CN113227373A - 鞘翅目昆虫的控制 - Google Patents

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Abstract

本文提供了使用靶向凋亡抑制剂(IAP)基因的RNAi分子以控制鞘翅目昆虫的方法、产生靶向IAP的RNAi分子的方法以及包含靶向IAP的RNAi分子的组合物。

Description

鞘翅目昆虫的控制
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年9月26日提交的美国临时申请号62/737,041的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle)(Leptinotarsa decemlineata)是马铃薯作物的主要害虫。控制科罗拉多马铃薯甲虫的年成本估计为数千万美元，如果不控制科罗拉多马铃薯甲虫，作物损失的预计年成本达到数十亿美元。此外，控制科罗拉多马铃薯甲虫因其对多种化学品和杀虫剂的抗性而复杂化。因此，需要控制科罗拉多马铃薯甲虫的新途径。
发明内容
在一些方面，本公开提供了用于控制科罗拉多马铃薯甲虫侵袭的组合物、遗传构建体和方法。为了减少对广谱化学杀虫剂的依赖及其相关问题，需要降低风险的杀虫剂。RNA干扰(RNAi)是一项提供昆虫有害生物控制的降低风险方法的希望的新技术。在一些实施方案中，本公开提供了基于RNAi的技术，其可以通过递送靶向(例如，结合)并干扰科罗拉多马铃薯甲虫凋亡抑制剂(Inhibitor of Apoptosis，IAP)基因的信使RNA(mRNA)的核糖核酸(RNA)干扰(RNAi)分子来减轻科罗拉多马铃薯甲虫的损害。
凋亡是细胞自杀的进化上保守的途径，其对于正常细胞发育和稳态至关重要。凋亡的关键调控因子为IAP。IAP发现于昆虫杆状病毒(苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydiapomonella granulosis virus)和黄杉毒蛾核型多角体病毒(Orgyia pseudotsugatanuclear polyhedrosis virus))中，并且后来在许多其它生物体诸如蚊虹彩病毒(mosquito iridescent viruses)、昆虫、酵母和人类中也发现了IAP。许多IAP在其它物种的细胞中过表达时会阻断凋亡。通过RNA干扰敲低IAP的表达通常会诱导凋亡。参见，例如，Pridgeon JW et al.J Med Entomol 2008；45(3):414-420。
实验室研究已证实，口服递送RNA分子(其作用方式为通过RNAi过程(例如，双链RNA(dsRNA)进行)对许多昆虫物种是有效的，因此，局部dsRNA被认为是合适的递送形式。然而，目前尚不存在喷洒dsRNA昆虫有害生物控制技术。以相对低的价格生产dsRNA的成本是Ag-Bio业的主要挑战。对于农业害虫，可以表达杀虫dsRNA的转基因植物可保护该植物免受虫食。然而，并非所有国家都接受基因修饰的作物，而dsRNA的喷雾施用被认为是一种保护的替代递送方法。
为了鉴定RNAi敲低的靶标，利用全基因组信息鉴定了目标物种(科罗拉多马铃薯甲虫)中IAP的合适基因序列，其当被选择性沉默时可以控制这些关键有害生物，而不会对马铃薯农业生态系统中的非目标物种产生不利影响。鉴于目的DNA序列和输出序列的设计准则规则集，将适当的计算算法与公众可获得的RNAi设计工具相结合，以创建满足这些准则的输出序列。通过检索拟谷盗属(Tribolium)和果蝇属(Drosophila)基因组的综合序列数据库(例如，Flybase，SnapDragon，Beetlebase等)鉴定了选择用于设计dsRNA的原始/起始区域。将可用于使用预测的基于siRNA的方法设计dsRNA的公众可获得的E-RNAi工具与专有算法组合以创建设计工作流程。然后使用该设计工作流程来创建特定长dsRNA序列，与原始序列具有(a)所需长度，(b)所需百分比同一性(通过引入随机突变)以及(c)通过将初始IAP基因序列分割成多个片段得到。
在一些实施方案中，RNAi分子包含单链RNA(ssRNA)，并且在一些实施方案中，RNAi分子包含双链RNA(dsRNA)或部分dsRNA。在其它实施方案中，RNAi分子可为具有二级结构的单链RNA分子，所述二级结构含有显著的双链特征，诸如但不限于发夹RNA。本公开提供了靶向IAP mRNA的RNA，例如单链RNA(ssRNA)，小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，信使RNA(mRNA)，短发夹RNA(shRNA)或双链RNA(dsRNA)。
在一些实施方案中，IAP RNA有效降低昆虫中的IAP表达，使幼虫发育迟缓(stunting)，抑制昆虫的生长、繁殖(例如，生育力(fertility)和/或繁殖力(fecundity))和/或修复，杀死幼虫或昆虫，以及减少昆虫的摄食。因此，本公开的一个方面提供了一种用于控制昆虫的方法，其包含递送有效量的靶向IAP的RNA给植物和/或昆虫(例如使它们接触)。IAP RNA尤其可用于控制鞘翅目(Coleopteran)昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)，从而减少和/或防止对作为人类主要食物来源的某些植物(例如，马铃薯)的侵袭。
本公开的一些方面还提供了产生靶向IAP的RNA的无细胞方法，该方法包含：(a)在适于产生5′核苷单磷酸(5′NMP)的条件下在反应混合物中温育细胞RNA和核糖核酸酶；(b)消除核糖核酸酶；以及(c)在适于从DNA产生靶向IAP的RNA的条件下温育该反应混合物，或在第二反应混合物中温育该5'NMP、多磷酸盐激酶、多磷酸盐、聚合酶和DNA(也称为DNA模板)。
本文还提供了包含靶向IAP的RNA的组合物。在一些实施方案中，包含靶向IAP的RNA的组合物还包含添加剂，例如，化学品、农药、表面活性剂、生物或其它非农药成分。在一些实施方案中，在表达载体中提供靶向IAP的RNA。在一些实施方案中，在植物或植物细胞中提供靶向IAP的RNA。
应当理解，“靶向IAP的RNAi分子”涵盖“靶向IAP编码的mRNA的RNAi分子”。如果RNAi分子结合(例如，瞬时结合)并抑制(减少或阻断)mRNA的翻译(例如，由于mRNA被降解)，则认为该RNAi分子靶向目的基因。在一些实施方案中，如果存在表观遗传改变，则RNAi分子可以抑制由目的基因编码的mRNA的表达。还应当理解的是，在一些实施方案中，多核苷酸为双链RNA(例如，dsRNA GS3)，其抑制基因(例如，IAP)的编码区的表达。在其它实施方案中，多核苷酸为编码dsRNA的DNA序列。在其它实施方案中，多核苷酸为反义RNA。应当理解，本文公开的作为DNA序列的序列可以通过用尿嘧啶替代每个胸腺嘧啶而从DNA序列转化为RNA序列。
附图说明
图1A-1B包括显示在将CPB暴露于本公开的IAP RNAi(GS3)组合物(含有靶向IAPmRNA的双链RNA(dsRNA))或对照RNAi(GS4)组合物(10μg/cm2浓度的RNAi)9天后，科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)的死亡率百分比(图1A)和CPB的叶圆片消耗(leaf disc consumption)百分比(图1B)的图。
图2A-2B包括显示在CPB前三(3)天暴露于本公开的IAP RNAi组合物(1.0μg/cm2、0.1μg/cm2、0.01μg/cm2或0.001μg/cm2的GS3)或对照RNAi组合物(1.0μg/cm2的GS4)的八天剂量试验时间进程后，科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)的死亡率百分比(图2A)和CPB的叶圆片消耗百分比(图2B)的图。
图3A-3B包括显示用本公开的IAP RNAi组合物(GS3)、IAP RNAi组合物随后进行灌溉(每株植物约500ml水，模拟1/2英寸的降雨)、对照组合物(+对照)进行叶处理或不进行处理(未处理)后，每株植物的活CPB幼虫数量(图3A)和植物脱叶百分比(图3B)的图。
图4包括显示在使用本公开的IAP RNAi组合物(GS3)、对照组合物(+对照，例如，
Figure BDA0003073106330000041
)以及不进行处理(未处理)的田间试验中，在叶处理后植物脱叶百分比的图。
图5包括显示在口服暴露于包括靶向由IAP DNA的5'末端区域编码的IAP mRNA的双链RNA(dsRNA)的RNAi组合物(GS167)、包括靶向由IAP DNA的中心区域编码的IAP mRNA的dsRNA的RNAi组合物(GSP168)、包括靶向由IAP DNA的3'末端区域编码的IAP mRNA的dsRNA的RNAi组合物(GSP169)或阴性对照RNAi组合物(GS4)9天后科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)的死亡率百分比的图(n＝2)。
图6A-6B包括显示在口服暴露于包括靶向IAP mRNA的dsRNA的RNAi组合物后9天CPB的死亡率百分比的图。dsRNA大小不同，其中GS3具有432个核苷酸的长度，GS176具有200个核苷酸的长度，GS177具有150个核苷酸的长度，G178具有100个核苷酸的长度(图6A)，GS179具有74个核苷酸的长度，具有50个互补核苷酸，而GS193具有49个核苷酸的长度，具有25个互补核苷酸(图6B)。进一步评估了阴性对照RNAi组合物(GS4)。
图7包括显示在口服暴露于包括dsRNA的RNAi组合物后9天CPB的死亡率百分比的图，该dsRNA在长度为432个核苷酸的区域(GS3)内与IAP mRNA为70％(GS170)、75％(GS171)、80％(GS172)、85％(GS173)、90％(GS174)或95％(GS175)互补。进一步评估了阴性对照RNAi组合物(GS4)。
图8包括显示用0.1μg/cm2的GS3和GS4饲养三天并在三天后收集的第一龄CPB幼虫的IAP mRNA相对表达水平的图。使用内源性对照RP4基因将相对表达标准化并使用2-ddCt方法进行计算。
图9A-9C包括显示在在二十一(21)天时段内使用本公开的IAP RNAi组合物(GS3)、对照阳性组合物(标准品，例如，
Figure BDA0003073106330000042
NOVODORTM)以及不进行处理(未处理对照)的田间试验中在叶处理后植物脱叶百分比的图。
具体实施方式
根据本公开的一些方面，靶向IAP的RNAi分子(例如，dsRNA)有效地干扰鞘翅目昆虫细胞中由IAP基因编码的mRNA，从而减少或消除mRNA的翻译(例如，翻译成其相应的蛋白质)。因此，在一些方面，本公开提供了通过使本文提供的RNAi分子与植物的任何部分(例如，根，块茎，茎，枝，叶，花等)、地面(例如，土壤，泥土(dirt)，草等)、鞘翅目昆虫和/或该昆虫的饮食(例如，摄取的食物和/或水)接触来控制鞘翅目侵袭的组合物和方法。本文还提供了合成靶向IAP基因产物(mRNA)的RNAi分子的无细胞方法。
如本文所用的鞘翅目昆虫是指处于任何发育阶段的鞘翅目昆虫。在一些实施方案中，鞘翅目昆虫是昆虫卵。在一些实施方案中，鞘翅目昆虫是昆虫幼虫。在一些实施方案中，鞘翅目昆虫是昆虫蛹。在一些实施方案中，鞘翅目昆虫是成体昆虫。
鞘翅目昆虫可以是鞘翅目的任何鞘翅目昆虫。鞘翅目的昆虫的实例包括但不限于：叶甲科(Chrysomelidae)(叶甲虫(leaf beetle))，象甲科(Curculionidae)(象鼻虫(snout beetle)，芫菁科(Meloidae)(斑蝥(blister beetle))，拟步甲科(Tenebrionidae)(拟步甲(darkling beetle))，金龟子科(Scarabaeidae)(圣甲虫(scarab beetle))，天牛科(Cerambycidae)(Japanese pine sawyer)，象甲科(Curculionidae)(中国松甲虫(Chinese white pine beetle))，露尾甲科(Nitidulidae)(蜂巢小甲虫(small hivebeetle))，叶甲科(Chrysomelidae)(宽肩叶甲虫(broad-shouldered leaf beetle))，天牛科(Cerambycidae)(桑天牛(mulberry longhorn beetle))，条跳甲属(Phyllotreta)(跳甲(flea beetle))，Diabrotica(玉米根虫(corn rootworm))，Chrysomela(杨木叶甲虫(cottonwood leaf beetle))，Hypothenemus(咖啡果小蠹(coffee berry borer))，Sitophilus(玉米象(maize weevil))，Epitrix(烟草跳
Figure BDA0003073106330000051
(tobacco flea beetle))，E.cucumeris(马铃薯跳甲(potato flea beetle))，P.pusilla(西方黑色跳蚤甲虫(western black flea beetle))；花象属(Anthonomus)(胡椒象甲(pepper weevil))，Hemicrepidus(金针虫(wireworms))，Melanotus(金针虫)，Ceutorhychus(甘蓝荚象甲(cabbage seedpod weevil))，Aeolus(金针虫)，Horistonotus(sand wireworm)，Sphenophorus(玉米象虫(maize billbug))，S.zea(timothy billbug)，S.parvulus(早熟禾谷象甲(bluegrass billbug))，S.callosus(南方玉米谷(southern corn billbug))；Phyllophaga(蛴螬(white grubs))，凹胫跳甲属(Chaetocnema)(玉米跳甲(corn fleabeetle))，弧丽金龟属(Popillia)(日本丽金龟(Japanese beetle))，食植瓢虫属(Epilachna)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle))，Cerotoma(豆青叶甲(bean leafbeetle))，豆芫菁属(Epicauta)(斑蝥(blister beetle))，叶甲科(Chrysomelidae)(alligator weed flea beetle)及其任何组合。
此外，鞘翅目昆虫可以是金花虫属(Leptinotarsa)的任何物种。金花虫属物种包括，但不限于，科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)，Leptinotarsabehrensi，Leptinotarsa collinsi，Leptinotarsa defecta，Leptinotarsa haldemani(Haldeman’s green potato beetle)，Leptinotarsa heydeni，Leptinotarsa juncta(假马铃薯甲虫(false potato beetle))，Leptinotarsa lineolata(菊科灌木叶甲虫(burrobrush leaf beetle))，Leptinotarsa peninsularis，Leptinotarsa rubiginosa，Leptinotarsa texana，Leptinotarsa tlascalana，Leptinotarsa tumamoca以及Leptinotarsa typographica。
靶向凋亡抑制剂(IAP)的RNAi分子
通过IAP mRNA的检测和体内(例如，植物/田间)测试，已经鉴定了靶向IAP的RNAi分子。此类靶向IAP的RNAi分子可用于控制鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)，例如，通过抑制或降低IAP的表达，并因此通过提高昆虫死亡率，以及降低鞘翅目昆虫的生长、繁殖(例如，生育力和/或繁殖力)和/或摄食(feeding)(例如，进食(eating)和/或喝水(drinking))。
如果细胞中基因编码的mRNA和/或蛋白的水平相对于未与RNAi分子接触的对照细胞降低至少10％，则认为细胞(例如，昆虫细胞)中该基因的表达通过与RNAi分子接触而被抑制或降低。例如，与未与靶向IAP的RNAi分子接触的细胞相比，将靶向IAP的RNAi分子(例如，dsRNA)递送至细胞(例如，与细胞接触)可导致RNA转录物和/或蛋白质(例如，由IAP基因编码)的量降低(例如，降低至少10％)。
在一些实施方案中，本公开的RNAi分子特异性地抑制IAP基因的表达而没有生物学上相关的或生物学上显著的脱靶效应(在非IAP基因的表达中没有相关的或显著的变化)。在一些实施方案中，RNAi分子通过特异性抑制编码IAP蛋白的IAP mRNA(例如，降解IAPmRNA)(例如，SEQ ID NO:19的IAP mRNA)的表达来特异性抑制(减少或阻断)IAP蛋白的翻译。对IAP基因的特异性抑制包括IAP基因表达(例如，IAP mRNA表达和/或IAP蛋白表达)的可测量的降低或可检测的基因表达(例如，IAP mRNA表达和/或IAP蛋白表达)的完全缺乏。
在一些实施方案中，本公开的RNAi分子特异性地抑制IAP基因的表达而没有生物学上相关的或生物学上显著的脱靶效应(在非IAP基因的表达中没有相关的或显著的变化)。在一些实施方案中，RNAi分子通过特异性抑制编码IAP蛋白的mRNA(例如，SEQ ID NO:19的IAP mRNA)而特异性抑制IAP蛋白的表达。对IAP基因的特异性抑制涉及IAP基因表达(例如，IAP mRNA表达和/或IAP蛋白表达)的可测量的降低或可检测的基因表达(例如，IAPmRNA表达和/或IAP蛋白表达)的完全缺乏。
在一些实施方案中，本文提供的靶向IAP的RNAi分子被设计为与鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)的IAP mRNA具有互补性。在SEQ ID NO:1的序列中提供了编码科罗拉多马铃薯甲虫IAP的DNA序列的实例。在SEQ ID NO:19的序列中提供了编码科罗拉多马铃薯甲虫IAP的mRNA序列的实例。在SEQ ID NO:19-21和23-36的序列中提供由本公开的RNAi分子编码的靶向的科罗拉多马铃薯甲虫IAP mRNA序列的实例。在SEQ ID NO:37-39和41-54的序列中提供了靶向IAP的RNA分子的实例。
在一些实施方案中，本文提供的靶向IAP的RNAi分子被设计为与鞘翅目昆虫的IAPmRNA具有互补性，该鞘翅目昆虫例如叶甲科(叶甲虫)，象甲科(象鼻虫)，芫菁科(斑蝥)，拟步甲科(拟步甲)，金龟子科(圣甲虫)，天牛科(Japanese pine sawyer)，象甲科(中国松甲虫)，露尾甲科(蜂巢小甲虫)，叶甲科(宽肩叶甲虫)，天牛科(桑天牛)，C.scripta(杨木叶甲虫)，H.hampei(咖啡果小蠹)，S.Zeamais(玉米象)，f.hirtipennis(烟草跳
Figure BDA0003073106330000071
