
[0171] 29. O método do parágrafo 28, em que o inseto coleóptero é de uma espécie selecionada a partir do grupo consistindo em: Leptinotarsa spp., Phyllotreta spp., Cerotoma spp., Diabrotica spp., Tribolium spp., Anthonomus spp e Alticini spp.
[0172] 30. O método do parágrafo 28 ou 29, em que o inseto coleóptero é um inseto do gênero Leptinotarsa spp..
[0173] 31. O método do parágrafo 30, em que o inseto do gênero Leptinotarsa spp. é um besouro-da-batata-do-Colorado.
[0174] 32. O método de qualquer um dos parágrafos de 28 a 31, em que a planta é selecionada a partir do grupo consistindo em plantas Solanaceae, plantas Brassicaceae, plantas Poaceae, plantas Cucurbitaceae, plantas Fobaceae, plantas Apiaceae, plantas Amaranthaceae, e plantas Malvaceae.
[0175] 33. O método de qualquer um dos parágrafos 28 a 32, em que o método prejudica o crescimento, reprodução e/ou alimentação do inseto coleóptero.
[0176] 34. O método de qualquer um dos parágrafos 28 a 32, em que o método resulta em morte do inseto coleóptero.
[0177] 35. Um método para produzir um polinucleotídeo para uso no controle de insetos, o método compreendendo:
[0178] (a) incubar, em uma mistura de reação, ácido ribonucleico (RNA) celular e uma ribonuclease e produzir 5′ nucleosídeo monosfosfatos (5′ NMPs);
[0179] (b)eliminar a ribonuclease; e
[0180] (c)incubar, na mistura de reação, ou em uma segunda mistura de reação, os 5′ NMPs, uma polifosfato quinase, um polifosfato, uma polimerase, e um molde de ácido desoxirribonucleico (DNA) possuindo pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1, ou codificar uma sequência de RNA que compreende um segmento que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos, em que o segmento tem pelo menos 90% de identidade com um segmento de uma sequência da SEQ ID NO: 2, e produzir o RNA de interesse, opcionalmente em que a mistura de reação da etapa (c) adicionalmente compreende uma nucleosídeo quinase, uma NMP quinase e/ou uma NDP quinase.
[0181] 36. O método do parágrafo 35, em que o RNA celular compreende RNA ribossômico, RNA mensageiro e/ou RNA de transferência.
[0182] 37. O método dos parágrafos 35 ou 36, em que a polifosfato quinase é selecionada a partir de enzimas da família PPK1 e enzimas da família PPK2, e opcionalmente em que a polifosfato quinase compreende uma polifosfato quinase 2 Classe III de Deinococcus geothermalis.
[0183] 38. O método de qualquer um dos parágrafos de 35 a 37, em que o polifosfato compreende hexametafosfato.
[0184] 39. O método de acordo com o parágrafo 35, em que o DNA molde é um promotor operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos codificando um
RNA de direcionamento ao IAP desejado, e, opcionalmente, um terminador transcricional.
[0185] 40. O método de acordo com o parágrafo 39, em que o DNA molde adicionalmente compreende um segundo molde compreendendo um promotor operavelmente ligado ao complemento reverso da sequência de nucleotídeos codificando um RNA de direcionamento ao IAP desejado, em que as duas moléculas de RNA individuais fazem o anelamento para formar uma molécula de dsRNA.
[0186] 41. O método de acordo com o parágrafo 35, em que o DNA molde é um promotor operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos codificando: (a) um RNA IAP desejado, (b) um ou mais nucleotídeos de uma região de alça de um transcrito de RNA, (c) o complemento reverso da sequência de nucleotídeos codificando o RNA de direcionamento ao IAP desejado, e, opcionalmente, um terminador transcricional.
[0187] 42. O método de acordo com o parágrafo 35, em que o DNA molde compreende:
[0188] a. um primeiro promotor,
[0189] b. uma sequência de nucleotídeos codificando um RNA de direcionamento ao IAP desejado,
[0190] c. um segundo promotor, e
[0191] d. opcionalmente, um ou mais terminadores transcricionais,
[0192] em que o primeiro e segundo promotores são operavelmente ligados à sequência de nucleotídeos codificando um RNA de direcionamento ao IAP desejado, e em que a transcrição bidirecional da sequência de nucleotídeos codificando o RNA de direcionamento ao IAP desejado resulta em moléculas de RNA complementares que se anelam para formar a molécula de dsRNA.
[0193] 43. O método do parágrafo 35, em que a ribonuclease, a polifosfato quinase, o DNA molde e/ou a polimerase é preparada a partir de células que expressam a ribonuclease, a polifosfato quinase, o DNA molde e/ou a polimerase.
[0194] 44. O método do parágrafo 35, em que a mistura de reação de (a) compreende um lisado celular preparado a partir de células que expressam a ribonuclease, a polifosfato quinase, o DNA molde e/ou a polimerase.
[0195] 45. O método do parágrafo 35, em que a etapa (b) compreende eliminar a ribonuclease e as atividades enzimáticas nativas no lisado celular por meio de temperatura, pH, sal, detergente, álcool e/ou inibidores químicos.
[0196] 46. O método do parágrafo 35, em que a etapa (b) compreende eliminar a atividade enzimática nativa das enzimas no lisado celular por meio de separação, precipitação, filtração, captura e/ou cromatografia.
[0197] 47. O método do parágrafo 35, em que a etapa (b) compreende eliminar a atividade enzimática nativa das enzimas no lisado celular por meio de modificação genética, secreção enzimática a partir de uma célula e/ou direcionamento da protease.
[0198] 48. O método de qualquer um dos parágrafos 45 a 47, em que as atividades enzimáticas nativas são selecionadas a partir de fosfatases, nucleases, proteases, desaminases e hidrolases.
[0199] 49. O método de qualquer um dos parágrafos 45 a 48, em que a polifosfato quinase e/ou a polimerase podem resistir a condições de eliminação.
[0200] 50. O método do parágrafo 35, em que a polimerase compreende pelo menos uma RNA polimerase.
[0201] 51. Um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) compreendendo uma sequência com pelo menos 80% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 3.
[0202] 52. O dsRNA do parágrafo 51, compreendendo uma sequência com pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 3.
[0203] 53. O dsRNA do parágrafo 51, compreendendo uma sequência do SEQ ID NO: 3.
[0204] 54. Uma composição compreendendo o dsRNA de qualquer um dos parágrafos 51 a 53, opcionalmente formulada a uma concentração de 0,001 μg/cm2 a 10 μg/cm2.
[0205] 55. O método do parágrafo 28, em que a etapa de contato compreende aplicar o polinucleotídeo à superfície da planta, solo, inseto coleóptero, ou dieta de um inseto coleóptero a uma concentração de pelo menos 0,001 μg/cm2.
[0206] 56. O método do parágrafo 55, em que a etapa de contato compreende aplicar o polinucleotídeo à superfície da planta, solo, inseto coleóptero, ou dieta de um inseto coleóptero a uma concentração de pelo menos 0,001 μg/cm2 a 10 μg/cm2.
[0207] 57. O método do parágrafo 56, em que a etapa de contato compreende aplicar o polinucleotídeo à superfície da planta, solo, inseto coleóptero, ou dieta de um inseto coleóptero a uma concentração de pelo menos 0,001 μg/cm2 a 0,1 μg/cm2.
[0208] 58. O método de qualquer um dos parágrafos 55 a 57, em que o percentual de mortalidade dos insetos coleópteros aumenta para pelo menos 30% após menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6 ou menos de 5 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não-tratadas.
[0209] 59. O método do parágrafo 58, em que o percentual de mortalidade dos insetos coleópteros aumenta para pelo menos 40% após menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não-tratadas.
[0210] 60. O método do parágrafo 59, em que o percentual de mortalidade dos insetos coleópteros aumenta para pelo menos 50% após menos de 10, menos de 9, menos de 8, ou menos de 7 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não- tratadas.
[0211] 61. O método do parágrafo 60, em que o percentual de mortalidade dos insetos coleópteros aumenta para pelo menos 60% ou pelo menos 70% seguindo-se menos de 10, menos de 9, ou menos de 8 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não-tratadas.
[0212] 62. O método do parágrafo 60, em que o percentual de mortalidade dos insetos coleópteros aumenta para pelo menos 90% após menos de 10 dias ou menos de 9 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não-tratadas.
[0213] 63. O método de qualquer um dos parágrafos 55 a 62, em que o consumo de disco de folha diminui para menos de 20% após menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6 ou menos de 5 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não tratadas.
[0214] 64. O método do parágrafo 63, em que o consumo de disco de folha diminui para menos de 10% seguindo menos de 10%, seguindo menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6 ou menos de 5 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não tratadas.
[0215] 65. O método de qualquer um dos parágrafos 55 a 64, em que o percentual de desfolhação plantar diminui para menos de 10% após menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6, menos de 5 ou menos de 4 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não tratadas.