)，F.cucumeris(马铃薯跳甲(potato flea beetle))，P.cruciferae(十字花科植物跳蚤甲虫(crucifer flea beetle))和P.pusilla(西方黑色跳蚤甲虫)，花象属(胡椒象甲)，H.memnonius(金针虫)，M.communis(金针虫)，C.assimilis(甘蓝荚象甲)，P.striolata(黄条跳甲)，A.mellillus(金针虫)，A.mancus(小麦沟金针虫)，H.uhlerii(sand wireworm)，S.maidis(玉米象虫)，S.zea(timothy billbug)，S.parvulus(早熟禾谷象甲)和S.callosus(南方玉米谷)，Phyllophaga属种(蛴螬)，C.pulicaria(玉米跳甲)，P.japonica(日本丽金龟)，F.varivestis(墨西哥豆瓢虫)，C.trifurcate(豆青叶甲)，F.pestifera和F.lemniscata(斑蝥)，Oulema melanapus(谷叶甲虫)，Hypera postica(苜蓿叶象虫)，大小蠹属(Dendroctonus)(山松甲虫)，吉丁属(Emarald Ash Borer)，瘤干小蠹属(波纹棘胚小蠹)，小蠹属(欧洲榆小蠹)和/或叶甲科(alligator weed flea beetle)。
在一些实施方案中，本文提供的靶向IAP的RNAi分子被设计为与金花虫属(Leptinotarsa)昆虫的IAP mRNA具有互补性，该金花虫属昆虫例如科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)，Leptinotarsa behrensi，Leptinotarsa collinsi，Leptinotarsa defecta，Leptinotarsa haldemani(Haldeman’sgreen potato beetle)，Leptinotarsa heydeni，Leptinotarsa juncta(假马铃薯甲虫(false potato beetle))，Leptinotarsa lineolata(菊科灌木叶甲虫)，Leptinotarsa peninsularis，Leptinotarsarubiginosa，Leptinotarsa texana，Leptinotarsa tlascalana，Leptinotarsa tumamoca和/或Leptinotarsa typographica。
在一些实施方案中，本公开的双链RNA(dsRNA)包含与鞘翅目IAP基因编码的信使RNA(mRNA)结合(例如，至少部分互补或完全互补)的第一链，以及与第一链互补的第二链。
dsRNA可包含相同长度或不同长度的RNA链。在一些实施方案中，dsRNA包含与第二链(例如，有义链)相同长度的第一链(例如，反义链)。在一些实施方案中，dsRNA包含长度不同于第二链(例如，有义链)长度的第一链(例如，反义链)。第一链可以比第二链长约1％，2％，3％，4％，5％，10％，15％，20％或大于20％。第一链可以比第二链长1-5，2-5，2-10，5-10，5-15，10-20，15-20或大于20个核苷酸。
dsRNA分子也可由单个寡核苷酸以茎环结构进行组装，其中RNA分子的自身互补的有义和反义区域通过基于核酸的或非基于核酸的接头连接，以及具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义链和反义链的茎的环状单链RNA，其中环状RNA可以在体内或体外加工以产生能够介导RNAi的活性RNAi分子。RNAi分子可以在分子的一端包含3'突出(overhang)，另一端可为平末端(blunt-ended)或也具有突出(5'或3')。当RNAi分子在分子的两端包含突出时，突出的长度可相同或不同。
在一些实施方案中，本公开的单链RNA包含与鞘翅目IAP基因编码的mRNA结合的链。
如本文提供的靶向IAP的RNAi分子的长度可以变化。应当理解的是，在一些实施方案中，虽然将长RNA(例如，dsRNA或ssRNA)分子作为杀虫剂施用(例如，用于植物)，但是在进入细胞后，该dsRNA被Dicer酶切割为长度为例如15至25个核苷酸的较短双链RNA片段。因此，本公开的RNAi分子可以作为例如15至25个核苷酸片段递送，或者它们可以作为较长双链核酸(例如，至少100个核苷酸)递送。
因此，在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含15-1564个核苷酸(ssRNA)或核苷酸碱基对(dsRNA)。例如，本公开的RNAi分子可包含15-1000，15-950，15-900，15-850，15-800，15-750，15-700，15-650，15-600，15-500，15-450，15-400，15-350，15-300，15-250，15-200，15-150，15-100，15-50，19-1000，18-950，18-900，18-850，18-800，18-750，18-700，18-650，18-600，18-500，18-450，18-400，18-350，18-300，18-250，18-200，18-180，18-100，18-50，19-1000，19-950，19-900，19-850，19-800，19-750，19-700，19-650，19-600，19-500，19-450，19-400，19-350，19-300，19-250，19-200，19-190，19-100，19-50，20-1000，20-950，20-900，20-850，20-800，20-750，20-700，20-650，20-600，20-500，20-450，20-400，20-350，20-300，20-250，20-200，20-200，20-100，20-50，15211000，21-950，21-900，21-850，21-800，21-750，21-700，21-650，21-600，21-500，21-450，21-400，21-350，21-300，21-250，21-210，21-210，21-100，21-50，22-1000，22-950，22-900，22-850，22-800，22-750，22-700，22-650，22-600，22-500，22-450，22-400，22-350，22-300，22-250，22-220，22-220，22-100，22-50，23-1000，23-950，23-900，23-850，23-800，23-750，23-700，23-650，23-600，23-500，23-450，23-400，23-350，23-300，23-250，23-230，23-230，23-100，23-50，24-1000，24-950，24-900，24-850，24-800，24-750，24-700，24-650，24-600，24-500，24-450，24-400，24-350，24-300，24-250，24-240，24-240，24-100，24-50，25-1000，25-950，25-900，25-850，25-800，25-750，25-700，25-650，25-600，25-500，25-450，25-400，25-350，25-300，25-250，25-250，25-250，25-100或25-50个核苷酸或核苷酸碱基对。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由以下组成：至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少25，至少50，至少200，至少300，至少400，至少500，至少600，至少700，至少800，至少900，或至少1000个核苷酸或核苷酸碱基对。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含与由鞘翅目IAP基因编码的mRNA或mRNA的区段互补的序列或由其组成。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含与由SEQID NO:1-3或5-18中任一个的DNA序列编码的mRNA或mRNA的区段互补的序列或由其组成。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含与由SEQ ID NO:1的DNA序列编码的mRNA互补的序列或由其组成。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含与鞘翅目IAPD NA的区域或区段编码的mRNA互补的序列或由其组成。在一些实施方案中，RNAi分子靶向由鞘翅目IAP DNA的5'区域或区段编码的mRNA。鞘翅目IAP DNA的5'区域可包含IAP DNA的核苷酸1至600，核苷酸10至600，核苷酸25至600，核苷酸50至600，核苷酸100至600，核苷酸150至600，核苷酸200至600，核苷酸250至600，核苷酸300至600，核苷酸350至600，核苷酸400至600，核苷酸450至600，或核苷酸500至600(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸1-600)所涵盖的任何序列或由其组成。在一些实施方案中，RNAi分子靶向由鞘翅目IAP DNA的中心区域或区段编码的mRNA。鞘翅目IAP DNA的中心区域可包含IAP DNA的核苷酸400至1200，核苷酸450至1200，核苷酸500至1200，核苷酸550至1200，核苷酸600至1200，核苷酸650至1200，核苷酸700至1200，核苷酸850至1200，核苷酸900至1200，核苷酸950至1200，核苷酸1000至1200，核苷酸1050至1200，或核苷酸1100至1200(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸400-1200)所涵盖的任何序列或由其组成。在一些实施方案中，RNAi分子靶向由鞘翅目IAP DNA的3'区或区段编码的mRNA。鞘翅目IAP DNA的3'区域可包含IAP DNA的核苷酸1000至1564，核苷酸1050至1564，核苷酸1100至1564，核苷酸1150至1564，核苷酸1200至1564，核苷酸1250至1564，核苷酸1300至1564，核苷酸1350至1564，核苷酸1400至1564，核苷酸1450至1564或核苷酸1500至1564(例如，SEQ IDNO:1的核苷酸1000-1564)所涵盖的任何序列或由其组成。
应当理解，术语基因包括编码和非编码核酸。因此，在一些实施方案中，IAP基因编码包含5'非翻译区、开放阅读框和3'非翻译区的mRNA。因此，在一些实施方案中，本文的RNAi分子与mRNA的5'非翻译区、开放阅读框和/或3'非翻译区结合。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含SEQ ID NO:37-39或41-54中任一个的RNA序列或由其组成。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含SEQ ID NO:37的RNA序列或由其组成。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含与SEQ ID NO:19-21或23-36中任一个的RNA序列互补的序列或由其组成。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含与SEQID NO:19的RNA序列互补的序列或由其组成。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含(至少一个)连续序列或由其组成，该连续序列与鞘翅目IAP基因编码的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。在一些实施方案中，IAP基因包含SEQ ID NO:1的DNA序列。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含(至少一个)连续序列或由其组成，该连续序列与由SEQ ID NO:1-3或5-18中任一个的DNA序列编码的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含(至少一个)连续序列或由其组成，该连续序列与由鞘翅目IAP基因编码的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。在一些实施方案中，IAP基因包含SEQ ID NO:1的DNA序列。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含(至少一个)连续序列或由其组成，该连续序列与由SEQID NOS：1-3或5-18中任一个的DNA序列编码的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含(至少一个)连续序列或由其组成，该连续序列与SEQ ID NOS：37-39或41-54中任一个的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含连续序列或由其组成，该连续序列与SEQ ID NO:37的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含(至少一个)连续序列或由其组成，该连续序列与SEQ ID NO:19-21或23-36中任一个的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含连续序列或由其组成，该连续序列与SEQ ID NO:19的RNA序列具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由其组成：至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个，至少25个，至少50个，至少75个，至少100个，至少150个，至少200个，至少250个，至少300个，至少350个，至少400个，至少450个，至少500个，至少550，至少600个，至少650个，至少700个，至少750个，至少800个，至少850个，至少900个，至少950个或至少1000个核苷酸或核苷酸碱基对，该核苷酸或核苷酸碱基对与SEQID NO:37-39或41-54中任一个的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由其组成：至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个，至少25个，至少50个，至少75个，至少100个，至少150个，至少200个，至少250个，至少300个，至少350个，至少400个，至少450个，至少500个，至少550，至少600个，至少650个，至少700个，至少750个，至少800个，至少850个，至少900个，至少950个或至少1000个核苷酸或核苷酸碱基对，该核苷酸或核苷酸碱基对与SEQ ID NO:37的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％的同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由其组成：至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个，至少25个，至少50个，至少75个，至少100个，至少150个，至少200个，至少250个，至少300个，至少350个，至少400个，至少450个，至少500个，至少550，至少600个，至少650个，至少700个，至少750个，至少800个，至少850个，至少900个，至少950个或至少1000个核苷酸或核苷酸碱基对，该核苷酸或核苷酸碱基对与SEQID NO:19-21或23-36中任一个的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％的互补性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％互补性)。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由其组成：至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个，至少25个，至少50个，至少75个，至少100个，至少150个，至少200个，至少250个，至少300个，至少350个，至少400个，至少450个，至少500个，至少550，至少600个，至少650个，至少700个，至少750个，至少800个，至少850个，至少900个，至少950个或至少1000个核苷酸或核苷酸碱基对，该核苷酸或核苷酸碱基对与SEQ ID NO:19的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％的互补性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％互补性)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由以下组成：10至25，10至24，10至23，10至22，10至21，10至20，11至25，11至24，11至23，11至22，11至21，11至20，12至25，12至24，12至23，12至22，12至21，12至20，13至25，13至24，13至23，13至22，13至21，13至20，14至25，14至24，14至23，14至22，14至21，14至20，15至25，15至24，15至23，15至22，15至21，15至20，16至25，16至24，16至23，16至22，16至21，16至20，17至25，17至24，17至23，17至22，17至21，17至20，18至25，18至24，18至23，18至22，18至21，18至20个连续核苷酸，该连续核苷酸与SEQ ID NO:37-39或41-54中任一个的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由以下组成：10至25，10至24，10至23，10至22，10至21，10至20，11至25，11至24，11至23，11至22，11至21，11至20，12至25，12至24，12至23，12至22，12至21，12至20，13至25，13至24，13至23，13至22，13至21，13至20，14至25，14至24，14至23，14至22，14至21，14至20，15至25，15至24，15至23，15至22，15至21，15至20，16至25，16至24，16至23，16至22，16至21，16至20，17至25，17至24，17至23，17至22，17至21，17至20，18至25，18至24，18至23，18至22，18至21，18至20个连续核苷酸，该连续核苷酸与SEQ ID NO:37的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％同一性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由以下组成：10至25，10至24，10至23，10至22，10至21，10至20，11至25，11至24，11至23，11至22，11至21，11至20，12至25，12至24，12至23，12至22，12至21，12至20，13至25，13至24，13至23，13至22，13至21，13至20，14至25，14至24，14至23，14至22，14至21，14至20，15至25，15至24，15至23，15至22，15至21，15至20，16至25，16至24，16至23，16至22，16至21，16至20，17至25，17至24，17至23，17至22，17至21，17至20，18至25，18至24，18至23，18至22，18至21，18至20个连续核苷酸，该连续核苷酸与SEQ ID NO:19-21或23-36中任一个的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％的互补性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％互补性)。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含以下或由以下组成：10至25，10至24，10至23，10至22，10至21，10至20，11至25，11至24，11至23，11至22，11至21，11至20，12至25，12至24，12至23，12至22，12至21，12至20，13至25，13至24，13至23，13至22，13至21，13至20，14至25，14至24，14至23，14至22，14至21，14至20，15至25，15至24，15至23，15至22，15至21，15至20，16至25，16至24，16至23，16至22，16至21，16至20，17至25，17至24，17至23，17至22，17至21，17至20，18至25，18至24，18至23，18至22，18至21，18至20个连续核苷酸，该连续核苷酸与SEQ ID NO:19的RNA序列或该RNA序列的区段具有70％至100％的互补性(例如，70％至100％，75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，96％至100％，97％至100％，98％至100％，99％至100％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％互补性)。