[0216] 66. O método de qualquer um dos parágrafos 55 a 65, em que o percentual de desfolhação plantar permanece menor do que 10% seguindo pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 dias após a exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeos, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não tratadas. Tabela 8. Sequências, 5  3 Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
DNA IAP 1564 CTAATGCATTGCGTTGTTCAGATACAAACGT 1
ACGTGCAGTTCAGTTCAGTTCAGTTCTCGTA TCGCTAGTTTGTCGGAGCAATTGGTTCACTT GGTATTTGGGGCGATTTTAACGTGTTTTTTA CGAAGGATCTTATAAAAATCATGCAGTGTTA CAGCATCATATTTTTTGGTACTGAGAAGGCA TGAAAATGAATCAAACATTTCCCACAATCAG CAGTTACTCTGATCAGACAGACAATAACCCC AAACATAAAAGTTTTTTTGAAGTAAACGTCAA CAATTCCGCATTGGAGGCGAGACTGAGAAC ATTTGACAATTGGCCAAGCACACAACTATCC AAGGAAGCGCTCGCGTCTGCCGGTTTTGAA TACACTGGACAAGATGACATTGTTTTGTGTC GTTTCTGTAAGATAGAAGGATACAATTGGGT ATCTGGAGATGATCCAATGGCAGACCATCG AGAATGGAGTCCTGACTGTCCTTTTATTAGA ACTGTAGAGAACGGCAGGTCTGGGAGTAAT AGAAACGCAGATACTTGTGGACTGTACGGC ATAGAGGTTCTTCCAAATTCCCTCCCGGAGG ACAGGAGATCCATTGATTTGCAACAGTTGGG AATCCACAAAGGAAGTGGACCACACAACCA GGATAAAATAACGGTAAATAGTCGACTAGCA ACGTTCGAAAACTGGCCCAAGTCCATCAAG CAGAGACCCGTTGATTTGGCAGAAGCGGGA
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
TTTTATTATACCGGTGTGGGAGACCAGACAC TTTGTTTCTACTGTGGTGGTGGTCTAAAAGA CTGGGAAGAATCTGACGAACCTTGGGAACA ACACGCCCTTTGGTTCAGCAAGTGTGTTTTT CTAAATTTGAAAAAAGGTAAAGACTTTGTCG AAAAGGTCAAACAGAGGGCAGACCCTCTCT TGTCGCTCCCCGGAACAAGTCAAGACAAGA CCAAAGAGCTAGAAGAACCTAAAGAGCCCT GCAGTAGGACTCCAGAAAAGGCTGAAAAGA CTACTGAAACGGAAGCAACAGAGAAGACTTT GTGTAAAATCTGTTATAAAAACGAACTTGGT GTTGTATTCTTGCCTTGTGGACATGTTGTTG CTTGTGTAGATTGTGCTTCTGCTTTGAAAAC TTGTGCTGTCTGTAGGAAACCTTTGGAAGCG ACAGTTCGAGCATTTCTCTCATAATTTTTCCA TTCTTTAATTTTCGTTTCTCAGATCTAGTCAA TTTGAATTTGATTCTTGAAGGTTTATTAAAAA GTTTTGTCAAAAATTATTCTTTTCTTGTTTTAG GATTAGAAGTAAATCTATTTTTATACAATCTG AGTACAAATTCCACATACTTTTTTAGTTATAA GTTTGAAGCGCTTATGAAACATACTTTTAGTT CATTAATGACTGCAAACCATATCTTTCGTACA CTAATACTTATTAGTTATCAAGCTCTCGTGAG TGGAACTTCCTTATTAGAACATTTTATTATAA AACTGACACAGAGATATATCTGTATGTTTGT GTGTATGTTCACTAAGTATGCTAATAATATAA
TAATTTATGAAAAA IAP 1453 CTAATGCATTGCGTTGTTCAGATACAAACGT 2
ACGTGCAGTTCAGTTCAGTTCAGTTCTCGTA TCGCTAGTTGGCATGAAAATGAATCAAACAT TTCCCACAATCAGCAGTTACTCTGATCAGAC AGACAATAACCCCAAACATAAAAGTTTTTTTG AAGTAAACGTCAACAATTCCGCATTGGAGGC GAGACTGAGAACATTTGACAATTGGCCAAGC ACACAACTATCCAAGGAAGCGCTCGCGTCT GCCGGTTTTGAATACACTGGACAAGATGACA TTGTTTTGTGTCGTTTCTGTAAGATAGAAGG ATACAATTGGGTATCTGGAGATGATCCAATG GCAGACCATCGAGAATGGAGTCCTGACTGT CCTTTTATTAGAACTGTAGAGAACGGCAGGT CTGGGAGTAATAGAAACGCAGATACTTGTG GACTGTACGGCATAGAGGTTCTTCCAAATTC CCTCCCGGAGGACAGGAGATCCATTGATTT GCAACAGTTGGGAATCCACAAAGGAAGTGG
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
ACCACACAACCAGGATAAAATAACGGTAAAT AGTCGACTAGCAACGTTCGAAAACTGGCCC AAGTCCATCAAGCAGAGACCCGTTGATTTGG CAGAAGCGGGATTTTATTATACCGGTGTGG GAGACCAGACACTTTGTTTCTACTGTGGTGG TGGTCTAAAAGACTGGGAAGAATCTGACGAA CCTTGGGAACAACACGCCCTTTGGTTCAGC AAGTGTGTTTTTCTAAATTTGAAAAAAGGTAA AGACTTTGTCGAAAAGGTCAAACAGAGGGC AGACCCTCTCTTGTCGCTCCCCGGAACAAG TCAAGACAAGACCAAAGAGCTAGAAGAACCT AAAGAGCCCTGCAGTAGGACTCCAGAAAAG GCTGAAAAGACTACTGAAACGGAAGCAACA GAGAAGACTTTGTGTAAAATCTGTTATAAAAA CGAACTTGGTGTTGTATTCTTGCCTTGTGGA CATGTTGTTGCTTGTGTAGATTGTGCTTCTG CTTTGAAAACTTGTGCTGTCTGTAGGAAACC TTTGGAAGCGACAGTTCGAGCATTTCTCTCA TAATTTTTCCATTCTTTAATTTTCGTTTCTCAG ATCTAGTCAATTTGAATTTGATTCTTGAAGGT TTATTAAAAAGTTTTGTCAAAAATTATTCTTTT CTTGTTTTAGGATTAGAAGTAAATCTATTTTT ATACAATCTGAGTACAAATTCCACATACTTTT TTAGTTATAAGTTTGAAGCGCTTATGAAACAT ACTTTTAGTTCATTAATGACTGCAAACCATAT CTTTCGTACACTAATACTTATTAGTTATCAAG CTCTCGTGAGTGGAACTTCCTTATTAGAACA TTTTATTATAAAACTGACACAGAGATATATCT GTATGTTTGTGTGTATGTTCACTAAGTATGCT
AATAATATAATAATTTATGAAAAA GS3 432bp GGTGTGGGAGACCAGACACTTTGTTTCTACT 3
GTGGTGGTGGTCTAAAAGACTGGGAAGAAT CTGACGAACCTTGGGAACAACACGCCCTTT GGTTCAGCAAGTGTGTTTTTCTAAATTTGAAA AAAGGTAAAGACTTTGTCGAAAAGGTCAAAC AGAGGGCAGACCCTCTCTTGTCGCTCCCCG GAACAAGTCAAGACAAGACCAAAGAGCTAG AAGAACCTAAAGAGCCCTGCAGTAGGACTC CAGAAAAGGCTGAAAAGACTACTGAAACGG AAGCAACAGAGAAGACTTTGTGTAAAATCTG TTATAAAAACGAACTTGGTGTTGTATTCTTGC CTTGTGGACATGTTGTTGCTTGTGTAGATTG TGCTTCTGCTTTGAAAACTTGTGCTGTCTGT AGGAAACCTTTGGAAGCGACAGTTCGAGCA
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
TTT GS4 524bp ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC 4 (controle GGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGAC negativo) GGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTG
TCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTA CGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCAC CACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCAC CCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCA GTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAA GCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCC CGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTT CTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCG CGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCT GGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGA CTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCA CAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAA CGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAA CGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCA
CAACATCGAGGACGG GS167 521bp CTAATGCATTGCGTTGTTCAGATACAAACGT 5 dsRNA target ACGTGCAGTTCAGTTCAGTTCAGTTCTCGTA
TCGCTAGTTTGTCGGAGCAATTGGTTCACTT 5’ region GGTATTTGGGGCGATTTTAACGTGTTTTTTA
CGAAGGATCTTATAAAAATCATGCAGTGTTA CAGCATCATATTTTTTGGTACTGAGAAGGCA TGAAAATGAATCAAACATTTCCCACAATCAG CAGTTACTCTGATCAGACAGACAATAACCCC AAACATAAAAGTTTTTTTGAAGTAAACGTCAA CAATTCCGCATTGGAGGCGAGACTGAGAAC ATTTGACAATTGGCCAAGCACACAACTATCC AAGGAAGCGCTCGCGTCTGCCGGTTTTGAA TACACTGGACAAGATGACATTGTTTTGTGTC GTTTCTGTAAGATAGAAGGATACAATTGGGT ATCTGGAGATGATCCAATGGCAGACCATCG AGAATGGAGTCCTGACTGTCCTTTTATTAGA