两个核酸序列(例如，本文提供的靶向IAP的RNAi分子和例如SEQ ID NO:1、19或37中的任一个)的“同一性百分比”可通过本领域已知的任何方法测定。在一些实施方案中，本文提供的变体含有随机放置的突变，其中对于给定突变以近似相等的概率选择四个核苷酸(A，U，G，C)。在一些实施方案中，这些突变可分布在序列的小区域内，或在序列的长度内广泛分布。在一些实施方案中，使用如Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中修饰的Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990中的算法测定两个核酸序列的同一性百分比。将这种算法并入Altschul etal.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用NBLAST程序(分数＝100，字长-12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与靶核酸同源的引导序列。当两个序列之间存在缺口时，可以使用Gapped BLAST，如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸，诸如靶向IAP的RNAi分子，被设计成具有至少一个与鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)的IAP mRNA的序列的区段互补(例如，完全(100％)或部分(小于100％，例如，90％至99％)互补)的沉默元件。在一些实施方案中，多核苷酸包含至少一个与鞘翅目昆虫的IAP mRNA基本上相同或基本上互补的沉默元件。在一些实施方案中，多核苷酸包含2至5个，至10个，2至20个，2至20个，2至40个或2至50个沉默元件。在一些实施方案中，多核苷酸包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，至少30个，至少35个，至少40个，至少45个或至少50个沉默元件。
本文提供的靶向IAP的RNAi分子可为任何形式的RNA，包括单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)。单链RNA的非限制性实例包括mRNA，微小RNA(miRNA)(例如，人工miRNA(amiRNA)，小干扰RNA(siRNA)，piwi相互作用RNA(piRNA)以及反义RNA。双链RNA包括不含有单链区域(例如，环或突出)的全双链分子，以及含有双链区域和单链区域(例如，环或突出)的部分双链分子。此外，RNAi分子可为具有二级结构的单链RNA分子，其含有显著的双链特征，诸如，但不限于，发夹RNA。因此，在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子可为短发夹RNA(shRNA)。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含dsRNA，ssRNA，siRNA，miRNA(例如，amirRNA)，piRNA，mRNA或shRNA。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含多于一种形式的RNA。例如，靶向IAP的RNAi分子可包含ssRNA和dsRNA。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含与RNA和DNA的杂交体。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子包含由非蛋白质编码RNA的长前体转录物加工的amiRNA，其为部分自身互补的，以介导靶mRNA的沉默。在一些实施方案中，通过用源自靶基因的21个核苷酸长的片段替换pre-miRNA内的成熟21个核苷酸miRNA序列来设计amiRNA(Frontiers in Plant Science,Sebastian et al.,2017)。amiRNA可具有例如至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸的长度。
靶向IAP的RNAi分子可作为靶向IAP的RNAi分子的混合物提供，例如，具有不同序列的靶向IAP的RNAi分子的混合物。可以在靶向IAP的RNAi分子的混合物中提供任何数目的不同的靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的混合物包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个或至少10个不同的(具有不同的序列/核苷酸组成)靶向IAP的RNAi分子。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子作为RNAi分子(其与IAP基因(例如，包含SEQ ID NO:1的序列)编码的mRNA的不同区段互补(全部或部分))的混合物提供。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子作为RNAi分子(其与SEQ ID NO:19的RNA序列的不同区段互补(完全或部分))的混合物提供。可以在靶向IAP的RNAi分子的混合物中提供与IAP基因(例如，包含SEQ ID NO:1的序列)编码的mRNA(例如，包含SEQ ID NO:19的序列)的不同区段互补的任何数目的靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的混合物包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个或至少10个靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的混合物包含2至5个，或2至10个靶向IAP的RNAi分子。
在一些实施方案中，与IAP mRNA的相应序列(例如，SEQ ID NO:19)相比，本文提供的靶向IAP的RNAi分子可具有一个或多个错配。靶向IAP的RNAi分子上的互补区域可具有至多1个，至多2个，至多3个，至多4个等错配，只要其保持在适当杂交条件下与IAP mRNA形成互补碱基对的能力。或者，靶向IAP的RNAi分子上的互补性区域可具有不超过1个，不超过2个，不超过3个或不超过4个错配，只要其保持在适当杂交条件下与IAP mRNA形成互补碱基对的能力。在一些实施方案中，如果在互补性区域中存在多于一个错配，则它们可以连续地定位(例如，一行中的2、3、4或更多个)，或散布在整个互补区域中，只要靶向IAP的RNAi分子保持在适当的杂交条件下与IAP mRNA形成互补碱基对的能力。
可以以各种方式修饰靶向IAP的RNAi分子，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、降解、对核酸酶降解的抗性、碱基配对特性、RNA分布和细胞摄取以及与其使用相关的其它特征。参见，例如，Bramsen et al.,Nucleic Acids Res.,2009,37,2867-2881；Bramsen and Kjems,Frontiers in Genetics,3(2012):1-22。因此，在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子可包括一种或多种(至少一种)合适的修饰。在一些实施方案中，经修饰的靶向IAP的RNAi分子在其碱基、糖(例如，核糖、脱氧核糖)或磷酸基团上具有修饰。
通过本文提供的方法产生的靶向IAP的RNAi分子可以如本文所述进行修饰。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子是根据本文所述的方法产生的，并随后进行修饰。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子是根据本文所述的方法使用经修饰的起始材料产生的。在一些实施方案中，经修饰的起始材料为经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的起始材料为修饰的核苷。在一些实施方案中，经修饰的起始材料为修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的靶向IAP的RNAi分子包含骨架修饰。在一些实施方案中，由于降解(例如，核酸酶介导的降解)减少，骨架修饰导致RNA的半衰期更长。这进而导致更长的半衰期。合适的骨架修饰的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯修饰，二硫代磷酸酯修饰，p-乙氧基修饰，甲基膦酸酯修饰，甲基硫代磷酸酯修饰，烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中带电的膦酸酯氧被烷基或芳基替代)，烷基膦酸三酯(其中带电的氧部分被烷基化)，肽核酸(PNA)骨架修饰和锁核酸(LNA)骨架修饰。这些修饰可彼此组合使用和/或与磷酸二酯骨架键组合使用。
可替代地或另外地，靶向IAP的RNAi分子可包含其他修饰，包括碱基或糖部分的修饰。实例包括具有糖的RNA，该糖与除3'位的羟基和5'位的磷酸基以外的低分子量有机基团(例如，2'-O-烷基化的核糖)共价连接，或具有糖诸如阿拉伯糖而非核糖的RNA。RNA还包括取代的嘌呤和嘧啶，诸如C-5丙炔修饰的碱基(Wagner et al.,Nature Biotechnology 14:840-844,1996)。其它嘌呤和嘧啶包括，但不限于，5-甲基胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2,6-二氨基嘌呤和次黄嘌呤。其它此类修饰是本领域技术人员所熟知的。
可以使用任何合适的方法设计和制备包含与靶序列的全部或片段互补的核苷酸序列的RNAi分子。在一些实施方案中，RNAi分子可以在来自综合序列数据库(诸如已知用于拟谷盗属(Tribolium)和果蝇属(Drosophila)遗传学的那些(例如，Flybase，SnapDragon，Beetlebase等))的帮助下设计。在一些实施方案中，使用序列数据库来确定所设计的RNAi分子的脱靶效应(例如，Arziman,Z.,Horn,T.,&Boutros,M.(2005).E-RNAi:a webapplication to design optimized RNAi constructs.Nucleic Acids Research,33(WebServer issue),W582–W588.doi:10.1093/nar/gki468.)
使用方法
在一些实施方案中，本公开的方面提供了用于控制鞘翅目昆虫侵袭的方法，其包含将有效量的靶向IAP的RNAi分子(或包含靶向IAP的RNAi分子的组合物)递送至植物或鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)。在一些实施方案中，该递送方法包含向植物或鞘翅目昆虫的表面施用包含RNAi分子的组合物。在一些实施方案中，包含靶向IAP的RNAi分子的组合物为固体或液体(例如，溶液、悬浮液或乳液)。非限制性实例包括可乳化浓缩物，浓缩物溶液，低浓度溶液，超低体积浓缩物溶液，水溶性浓缩物溶液，水溶性液体溶液，诱饵(糊剂，凝胶，液体，固体或注射剂)，烟(smoke)，雾剂(fog)，反乳液，可流动剂(flowables)，气雾剂，均质和非均质混合物，悬浮液(水和油基)，粉尘(dust)、粉剂(powder)(可湿性的或可溶性的)，颗粒剂(水分散性的或干流动性的)，丸剂，胶囊剂，熏剂，包囊制剂或微包囊制剂，或其任何组合。
在一些实施方案中，包含靶向IAP的RNAi分子的组合物可以浓缩物、喷雾(在稀释或浓缩后)、雾剂、在犁沟中、种子处理、浸液(drench)、滴注、昆虫饮食、诱饵或其他适于施用至犁沟的任何其他形式施用。本文所述的靶向IAP的RNAi分子可递送至植物的任何部分，包括，但不限于，叶，茎，花，果实，芽，根，种子，块茎，花药，雄蕊和/或花粉。在一些实施方案中，RNAi通过高压喷雾或喷砂以机械方式来递送。在一些实施方案中，组合物包含RNAi分子和至少一种添加剂，该添加剂选自：佐剂，引诱剂，杀菌剂，生长调节物质，载体或稀释剂，稳定剂和/或农药(pesticidal agent)(例如，杀虫剂、杀真菌剂和/或除草剂)。农药包括，例如，不同于IAP、马铃薯糖蛋白(patatin)、植物凝集素、植物蜕皮激素、cry蛋白、营养期杀虫蛋白(vip)、溶细胞蛋白(cyt)、生物素结合蛋白、蛋白酶抑制剂、壳多糖酶、有机化合物或其任何组合的其它dsRNA靶向基因。也可以使用非农药试剂(例如，助剂，诸如消泡剂，缓冲剂，相容剂，漂移控制添加剂(drift control additives)，乳化剂，增量剂(extender)，反乳化剂，植物渗透剂，安全剂，铺展剂，粘着剂，表面活性剂，增稠剂和润湿剂)。
在一些实施方案中，组合物包括靶向IAP的RNAi分子和多种农用化学品、杀虫剂、杀螨剂、杀真菌剂、农药和/或生物农药(例如，微生物剂、PIP剂和生化剂)中的至少一种的混合物，该农用化学品、杀虫剂、杀螨剂、杀真菌剂、农药和/或生物农药诸如，螺甲螨酯(Spiromesifen)，螺螨酯(Spirodiclofen)，螺虫乙酯(Spirotetramat)，哒螨灵(Pyridaben)，吡螨胺(Tebufenpyrad)，唑虫酰胺(Tolfenpyrad)，唑螨酯(Fenpyroximate)，嘧虫胺(Flufenerim)，嘧螨醚(Pyrimidifen)，喹螨醚(Fenazaquin)，鱼藤酮(Rotenone)，腈吡螨酯(Cyenopyrafen)，氟蚁腙(Hydramethylnon)，灭螨醌(Acequinocyl)，嘧螨酯(Fluacrypyrim)，磷化铝(Aluminium phosphide)，磷化钙(Calcium phosphide)，磷化氢(Phosphine)，磷化锌(Zinc phosphide)，氰化物，丁醚脲(Diafenthiuron)，三唑锡(Azocyclotin)，三环锡(Cyhexatin)，苯丁锡(Fenbutatin oxide)，克螨特(Propargite)，三氯杀螨砜(Tetradifon)，杀虫磺(Bensultap)，杀虫环(Thiocyclam)，杀虫双(Thiosultap-sodium)，氟啶虫酰胺(Flonicamid)，乙螨唑(Etoxazole)，四螨嗪(Clofentezine)，氟螨嗪(Diflovidazin)，噻螨酮(Hexythiazox)，定虫隆(Chlorfluazuron)，双三氟虫脲(Bistrifluron)，伏虫脲(Diflubenzuron)，氟螨脲(Flucycloxuron)，氟虫脲(Flufenoxuron)，氟铃脲(Hexaflumuron)，虱螨脲(Lufenuron)，双苯氟脲(Novaluron)，多氟脲(Noviflumuron)，氟苯脲(Teflubenzuron)，杀铃脲(Triflumuron)，噻嗪酮(Buprofezin)，灭蝇胺(Cyromazine)，烯虫乙酯(Hydroprene)，烯虫炔酯(Kinoprene)，烯虫酯(Methoprene)，苯氧威(Fenoxycarb)，吡丙醚(Pyriproxyfen)，吡蚜酮(Pymetrozine)，氟虫吡喹(Pyrifluquinazon)，溴虫腈(Chlorfenapyr)，吡咯腈(Tralopyril)，甲基溴和/或其他烷基卤化物，氯化苦(Chloropicrin)，磺酰氟(Sulfurylfluoride)，Benclothiaz，灭螨猛(Chinomethionat)，冰晶石(Cryolite)，甲基新癸酰胺(Methylneodecanamide，苯螨特(Benzoximate)，螨蜱胺(Cymiazole)，氟噻虫砜(Fluensulfone)，印楝素(Azadirachtin)，联苯肼酯(Bifenazate)，磺胺螨酯(Amidoflumet)，三氯杀螨醇(Dicofol)，三氯杀虫酯(Plifenate)，丁氟螨酯(Cyflumetofen)，啶虫丙醚(Pyridalyl)，球孢白僵菌GHA(Beauveria bassiana GHA)，氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)，乙基多杀菌素(Spinetoram)，多杀菌素(Spinosad)，多杀菌素(Spinosad)，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin benzoate)，雷皮菌素(Lepimectin)，密灭汀(Milbemectin)，阿维菌素(Abamectin)，甲氧虫酰肼(Methoxyfenozide)，环虫酰肼(Chromafenozide)，氯虫酰肼(Halofenozide)，虫酰肼(Tebufenozide)，双甲脒(Amitraz)，氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)，溴氰虫酰胺(Cyantraniliprole)，氟虫双酰胺(Flubendiamide)，α-硫丹(alpha-endosulfan)，氯丹(Chlordane)，硫丹(Endosulfan)，氟虫腈(Fipronil)，乙酰虫腈(Acetoprole)，乙虫腈(Ethiprole)，Pyrafluprole，Pyriprole，茚虫威(Indoxacarb)，氰氟虫腙(Metaflumizone)，氟丙菊酯(Acrinathrin)，烯丙菊酯(Allethrin)，顺反式烯丙菊酯(Allethrin-cis-trans)，反式烯丙菊酯(Allethrin-trans)，β-氟氯氰菊酯(beta-Cyfluthrin)，β-氯氰菊酯(beta-Cypermethrin)，联苯菊酯(Bifenthrin)，生物丙烯菊酯(Bioallethrin)，生物丙烯菊酯S-环戊烯基异构物(Bioallethrin S-cyclopentenyl)，苄呋菊脂(Bioresmethrin)，乙氰菊酯(Cycloprothrin)，氟氯氰菊酯(Cyfluthrin)，三氟氯氰菊酯(Cyhalothrin)，氯氰菊酯(Cypermethrin)，苯氰菊酯(Cyphenothrin)[(1R)-反式异构体]，四氟甲醚菊酯(Dimefluthrin)，右旋烯炔菊酯(Empenthrin)[(EZ)-(1R)-异构体]，顺式氰戊菊酯(Esfenvalerate)，醚菊酯(Etofenprox)，甲氰菊酯(Fenpropathrin)，氰戊菊酯(Fenvalerate)，氟氰戊菊酯(Flucythrinate)，氟氯苯菊酯(Flumethrin)，γ-氯氟氰菊酯(Gamma-cyhalothryn)，λ-氯氟氰菊酯(lambda-Cyhalothrin)，氯氟醚菊酯(Meperfluthrin)，甲氧苄氟菊酯(Metofluthrin)，氯菊酯(Permethrin)，苯醚菊酯(Phenothrin)[(1R)-反式异构体]，右旋炔丙菊酯(Prallethrin)，丙氟菊酯(Profluthrin)，丙苯烃菊酯(Protrifenbute)，苄呋菊酯(Resmethrin)，氟硅菊酯(Silafluofen)，氟胺氰菊酯(tau-Fluvalinate)，七氟菊酯(Tefluthrin)，胺菊酯(Tetramethrin)，胺菊酯(Tetramethrin)[(1R)-异构体])，四氟醚菊酯(Tetramethylfluthrin)，θ-氯氰菊酯(theta-Cypermethrin)，四溴菊酯(Tralomethrin)，四氟苯菊酯(Transfluthrin)，ζ-氯氰菊酯(zeta-Cypermethrin)，α-氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)，溴氰菊酯(Deltamethrin)，DDT，甲氧滴滴涕(Methoxychlor)，硫双威(Thiodicarb)，棉铃威(Alanycarb)，涕灭威(Aldicarb)，恶虫威(Bendiocarb)，丙硫克百威(Benfuracarb)，丁酮砜威(Butoxycarboxim)，甲萘威(Carbaryl)，克百威(Carbofuran)，丁硫克百威(Carbosulfan)，乙硫苯威(Ethiofencarb)，仲丁威(Fenobucarb)，伐虫脒(Formetanate)，呋线威(Furathiocarb)，异丙威(Isoprocarb)，灭虫威(Methiocarb)，灭多虫(Methomyl)，速灭威(Metolcarb)，欧杀灭(Oxamyl)，抗蚜威(Pirimicarb)，安丹(Propoxur)，久效威(Thiofanox)，唑蚜威(Triazamate)，托卡伯(Trimethacarb)，XMC，灭杀威(Xylylcarb)，毒死蜱(Chlorpyrifos)，马拉硫磷(Malathion)，乙酰甲胺磷(Acephate)，甲基吡啶磷(Azamethiphos)，乙基谷硫磷(Azinphos-ethyl)，甲基谷硫磷(Azinphos-methyl)，硫线磷(Cadusafos)，氯氧磷(Chlorethoxyfos)，杀螟威(Chlorfenvinphos)，氯甲磷(Chlormephos)，甲基毒死蜱(Chlorpyrifos-methyl)，阔马磷(Coumaphos)，杀螟腈(Cyanophos)，甲基内吸磷(Demeton-S-methyl)，二嗪磷(Diazinon)，敌敌畏(Dichlorvos/DDVP)，百治磷(Dicrotophos)，乐果(Dimethoate)，甲基毒虫畏(Dimethylvinphos)，乙拌磷(Disulfoton)，EPN，乙硫磷(Ethion)，灭线磷(Ethoprophos)，胺磺磷(Famphur)，苯线磷(Fenamiphos)，杀螟硫磷(Fenitrothion)，倍硫磷(Fenthion)，地虫硫磷(Fonofos)，噻唑膦(Fosthiazate)，伊米塞弗(Imicyafos)，甲基异柳磷(Isofenphos-methyl)，灭蚜磷(Mecarbam)，甲胺磷(Methamidophos)，杀扑磷(Methidathion)，速灭磷(Mevinphos)，久效磷(Monocrotophos)，二溴磷(Naled)，殴灭松(Omethoate)，亚砜磷(Oxydemeton-methyl)，对硫磷(Parathion)，甲基对硫磷(Parathion-methyl)，稻丰散(Phenthoate)，甲拌磷(Phorate)，伏杀硫磷(Phosalone)，亚胺硫磷(Phosmet)，磷胺(Phosphamidon)，辛硫磷(Phoxim)，甲基嘧啶磷(Pirimiphos-methyl)，丙溴磷(Profenofos)，丙虫磷(Propaphos)，异丙氧磷(Propetamphos)，丙硫磷(Prothiofos)，吡唑硫磷(Pyraclofos)，哒嗪硫磷(Pyridaphenthion)，喹硫磷(Quinalphos)，治螟磷(Sulfotep)，丁基嘧啶磷(Tebupirimfos)，双硫磷(Temephos)，特丁硫磷(Terbufos)，杀虫畏(Tetrachlorvinphos)，甲基乙拌磷(Thiometon)，三唑磷(Triazophos)，Triclorfon，蚜灭多(Vamidothion)，吡虫啉(Imidacloprid)，噻虫嗪(Thiamethoxam)，啶虫脒(Acetamiprid)，噻虫胺(Clothianidin)，呋虫胺(Dinotefuran)，烯啶虫胺(Nitenpyram)，Nithiozine，烟碱，噻虫啉(Thiacloprid)，溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)，氨基甲酸酯类(carbamates)，有机磷类(organophosphates)，环戊二烯有机氯类(cyclodiene organochlorines)，苯基吡唑类(phenylpyrazoles(芬普尼(fiproles)))，拟除虫菊酯(pyrethroids)，除虫菊酯(pyrethins)，甲氧滴滴涕(DDT Methoxychlor)，新烟碱(Neonicotinoids)，烟碱，亚砜亚胺(Sulfoximines)，白术内酯(Butenolides)，Mesoionics，多杀菌素(Spinosyns)，阿维菌素(Avermectins)，Milbernycins，保幼激素类似物(Juvenile hormone analogues)，苯氧威(Fenoxycarb)，吡丙醚(Pyriproxyfen)，烷基卤化物(Alkyl halides)，氯化苦(Chloropicrin)，氟化物(Fluorides)，硼酸盐(Borates)，吐酒石(Tarter emetic)，异硫氰酸甲酯生成剂(Methyl isothiocyanate generators)，吡啶偶氮甲亚胺衍生物(pyridineazomethine derivatives)，Pyropenes，四螨嗪(Clofentezine)，氟螨酯(Diflovidazin)，噻螨酮(Hexythiazox)，乙螨唑(Etoxazole)，丁醚脲(Diafenthiuron)，有机锡杀螨剂(Organotin miticides)，快螨特(Propargite)，三氯杀螨砜(Tetradifon)，吡咯类(Pyrroles)，二硝基苯酚类(Dinitrophenols)，氟虫胺(Sulfuramid)，沙蚕毒素类似物(Nereistoxin analogues)，苄基脲(Benzoylureas)，噻嗪酮(Buprofezin)，灭蝇胺(Cyromazine)，二芳甲酰基肼类(Diacylhydrazines)，双甲脒(Amitraz)，氟蚁腙(Hydramethylnon)，灭螨醌(Acequinocyl)，嘧螨酯(Fluacrypyrim)，联苯肼酯(Bifenazate)，METI杀螨剂和杀虫剂(METI acaricides and insecticides)，鱼藤酮(Rotenone)，恶二嗪类(Oxadiazines)，缩氨基脲类(Semicarbazones)，Tetronic和特特拉姆酸衍生物(Tetronic and Tetramic acid derivatives)，磷化物(Phosphides)，氰化物(Cyanides)，β-酮腈衍生物(Beta-ketonitrile derivatives)，羧酰苯胺(Carboxanilides)，二酰胺(Diamides)，氟啶虫酰胺(Flonicamid)，间二酰胺异恶唑啉(Meta-diamides Isoxazolines)，颗粒体病毒(Granuloviruses(GV))，核型多角体病毒(Nucleopolyhedroviruses(NPV))，GS-ω/κHXTX-Hv1a肽(GS-omega/kappa HXTX-Hv1apeptide)，印楝素(Azadirachtin)，苯并肟(Benzoximate)，溴螨酯(Bromopropylate)，灭螨猛(Chinomethionat)，三氯杀螨醇(Dicofol)，石硫合剂(Lime sulfur)，代森锰锌(Mancozeb)，啶虫丙醚(Pyridalyl)，硫(Sulfur)，苯并咪唑(Benzimidazoles)，二甲酰亚胺(Dicarboximides)，吡啶类(Pyridines)，嘧啶类(Pyrimidines)，三唑类(Triazoles)，酰基丙氨酸类(Acylalanines)，吡啶甲酰胺类(Pyridine carboxamides)，苯胺嘧啶类(Anilino-pyrimidines)，醌外部抑制剂(Quinone outside Inhibitors(QoI-杀真菌剂))，苯基吡咯类(Phenylpyrroles)，喹啉类(Quinolines)，羟基苯胺类(Hydroxyanilides)，Toluamides，氰乙酰胺肟类(Cyanoacetamide-oximes)，巴豆酸二硝基苯酯类(Dinitrophenyl crotonates)，膦酸酯类(Phosphonates)，羧酸酰胺(Carboxylic AcidAmides(CAA-杀真菌剂))，M1无机物(M1 inorganic)，M2无机物(M2 inorganic)，M3二硫代氨基甲酸酯(M3 dithiocarbamates)，M4邻苯二甲酰亚胺(M4 phthalimides)，石蜡油，石油基园艺用油，棕榈油，硬脂酸油，亚油酸油，油酸油，低芥酸菜籽油大豆油，牛至油，万寿菊油，香脂冷杉油，百里香油，黑胡椒油，薄荷油，柏木油，鱼油，霍霍巴油，lavadin油，蓖麻油，桉叶油，罗勒油，广藿香油，柑橘油，青蒿油，樟脑油，冬青油，甲基丁子香酚油，百里酚油，天竺葵油，芝麻油，亚麻子油，棉籽油，柠檬草油，香柠檬油，芥子油，橙油，香茅油，茶树油，印楝油，大蒜油，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(例如，苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillusthuringiensisvar.aizawai)，苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensisvar.israelensis)，苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensisvar.kurstaki)，苏云金芽孢杆菌球形芽孢杆菌亚种(Bacillus thuringiensisvar.sphaericus)，苏云金芽孢杆菌tenebrionensis亚种(Bacillusthuringiensisvar.tenebrionensis)及其产生的杀虫蛋白(例如Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1Fa，Cry1A.105，Cry2Ab，Vip3A，mCry3A，Cry3Ab，Cry3Bb，Cry34Ab1/Cr35Ab1)，日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)，嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)，核多角体病毒(nuclear polyhedrosis viruses)，颗粒病毒(granulosis viruses)，非关闭杆状病毒(non-occluded baculoviruses)，白僵菌属种(Beauveria spp)，绿僵菌属(Metarhizium)，Entomophaga，Zoopthora，玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)，Normuraea，蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)，小孢子虫属(Nosema)，泰洛哈虫属(Thelohania)，变形孢虫属(Vairimorpha)，斯氏线虫属种(Steinernema spp)，异小杆线虫属种(Heterorhabditis spp)或其任何组合，其可进一步包含选自由以下组成的组的活性成分：甲基谷硫磷(Azinphos-methyl)，乙酰甲胺磷(acephate)，异恶唑磷(isoxathion)，异柳磷(isofenphos)，乙硫磷(ethion)，乙嘧硫磷(etrimfos)，亚砜磷(oxydemeton-methyl)，异亚砜磷(oxydeprofos)，喹硫磷(quinalphos)，毒死蜱(chlorpyrifos)，甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)，毒虫畏(chlorfenvin phos)，杀螟腈(cyanophos)，蔬果磷(dioxabenzofos)，dichlorvos)，乙拌磷(disulfoton)，甲基毒虫畏(dimethylvinphos)，乐果(dimethoate)，硫丙磷(sulprofos)，二嗪磷(diazinon)，甲基乙拌磷(thiometon)，杀虫畏(tetrachlorvinphos)，双硫磷(temephos)，丁基嘧啶磷(tebupirimfos)，特丁硫磷(terbufos)，二溴磷(naled)，蚜灭多(vamidothion)，吡唑硫磷(pyraclofos)，哒嗪硫磷(pyridafen thion)，甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)，杀螟硫磷(fenitrothion)，倍硫磷(fenthion)，稻丰散(phenthoate)，吡氟硫磷(flupyrazophos)，丙硫磷(prothiofos)，丙虫磷(propaphos)，丙溴磷(profenofos)，辛硫磷(phoxime)，伏杀硫磷(phosalone)，亚胺硫磷(phosmet)，安果(formothion)，甲拌磷(phorate)，马拉硫磷(malathion)，灭蚜磷(mecarbam)，倍硫磷亚砜(mesulfenfos)，甲胺磷(methamidophos)，杀扑磷(methidathion)，对硫磷(parathion)，甲基对硫磷(methyl parathion)，久效磷(monocrotophos)，敌百虫(trichlorphon)，EPN，氯唑磷(isazophos)，isamidofos，硫线磷(cadusafos)，除线特(diamidaphos)，除线磷(dichlofenthion)，虫线磷(thionazin)，苯线磷(fenamiphos)，噻唑膦(fosthiazate)，丁硫环磷(fosthietan)，磷虫威(phosphocarb)，DSP，灭线磷(ethoprophos)，棉铃威(alanycarb)，涕灭威(aldicarb)，异丙威(isoprocarb)，杀虫丹(ethiofen carb)，甲萘威(carbaryl)，丁硫克百威(carbosulfan)，灭杀威(xylylcarb)，硫双威(thiodicarb)，抗蚜威(pirimicarb)，仲丁威(fenobucarb)，呋线威(furathiocarb)，安丹(propoxur)，恶虫威(ben diocarb)，丙硫克百威(benfuracarb)，灭多虫(methomyl)，速灭威(metolcarb)，XMC，克百威(carbofuran)，氧涕灭威(aldoxycarb)，欧杀灭(oxamyl)，acrin athrin，烯丙菊酯(allethrin)，顺式氰戊菊酯(esfenvalerate)，右旋烯炔菊酯(empenthrin)，乙氰菊酯(cycloprothrin)，三氟氯氰菊酯(cyhalothrin)，γ-氯氟氰菊酯(gamma-cyhalothrin)，λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)，氟氯氰菊酯(cyfluthrin)，β-氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)，氯氰菊酯(cypermethrin)，α-氯氰菊酯(alpha-cypermethrin)，ζ-氯氰菊酯(zeta-cypermethrin)，氟硅菊酯(silafluofen)，胺菊酯(tetramethrin)，七氟菊酯(tefluthrin)，溴氰菊酯(deltamethrin)，四溴菊酯(tralomethrin)，联苯菊酯(bifenthrin)，苯醚菊酯(phenothrin)，氰戊菊酯(fenvalerate)，甲氰菊酯(fenpropathrin)，炔呋菊酯(furamethrin)，右旋炔丙菊酯(prallethrin)，氟氰戊菊酯(flucythrinate)，氟胺氰菊酯(fluvalinate)，溴氟菊酯(flubrocythrinate)，氯菊酯(permethrin)，苄呋菊酯(resmethrin)，醚菊酯(ethofenprox)，杀螟丹(cartap)，杀虫环(thiocyclam)，杀虫磺(bensultap)，啶虫脒(acetamiprid)，吡虫啉(imidacloprid)，噻虫胺(clothianidin)，呋虫胺(dinotefuran)，噻虫啉(thiacloprid)，噻虫嗪(thiamethoxam)，烯啶虫胺(nitenpyram)，定虫隆(chlorfluazuron)，伏虫脲(difluben