ACTGTAGAGAACGGCAGGTCTGGGAGT GS168 522bp AATAGAAACGCAGATACTTGTGGACTGTACG 6 dsRNA alvo GCATAGAGGTTCTTCCAAATTCCCTCCCGGA
GGACAGGAGATCCATTGATTTGCAACAGTTG região central GGAATCCACAAAGGAAGTGGACCACACAAC
CAGGATAAAATAACGGTAAATAGTCGACTAG CAACGTTCGAAAACTGGCCCAAGTCCATCAA GCAGAGACCCGTTGATTTGGCAGAAGCGGG ATTTTATTATACCGGTGTGGGAGACCAGACA CTTTGTTTCTACTGTGGTGGTGGTCTAAAAG
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
ACTGGGAAGAATCTGACGAACCTTGGGAAC AACACGCCCTTTGGTTCAGCAAGTGTGTTTT TCTAAATTTGAAAAAAGGTAAAGACTTTGTC GAAAAGGTCAAACAGAGGGCAGACCCTCTC TTGTCGCTCCCCGGAACAAGTCAAGACAAG ACCAAAGAGCTAGAAGAACCTAAAGAGCCC TGCAGTAGGACTCCAGAAAAGGCTGAAAAG ACTACTGAAACGGAAGCAACAGAGAAGACTT
TG GS169 521bp TGTAAAATCTGTTATAAAAACGAACTTGGTGT 7 dsRNA alvo TGTATTCTTGCCTTGTGGACATGTTGTTGCT
TGTGTAGATTGTGCTTCTGCTTTGAAAACTT região 3’ GTGCTGTCTGTAGGAAACCTTTGGAAGCGA
CAGTTCGAGCATTTCTCTCATAATTTTTCCAT TCTTTAATTTTCGTTTCTCAGATCTAGTCAAT TTGAATTTGATTCTTGAAGGTTTATTAAAAAG TTTTGTCAAAAATTATTCTTTTCTTGTTTTAGG ATTAGAAGTAAATCTATTTTTATACAATCTGA GTACAAATTCCACATACTTTTTTAGTTATAAG TTTGAAGCGCTTATGAAACATACTTTTAGTTC ATTAATGACTGCAAACCATATCTTTCGTACAC TAATACTTATTAGTTATCAAGCTCTCGTGAGT GGAACTTCCTTATTAGAACATTTTATTATAAA ACTGACACAGAGATATATCTGTATGTTTGTG TGTATGTTCACTAAGTATGCTAATAATATAAT
AATTTATGAAAAA GS170 432bp GATGAGTGACTGCAGAATCTTTGTTTCCGCT 8 dsRNA alvo GAGGTTGTTGGCTTGAACACTAGGAAAGAG
GTTATGAACCTTGGTAACTACACACCATTTG 70% de ATGCAGCAAGCGTGATCTTCTAAATTAGTTA identidade GCAATGAAAGCCTTTGTCTAAGGGGTGAAC com GS3 CAGCGTGCCGAGCCTCTCTAGCCCCTCTCT
GACACAAGTCAAAACATGATCATTGGGCTTG TAGAGCCTCGAGAGGTCTGCAGTAGAACAC CAGACCAGGCTGGAAAGTCTCCTGAAACAG ATCCACCAGAGGAGACGTAGTTGAAAATCC GTTATAGAATCGAACTTCGCGTTGTACCACG GCTTTATAGGCAACCAGTTACTTGTCTAGAT TGTGCTTCAGCTACTAGAAATTGTGCTGAAA GGAGGAAACCACTGCAAGGGCTGGAACGG
GGATTA GS171 432bp AGTGTTTTAAAAACGCCCCTTTTTGGCTACT 9 dsRNA alvo GTAGTTGTAGTTTCAAAAACTGTGAAGAATC
GGACGATCATTGGGAACAACACGCGCTTTC 75% de GTTCAGCAAGTGGACTTCTAGAACTTTGAAA
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) identidade AAAGGTAATGACACAGTTGAGGAGGTCAAA com GS3 CTGAGGGCACACGCTCTCTTGTCGCAGCCG
GGAACAAGACAAGACATGACCAATAAGATAG AAGGACATACAGGCTCATTGAGTAGGGCTC GAGAAAAAGGTCAAAAGACTACTGATACGGA ACCCCCACAGCACACATTGTCTACTATCTGA CCTAAGATCTGACCTGGTGTTATATTCTTGA CCTGTGGACCTGTTGTGGCTTGCCTAGATTG AGCTACTGACATGAAAATATCTGATGTCTGT AGGAAGCATACGGAAGCGACGGCATGCGCA
TTT GS172 432bp GTTGTGGGAGACCAGTCTATGTGGTGCAAC 10 dsRNA alvo TATACTGGTGGTCATAAAAACTGGGACATAT
CAGACGTACCTCGGGTAGAACCCGCGCTTG 80% de GGTTCAGGAAGTGTGTTTTGCTAAAAATGAT identidade ATAAGCTCAAGACTTTGTCGAAAACGACAAC com GS3 CAGAGGGAAGAACATCTCTTGTCGCTCTCC
GAAACAACTCAAAACAAGACCAAAAAGATAG AGGTATCGGAAGAGCCCAGCAGTAGGAGCC TCGAACAGGCTGAAGAGACTACTAAGAGGG ACGCTACAGAGCACACTTTGACTAAGATCTG TTAAAAAGACGAGCTTGGTTTAGTTTTCTTAC CTGGTTGACTTGTTGTTGCCTGTCGAAATTG TGCTTCTGCTTTGAAAACTTGTGCTGTCTGT AGGCAACCTTTGGAATCGACAGTTAGCGCAT
TC GS173 432bp GGTGTAGGAGACCAGACACTCTGTTTCTACT 11 dsRNA alvo GAGGTGCTCGTCTAGGAGACCGTGTAGAAT
CTAACGAACCTTGGGAACAACACGCCCTTTG 85% de TTTCAGCCAGTGTGATTTTCAAAATGTGAAAT identidade AAGGTTAAGACTTTGTCGGCAAGGTCAAACA com GS3 GAGGCCAGACCATCTCTTGACGCGCCCCGT
AACAAGTCAAGAAAATACCAACGAGCTACAA GAACATAAAGAGCGCTGCAGTAGGACTCCG GAAAAGGTTGAGAAGACTACTGAAAGGGAA GCAAGAGGTAAGGCTATGTGTTAATTCTTTT ATAAAGACTTTCTTGGTGTCGTATATTTGCCT TGTGGCCATGTTGTTGCTCGTGTAGGTTGTT CTTCTGCTTAAGCAACTTGTGCTGTATGTAG
CAAACTTTTGCCAGCGGCAGTTCGAGCATTT GS174 432bp GGTGTGGGAGAGCAGACACTTCGTTTCTAC 12 dsRNA alvo AGTGGTGGCGGTCTAAAAGACTGGGAAGAA
TCTGACGAGCCTTGCGAACAACAGGCACTT 90% de GGGTTCAGCAAGTTTGCTTTTCTGAATTTGA identidade AAAAATGTTAAGACCTTGTCGGAAAGGTCAA
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) com GS3 ACAGAGGCCAGACCCTCTCTTGTGGCACCC
CTGAACAAGTCAAGACAAGACCACAGGCCG AGAAGAACCTAAAGAGCCCTGCAGCAGGAC TCCAGACAAGGCTGAAAAGACTACTGCAAC GGAAGCAGGAGAAAAGGCTTTGTGTAAAAT CTGTTCTAAAAACGAACTTGGAGTTGTATTC TGGCCTTGTGGCCATGTTGTTGCGGGTGTC GATTGTGCGTCTGCTTTGAATACTTGTGCTG TCCTTAGGAAACCTTTGGAAGCGACAGTTCG
AGCAATT GS175 432bp GGTGTGGGAGACCAGACACTTTGTTTCTACT 13 dsRNA alvo GTGATGGTGGTCTAAAAGACTGGGAAAAATC
TGACGAACCTTGGGTACAACACGGCCTTTG 95% de GTTCAGCAAGTGTGTCTTTATAAATTTGAAAA identidade AAGGTAAAGACTTTGGCGAAAAGGTCAAGC com GS3 AGAGGGCAATCCCTCTCTTGTCGCACCCCG
GAACAAGTCAAGACAAGACCAAAGAGCTAG ACGAACCTAAAGAGCCCTGCAGTAGGACTC CAGAAAAGGCTGAAAAGACTACTGAAACGG AAGCCACAGAGAAGACTTTGTGTAAAATCTG TTATAAAAACCAACTTGATGTTGTTTTCTTGC CATGTGGACATTTTGTTGCTTGTGGAGCTTG TGCTTCTGCTTTGAAAACTTGTGCTGTCTGT AGGAAACCTTTGGAAGCGACAGTTCGAGCA
TTC GS176 200bp GCAGACCCTCTCTTGTCGCTCCCCGGAACA 14 dsRNA alvo AGTCAAGACAAGACCAAAGAGCTAGAAGAA
CCTAAAGAGCCCTGCAGTAGGACTCCAGAA Nucleotídeos AAGGCTGAAAAGACTACTGAAACGGAAGCA (nt) 160-360 of ACAGAGAAGACTTTGTGTAAAATCTGTTATA GS3 AAAACGAACTTGGTGTTGTATTCTTGCCTTG
TGGACATGTTGTTGCTTG GS177 150bp GAACAAGTCAAGACAAGACCAAAGAGCTAG 15 dsRNA alvo AAGAACCTAAAGAGCCCTGCAGTAGGACTC
CAGAAAAGGCTGAAAAGACTACTGAAACGG nt 185-335 de AAGCAACAGAGAAGACTTTGTGTAAAATCTG GS3 TTATAAAAACGAACTTGGTGTTGTATTCT GS178 100bp GCTAGAAGAACCTAAAGAGCCCTGCAGTAG 16 dsRNA target GACTCCAGAAAAGGCTGAAAAGACTACTGAA
ACGGAAGCAACAGAGAAGACTTTGTGTAAAA nt 210-310 de TCTGTTAT GS3 GS179 50bp/ AGTAGGACTCCAGAAAAGGCTGAAAAGACT 17
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) dsRNA alvo 74bp* ACTGAAACGGAAGCAACAGA / GGGAGAagatctAGTAGGACTCCAGAAAAGGC nt 235-385 de TGAAAAGACTACTGAAACGGAAGCAACAGAg GS3 gtaccTCTCCC GS180 25bp/ GAAAAGGCTGAAAAGACTACTGAAA / 18 dsRNA alvo 49bp* GGGAGAagatctGAAAAGGCTGAAAAGACTAC TGAAAggtaccTCTCCC nt 247-272 de GS3
FITAS DE RNA IAP mRNA 1564 CUAAUGCAUUGCGUUGUUCAGAUACAAACG 19
UACGUGCAGUUCAGUUCAGUUCAGUUCUC GUAUCGCUAGUUUGUCGGAGCAAUUGGUU CACUUGGUAUUUGGGGCGAUUUUAACGUG UUUUUUACGAAGGAUCUUAUAAAAAUCAUG CAGUGUUACAGCAUCAUAUUUUUUGGUACU GAGAAGGCAUGAAAAUGAAUCAAACAUUUC CCACAAUCAGCAGUUACUCUGAUCAGACAG ACAAUAACCCCAAACAUAAAAGUUUUUUUG AAGUAAACGUCAACAAUUCCGCAUUGGAGG CGAGACUGAGAACAUUUGACAAUUGGCCAA GCACACAACUAUCCAAGGAAGCGCUCGCGU CUGCCGGUUUUGAAUACACUGGACAAGAU GACAUUGUUUUGUGUCGUUUCUGUAAGAU AGAAGGAUACAAUUGGGUAUCUGGAGAUG AUCCAAUGGCAGACCAUCGAGAAUGGAGUC CUGACUGUCCUUUUAUUAGAACUGUAGAGA ACGGCAGGUCUGGGAGUAAUAGAAACGCA GAUACUUGUGGACUGUACGGCAUAGAGGU UCUUCCAAAUUCCCUCCCGGAGGACAGGA GAUCCAUUGAUUUGCAACAGUUGGGAAUC CACAAAGGAAGUGGACCACACAACCAGGAU AAAAUAACGGUAAAUAGUCGACUAGCAACG UUCGAAAACUGGCCCAAGUCCAUCAAGCAG AGACCCGUUGAUUUGGCAGAAGCGGGAUU UUAUUAUACCGGUGUGGGAGACCAGACAC UUUGUUUCUACUGUGGUGGUGGUCUAAAA GACUGGGAAGAAUCUGACGAACCUUGGGA ACAACACGCCCUUUGGUUCAGCAAGUGUG UUUUUCUAAAUUUGAAAAAAGGUAAAGACU UUGUCGAAAAGGUCAAACAGAGGGCAGACC CUCUCUUGUCGCUCCCCGGAACAAGUCAA
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
GACAAGACCAAAGAGCUAGAAGAACCUAAA GAGCCCUGCAGUAGGACUCCAGAAAAGGC UGAAAAGACUACUGAAACGGAAGCAACAGA GAAGACUUUGUGUAAAAUCUGUUAUAAAAA CGAACUUGGUGUUGUAUUCUUGCCUUGUG GACAUGUUGUUGCUUGUGUAGAUUGUGCU UCUGCUUUGAAAACUUGUGCUGUCUGUAG GAAACCUUUGGAAGCGACAGUUCGAGCAU UUCUCUCAUAAUUUUUCCAUUCUUUAAUUU UCGUUUCUCAGAUCUAGUCAAUUUGAAUUU GAUUCUUGAAGGUUUAUUAAAAAGUUUUGU CAAAAAUUAUUCUUUUCUUGUUUUAGGAUU AGAAGUAAAUCUAUUUUUAUACAAUCUGAG UACAAAUUCCACAUACUUUUUUAGUUAUAA GUUUGAAGCGCUUAUGAAACAUACUUUUAG UUCAUUAAUGACUGCAAACCAUAUCUUUCG UACACUAAUACUUAUUAGUUAUCAAGCUCU CGUGAGUGGAACUUCCUUAUUAGAACAUUU UAUUAUAAAACUGACACAGAGAUAUAUCUG UAUGUUUGUGUGUAUGUUCACUAAGUAUG
CUAAUAAUAUAAUAAUUUAUGAAAAA IAP mRNA 1453 CUAAUGCAUUGCGUUGUUCAGAUACAAACG 20
UACGUGCAGUUCAGUUCAGUUCAGUUCUC GUAUCGCUAGUUGGCAUGAAAAUGAAUCAA ACAUUUCCCACAAUCAGCAGUUACUCUGAU CAGACAGACAAUAACCCCAAACAUAAAAGU UUUUUUGAAGUAAACGUCAACAAUUCCGCA UUGGAGGCGAGACUGAGAACAUUUGACAA UUGGCCAAGCACACAACUAUCCAAGGAAGC GCUCGCGUCUGCCGGUUUUGAAUACACUG GACAAGAUGACAUUGUUUUGUGUCGUUUC UGUAAGAUAGAAGGAUACAAUUGGGUAUCU GGAGAUGAUCCAAUGGCAGACCAUCGAGAA UGGAGUCCUGACUGUCCUUUUAUUAGAAC UGUAGAGAACGGCAGGUCUGGGAGUAAUA GAAACGCAGAUACUUGUGGACUGUACGGC AUAGAGGUUCUUCCAAAUUCCCUCCCGGA GGACAGGAGAUCCAUUGAUUUGCAACAGU UGGGAAUCCACAAAGGAAGUGGACCACACA ACCAGGAUAAAAUAACGGUAAAUAGUCGAC UAGCAACGUUCGAAAACUGGCCCAAGUCCA UCAAGCAGAGACCCGUUGAUUUGGCAGAA GCGGGAUUUUAUUAUACCGGUGUGGGAGA CCAGACACUUUGUUUCUACUGUGGUGGUG
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
GUCUAAAAGACUGGGAAGAAUCUGACGAAC CUUGGGAACAACACGCCCUUUGGUUCAGC AAGUGUGUUUUUCUAAAUUUGAAAAAAGGU AAAGACUUUGUCGAAAAGGUCAAACAGAGG GCAGACCCUCUCUUGUCGCUCCCCGGAAC AAGUCAAGACAAGACCAAAGAGCUAGAAGA ACCUAAAGAGCCCUGCAGUAGGACUCCAGA AAAGGCUGAAAAGACUACUGAAACGGAAGC AACAGAGAAGACUUUGUGUAAAAUCUGUUA UAAAAACGAACUUGGUGUUGUAUUCUUGCC UUGUGGACAUGUUGUUGCUUGUGUAGAUU GUGCUUCUGCUUUGAAAACUUGUGCUGUC UGUAGGAAACCUUUGGAAGCGACAGUUCG AGCAUUUCUCUCAUAAUUUUUCCAUUCUUU AAUUUUCGUUUCUCAGAUCUAGUCAAUUUG AAUUUGAUUCUUGAAGGUUUAUUAAAAAGU UUUGUCAAAAAUUAUUCUUUUCUUGUUUUA GGAUUAGAAGUAAAUCUAUUUUUAUACAAU CUGAGUACAAAUUCCACAUACUUUUUUAGU UAUAAGUUUGAAGCGCUUAUGAAACAUACU UUUAGUUCAUUAAUGACUGCAAACCAUAUC UUUCGUACACUAAUACUUAUUAGUUAUCAA GCUCUCGUGAGUGGAACUUCCUUAUUAGA ACAUUUUAUUAUAAAACUGACACAGAGAUA UAUCUGUAUGUUUGUGUGUAUGUUCACUA AGUAUGCUAAUAAUAUAAUAAUUUAUGAAA
AA GS3 432bp GGUGUGGGAGACCAGACACUUUGUUUCUA 21
CUGUGGUGGUGGUCUAAAAGACUGGGAAG AAUCUGACGAACCUUGGGAACAACACGCCC UUUGGUUCAGCAAGUGUGUUUUUCUAAAU UUGAAAAAAGGUAAAGACUUUGUCGAAAAG GUCAAACAGAGGGCAGACCCUCUCUUGUC GCUCCCCGGAACAAGUCAAGACAAGACCAA AGAGCUAGAAGAACCUAAAGAGCCCUGCAG UAGGACUCCAGAAAAGGCUGAAAAGACUAC UGAAACGGAAGCAACAGAGAAGACUUUGUG UAAAAUCUGUUAUAAAAACGAACUUGGUGU UGUAUUCUUGCCUUGUGGACAUGUUGUUG CUUGUGUAGAUUGUGCUUCUGCUUUGAAA ACUUGUGCUGUCUGUAGGAAACCUUUGGA
AGCGACAGUUCGAGCAUUU GS4 524bp AUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGUUCAC 22 (controle CGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGG
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) negativo) ACGGCGACGUAAACGGCCACAAGUUCAGC
GUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCAC CUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCU GCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGG CCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGG CGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACC ACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCG CCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGC ACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUAC AAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGG CGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGA AGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAAC AUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUA CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGA CAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUU
CAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGG GS167 521bp CUAAUGCAUUGCGUUGUUCAGAUACAAACG 23 fita de dsRNA UACGUGCAGUUCAGUUCAGUUCAGUUCUC
GUAUCGCUAGUUUGUCGGAGCAAUUGGUU região 5’ CACUUGGUAUUUGGGGCGAUUUUAACGUG
UUUUUUACGAAGGAUCUUAUAAAAAUCAUG CAGUGUUACAGCAUCAUAUUUUUUGGUACU GAGAAGGCAUGAAAAUGAAUCAAACAUUUC CCACAAUCAGCAGUUACUCUGAUCAGACAG ACAAUAACCCCAAACAUAAAAGUUUUUUUG AAGUAAACGUCAACAAUUCCGCAUUGGAGG CGAGACUGAGAACAUUUGACAAUUGGCCAA GCACACAACUAUCCAAGGAAGCGCUCGCGU CUGCCGGUUUUGAAUACACUGGACAAGAU GACAUUGUUUUGUGUCGUUUCUGUAAGAU AGAAGGAUACAAUUGGGUAUCUGGAGAUG AUCCAAUGGCAGACCAUCGAGAAUGGAGUC CUGACUGUCCUUUUAUUAGAACUGUAGAGA
ACGGCAGGUCUGGGAGU GS168 522bp AAUAGAAACGCAGAUACUUGUGGACUGUAC 24 fita de dsRNA GGCAUAGAGGUUCUUCCAAAUUCCCUCCC
GGAGGACAGGAGAUCCAUUGAUUUGCAAC região central AGUUGGGAAUCCACAAAGGAAGUGGACCAC
ACAACCAGGAUAAAAUAACGGUAAAUAGUC GACUAGCAACGUUCGAAAACUGGCCCAAGU CCAUCAAGCAGAGACCCGUUGAUUUGGCA GAAGCGGGAUUUUAUUAUACCGGUGUGGG AGACCAGACACUUUGUUUCUACUGUGGUG GUGGUCUAAAAGACUGGGAAGAAUCUGAC GAACCUUGGGAACAACACGCCCUUUGGUU