zuron)，氟苯脲(teflubenzuron)，杀铃脲(triflumuron)，双苯氟脲(novaluron)，多氟脲(noviflumuron)，bistrifluoron，吡虫隆(fluazuron)，氟螨脲(flucycloxuron)，氟虫脲(flufenoxuron)，氟铃脲(hexaflumuron)，虱螨脲(lufenuron)，环虫酰肼(chromafen ozide)，虫酰肼(tebufenozide)，氯虫酰肼(halofen ozide)，甲氧虫酰肼(methoxyfen ozide)，苯虫醚(diofenolan)，灭蝇胺(cyromazine)，吡丙醚(pyriproxyfen)，噻嗪酮(buprofezin)，烯虫酯(methoprene)，烯虫乙酯(hydroprene)，烯虫炔酯(kinoprene)，唑蚜威(triazamate)，硫丹(endosulfan)，杀螨酯(chlorfenson)，乙酯杀螨醇(chlorobenzilate)，三氯杀螨醇(dicofol)，溴螨酯(bromopropylate)，乙酰虫腈(acetoprole)，flpronil，乙虫腈(ethiprole)，除虫菊酯(pyrethrin)，鱼藤酮(rotenone)，硫酸芋碱(nicotinesulphate)，多杀菌素(spinosad)，finpronil，螺虫乙酯(Spirotetramat)，阿维菌素(abamectin)，灭螨醌(acequinocyl)，磺胺螨酯(amidoflumet)，双甲脒(amitraz)，乙螨唑(etoxazole)，灭螨猛(chinomethionat)，四螨嗪(clofentezine)，苯丁锡(fenbutatin oxide)，除螨灵(dienochlor)，三环锡(cyhexatin)，螺螨酯(spirodiclofen)，螺甲螨酯(spiromesifen)，三氯杀螨砜(tetradifon)，吡螨胺(tebufenpyrad)，乐杀螨(binapacryl)，联苯肼酯(bifenazate)，哒螨灵(pyridaben)，嘧螨醚(pyrimidifen)，喹螨醚(fenazaquin)，苯硫威(fenothiocarb)，唑螨酯(fenpyroximate)，嘧螨酯(fluacrypyrim)，氟啶胺(fluazinam)，杀螨净(flufenzin)，噻螨酮(hexythiazox)，克螨特(propargite)，素酯混剂(polynactincomplex)，密灭汀(milbemectin)，虱螨脲(lufenuron)，灭蚜磷(mecarbam)，灭虫威(methiocarb)，速灭磷(mevinphos)，苄螨醚(halfenprox)，印楝素(azadirachtin)，丁醚脲(diafenthiuron)，茚虫威(indoxacarb)，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectinbenzoate)，油酸钾，油酸钠，溴虫腈(chlorfenapyr)，唑虫酰胺(tolfenpyrad)，吡蚜酮(pymetrozine)，苯氧威(fenoxycarb)，氟蚁腙(hydramethylnon)，羟丙基淀粉(hydroxypropyl starch)，啶虫丙醚(pyridalyl)，嘧虫胺(flufenerim)，氟虫双酰胺(flubendiamide)，氟啶虫酰胺(flonicamid)，metaflumizole，雷皮菌素(lepimectin)，TPIC，阿苯达唑(albendazole)，奥苯达唑(oxibendazole)，奥芬达唑(oxfendazole)，水杨菌胺(trichlamide)，线虫磷(fensulfothion)，芬苯达唑(fenbendazole)，盐酸左旋咪唑(levamisole hydrochloride)，酒石酸莫仑太尔(morantel tartrate)，dazomet)，威百亩(metam-sodium)，三唑酮(triadimefon)，己唑醇(hexaconazole)，丙环唑(propiconazole)，种菌唑(ipconazole)，咪鲜胺(prochloraz)，氟菌唑(triflumizole)，戊唑醇(tebuconazole)，氟环唑(epoxiconazole)，苯醚甲环唑(difenoconazole)，氟硅唑(flusilazole)，三唑醇(triadimenol)，环丙唑醇(cyproconazole)，叶菌唑(metconazole)，氟喹唑(fluquinconazole)，联苯三唑醇(bitertanol)，四氟醚唑(tetraconazole)，灭菌唑(triticonazole)，粉唑醇(flutriafol)，戊菌唑(penconazole)，烯唑醇(diniconazole)，腈苯唑(fenbuconazole)，糠菌唑(bromuconazole)，亚胺唑(imibenconazole)，硅氟唑(simeconazole)，腈菌唑(myclobutanil)，恶霉灵(hymexazole)，抑霉唑(imazalil)，呋吡菌胺(furametpyr)，噻呋酰胺(thifluzamide)，土菌灵(etridiazole)，恶咪唑(oxpoconazole)，恶咪唑富马酸盐(oxpoconazole fumarate)，稻瘟酯(pefurazoate)，丙硫菌唑(prothioconazole)，啶斑肟(pyrifenox)，氯苯嘧啶醇(fenarimol)，氟苯嘧啶醇(nuari mol)，乙嘧酚磺酸酯(bupirimate)，嘧菌胺(mepanipyrim)，嘧菌环胺(cyprodinil)，嘧霉胺(pyrimethanil)，甲霜灵(metalaxyl)，精甲霜灵(mefenoxam)，恶霜灵(oxadixyl)，苯霜灵(benalaxyl)，硫菌灵(thiophanate)，甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)，苯菌灵(benomyl)，多菌灵(carbendazim)，麦穗宁(fuberidazole)，噻菌灵(thiabendazole)，manzeb，丙森锌(propineb)，代森锌(zineb)，代森联(metiram)，代森锰(maneb)，福美锌(ziram)，秋兰姆(thiuram)，百菌清(chlorothalonil)，噻唑菌胺(ethaboxam)，氧化萎锈灵(oxycarboxin)，萎锈灵(carboxin)，氟酰胺(flutolanil)，硅噻菌胺(silthiofam)，灭锈胺(mepronil)，烯酰吗啉(dimethomorph)，苯锈啶(fenpropidin)，丁苯吗啉(fenpropimorph)，螺环菌胺(spiroxamine)，十三吗啉(tridemorph)，十二环吗啉(dodemorph)，氟吗啉(flumorph)，嘧菌酯(azoxystrobin)，醚菌酯(kresoxim-methyl)，苯氧菌胺(metominostrobin)，肟醚菌胺(orysastrobin)，氟嘧菌酯(fluoxastrobin)，肟菌酯(trifloxystrobin)，醚菌胺(dimoxystrobin)，唑菌胺酯(pyraclostrobin)，啶氧菌酯(picoxystrobin)，异菌脲(iprodione)，腐霉利(procymidone)，乙烯菌核利(vinclozolin)，乙菌利(chlozolinate)，磺菌胺(flusulfamide)，棉隆(dazomet)，异硫氰酸甲酯(methyl isothiocyanate)，氯化苦(chloropicrin)，磺菌威(methasulfocarb)，土菌消(hydroxyisoxazole)，potassiumhydroxyisoxazole，氯唑灵(echlomezol)，D-D，威百亩(carbam)，碱式氯化铜(basiccopper chloride)，碱式硫酸铜(basic copper sulfate)，壬基苯酚磺酸铜(coppernonylphenolsulfonate)，喹啉铜(oxine copper)，DBEDC，无水硫酸铜，五水合硫酸铜，氢氧化铜，无机硫，可湿性硫磺(wettable sulfur)，石硫合剂(lime sulfur)，硫酸锌，三苯锡(fentin)，碳酸氢钠，碳酸氢钾，次氯酸钠，银，敌瘟磷(edifenphos)，甲基立枯磷(tolclofos-methyl)，三乙膦酸(fosetyl)，异稻瘟净(iprobenfos)，敌螨普(dinocap)，吡菌磷(pyrazophos)，环丙酰菌胺(carpropamid)，稻瘟酞(fthalide)，三环唑(tricyclazole)，咯喹酮(pyroquilon)，双氯氰菌胺(diclocymet)，氰菌胺(fenoxanil)，春雷霉素(kasugamycin)，有效霉素(validamycin)，多氧霉素(polyoxins)，杀稻瘟素S(blasticiden S)，土霉素(oxytetracycline)，米多霉素(mildiomycin)，链霉素(streptomycin)，油菜籽油，机油，苯噻菌胺(benthiavalicarbisopropyl)，丙森锌(iprovalicarb)，霜霉威(propamocarb)，乙霉威(diethofencarb)，唑呋草(fluoroimide)，氟菌腈(fludioxanil)，拌种咯(fenpiclonil)，喹氧灵(quinoxyfen)，恶喹酸(oxolinicacid)，百菌清(chlorothalonil)，克菌丹(captan)，灭菌丹(folpet)，烯丙苯噻唑(probenazole)，阿拉酸式苯-S-甲基(acibenzolar-S-methyl)，噻酰菌胺(tiadinil)，环氟菌胺(cyflufenamid)，环酰菌胺(fenhexamid)，二氟林(diflumetorim)，苯菌酮(metrafenone)，氟吡菌胺(picobenzamide)，丙氧喹啉(proquinazid)，恶唑菌酮(famoxadone)，氰霜唑(cyazofamid)，咪唑菌酮(fenamidone)，苯酰菌胺(zoxamide)，啶酰菌胺(boscalid)，霜脲氰(cymoxanil)，二氰蒽醌(dithianon)，氟啶胺(fluazinam)，抑菌灵(dichlofluanide)，嗪胺灵(triforine)，稻瘟灵(isoprothiolane)，嘧菌腙(ferimzone)，哒菌酮(diclomezine)，叶枯酞(tecloftalam)，戊菌隆(pencycuron)，灭螨猛(chinomethionat)，双胍辛胺乙酸盐(iminoctadine acetate)，双胍辛胺烷苯磺酸盐(iminoctadine albesilate)，代森铵(ambam)，福代锌(polycarbamate)，噻二嗪(thiadiazine)，地茂散(chloroneb)，二甲基二硫代氨基甲酸镍(nickeldimethyldithiocarbamate)，双辛胍胺(guazatine)，乙酸十二烷基胍(dodecylguanidineacetate)，五氯硝基苯(quintozene)，甲苯氟磺胺(tolylfluanid)，敌菌灵(anilazine)，间硝酞异丙酯(nitrothalisopropyl)，种衣酯(fenitropan)，甲菌定(dimethirimol)，苯噻硫氰(benthiazole)，氟联苯菌(flumetover)，双炔酰菌胺(mandipropamide)和吡噻菌胺(penthiopyrad)，或其任意组合。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子在鞘翅目昆虫的饮食中提供。例如，靶向IAP的RNAi分子可局部施用于植物或种子(例如经由浸泡、包衣、撒粉或喷雾)，或可工程化植物的细胞以表达该RNAi分子。RNAi分子也可在另一种食物或水源中提供。
植物可为经受鞘翅目昆虫侵袭的任何植物。在一些实施方案中，植物为茄科植物(例如，茄科)。茄科植物的实例包括，但不限于，马铃薯植物(Solanum tuberosum)，刺萼龙葵(buffalo bur)植物(Solanum rostratum)，茄子植物(Solanum melongena)，番茄植物(Solanum lycopersicum)，烟草植物(Nicotiana tabacum)，胡椒植物(Capsicum annum)和欧白英(woody nightshade)植物(Solanum dulcamara)。
因此，在一些实施方案中，该方法包含将例如有效量的靶向IAP的RNAi分子递送至植物(例如，马铃薯植物)以抑制鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)侵袭该植物。在其他实施方案中，该方法包含将例如有效量的靶向IAP的RNAi分子递送至刺萼龙葵植物以抑制鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)侵袭该植物。在其他实施方案中，该方法包含将例如有效量的靶向IAP的RNAi分子递送至茄子植物以抑制鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)侵袭该植物。在其它实施方案中，该方法包含将例如有效量的靶向IAP的RNAi分子递送至番茄植物以抑制鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)侵袭该植物。在进一步的实施方案中，该方法包含将例如有效量的靶向IAP的RNAi分子递送至烟草植物以抑制鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)侵袭该植物。在另外的实施方案中，该方法包含将例如有效量的靶向IAP的RNAi分子递送至胡椒植物以抑制鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)侵袭该植物。
将靶向IAP的RNAi分子递送至植物(例如，植物的一部分)和/或鞘翅目昆虫可包括，例如，将该RNAi分子或包含该RNAi分子的组合物局部施用(例如，浸泡、涂覆或撒粉)至植物的任何部分(例如，根，块茎，茎，枝，叶，花等)、地面(例如，土壤，泥土(dirt)，草等)、昆虫和/或昆虫的饮食。递送步骤还可包括对植物的细胞进行基因工程改造以表达该RNAi分子。递送步骤还可包括将植物或鞘翅目昆虫暴露于已被基因工程改造以表达RNAi分子和/或将RNAi分子递送至该植物或鞘翅目昆虫的生物体(例如，病毒、细菌、真菌等)。
有效量是单独或与一种或多种其他添加剂组合以赋予对鞘翅目昆虫的侵袭的有益效果(例如，死亡，停止摄食，抑制生长、发育或繁殖)所需的靶向IAP的RNAi分子的量。有益效果包括相对于对照，侵袭减少例如至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在一些实施方案中，该对照不存在杀虫剂(insecticide)和/或杀虫剂(pesticide)。在一些实施方案中，有效量的靶向IAP的RNAi分子完全消除了鞘翅目昆虫(例如，科罗拉多马铃薯甲虫)对植物的侵袭。
如本领域技术人员所认识到的，有效量根据具体植物、侵袭的严重性、侵袭的持续时间、先前暴露于杀虫剂等在从业者的知识和专长内的因素而变化。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用较低的有效浓度，即提供对昆虫控制的最低浓度，以提高效率并降低成本。
靶向IAP的RNAi分子的有效量也可根据递送方法而变化。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量表示为每平方厘米(cm2)的植物或地面(例如，土壤、泥土、草等)的表面的靶向IAP的RNAi分子的微克(μg)数，即，μg/cm2。因此，在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量包含0.001μg/cm2至10μg/cm2。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量包含0.001μg/cm2至9μg/cm2，0.001μg/cm2至8μg/cm2，0.001μg/cm2至7μg/cm2，0.001μg/cm2至6μg/cm2，0.001μg/cm2至5μg/cm2，0.001μg/cm2至4μg/cm2，0.001μg/cm2至3μg/cm2，0.001μg/cm2至2μg/cm2，0.001μg/cm2至1μg/cm2，0.001μg/cm2至0.1μg/cm2，或0.001μg/cm2至0.01μg/cm2。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量包含0.01μg/cm2至10μg/cm2，0.1μg/cm2至10μg/cm2，1μg/cm2至10μg/cm2，2μg/cm2至10μg/cm2，3μg/cm2至10μg/cm2，4μg/cm2至10μg/cm2，5μg/cm2至10μg/cm2，6μg/cm2至10μg/cm2，7μg/cm2至10μg/cm2，8μg/cm2至10μg/cm2，或9μg/cm2至10μg/cm2。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量表示为每英亩(ac.)的植物或地面(例如，土壤、泥土、草等)的表面的靶向IAP的RNAi分子的克(g)数，即，g/ac.。因此，在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量包含0.01g/ac.至100g/ac.。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量包含0.01g/ac.至90g/ac.，0.01g/ac.至80g/ac.，0.01g/ac.至70g/ac.，0.01g/ac.至60g/ac.，0.01g/ac.至50g/ac.，0.01g/ac.至40g/ac.，0.01g/ac.至30g/ac.，0.01g/ac.至20g/ac.，0.01g/ac.至10g/ac.，0.01g/ac.至1g/ac.，或0.01g/ac.至0.1g/ac.。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量包含0.1g/ac.达到100g/ac.，1g/ac.达到100g/ac.，10g/ac.达到100g/ac.，20g/ac.达到100g/ac.，30g/ac.达到100g/ac.，40g/ac.达到100g/ac.，50g/ac.达到100g/ac.，60g/ac.达到100g/ac.，70g/ac.达到100g/ac.，80g/ac.达到100g/ac.，或90g/ac.达到100g/ac.。
在一些实施方案中，RNAi分子控制鞘翅目昆虫的有效性可以使用该RNAi分子杀死昆虫或昆虫种群或使其死亡的能力来测定。昆虫种群的死亡率(rate of death)可通过死亡率(mortality)百分比(例如，随时间的死亡率百分比)来确定。通常，昆虫种群的死亡率百分比反映了所述种群中由于RNAi分子而已死亡的昆虫的百分比(例如，75％死亡率表明RNAi分子已经杀死了总昆虫种群的75％)。在一些实施方案中，随时间推移(例如，在将昆虫暴露于RNAi分子持续多天的过程中)测量死亡率百分比。在一些实施方案中，在暴露至少3，4，5，6，7，8，9，10，15或20天后测量死亡率百分比。在一些实施方案中，RNAi分子引起鞘翅目昆虫种群的死亡率百分比为至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％或100％。在一些实施方案中，通过靶向IAP的RNAi分子杀死鞘翅目昆虫种群的至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％或100％。在一些实施方案中，将RNAi分子的死亡率百分比与对照(例如，对照分子或未处理条件)进行比较。在一些实施方案中，RNAi分子的死亡率百分比比对照(例如，对照分子或未处理条件)高至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％或200％。
在一些实施方案中，RNAi分子控制鞘翅目昆虫的有效性可以使用RNAi分子限制鞘翅目昆虫或昆虫种群的叶圆片消耗(leaf disc consumption)的能力来确定。叶圆片消耗是指由昆虫或昆虫种群消耗或食用的植物材料(例如，茄子叶)的量(例如，百分比)。在一些实施方案中，RNAi分子引起昆虫或昆虫种群的叶圆片消耗减少至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％或100％。在一些实施方案中，将RNAi分子降低叶圆片消耗的能力与对照(例如，对照分子或未处理条件)进行比较。在一些实施方案中，随时间推移(例如，在将昆虫暴露于RNAi分子持续多天的过程中)测量叶圆片消耗。在一些实施方案中，在暴露3，4，5，6，7，8，9，10或更多天之后测量叶圆片消耗。
在一些实施方案中，RNAi分子控制鞘翅目昆虫的有效性可以使用RNAi分子降低鞘翅目昆虫或昆虫种群的植物脱叶百分比的能力来确定。植物脱叶百分比是指被昆虫或昆虫种群破坏(例如，消耗)的植物材料(例如，茄子叶)的百分比。在一些实施方案中，RNAi分子引起昆虫或昆虫种群的植物脱叶百分比降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％或100％。在一些实施方案中，RNAi分子使植物脱叶百分比降低至低于40％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，3％或1％。在一些实施方案中，在将昆虫暴露于RNAi分子之后，植物脱叶百分比保持低于40％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，3％或1％持续至少5，6，7，8，9，10，15或20天。在一些实施方案中，将RNAi分子降低植物脱叶百分比的能力相对于对照(例如，对照分子或未处理条件)进行比较。在一些实施方案中，随时间推移(例如，在将昆虫暴露于RNAi分子持续多天的过程中)测量植物脱叶百分比。在一些实施方案中，在暴露3，4，5，6，7，8，9，10或更多天之后测量植物脱叶百分比。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子可配制在溶液(例如，施用于鞘翅目昆虫和/或饮食(例如，摄入的食物和/或水)、植物或地面(例如，土壤、泥土、草等)的表面)中。在一些实施方案中，溶液中靶向IAP的RNAi分子的有效量表示为每毫升(ml)溶液中靶向IAP的RNAi分子的纳克(ng)或微克(μg)数，即，ng/ml。因此，在一些实施方案中，溶液包含10ng/ml至100μg/ml浓度的靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，溶液包含浓度为10ng/ml至100μg/ml，100ng/ml至100μg/ml，250ng/ml至100μg/ml，750ng/ml至100μg/ml，1000ng/ml至100μg/ml，10μg/ml至100μg/ml，25μg/ml至100μg/ml，50μg/ml至100μg/ml，或75μg/ml至100μg/ml的靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，溶液包含浓度为10ng/ml至100μg/ml，10ng/ml至75μg/ml，10ng/ml至50μg/ml，10ng/ml至25μg/ml，10ng/ml至10μg/ml，10ng/ml至1000ng/ml，10ng/ml至1000ng/ml，10ng/ml至750ng/ml，10ng/ml至500ng/ml，10ng/ml至250ng/ml，10ng/ml至100ng/ml，10ng/ml至75ng/ml，10ng/ml至50ng/ml，或10ng/ml至25ng/ml的靶向IAP的RNAi分子。
在一些实施方案中，溶液包含靶向IAP的RNAi分子和至少一种另外的添加剂(例如，农药、表面活性剂或其他非农药试剂)。在一些实施方案中，这种混合物包含浓度为0.0001μg/ml至10μg/ml的靶向IAP的RNAi分子(例如，其被施用至植物和/或地面(例如，土壤、泥土、草等)的表面)在一些实施方案中，这种混合物包含浓度为0.001μg/ml至10μg/ml，0.01μg/ml至10μg/ml，0.1μg/ml至10μg/ml，1μg/ml至10μg/ml，2μg/ml至10μg/ml，3μg/ml至10μg/ml，4μg/ml至10μg/ml，5μg/ml至10μg/ml，6μg/ml至10μg/ml，7μg/ml至10μg/ml，8μg/ml至10μg/ml，或9μg/ml至10μg/ml的靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，这种混合物包含浓度为0.0001μg/ml至9μg/ml，0.0001μg/ml至8μg/ml，0.0001μg/ml至7μg/ml，0.0001μg/ml至6μg/ml，0.0001μg/ml至5μg/ml，0.0001μg/ml至4μg/ml，0.0001μg/ml至3μg/ml，0.0001μg/ml至2μg/ml，0.0001μg/ml至1μg/ml，0.0001μg/ml至0.1μg/ml，0.0001μg/ml至0.01μg/ml，或0.0001μg/ml至0.001μg/ml的靶向IAP的RNAi分子。
在一些实施方案中，在昆虫的饮食中提供靶向IAP的RNAi分子。因此，在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子的有效量表示为每毫升(ml)昆虫饮食中靶向IAP的RNAi分子的微克(μg)数，即μg/ml。在一些实施方案中，昆虫的饮食包含浓度为0.001μg/ml至10μg/ml的靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，昆虫的饮食包含浓度为0.001μg/ml至9μg/ml，0.001μg/ml至8μg/ml，0.001μg/ml至7μg/ml，0.001μg/ml至6μg/ml，0.001μg/ml至5μg/ml，0.001μg/ml至4μg/ml，0.001μg/ml至3μg/ml，0.001μg/ml至2μg/ml，0.001μg/ml至1μg/ml，0.001μg/ml至0.1μg/ml，或0.001μg/ml至0.01μg/ml的浓度靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，昆虫的饮食包含浓度为0.01μg/ml至10μg/ml，0.1μg/ml至10μg/ml，1μg/ml至10μg/ml，2μg/ml至10μg/ml，3μg/ml至10μg/ml，4μg/ml至10μg/ml，5μg/ml至10μg/ml，6μg/ml至10μg/ml，7μg/ml至10μg/ml，8μg/ml至10μg/ml，或9μg/ml至10μg/ml的靶向IAP的RNAi分子。
向植物的任何部分(例如，根，块茎，茎，枝，叶，花等)、地面(例如，土壤，泥土，草等)、昆虫和/或昆虫的饮食递送靶向IAP的RNAi分子的步骤可包括将靶向IAP的RNAi分子单次施用(单次接触)或多次施用(多次接触)至植物、地面(例如，土壤，泥土，草等)、昆虫和/或昆虫的饮食。递送至植物的一部分、昆虫和/或昆虫的饮食可为喷雾(例如，加压/雾化喷雾，泵)、固体(例如，粉剂，丸剂，诱饵)或液体(例如，均质混合物诸如溶液和非均质混合物诸如悬浮液(水和油基)，胶体，胶束，乳剂)。接触时间可有所不同。在一些实施方案中，递送包括使靶向IAP的RNAi分子与植物的一部分和/或鞘翅目昆虫接触足以减少鞘翅目昆虫的生长、繁殖(例如，生育力和/或繁殖力)和/或鞘翅目昆虫的摄食和/或鞘翅目昆虫的死亡(如果有的话)的合适时间段。
在一些实施方案中，向植物和/或鞘翅目昆虫递送靶向IAP的RNAi分子之后，植物和/或鞘翅目昆虫摄取和/或吸收该靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，鞘翅目昆虫摄取靶向IAP的RNAi分子会改变鞘翅目昆虫的生物功能，从而控制鞘翅目昆虫的侵袭。鞘翅目昆虫的改变的生物功能的实例包括，但不限于，生长减少，繁殖(例如，生育力和/或繁殖力)减少，摄食减少，运动减少，发育减少，细胞修复减少和/或死亡率增加。
在一些实施方案中，递送包含将靶向IAP的RNAi分子施用于植物表面的一部分和/或与鞘翅目昆虫接触的表面(例如，地面(例如，土壤、泥土、草等)。在一些实施方案中，将靶向IAP的RNAi分子施用于表面的一部分包含向该表面或其部分喷洒、涂覆和/或撒粉。在一些实施方案中，将靶向IAP RNA的RNAi分子施用于表面的一部分包含将RNAi分子作为颗粒状或粉末状制剂进行地面浸润或施用于与植物根部相邻的土壤。
靶向IAP的RNAi分子可应用于植物的任何部分(例如，根，块茎，茎，枝，叶，花等)。在一些实施方案中，使靶向IAP的RNAi分子与植物的地上部分(例如，叶)和/或与植物的地下部分(例如，根)接触，其可包括至少一种选自由以下组成的组中的犁沟制剂(furrowformulation)：粉剂，颗粒剂，丸剂，胶囊剂，可溶性液体浓缩物，喷雾(稀释或浓缩后)，雾剂，在犁沟中，种子处理，昆虫饮食，诱饵，浸液，滴灌或适于施用至犁沟的任何其它形式。可与本文所述的靶向IAP的RNAi分子接触的植物部分包括，但不限于，叶，茎，花，果实，芽，根，种子，块茎，花药，雄蕊或花粉。在一些实施方案中，RNAi通过高压喷雾或喷砂以机械方式来递送。
在一些实施方案中，递送包含提供靶向IAP的RNAi分子以供鞘翅目昆虫饮食摄取。在一些实施方案中，接触包含提供靶向IAP的RNAi分子，其可由鞘翅目昆虫摄取或以其它方式内部吸收。在一些实施方案中，在饮食中提供靶向IAP的RNAi分子以供鞘翅目昆虫饮食摄取。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子提供于植物或植物部分中/上，或局部施用于植物或植物部分(例如，浸泡、涂覆、撒粉)。在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子在植物或植物部分中表达。
在一些实施方案中，将靶向IAP的RNAi分子递送至鞘翅目昆虫可抑制鞘翅目昆虫中内源互补核苷酸序列(例如，RNA序列)的表达(降低或抑制其表达)。在一些实施方案中，内源互补核苷酸序列为内源IAP序列。
抑制的结果可通过评估昆虫的一种或多种特性的任何合适的测定法，或通过评估指示IAP表达的分子的生物化学技术(例如，RNA，蛋白质)来证实。在一些实施方案中，本文提供的靶向IAP的RNAi分子降低IAP表达水平的程度通过将IAP的表达水平(例如，IAP的mRNA或蛋白水平)与适当对照(例如，未递送靶向IAP的RNAi分子或递送阴性对照的细胞或细胞群的IAP表达水平)进行比较来评估。在一些实施方案中，IAP表达的适当对照水平可以是预定水平或值，使得不需要每次测量对照水平。该预定水平或值可以采取多种形式。在一些实施方案中，预定水平或值可以是单个截止值，诸如中值或平均值。
在一些实施方案中，递送如本文所述的靶向IAP的RNAi分子导致昆虫细胞中IAP表达水平的降低。在一些实施方案中，IAP表达水平的降低可以是相对于对照水平降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％。在一些实施方案中，对照水平是未与RNAi分子接触的类似昆虫细胞中IAP表达的水平(或细胞群中的平均水平)。在一些实施方案中，对照水平是与靶向不被昆虫细胞表达的基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP))的RNAi分子接触的类似昆虫细胞中IAP表达的水平(或细胞群中的平均水平)。
在一些实施方案中，在有限的时间段之后评估将靶向IAP的RNAi分子递送至细胞或昆虫的效果。例如，可以在将靶向IAP的RNAi分子递送至细胞或昆虫后至少4小时，8小时，12小时，18小时，24小时；或至少1，2，3，4，5，6，7或14天，测定细胞或昆虫中IAP的水平。
在一些实施方案中，递送如本文所述的靶向IAP的RNAi分子导致昆虫的生长、繁殖(例如，生育力和/或繁殖力)和/或摄食水平的降低。在一些实施方案中，生长、繁殖(例如，生育力和/或繁殖力)和/或摄食水平的降低可相对于对照水平降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％。在一些实施方案中，对照水平是未与该RNAi分子接触的类似昆虫的生长、繁殖(例如，生育力和/或繁殖力)和/或摄食水平。在一些实施方案中，对照水平是与靶向不被昆虫细胞表达的基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP))的RNAi分子接触的类似昆虫的生长、繁殖(例如，生育力和/或繁殖力)和/或摄食水平。
在一些实施方案中，递送如本文所述的靶向IAP的RNAi分子导致昆虫种群中死亡率的增加。在一些实施方案中，死亡率水平的增加可为相对于对照增加至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％。在一些实施方案中，对照是未与RNAi分子接触的昆虫种群中的死亡率。在一些实施方案中，对照是与靶向不被昆虫细胞表达的基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP))的RNAi分子接触的昆虫种群种的死亡率。
本公开的方面提供了表达如本文所述的靶向IAP的RNAi分子的植物。在一些实施方案中，将编码本文提供的靶向IAP的RNAi分子的DNA提供至植物(植物的种子或细胞)，使得该植物表达该靶向IAP的RNAi分子。在一些实施方案中，编码靶向IAP的RNAi分子的DNA通过转基因表达在植物中表达，例如，通过将编码靶向IAP的RNAi分子的DNA稳定地整合至植物的基因组中，使得该植物表达该靶向IAP的RNAi分子。
产生靶向IAP的RNAi分子的方法
如本文提供的靶向IAP的RNAi分子可通过本领域已知的任何合适的方法产生。用于产生靶向IAP的RNAi分子的方法的实例包括，但不限于，体外转录(IVT)，化学合成，在生物体(例如，植物)中的表达或在细胞培养物(例如，植物细胞培养物)中的表达和微生物发酵。
在一些实施方案中，靶向IAP的RNAi分子可根据以下中所述的无细胞生产方法产生：于2017年10月12日公布的名称为“核糖核酸的无细胞生产(Cell-Free Production ofRibonucleic Acid)”的国际申请公布WO 2017/176963 A1；于2017年10月11日提交的名称为“用于核苷三磷酸和核糖核酸生产的方法和组合物(Methods and Compositions forNucleoside Triphosphate and Ribonucleic Acid Production)”的美国临时申请U.S.S.N.62/571,071；以及于2019年4月18日公布的名称为“用于核苷三磷酸和核糖核酸生产的方法和组合物(Methods and Compositions for Nucleoside Triphosphate andRibonucleic Acid Production)”的国际申请公布WO 2019/075167 A1；其各自通过引用并入本文。
编码本文所述靶向IAP的RNAi分子的任何合适的DNA可用于本文所述的方法中。DNA可为单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。在一些实施方案中，DNA包含一个或多个DNA表达盒，其在转录时产生单链RNA(ssRNA)分子(例如，保留单链或折叠成RNA发夹)或互补ssRNA分子，其退火产生双链RNA(dsRNA)分子。
在一些实施方案中，DNA包含与编码与IAP区段互补的RNA的核苷酸序列可操作地连接的启动子(例如，诱导型启动子)，和任选地终止子。在其它实施方案中，DNA包含与编码与IAP区段互补的RNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子(例如，诱导型启动子)和任选地终止子，以及与编码与第一RNA互补的第二RNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子(例如，诱导型启动子)和任选地终止子。在其它实施方案中，DNA包含与编码RNA的第一区域的核苷酸序列可操作地连接的启动子(例如，诱导型启动子)，接着是环区域的一个或多个核苷酸，然后是RNA的第二区域，并且任选地接着是终止子，其中RNA的第一区域与IAP的区段互补，并且第二区域与第一区域互补。在其它实施方案中，DNA包含第一链和第二链，第一链包含与编码第一RNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子(例如，诱导型启动子)和任选地终止子，第一RNA与IAP的区段互补，而第二链包含与编码第二RNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子(例如，诱导型启动子)和任选的终止子，第二RNA与第一RNA互补，其中第一启动子和第二启动子与编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列可操作地连接，并且其中编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列的双向转录产生互补RNA分子，该互补RNA分子退火形成dsRNA分子。