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
CAGCAAGUGUGUUUUUCUAAAUUUGAAAAA AGGUAAAGACUUUGUCGAAAAGGUCAAACA GAGGGCAGACCCUCUCUUGUCGCUCCCCG GAACAAGUCAAGACAAGACCAAAGAGCUAG AAGAACCUAAAGAGCCCUGCAGUAGGACUC CAGAAAAGGCUGAAAAGACUACUGAAACGG
AAGCAACAGAGAAGACUUUG GS169 521bp UGUAAAAUCUGUUAUAAAAACGAACUUGGU 25 fita de dsRNA GUUGUAUUCUUGCCUUGUGGACAUGUUGU
UGCUUGUGUAGAUUGUGCUUCUGCUUUGA região 3’ AAACUUGUGCUGUCUGUAGGAAACCUUUG
GAAGCGACAGUUCGAGCAUUUCUCUCAUAA UUUUUCCAUUCUUUAAUUUUCGUUUCUCAG AUCUAGUCAAUUUGAAUUUGAUUCUUGAAG GUUUAUUAAAAAGUUUUGUCAAAAAUUAUU CUUUUCUUGUUUUAGGAUUAGAAGUAAAUC UAUUUUUAUACAAUCUGAGUACAAAUUCCA CAUACUUUUUUAGUUAUAAGUUUGAAGCGC UUAUGAAACAUACUUUUAGUUCAUUAAUGA CUGCAAACCAUAUCUUUCGUACACUAAUAC UUAUUAGUUAUCAAGCUCUCGUGAGUGGA ACUUCCUUAUUAGAACAUUUUAUUAUAAAA CUGACACAGAGAUAUAUCUGUAUGUUUGU GUGUAUGUUCACUAAGUAUGCUAAUAAUAU
AAUAAUUUAUGAAAAA GS170 432bp GAUGAGUGACUGCAGAAUCUUUGUUUCCG 26 fita de dsRNA CUGAGGUUGUUGGCUUGAACACUAGGAAA
GAGGUUAUGAACCUUGGUAACUACACACCA 70% de UUUGAUGCAGCAAGCGUGAUCUUCUAAAUU identidade AGUUAGCAAUGAAAGCCUUUGUCUAAGGG com GS3 GUGAACCAGCGUGCCGAGCCUCUCUAGCC
CCUCUCUGACACAAGUCAAAACAUGAUCAU UGGGCUUGUAGAGCCUCGAGAGGUCUGCA GUAGAACACCAGACCAGGCUGGAAAGUCUC CUGAAACAGAUCCACCAGAGGAGACGUAGU UGAAAAUCCGUUAUAGAAUCGAACUUCGCG UUGUACCACGGCUUUAUAGGCAACCAGUUA CUUGUCUAGAUUGUGCUUCAGCUACUAGA AAUUGUGCUGAAAGGAGGAAACCACUGCAA
GGGCUGGAACGGGGAUUA GS171 432bp AGUGUUUUAAAAACGCCCCUUUUUGGCUAC 27 fita de dsRNA UGUAGUUGUAGUUUCAAAAACUGUGAAGAA
UCGGACGAUCAUUGGGAACAACACGCGCU 75% de UUCGUUCAGCAAGUGGACUUCUAGAACUU identidade UGAAAAAAGGUAAUGACACAGUUGAGGAGG
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) com GS3 UCAAACUGAGGGCACACGCUCUCUUGUCG
CAGCCGGGAACAAGACAAGACAUGACCAAU AAGAUAGAAGGACAUACAGGCUCAUUGAGU AGGGCUCGAGAAAAAGGUCAAAAGACUACU GAUACGGAACCCCCACAGCACACAUUGUCU ACUAUCUGACCUAAGAUCUGACCUGGUGU UAUAUUCUUGACCUGUGGACCUGUUGUGG CUUGCCUAGAUUGAGCUACUGACAUGAAAA UAUCUGAUGUCUGUAGGAAGCAUACGGAA
GCGACGGCAUGCGCAUUU GS172 432bp GUUGUGGGAGACCAGUCUAUGUGGUGCAA 28 fita de dsRNA CUAUACUGGUGGUCAUAAAAACUGGGACAU
AUCAGACGUACCUCGGGUAGAACCCGCGC 80% de UUGGGUUCAGGAAGUGUGUUUUGCUAAAA identidade AUGAUAUAAGCUCAAGACUUUGUCGAAAAC com GS3 GACAACCAGAGGGAAGAACAUCUCUUGUCG
CUCUCCGAAACAACUCAAAACAAGACCAAA AAGAUAGAGGUAUCGGAAGAGCCCAGCAG UAGGAGCCUCGAACAGGCUGAAGAGACUA CUAAGAGGGACGCUACAGAGCACACUUUGA CUAAGAUCUGUUAAAAAGACGAGCUUGGUU UAGUUUUCUUACCUGGUUGACUUGUUGUU GCCUGUCGAAAUUGUGCUUCUGCUUUGAA AACUUGUGCUGUCUGUAGGCAACCUUUGG
AAUCGACAGUUAGCGCAUUC GS173 432bp GGUGUAGGAGACCAGACACUCUGUUUCUA 29 fita de dsRNA CUGAGGUGCUCGUCUAGGAGACCGUGUAG
AAUCUAACGAACCUUGGGAACAACACGCCC 85% de UUUGUUUCAGCCAGUGUGAUUUUCAAAAU identidade GUGAAAUAAGGUUAAGACUUUGUCGGCAA com GS3 GGUCAAACAGAGGCCAGACCAUCUCUUGAC
GCGCCCCGUAACAAGUCAAGAAAAUACCAA CGAGCUACAAGAACAUAAAGAGCGCUGCAG UAGGACUCCGGAAAAGGUUGAGAAGACUAC UGAAAGGGAAGCAAGAGGUAAGGCUAUGU GUUAAUUCUUUUAUAAAGACUUUCUUGGUG UCGUAUAUUUGCCUUGUGGCCAUGUUGUU GCUCGUGUAGGUUGUUCUUCUGCUUAAGC AACUUGUGCUGUAUGUAGCAAACUUUUGC
CAGCGGCAGUUCGAGCAUUU GS174 432bp GGUGUGGGAGAGCAGACACUUCGUUUCUA 30 fita de dsRNA CAGUGGUGGCGGUCUAAAAGACUGGGAAG
AAUCUGACGAGCCUUGCGAACAACAGGCAC 90% de UUGGGUUCAGCAAGUUUGCUUUUCUGAAU identidade UUGAAAAAAUGUUAAGACCUUGUCGGAAAG
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) com GS3 GUCAAACAGAGGCCAGACCCUCUCUUGUG
GCACCCCUGAACAAGUCAAGACAAGACCAC AGGCCGAGAAGAACCUAAAGAGCCCUGCAG CAGGACUCCAGACAAGGCUGAAAAGACUAC UGCAACGGAAGCAGGAGAAAAGGCUUUGU GUAAAAUCUGUUCUAAAAACGAACUUGGAG UUGUAUUCUGGCCUUGUGGCCAUGUUGUU GCGGGUGUCGAUUGUGCGUCUGCUUUGAA UACUUGUGCUGUCCUUAGGAAACCUUUGG
AAGCGACAGUUCGAGCAAUU GS175 432bp GGUGUGGGAGACCAGACACUUUGUUUCUA 31 fita de dsRNA CUGUGAUGGUGGUCUAAAAGACUGGGAAA
AAUCUGACGAACCUUGGGUACAACACGGCC 95% de UUUGGUUCAGCAAGUGUGUCUUUAUAAAU identidade UUGAAAAAAGGUAAAGACUUUGGCGAAAAG com GS3 GUCAAGCAGAGGGCAAUCCCUCUCUUGUC
GCACCCCGGAACAAGUCAAGACAAGACCAA AGAGCUAGACGAACCUAAAGAGCCCUGCAG UAGGACUCCAGAAAAGGCUGAAAAGACUAC UGAAACGGAAGCCACAGAGAAGACUUUGUG UAAAAUCUGUUAUAAAAACCAACUUGAUGU UGUUUUCUUGCCAUGUGGACAUUUUGUUG CUUGUGGAGCUUGUGCUUCUGCUUUGAAA ACUUGUGCUGUCUGUAGGAAACCUUUGGA
AGCGACAGUUCGAGCAUUC GS176 200bp GCAGACCCUCUCUUGUCGCUCCCCGGAAC 32 fita de dsRNA AAGUCAAGACAAGACCAAAGAGCUAGAAGA
ACCUAAAGAGCCCUGCAGUAGGACUCCAGA Nucleotídeos AAAGGCUGAAAAGACUACUGAAACGGAAGC (nt) 160-360 AACAGAGAAGACUUUGUGUAAAAUCUGUUA de GS3 UAAAAACGAACUUGGUGUUGUAUUCUUGCC
UUGUGGACAUGUUGUUGCUUG GS177 150bp GAACAAGUCAAGACAAGACCAAAGAGCUAG 33 fita de dsRNA AAGAACCUAAAGAGCCCUGCAGUAGGACUC
CAGAAAAGGCUGAAAAGACUACUGAAACGG nt 185-335 de AAGCAACAGAGAAGACUUUGUGUAAAAUCU GS3 GUUAUAAAAACGAACUUGGUGUUGUAUUCU GS178 100bp GCUAGAAGAACCUAAAGAGCCCUGCAGUAG 34 fita de dsRNA GACUCCAGAAAAGGCUGAAAAGACUACUGA
AACGGAAGCAACAGAGAAGACUUUGUGUAA nt 210-310 de AAUCUGUUAU GS3 GS179 50bp AGUAGGACUCCAGAAAAGGCUGAAAAGACU 35
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) fita de dsRNA ACUGAAACGGAAGCAACAGA nt 235-385 de GS3 GS180 25bp GAAAAGGCUGAAAAGACUACUGAAA 36 fita de dsRNA nt 247-272 de GS3
REVERSE COMPLEMENT RNA STRANDS complemento 1564 UUUUUCAUAAAUUAUUAUAUUAUUAGCAUA 37 reverso de CUUAGUGAACAUACACACAAACAUACAGAU IAP mRNA AUAUCUCUGUGUCAGUUUUAUAAUAAAAUG
UUCUAAUAAGGAAGUUCCACUCACGAGAGC UUGAUAACUAAUAAGUAUUAGUGUACGAAA GAUAUGGUUUGCAGUCAUUAAUGAACUAAA AGUAUGUUUCAUAAGCGCUUCAAACUUAUA ACUAAAAAAGUAUGUGGAAUUUGUACUCAG AUUGUAUAAAAAUAGAUUUACUUCUAAUCC UAAAACAAGAAAAGAAUAAUUUUUGACAAAA CUUUUUAAUAAACCUUCAAGAAUCAAAUUC AAAUUGACUAGAUCUGAGAAACGAAAAUUA AAGAAUGGAAAAAUUAUGAGAGAAAUGCUC GAACUGUCGCUUCCAAAGGUUUCCUACAGA CAGCACAAGUUUUCAAAGCAGAAGCACAAU CUACACAAGCAACAACAUGUCCACAAGGCA AGAAUACAACACCAAGUUCGUUUUUAUAAC AGAUUUUACACAAAGUCUUCUCUGUUGCUU CCGUUUCAGUAGUCUUUUCAGCCUUUUCU GGAGUCCUACUGCAGGGCUCUUUAGGUUC UUCUAGCUCUUUGGUCUUGUCUUGACUUG UUCCGGGGAGCGACAAGAGAGGGUCUGCC CUCUGUUUGACCUUUUCGACAAAGUCUUUA CCUUUUUUCAAAUUUAGAAAAACACACUUG CUGAACCAAAGGGCGUGUUGUUCCCAAGG UUCGUCAGAUUCUUCCCAGUCUUUUAGAC CACCACCACAGUAGAAACAAAGUGUCUGGU CUCCCACACCGGUAUAAUAAAAUCCCGCUU CUGCCAAAUCAACGGGUCUCUGCUUGAUG GACUUGGGCCAGUUUUCGAACGUUGCUAG UCGACUAUUUACCGUUAUUUUAUCCUGGU UGUGUGGUCCACUUCCUUUGUGGAUUCCC