通常在载体诸如质粒上提供DNA，尽管可以使用其它模板形式(例如，通过聚合酶链反应(PCR)、化学合成或本领域已知的其它方法产生的线性DNA)。在一些实施方案中，在反应混合物中使用多于一种DNA。在一些实施方案中，在反应混合物中使用2，3，4，5或更多种不同的DNA。
启动子或终止子可为天然存在的序列或工程改造(例如，合成)的序列。在一些实施方案中，工程改造的序列被修饰以增强转录活性。在一些实施方案中，启动子是天然存在的序列。在其他实施方案中，启动子是工程改造的序列。在一些实施方案中，终止子是天然存在的序列。在其它实施方案中，终止子是工程改造的序列。
实施例
为了可以更充分地理解本文所述的发明，阐述了以下实施例。提供本申请中描述的实施例以说明本文提供的方法、组合物和系统，并且不以任何方式解释为限制其范围。
以下实施例中使用的双链RNA(dsRNA)分子如下，其序列示于表8中。
GS3：一条由SEQ ID NO:21的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:39的序列组成的另一条RNA链结合。GS3靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸750-1181编码的mRNA。
GS4：一条由SEQ ID NO:22的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:40的序列组成的另一条RNA链结合。GS4靶向由gfp编码的mRNA。
GS167：一条由SEQ ID NO:23的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:41的序列组成的另一条RNA链结合。GS167靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸1-521编码的mRNA。
GS168：一条由SEQ ID NO:24的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:42的序列组成的另一条RNA链结合。GS168靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸522-1044编码的mRNA。
GS169：一条由SEQ ID NO:25的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:43的序列组成的另一条RNA链结合。GS169靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸1045-1564编码的mRNA。
GS170：一条由SEQ ID NO:26的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:44的序列组成的另一条RNA链结合。GS170与GS3具有70％的序列同一性，GS3靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸750-1181编码的mRNA。
GS171：一条由SEQ ID NO:27的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:45的序列组成的另一条RNA链结合。GS171与GS3具有75％的序列同一性，GS3靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸750-1181编码的mRNA。
GSl72：一条由SEQ ID NO:28的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:46的序列组成的另一条RNA链结合。GS172与GS3具有80％的序列同一性，GS3靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸750-1181编码的mRNA。
GS173：一条由SEQ ID NO:29的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:47的序列组成的另一条RNA链结合。GS173与GS3具有85％的序列同一性，GS3靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸750-1181编码的mRNA。
GS174：一条由SEQ ID NO:30的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:48的序列组成的另一条RNA链结合。GS174与GS3具有90％的序列同一性，GS3靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸750-1181编码的mRNA。
GS175：一条由SEQ ID NO:31的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:49的序列组成的另一条RNA链结合。GS175与GS3具有95％的序列同一性，GS3靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸750-1181编码的mRNA。
GS176：一条由SEQ ID NO:32的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:50的序列组成的另一条RNA链结合。GS176靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸909-1108编码的mRNA。
GS177：一条由SEQ ID NO:33的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:51的序列组成的另一条RNA链结合。GS177靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸934-1083编码的mRNA。
GS178：一条由SEQ ID NO:34的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:52的序列组成的另一条RNA链结合。GS178靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸959-1058编码的mRNA。
GS179：一条由SEQ ID NO:35的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:53的序列组成的另一条RNA链结合。GS179靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸984-1033编码的mRNA。
GS180：一条由SEQ ID NO:36的序列组成的RNA链与由SEQ ID NO:54的序列组成的另一条RNA链结合。GS180靶向由SEQ ID NO:1的DNA序列的核苷酸996-1020编码的mRNA。
实施例1：IAP RNAi组合物杀死科罗拉多马铃薯甲虫
为了评估IAP RNAi多核苷酸(SEQ ID NO:21和39)对科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)的作用，将包含IAP RNAi多核苷酸(下文称为“GS3”)的组合物(例如，包含水)处理(浓度为10μg/cm2)至马铃薯植物的叶上。与少于10％的CPB在暴露于阴性对照(GS4)叶后死亡相比，在9天暴露于GS3覆盖的马铃薯植物叶后，多达90％的CPB死亡(图1A)。这种响应于暴露于GS3而增加的死亡率也导致马铃薯叶消耗减少至接近0％(图1B)。马铃薯叶消耗百分比是指用RNAi组合物处理马铃薯叶圆片(从马铃薯叶中冲出)并且随后将这些圆片暴露于例如科罗拉多马铃薯甲虫之后的圆片的百分比。
还进行了GS3组合物的剂量滴定，以确定较低浓度的IAP RNAi多核苷酸在控制CPB中是否同样有效。与1.0μg/cm2的对照(GS4)组合物相比，在暴露于1.0μg/cm2和0.1μg/cm2的GS3三天后，多达90％的CPB死亡，在暴露于0.01μg/cm2的GS3三天后，约70％的CPB死亡，且在暴露于0.001μg/cm2的GS3三天后，约15％的CPB死亡(图2A)。当CPB暴露于1.0μg/cm2和0.1μg/cm2的GS3时，马铃薯叶消耗也降低至接近0％，而CPB暴露于0.01μg/cm2的GS3时CPB仅消耗约20％的马铃薯叶，且CPB暴露于0.001μg/cm2的GS3时CPB消耗约60％的马铃薯叶(图2B)。
与暴露于对照的CPB相比，将CPB暴露于低至0.1μg/cm2浓度的施用于马铃薯叶的IAP RNAi多核苷酸导致90％的死亡率和95％减少的马铃薯叶消耗。
实施例2：将IAP RNAi组合物应用于植物以控制科罗拉多马铃薯甲虫
测试了包含实施例1的IAP RNAi多核苷酸(GS3)的组合物在控制马铃薯植株上的科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)数目方面的有效性。简而言之，GS3组合物(例如，0.06g/L)、包含
Figure BDA0003073106330000391
(+对照；已知杀死CPB的试剂)的组合物施用于马铃薯植株的叶，或不进行处理(-对照)。还测试了灌溉(约500ml水/株植物，模拟1/2英寸降雨)对GS3组合物功效的影响。相对于未经处理的马铃薯植株，在用GS3处理的马铃薯植株中，不管灌溉如何，每株植物的CPB幼虫数量减少约90％(图3A)。相对于未处理的马铃薯植株，当植物用GS3处理时，不管灌溉如何，马铃薯植株的脱叶百分比也降低约90％(图3B)。
与暴露于未经处理的马铃薯植物的CPB相比，将CPB暴露于施用于马铃薯植株的GS3组合物中的IAP RNAi多核苷酸使每株植物活幼虫数目和植物脱叶率降低约90％。
实施例3：跨越IAP基因长度的IAP RNAi组合物在控制科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)侵袭中是有效的
评估了共同与由鞘翅目IAP基因(SEQ ID NO:1)编码的信使RNA(mRNA)(SEQ IDNO:19)的全长结合的四个dsRNA分子对控制科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)侵袭的有效性。本实施例中使用的dsRNA分子为：GS3、GS167、GS168、GS169和阴性对照分子(GS4)。
对于每种dsRNA，从茄子植物上切下四片叶(约20天龄)，用0.5μg/μL dsRNA涂覆，并干燥约30分钟。将四片叶中的每一片置于湿滤纸上的四个不同培养皿(100mm×15mm)中。对于每个培养皿，将5只“第二龄”CPB幼虫放置在每片叶的顶部上，并将培养皿保持在室温下。在第3天(72小时后)和第6天(144小时后)，将新的dsRNA处理的叶片置于培养皿中。在第3、6、7、8和9天的每个实验中计数CPB昆虫的总数。为了测定由每种dsRNA引起的死亡率，在第2天建立活CPB昆虫的初始计数。假定在第2天已经死亡的任何CPB昆虫由于处理条件或初始昆虫健康状况而死亡。使用不同批次的昆虫在不同周时重复每个dsRNA实验，每个都包含四种不同的叶培养皿。
所有测试的与鞘翅目IAP基因编码的mRNA结合的dsRNA分子(GS3、GS167、GS168和GS169)在CPB昆虫中引起了显著的时间依赖性死亡(表1-2)。暴露9天后，GS3在CPB昆虫中造成平均93％的死亡率；GS167在CPB昆虫中造成平均91％的死亡率；GS168在CPB昆虫中造成平均83％的死亡率；以及GS168在CPB昆虫中造成平均69％的死亡率。相反，阴性对照(GS4)仅引起平均26％的死亡率(图5)。
表2.靶向IAP基因长度的dsRNA分子引起的平均死亡率(联合重复)
Figure BDA0003073106330000411
实施例4：最小长度(49-200个核苷酸)的IAP RNAi组合物可有效控制科罗拉多马铃薯甲虫
评估了五种dsRNA分子对控制科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)的有效性，该dsRNA分子包含与由鞘翅目IAP基因(例如，SEQ ID NO:1)编码的信使RNA(mRNA)(例如，SEQ ID NO:19)结合的最小长度(49-200个核苷酸)的序列。所评估的dsRNA分子为：GS176、GS177、GS178、GS179、GS180、GS3和阴性对照(GS4)。
根据实施例3中描述的程序用GS4和GS3对GS176、GS177和GS178进行了测试。
GS179和GS193使用十二片茄子叶以浓度0.027μg/μL的GS4和GS3进行了测试，每片叶具有单个“第二龄”CPB幼虫。GS179和GS180包含与IAP mRNA互补的序列，其侧翼为T7启动子和限制性位点。
所有测试的包含与鞘翅目IAP基因编码的mRNA结合的100-200个核苷酸的dsRNA分子(GS176、GS177、GS178)在CPB昆虫中引起显著的时间依赖性死亡(表2)。暴露9天后，200个核苷酸长度的dsRNA分子(GS176)在CPB昆虫中造成平均89％的死亡率；150个核苷酸长度的dsRNA分子(GS177)在CPB昆虫中造成平均95％的死亡率；100个核苷酸长度的dsRNA分子(GS178)在CPB昆虫中造成平均89％的死亡率。这三种dsRNA分子中的每一种都以与432个核苷酸长度的dsRNA分子(GS3)相似的水平起控制/杀死CPB昆虫的作用。相反，阴性对照(GS4)仅引起平均26％的死亡率(图6A)。
分别包含49个核苷酸(GS179)和74个核苷酸(GS193)的dsRNA分子在CPB昆虫中引起时间依赖性死亡(表5)。暴露8天后，49个核苷酸长度的dsRNA分子(GS179)在CPB昆虫中造成平均56％的死亡率；74个核苷酸长度的dsRNA分子(GS180)在CPB昆虫中造成平均60％的死亡率。阴性对照(GS4)引起平均10％的死亡率(图6B)。
表2.由包含靶向IAP基因的100-200个核苷酸的dsRNA分子引起的两个生物学重复的平均死亡率(联合重复)
Figure BDA0003073106330000421
表3.由包含与靶IAP mRNA基因互补结合的25-50个核苷酸的dsRNA分子引起的死亡率
Figure BDA0003073106330000422
Figure BDA0003073106330000431
实施例5：包含与IAP mRNA具有90％互补性的序列的IAP RNAi组合物可有效控制科罗拉多马铃薯甲虫
将与由鞘翅目IAP基因编码的信使RNA(mRNA)结合的432个核苷酸的dsRNA(GS3)进行突变，以评估包含错配的dsRNA分子控制/杀死CPB昆虫的能力。评估的dsRNA分子为dsRNA，其：(1)与GS3具有70％的序列同一性(GS170)；(2)与GS3具有75％的序列同一性(GS171)；(3)与GS3具有80％的序列同一性(GS172)；(4)与GS3具有85％的序列同一性(GS173)；(5)与GS3具有90％的序列同一性(GS174)；以及与GS3具有95％的序列同一性(GS175)。GS170的序列与IAP基因编码的mRNA是70％互补的；GS171与IAP基因编码的mRNA是75％互补的；GS172与IAP基因编码的mRNA是80％互补的；GS173与IAP基因编码的mRNA是85％互补的；GS174与IAP基因编码的mRNA是90％互补的；以及GS175与IAP基因编码的mRNA是95％互补的。
根据实施例3中描述的程序用GS4和GS3对所有dsRNA分子进行了测试。
GS174和GS175(其分别与IAP基因编码的mRNA是90％和95％互补的)在CPB昆虫中引起时间依赖性死亡(表6-7)。暴露9天后，GS174在CPB昆虫中造成平均75％的死亡率；而GS175在CPB昆虫中造成平均84％的死亡率。这些dsRNA分子中的每一个以与与由IAP基因编码的mRNA 100％互补的dsRNA分子(GS3)相似的水平起到控制/杀死CPB昆虫的作用(图7)。
表4.由包含与IAP基因编码的mRNA具有可变互补性的序列的dsRNA分子引起的两个生物学重复的平均死亡率(联合重复)
Figure BDA0003073106330000432
Figure BDA0003073106330000441
实施例6：示例性IAP RNAi组合物在田间试验中控制科罗拉多马铃薯甲虫
在三个露天田间试验中评估了与由鞘翅目IAP基因编码的信使RNA(mRNA)结合的432个核苷酸的dsRNA(GS3)控制CPB昆虫的能力。简而言之，在每个田间试验中，将包含GS3的组合物(2-4克/英亩)、一种或多种包含
Figure BDA0003073106330000442
(73克/英亩)、
Figure BDA0003073106330000443
(88克/英亩)和/或NOVODORTM(161M Bio En/ha)的阳性对照组合物(标准品)施用于在露天田地中的马铃薯或茄子植物的叶，或不进行处理(阴性对照)。将每种RNAi组合物(GS3)以5天的间隔四次施用于叶片，或以7天的间隔三次施用于叶片。在七天的间隔内，对叶片三次施用标准品(第0、7和14天)。在第一次施用后第2、6、13和20天评估马铃薯叶的脱叶百分比，并且在第一次施用后第5、14和21天评估茄子叶的脱叶百分比。
在田间试验#1(图9A)中，未经处理的马铃薯植物在第20天脱叶率为39％。相反，用GS3处理的马铃薯植物在第20天脱叶率为10％；用标准品(例如
Figure BDA0003073106330000451
和
Figure BDA0003073106330000452
)处理的植物在第20天脱落率小于5％。
在田间试验#2(图9B)中，未经处理的马铃薯植物在第20天脱叶率为48％。相反，用GS3处理的马铃薯植物在第20天脱叶率为约10％；用标准品(例如
Figure BDA0003073106330000453
NOVODORTM)处理的植物在第20天脱落率小于5％。
在田间试验#3(图9C)中，未经处理的茄子植物在第21天脱叶率为45％。相反，用GS3处理的茄子植物在第21天脱叶率为15％，而用标准品(例如
Figure BDA0003073106330000454
和
Figure BDA0003073106330000455
)处理的植物在第21天脱叶率小于10％。
这些数据表明，当施用于露天田地(例如，作物田地)中的植物叶时，施用本公开的IAP RNAi组合物可防止植物(例如，马铃薯或茄子植物)脱叶。
其它实施方案
以下编号的段落涵盖了本公开的其他实施方案。
1.一种多核苷酸分子，其靶向鞘翅目凋亡抑制剂(IAP)基因，其中所述多核苷酸分子选自由以下组成的组：
多核苷酸分子，其与由包含SEQ ID NO:1的序列的脱氧核酸(DNA)编码的信使RNA(mRNA)结合并抑制其表达；