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
AACUGUUGCAAAUCAAUGGAUCUCCUGUCC UCCGGGAGGGAAUUUGGAAGAACCUCUAU GCCGUACAGUCCACAAGUAUCUGCGUUUC UAUUACUCCCAGACCUGCCGUUCUCUACAG UUCUAAUAAAAGGACAGUCAGGACUCCAUU CUCGAUGGUCUGCCAUUGGAUCAUCUCCA GAUACCCAAUUGUAUCCUUCUAUCUUACAG AAACGACACAAAACAAUGUCAUCUUGUCCA GUGUAUUCAAAACCGGCAGACGCGAGCGC UUCCUUGGAUAGUUGUGUGCUUGGCCAAU UGUCAAAUGUUCUCAGUCUCGCCUCCAAU GCGGAAUUGUUGACGUUUACUUCAAAAAAA CUUUUAUGUUUGGGGUUAUUGUCUGUCUG AUCAGAGUAACUGCUGAUUGUGGGAAAUG UUUGAUUCAUUUUCAUGCCUUCUCAGUACC AAAAAAUAUGAUGCUGUAACACUGCAUGAU UUUUAUAAGAUCCUUCGUAAAAAACACGUU AAAAUCGCCCCAAAUACCAAGUGAACCAAU UGCUCCGACAAACUAGCGAUACGAGAACUG AACUGAACUGAACUGCACGUACGUUUGUAU
CUGAACAACGCAAUGCAUUAG complemento 1453 UUUUUCAUAAAUUAUUAUAUUAUUAGCAUA 38 reverso de CUUAGUGAACAUACACACAAACAUACAGAU IAP mRNA AUAUCUCUGUGUCAGUUUUAUAAUAAAAUG
UUCUAAUAAGGAAGUUCCACUCACGAGAGC UUGAUAACUAAUAAGUAUUAGUGUACGAAA GAUAUGGUUUGCAGUCAUUAAUGAACUAAA AGUAUGUUUCAUAAGCGCUUCAAACUUAUA ACUAAAAAAGUAUGUGGAAUUUGUACUCAG AUUGUAUAAAAAUAGAUUUACUUCUAAUCC UAAAACAAGAAAAGAAUAAUUUUUGACAAAA CUUUUUAAUAAACCUUCAAGAAUCAAAUUC AAAUUGACUAGAUCUGAGAAACGAAAAUUA AAGAAUGGAAAAAUUAUGAGAGAAAUGCUC GAACUGUCGCUUCCAAAGGUUUCCUACAGA CAGCACAAGUUUUCAAAGCAGAAGCACAAU CUACACAAGCAACAACAUGUCCACAAGGCA AGAAUACAACACCAAGUUCGUUUUUAUAAC AGAUUUUACACAAAGUCUUCUCUGUUGCUU CCGUUUCAGUAGUCUUUUCAGCCUUUUCU GGAGUCCUACUGCAGGGCUCUUUAGGUUC UUCUAGCUCUUUGGUCUUGUCUUGACUUG UUCCGGGGAGCGACAAGAGAGGGUCUGCC CUCUGUUUGACCUUUUCGACAAAGUCUUUA CCUUUUUUCAAAUUUAGAAAAACACACUUG
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
CUGAACCAAAGGGCGUGUUGUUCCCAAGG UUCGUCAGAUUCUUCCCAGUCUUUUAGAC CACCACCACAGUAGAAACAAAGUGUCUGGU CUCCCACACCGGUAUAAUAAAAUCCCGCUU CUGCCAAAUCAACGGGUCUCUGCUUGAUG GACUUGGGCCAGUUUUCGAACGUUGCUAG UCGACUAUUUACCGUUAUUUUAUCCUGGU UGUGUGGUCCACUUCCUUUGUGGAUUCCC AACUGUUGCAAAUCAAUGGAUCUCCUGUCC UCCGGGAGGGAAUUUGGAAGAACCUCUAU GCCGUACAGUCCACAAGUAUCUGCGUUUC UAUUACUCCCAGACCUGCCGUUCUCUACAG UUCUAAUAAAAGGACAGUCAGGACUCCAUU CUCGAUGGUCUGCCAUUGGAUCAUCUCCA GAUACCCAAUUGUAUCCUUCUAUCUUACAG AAACGACACAAAACAAUGUCAUCUUGUCCA GUGUAUUCAAAACCGGCAGACGCGAGCGC UUCCUUGGAUAGUUGUGUGCUUGGCCAAU UGUCAAAUGUUCUCAGUCUCGCCUCCAAU GCGGAAUUGUUGACGUUUACUUCAAAAAAA CUUUUAUGUUUGGGGUUAUUGUCUGUCUG AUCAGAGUAACUGCUGAUUGUGGGAAAUG UUUGAUUCAUUUUCAUGCCAACUAGCGAUA CGAGAACUGAACUGAACUGAACUGCACGUA
CGUUUGUAUCUGAACAACGCAAUGCAUUAG complemento 432bp AAAUGCUCGAACUGUCGCUUCCAAAGGUUU 39 reverso de CCUACAGACAGCACAAGUUUUCAAAGCAGA GS3 AGCACAAUCUACACAAGCAACAACAUGUCC
ACAAGGCAAGAAUACAACACCAAGUUCGUU UUUAUAACAGAUUUUACACAAAGUCUUCUC UGUUGCUUCCGUUUCAGUAGUCUUUUCAG CCUUUUCUGGAGUCCUACUGCAGGGCUCU UUAGGUUCUUCUAGCUCUUUGGUCUUGUC UUGACUUGUUCCGGGGAGCGACAAGAGAG GGUCUGCCCUCUGUUUGACCUUUUCGACA AAGUCUUUACCUUUUUUCAAAUUUAGAAAA ACACACUUGCUGAACCAAAGGGCGUGUUG UUCCCAAGGUUCGUCAGAUUCUUCCCAGU CUUUUAGACCACCACCACAGUAGAAACAAA
GUGUCUGGUCUCCCACACC complemento 524bp CCGUCCUCGAUGUUGUGGCGGAUCUUGAA 40 reverso de GUUCACCUUGAUGCCGUUCUUCUGCUUGU GS4 CGGCCAUGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUG (controle UAGUUGUACUCCAGCUUGUGCCCCAGGAU negativo) GUUGCCGUCCUCCUUGAAGUCGAUGCCCU
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
UCAGCUCGAUGCGGUUCACCAGGGUGUCG CCCUCGAACUUCACCUCGGCGCGGGUCUU GUAGUUGCCGUCGUCCUUGAAGAAGAUGG UGCGCUCCUGGACGUAGCCUUCGGGCAUG GCGGACUUGAAGAAGUCGUGCUGCUUCAU GUGGUCGGGGUAGCGGCUGAAGCACUGCA CGCCGUAGGUCAGGGUGGUCACGAGGGUG GGCCAGGGCACGGGCAGCUUGCCGGUGGU GCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUUGCCGU AGGUGGCAUCGCCCUCGCCCUCGCCGGAC ACGCUGAACUUGUGGCCGUUUACGUCGCC GUCCAGCUCGACCAGGAUGGGCACCACCC CGGUGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACC
AU complemento 521bp ACUCCCAGACCUGCCGUUCUCUACAGUUC 41 reverso de UAAUAAAAGGACAGUCAGGACUCCAUUCUC GS167 GAUGGUCUGCCAUUGGAUCAUCUCCAGAU
ACCCAAUUGUAUCCUUCUAUCUUACAGAAA região 5’ CGACACAAAACAAUGUCAUCUUGUCCAGUG
UAUUCAAAACCGGCAGACGCGAGCGCUUC CUUGGAUAGUUGUGUGCUUGGCCAAUUGU CAAAUGUUCUCAGUCUCGCCUCCAAUGCG GAAUUGUUGACGUUUACUUCAAAAAAACUU UUAUGUUUGGGGUUAUUGUCUGUCUGAUC AGAGUAACUGCUGAUUGUGGGAAAUGUUU GAUUCAUUUUCAUGCCUUCUCAGUACCAAA AAAUAUGAUGCUGUAACACUGCAUGAUUUU UAUAAGAUCCUUCGUAAAAAACACGUUAAA AUCGCCCCAAAUACCAAGUGAACCAAUUGC UCCGACAAACUAGCGAUACGAGAACUGAAC UGAACUGAACUGCACGUACGUUUGUAUCU
GAACAACGCAAUGCAUUAG complemento 522bp CAAAGUCUUCUCUGUUGCUUCCGUUUCAG 42 reverso de UAGUCUUUUCAGCCUUUUCUGGAGUCCUA GS168 CUGCAGGGCUCUUUAGGUUCUUCUAGCUC
UUUGGUCUUGUCUUGACUUGUUCCGGGGA região central GCGACAAGAGAGGGUCUGCCCUCUGUUUG
ACCUUUUCGACAAAGUCUUUACCUUUUUUC AAAUUUAGAAAAACACACUUGCUGAACCAA AGGGCGUGUUGUUCCCAAGGUUCGUCAGA UUCUUCCCAGUCUUUUAGACCACCACCACA GUAGAAACAAAGUGUCUGGUCUCCCACACC GGUAUAAUAAAAUCCCGCUUCUGCCAAAUC AACGGGUCUCUGCUUGAUGGACUUGGGCC AGUUUUCGAACGUUGCUAGUCGACUAUUU
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp)
ACCGUUAUUUUAUCCUGGUUGUGUGGUCC ACUUCCUUUGUGGAUUCCCAACUGUUGCA AAUCAAUGGAUCUCCUGUCCUCCGGGAGG GAAUUUGGAAGAACCUCUAUGCCGUACAGU
CCACAAGUAUCUGCGUUUCUAUU complemento 521bp UUUUUCAUAAAUUAUUAUAUUAUUAGCAUA 43 reverso de CUUAGUGAACAUACACACAAACAUACAGAU GS169 AUAUCUCUGUGUCAGUUUUAUAAUAAAAUG
UUCUAAUAAGGAAGUUCCACUCACGAGAGC região 3’ UUGAUAACUAAUAAGUAUUAGUGUACGAAA
GAUAUGGUUUGCAGUCAUUAAUGAACUAAA AGUAUGUUUCAUAAGCGCUUCAAACUUAUA ACUAAAAAAGUAUGUGGAAUUUGUACUCAG AUUGUAUAAAAAUAGAUUUACUUCUAAUCC UAAAACAAGAAAAGAAUAAUUUUUGACAAAA CUUUUUAAUAAACCUUCAAGAAUCAAAUUC AAAUUGACUAGAUCUGAGAAACGAAAAUUA AAGAAUGGAAAAAUUAUGAGAGAAAUGCUC GAACUGUCGCUUCCAAAGGUUUCCUACAGA CAGCACAAGUUUUCAAAGCAGAAGCACAAU CUACACAAGCAACAACAUGUCCACAAGGCA AGAAUACAACACCAAGUUCGUUUUUAUAAC
AGAUUUUACA complemento 432bp UAAUCCCCGUUCCAGCCCUUGCAGUGGUU 44 reverso de UCCUCCUUUCAGCACAAUUUCUAGUAGCUG GS170 AAGCACAAUCUAGACAAGUAACUGGUUGCC
UAUAAAGCCGUGGUACAACGCGAAGUUCGA 70% de UUCUAUAACGGAUUUUCAACUACGUCUCCU complementari CUGGUGGAUCUGUUUCAGGAGACUUUCCA dade com GCCUGGUCUGGUGUUCUACUGCAGACCUC GS3 UCGAGGCUCUACAAGCCCAAUGAUCAUGUU
UUGACUUGUGUCAGAGAGGGGCUAGAGAG GCUCGGCACGCUGGUUCACCCCUUAGACA AAGGCUUUCAUUGCUAACUAAUUUAGAAGA UCACGCUUGCUGCAUCAAAUGGUGUGUAG UUACCAAGGUUCAUAACCUCUUUCCUAGUG UUCAAGCCAACAACCUCAGCGGAAACAAAG
AUUCUGCAGUCACUCAUC complemento 432bp AAAUGCGCAUGCCGUCGCUUCCGUAUGCU 45 reverso de UCCUACAGACAUCAGAUAUUUUCAUGUCAG GS171 UAGCUCAAUCUAGGCAAGCCACAACAGGUC
CACAGGUCAAGAAUAUAACACCAGGUCAGA 75% de UCUUAGGUCAGAUAGUAGACAAUGUGUGC complementari UGUGGGGGUUCCGUAUCAGUAGUCUUUUG dade com ACCUUUUUCUCGAGCCCUACUCAAUGAGCC
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) GS3 UGUAUGUCCUUCUAUCUUAUUGGUCAUGU
CUUGUCUUGUUCCCGGCUGCGACAAGAGA GCGUGUGCCCUCAGUUUGACCUCCUCAAC UGUGUCAUUACCUUUUUUCAAAGUUCUAGA AGUCCACUUGCUGAACGAAAGCGCGUGUU GUUCCCAAUGAUCGUCCGAUUCUUCACAG UUUUUGAAACUACAACUACAGUAGCCAAAA
AGGGGCGUUUUUAAAACACU complemento 432bp GAAUGCGCUAACUGUCGAUUCCAAAGGUU 46 reverso de GCCUACAGACAGCACAAGUUUUCAAAGCAG GS172 AAGCACAAUUUCGACAGGCAACAACAAGUC
AACCAGGUAAGAAAACUAAACCAAGCUCGU 80% de CUUUUUAACAGAUCUUAGUCAAAGUGUGCU complementari CUGUAGCGUCCCUCUUAGUAGUCUCUUCA dade com GCCUGUUCGAGGCUCCUACUGCUGGGCUC GS3 UUCCGAUACCUCUAUCUUUUUGGUCUUGU
UUUGAGUUGUUUCGGAGAGCGACAAGAGA UGUUCUUCCCUCUGGUUGUCGUUUUCGAC AAAGUCUUGAGCUUAUAUCAUUUUUAGCAA AACACACUUCCUGAACCCAAGCGCGGGUUC UACCCGAGGUACGUCUGAUAUGUCCCAGU UUUUAUGACCACCAGUAUAGUUGCACCACA
UAGACUGGUCUCCCACAAC complemento 432bp AAAUGCUCGAACUGCCGCUGGCAAAAGUUU 47 reverso de GCUACAUACAGCACAAGUUGCUUAAGCAGA GS173 AGAACAACCUACACGAGCAACAACAUGGCC
ACAAGGCAAAUAUACGACACCAAGAAAGUC 85% de UUUAUAAAAGAAUUAACACAUAGCCUUACC complementari UCUUGCUUCCCUUUCAGUAGUCUUCUCAA dade com CCUUUUCCGGAGUCCUACUGCAGCGCUCU GS3 UUAUGUUCUUGUAGCUCGUUGGUAUUUUC
UUGACUUGUUACGGGGCGCGUCAAGAGAU GGUCUGGCCUCUGUUUGACCUUGCCGACA AAGUCUUAACCUUAUUUCACAUUUUGAAAA UCACACUGGCUGAAACAAAGGGCGUGUUG UUCCCAAGGUUCGUUAGAUUCUACACGGU CUCCUAGACGAGCACCUCAGUAGAAACAGA
GUGUCUGGUCUCCUACACC complemento 432bp AAUUGCUCGAACUGUCGCUUCCAAAGGUU 48 reverso de UCCUAAGGACAGCACAAGUAUUCAAAGCAG GS174 ACGCACAAUCGACACCCGCAACAACAUGGC
CACAAGGCCAGAAUACAACUCCAAGUUCGU 90% de UUUUAGAACAGAUUUUACACAAAGCCUUUU complementari CUCCUGCUUCCGUUGCAGUAGUCUUUUCA dade com GCCUUGUCUGGAGUCCUGCUGCAGGGCUC
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) GS3 UUUAGGUUCUUCUCGGCCUGUGGUCUUGU
CUUGACUUGUUCAGGGGUGCCACAAGAGA GGGUCUGGCCUCUGUUUGACCUUUCCGAC AAGGUCUUAACAUUUUUUCAAAUUCAGAAA AGCAAACUUGCUGAACCCAAGUGCCUGUU GUUCGCAAGGCUCGUCAGAUUCUUCCCAG UCUUUUAGACCGCCACCACUGUAGAAACGA
AGUGUCUGCUCUCCCACACC complemento 432bp GAAUGCUCGAACUGUCGCUUCCAAAGGUU 49 reverso de UCCUACAGACAGCACAAGUUUUCAAAGCAG GS175 AAGCACAAGCUCCACAAGCAACAAAAUGUC
CACAUGGCAAGAAAACAACAUCAAGUUGGU 95% de UUUUAUAACAGAUUUUACACAAAGUCUUCU complementari CUGUGGCUUCCGUUUCAGUAGUCUUUUCA dade com GCCUUUUCUGGAGUCCUACUGCAGGGCUC GS3 UUUAGGUUCGUCUAGCUCUUUGGUCUUGU
CUUGACUUGUUCCGGGGUGCGACAAGAGA GGGAUUGCCCUCUGCUUGACCUUUUCGCC AAAGUCUUUACCUUUUUUCAAAUUUAUAAA GACACACUUGCUGAACCAAAGGCCGUGUU GUACCCAAGGUUCGUCAGAUUUUUCCCAG UCUUUUAGACCACCAUCACAGUAGAAACAA
AGUGUCUGGUCUCCCACACC complemento 200bp CAAGCAACAACAUGUCCACAAGGCAAGAAU 50 reverso de ACAACACCAAGUUCGUUUUUAUAACAGAUU GS176 UUACACAAAGUCUUCUCUGUUGCUUCCGU
UUCAGUAGUCUUUUCAGCCUUUUCUGGAG Nucleotídeos UCCUACUGCAGGGCUCUUUAGGUUCUUCU (nt) 160-360 AGCUCUUUGGUCUUGUCUUGACUUGUUCC de GS3 GGGGAGCGACAAGAGAGGGUCUGC complemento 150bp AGAAUACAACACCAAGUUCGUUUUUAUAAC 51 reverso de AGAUUUUACACAAAGUCUUCUCUGUUGCUU GS177 CCGUUUCAGUAGUCUUUUCAGCCUUUUCU
GGAGUCCUACUGCAGGGCUCUUUAGGUUC nt 185-335 de UUCUAGCUCUUUGGUCUUGUCUUGACUUG GS3 UUC complemento 100bp AUAACAGAUUUUACACAAAGUCUUCUCUGU 52 reverso de UGCUUCCGUUUCAGUAGUCUUUUCAGCCU GS178 UUUCUGGAGUCCUACUGCAGGGCUCUUUA
GGUUCUUCUAGC nt 210-310 de GS3
Descrição Compri Sequência SEQ mento ID NO: (bp) complemento 50bp UCUGUUGCUUCCGUUUCAGUAGUCUUUUC 53 reverso de AGCCUUUUCUGGAGUCCUACU GS179 nt 235-385 de GS3 complemento 25bp UUUCAGUAGUCUUUUCAGCCUUUUC 54 reverso de GS180 nt 247-272 de GS3 *Ambas as sequências são 24bp mais longas do que as sequências alvo reais devido à parte do promotor T7 e um sítio de restrição.
EQUIVALENTES E ESCOPO
[0217] Nas reivindicações, artigos, tais como “um”, “uma”, “o”, “a”, “os”, “as”, podem significar um ou mais, a menos que seja indicado o contrário ou fique de alguma outra forma evidente a partir do contexto. As reivindicações ou descrições que incluem “ou” entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais de um, ou todos os membros do grupo estiverem presentes em, empregados em, ou de alguma outra forma forem relevantes a um determinado produto ou processo, a menos que seja indicado o contrário ou de alguma outra forma fique evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente, é empregado ou de alguma outra forma é relevante para um determinado produto ou processo. A invenção inclui modalidades nas quais mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, são empregados ou de alguma outra forma são relevantes para um determinado produto ou processo.
[0218] Adicionalmente, a invenção engloba todas as variações, combinações e permutações nas quais uma ou mais limitações, elementos, cláusulas e termos descritivos de uma ou mais das reivindicações listadas são introduzidas em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que seja dependente de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que seja dependente da mesma reivindicação base.
Quando os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato de grupo de Markush, cada subgrupo dos elementos também é revelado, e quaisquer elementos podem ser removidos do grupo. Deve-se entender que, em geral, quando a invenção, ou aspectos da invenção, são referidos como compreendendo elementos e/ou aspectos específicos, certas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente de tais elementos e/ou aspectos. Para fins de simplicidade, essas modalidades não foram apresentadas especificamente aqui nessas palavras.
[0219] Observa-se ainda que os termos “compreendendo” e “contendo” pretendem ser abertos e permitem a inclusão de e elementos ou etapas adicionais.
Quando são dados intervalos, incluem-se pontos extremos. Adicionalmente, a menos que indicado o contrário ou de alguma outra forma evidente a partir do contexto e compreensão de um indivíduo com conhecimento geral na técnica, os valores que são expressos como intervalos podem assumir qualquer valor ou subintervalo específico dentro dos intervalos declarados nas diferentes modalidades da invenção, até o décimo da unidade do limite inferior do intervalo, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0220] Esta aplicação refere-se a várias patentes expedidas, pedidos de patentes publicados, artigos de jornais, e outras publicações, todos os quais são incorporados no presente para fins de referência. Se houver um conflito entre qualquer uma das referências incorporadas e o presente relatório descritivo, o relatório descritivo deverá prevalecer. Além disso, qualquer modalidade específica da presente invenção que se enquadre na técnica anterior pode ser explicitamente excluída de qualquer uma ou mais das reivindicações. Uma vez que tais modalidades são consideradas como conhecidas por um indivíduo com conhecimento geral na técnica, elas podem ser excluídas mesmo se a exclusão não for apresentada aqui explicitamente. Qualquer modalidade específica da invenção pode ser excluída de qualquer reivindicação, por qualquer razão, quer ou não relacionada à existência da técnica anterior.
[0221] Os versados na técnica irão reconhecer ou serão capazes de averiguar, usando não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas descritas aqui. O escopo das presentes modalidades descritas aqui não pretende se limitar à Descrição acima, mas, em vez disso, é conforme apresentado nas reivindicações anexas. Os versados na técnica irão apreciar que várias alterações e modificações nesta descrição podem ser feitas sem se afastar da essência ou âmbito da presente invenção, conforme definido nas reivindicações seguintes.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO por inibir especificamente a expressão de um gene Inibidor da Apoptose de coleópteros.
    2. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene IAP de coleópteros compreende uma sequência de ácido desoxirribonucleico (DNA) da SEQ ID NO: 1.
    3. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo é um ácido ribonucleico (RNA).
    4. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA é um RNA de fita dupla (dsRNA) compreendendo uma primeira fita que é complementar a um RNA mensageiro (mRNA) codificado pelo gene IAP de coleópteros, e uma segunda fita que é complementar à primeira fita.
    5. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o mRNA compreende a sequência de RNA da SEQ ID NO: 19.
    6. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira fita do dsRNA compreende uma sequência de RNA 70% a 100% complementar ao mRNA ou um segmento do MRNA codificado pelo gene IAP de coleópteros.
    7. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira fita do dsRNA compreende uma sequência de RNA 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100% ou 98% a 100% complementar ao mRNA ou um segmento do MRNA codificado pelo gene IAP de coleópteros.
    8. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento do mRNA tem um comprimento de pelo menos 18 a 500 nucleotídeos, pelo menos 21 a 500 nucleotídeos, pelo menos 50 a 500 nucleotídeos, pelo menos 100 a 500 nucleotídeos, ou pelo menos 200 a 500 nucleotídeos.
    9. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira fita do dsRNA compreende pelo menos 18 a 21 nucleotídeos contíguos pelo menos 90% a 100%, 95% a 100%, ou pelo menos 98% a 100% complementares ao mRNA ou ao segmento do mRNA codificado pelo gene IAP de coleópteros.
    10. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira fita do dsRNA compreende uma sequência de RNA que possui 70% a 100% de identidade com a sequência de RNA ou um segmento da sequência de RNA da SEQ ID NO: 37.
    11. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira fita do dsRNA compreende uma sequência de RNA que possui 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100% ou 98% a 100% de identidade com a sequência de RNA ou o segmento da sequência de RNA da SEQ ID NO: 37.
    12. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento da sequência de RNA da SEQ ID NO: 37 tem um comprimento de pelo menos 18 a 500 nucleotídeos, pelo menos 21 a 500 nucleotídeos, pelo menos 50 a 500 nucleotídeos, pelo menos 100 a 500 nucleotídeos, ou pelo menos 200 a 500 nucleotídeos.
    13. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira fita do dsRNA compreende pelo menos 18 a 21 nucleotídeos contíguos que possuem pelo menos 90% a 100%, 95% a 100%, ou pelo menos 98% a 100% de identidade com a sequência de RNA da SEQ ID NO: 37.
    14. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA é um RNA de fita simples (ssRNA) que se liga a um mRNA codificado pelo gene IAP de coleópteros.
    15. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o mRNA compreende a sequência de RNA da SEQ ID NO: 19.
    16. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o ssRNA compreende uma sequência de RNA 70% a 100% complementar ao mRNA ou um segmento do MRNA codificado pelo gene IAP de coleópteros.
    17. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o ssRNA compreende uma sequência de RNA 75% a 100%, 80% a 100%, 85% A 100%, 90% a 100%, 95% a 100% ou 98% a 100% complementar ao mRNA ou ao segmento do MRNA codificado pelo gene IAP de coleópteros.
    18. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento do mRNA tem um comprimento de pelo menos 18 a 500 nucleotídeos, pelo menos 21 a 500 nucleotídeos, pelo menos 50 a 500 nucleotídeos, pelo menos 100 a 500 nucleotídeos, ou pelo menos 200 a 500 nucleotídeos.
    19. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o ssRNA compreende pelo menos 18 a 21 nucleotídeos contíguos pelo menos 90% a 100%, 95% a 100%, ou pelo menos 98% a 100% complementares ao mRNA.
    20. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o ssRNA compreende uma sequência de RNA que tem 70% a 100% de identidade com a sequência de RNA da SEQ ID NO:
    37.
    21. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o ssRNA compreende uma sequência de RNA que possui 75% a 100%, 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100% ou 98% a 100% de identidade com a sequência de RNA ou o segmento da sequência de RNA da SEQ ID NO: 37.
    22. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o segmento da sequência de RNA da SEQ ID NO: 37 tem um comprimento de pelo menos 18 a 500 nucleotídeos, pelo menos 21 a 500 nucleotídeos, pelo menos 50 a 500 nucleotídeos, pelo menos 100 a 500 nucleotídeos, ou pelo menos 200 a 500 nucleotídeos.
    23. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o ssRNA compreende pelo menos 18 a 21 nucleotídeos contíguos que possuem pelo menos 90% a 100%, 95% a 100%, ou pelo menos 98% a 100% de identidade com a sequência de RNA da SEQ ID NO:
    37.
    24. Composição, CARACTERIZADA por compreender o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23.
    25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição (a) adicionalmente compreende pelo menos um aditivo selecionado a partir do grupo consistindo em: adjuvantes, atrativos, substâncias de regulação de crescimento, alimentação de inseto, feromônios, proteínas, carboidratos, polímeros, compostos orgânicos, produtos biológicos e agentes pesticidas; (b) é formulada como um líquido, uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um concentrado emulsificável, uma solução concentrada, uma solução de baixa concentração, uma solução concentrada de volume ultrabaixo, uma solução concentrada hidrossolúvel, uma isca, uma emulsão invertida, uma suspensão concentrada, uma mistura homogênea, uma mistura não-homogênea, um sólido, um polvilho, um pó, um grânulo, um precipitado, uma cápsula, um fumigante, uma formulação encapsulada ou uma formulação de micro-encapsulação; ou (c) é distribuída como um spray, névoa, tratamento de semente, calda, irrigação por gotejamento, em sulco, dieta de inseto ou isca.
    26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, CARACTERIZADA por ser formulada a uma concentração de 0,001 μg/cm2 a 10 μg/cm2.
    27. Ácido desoxirribonucleico (DNA), CARACTERIZADO por codificar o RNA de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 26.
    28. Método para controlar a infestação por insetos coleópteros, o método sendo CARACTERIZADO por compreender distribuir, a uma planta, solo ou inseto coleóptero, ou a uma dieta de um inseto coleóptero, a molécula de polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 23 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 24 a 27.
    29. Método para controlar a infestação por insetos coleópteros, o método sendo CARACTERIZADO por compreender distribuir, a uma planta, solo, um inseto coleóptero, ou a uma dieta de um inseto coleóptero, um polinucleotídeo ou uma composição compreendendo um polinucleotídeo que inibe especificamente a expressão do gene Inibidor da Apoptose (IAP) de coleópteros.
    30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é distribuída a uma folha, caule, semente, raiz ou solo da planta.
    31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta é selecionada a partir do grupo consistindo de plantas Solanaceae, plantas Brassicaceae, plantas Poaceae, plantas
    Cucurbitaceae, plantas Fobaceae, plantas Apiaceae, plantas Amaranthaceae, e plantas Malvaceae.
    32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo ou composição é distribuído em uma quantidade suficiente para causar raquitismo, mortalidade, redução da alimentação, ou inibição da reprodução de um inseto coleóptero.
    33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o inseto coleóptero é de uma espécie selecionada a partir do grupo consistindo em: Leptinotarsa spp., Phyllotreta spp., Cerotoma spp., Diabrotica spp., tribolium spp., Anthonomus spp. e Alticini spp.
    34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o inseto coleóptero é um inseto do gênero Leptinotarsa spp..
    35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o inseto do gênero Leptinotarsa spp. é um besouro-da-batata-do-Colorado.
    36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de distribuição compreende aplicar o polinucleotídeo à superfície da planta, ao solo, ao inseto coleóptero, ou à dieta de um inseto coleóptero a uma concentração de pelo menos 0,001 μg/cm2, de 0,001 μg/cm2 a 10 μg/cm2, ou de 0,001 μg/cm2 a 0,1 μg/cm2.
    37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o percentual de mortalidade dos insetos coleópteros aumenta para pelo menos 30% após menos de 10 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não-tratadas.
    38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o percentual de desfolhação diminui para menos de 15% após menos de 10 dias da exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não- tratadas; ou permanece menor do que 15% após pelo menos 10 dias após a exposição dos insetos coleópteros ao polinucleotídeo, em relação a um controle, opcionalmente sob condições não-tratadas.
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