多核苷酸分子，其与包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的序列的mRNA结合并抑制其表达；
多核苷酸分子，其包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:39的序列具有至少80％同一性的序列；以及
多核苷酸分子，其包含含有至少18个连续核苷酸的区段，其中所述区段与SEQ IDNO:21或SEQ ID NO:39的序列的区段具有至少90％的同一性。
2.根据段1所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子与SEQ ID NO:21的序列结合。
3.根据段1或2所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:39的序列具有至少85％，至少90％，至少95％，或至少98％同一性的序列。
4.根据段1或2所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包含含有至少18个连续核苷酸的区段，其中所述区段与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:39的序列具有至少95％或至少98％的同一性。
5.根据段3或4所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:39的序列。
6.根据段1-5中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子为单链RNA(ssRNA)分子，其任选地包含SEQ ID NO:39的序列或SEQ ID NO:39的区段。
7.根据段6所述的多核苷酸分子，其中所述ssRNA分子选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)和反义RNA。
8.根据段1-5中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子为双链RNA(dsRNA)分子，其任选地包含SEQ ID NO:21的序列或SEQ ID NO:21的区段。
9.一种多核苷酸，其特异性抑制鞘翅目凋亡抑制剂(IAP)基因表达，其中所述多核苷酸包含第一链，所述第一链包含SEQ ID NO:21或23-36中任一个的序列。
10.一种多核苷酸，其特异性抑制鞘翅目凋亡抑制剂(IAP)基因表达，其中所述多核苷酸包含含有SEQ ID NO:39或41-54任一个的序列的链。
11.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:21的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:39的序列组成的第二链。
12.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:23的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:41的序列组成的第二链。
13.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:24的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:42的序列组成的第二链。
14.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:25的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:43的序列组成的第二链。
15.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:26的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:44的序列组成的第二链。
16.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:27的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:45的序列组成的第二链。
17.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:28的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:46的序列组成的第二链。
18.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:29的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:47的序列组成的第二链。
19.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:30的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:48的序列组成的第二链。
20.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:31的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:49的序列组成的第二链。
21.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:32的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:50的序列组成的第二链。
22.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:33的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:51的序列组成的第二链。
23.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:34的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:52的序列组成的第二链。
24.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:35的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:53的序列组成的第二链。
25.根据段9所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含由SEQ ID NO:36的序列组成的第一链，其任选地进一步包含由SEQ ID NO:54的序列组成的第二链。
26.一种组合物，其包含段1-25中任一项所述的多核苷酸分子。
27.根据段26所述的组合物，其中所述组合物进一步包含添加剂，所述添加剂选自由以下组成的组：昆虫饲料、昆虫引诱剂、信息素、蛋白质、碳水化合物、聚合物和农药。
28.一种用于控制鞘翅目侵袭的方法，所述方法包含使植物、地面、鞘翅目昆虫或鞘翅目昆虫的饮食与根据段1-25中任一项所述的多核苷酸分子或根据段26或27所述的组合物接触。
29.根据段28所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫属于选自由以下组成的组的物种：金花虫属种(Leptinotarsa spp.)，条跳甲属种(Phyllotreta spp.)，Cerotoma属种，Diabrotica属种，拟谷盗属种(Tribolium spp.)，花象属种(Anthonomus spp.)以及Alticini属种。
30.根据段28或29所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫为金花虫属种昆虫。
31.根据段30所述的方法，其中所述金花虫属种昆虫为科罗拉多马铃薯甲虫。
32.根据段28-31中任一段所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：茄科(Solanaceae)植物、十字花科(Brassicaceae)植物、禾本科(Poaceae)植物、葫芦科(Cucurbitaceae)植物、豆科(Fobaceae)植物、伞形科(Apiaceae)植物、苋科(Amaranthaceae)植物以及锦葵科(Malvaceae)植物。
33.根据段28-32中任一项所述的方法，其中所述方法损害所述鞘翅目昆虫的生长、繁殖和/或摄食。
34.根据段28-32中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述鞘翅目昆虫的死亡。
35.一种生产用于昆虫控制的多核苷酸的方法，所述方法包含：
(a)在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)和核糖核酸酶，并产生5′核苷单磷酸(5′NMP)；
(b)消除所述核糖核酸酶；以及
(c)在所述反应混合物中或在第二反应混合物中温育所述5'NMP、多磷酸盐激酶、多磷酸盐、聚合酶和脱氧核糖核酸(DNA)模板，所述DNA模板与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性或编码RNA序列，所述RNA序列包含含有18个连续核苷酸的区段，其中所述区段与SEQID NO:2的序列的区段具有至少90％的同一性，并产生目的RNA，任选地其中所述步骤(c)的反应混合物还包含核苷激酶、NMP激酶和/或NDP激酶。
36.根据段35所述的方法，其中所述细胞RNA包含核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。
37.根据段35或36所述的方法，其中所述多磷酸盐激酶选自PPK1家族酶和PPK2家族酶，并且任选地其中所述多磷酸盐激酶包含来自中度嗜热菌(Deinococcusgeothermalis)的III类多磷酸盐激酶2。
38.根据段35-37中任一项所述的方法，其中所述多磷酸盐包含六偏磷酸盐。
39.根据段35所述的方法，其中所述DNA模板是与编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列可操作地连接的启动子，并且任选地为转录终止子。
40.根据段39所述的方法，其中所述DNA模板进一步包含第二模板，所述第二模板包含与编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列的反向互补序列可操作地连接的启动子，其中所述两个单独的RNA分子退火以形成dsRNA分子。
41.根据段35所述的方法，其中所述DNA模板是与编码以下各项的核苷酸序列可操作地连接的启动子：(a)所需IAP RNA，(b)RNA转录物的环区域的一个或多个核苷酸，(c)编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列的反向互补序列以及任选的转录终止子。
42.根据段35所述的方法，其中所述DNA模板包含：
a.第一启动子，
b.编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列，
c.第二启动子，以及
d.任选地，一种或多种转录终止子，
其中所述第一启动子和第二启动子与编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列可操作地连接，并且其中所述编码所需靶向IAP的RNA的核苷酸序列的双向转录产生互补RNA分子，所述互补RNA分子退火以形成dsRNA分子
43.根据段35所述的方法，其中所述核糖核酸酶、多磷酸盐激酶、DNA模板和/或聚合酶由表达所述核糖核酸酶、多磷酸盐激酶、DNA模板和/或聚合酶的细胞制备。
44.根据段35所述的方法，其中(a)的反应混合物包含由表达所述核糖核酸酶、多磷酸盐激酶、DNA模板和/或聚合酶的细胞制备的细胞裂解物。
45.根据段35所述的方法，其中步骤(b)包含通过温度、pH、盐、洗涤剂(detergent)、醇和/或化学抑制剂消除细胞裂解物中的核糖核酸酶和天然酶活性。
46.根据段35所述的方法，其中步骤(b)包含通过分离、沉淀、过滤、捕获和/或色谱法消除所述细胞裂解物中酶的天然酶活性。
47.根据段35所述的方法，其中步骤(b)包含通过遗传修饰、从细胞分泌酶和/或蛋白酶靶向消除所述细胞裂解物中酶的天然酶活性。
48.根据段45-47中任一项所述的方法，其中所述天然酶活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶和水解酶。
49.根据段45-48中任一项所述的方法，其中所述多磷酸盐激酶和/或聚合酶可以承受消除条件。
50.根据段35所述的方法，其中所述聚合酶包含至少一种RNA聚合酶。
51.一种双链核糖核酸(dsRNA)，其包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少80％同一性的序列。
52.根据段51所述的dsRNA，其包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％或至少95％同一性的序列。
53.根据段51所述的dsRNA，其包含SEQ ID NO:3的序列。
54.一种组合物，其包含根据段51-53中任一项所述的dsRNA，其任选地以0.001μg/cm2至10μg/cm2的浓度配制。
55.根据段28所述的方法，其中所述接触步骤包含将所述多核苷酸以至少0.001μg/cm2的浓度施加至所述植物的表面、地面、鞘翅目昆虫或鞘翅目昆虫的饮食。
56.根据段55所述的方法，其中所述接触步骤包含将所述多核苷酸以0.001μg/cm2至10μg/cm2的浓度施加至所述植物的表面、地面、鞘翅目昆虫或鞘翅目昆虫的饮食。
57.根据段56所述的方法，其中所述接触步骤包含将所述多核苷酸以0.001μg/cm2至0.1μg/cm2的浓度施加至所述植物的表面、地面、鞘翅目昆虫或鞘翅目昆虫的饮食。
58.根据段55-57中任一项所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天，少于9天，少于8天，少于7天，少于6天或少于5天后，所述鞘翅目昆虫的死亡率百分比增加至至少30％。
59.根据段58所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天，少于9天，少于8天，少于7天或少于6天后，所述鞘翅目昆虫的死亡率百分比增加至至少40％。
60.根据段59所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天，少于9天，少于8天或少于7天后，所述鞘翅目昆虫的死亡率百分比增加至至少50％。
61.根据段60所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10，少于9或少于8天后，所述鞘翅目昆虫的死亡率百分比增加至至少60％或至少70％。
62.根据段60所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天或少于9天后，所述鞘翅目昆虫的死亡率百分比增加至至少90％。
63.根据段55-62中任一项所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天，少于9天，少于8天，少于7天，少于6天或少于5天后，叶圆片消耗减少至小于20％。
64.根据段63所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天，少于9天，少于8天，少于7天，少于6天或少于5天后，叶圆片消耗减少至小于10％。
65.根据段55-64中任一项所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天，少于9天，少于8天，少于7天，少于6天，少于5天或少于4天后，植物脱叶百分比降低至小于10％。
66.根据段55-65中任一项所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸之后至少10天，至少15天或至少20天后，植物脱叶百分比保持小于10％。
表8.序列，5′→3′
Figure BDA0003073106330000521
Figure BDA0003073106330000531
Figure BDA0003073106330000541
Figure BDA0003073106330000551
Figure BDA0003073106330000561
Figure BDA0003073106330000571
Figure BDA0003073106330000581
Figure BDA0003073106330000591
Figure BDA0003073106330000601
Figure BDA0003073106330000611
Figure BDA0003073106330000621
Figure BDA0003073106330000631
Figure BDA0003073106330000641
Figure BDA0003073106330000651
Figure BDA0003073106330000661
Figure BDA0003073106330000671
Figure BDA0003073106330000681
Figure BDA0003073106330000691
Figure BDA0003073106330000701
*由于部分T7启动子和限制位点，两个序列均比实际靶序列长24bp。
等同物和范围
在权利要求中，冠词如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”可表示一个或多于一个，除非有相反的指示或从上下文明显看出。如果在给定产品或方法中存在、使用或以其他方式与之相关的一个、一个以上或所有组成员，则在组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书被认为是令人满意的，除非有相反的指示或从上下文明显看出。本发明包括其中该组中正好一个成员存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或以其它方式与给定产品或方法相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或所有组成员存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或以其它方式与给定产品或方法相关的实施方案。
此外，本发明涵盖其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限定、要素、条款和描述性术语引入到另一权利要求中的所有变型、组合和置换。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求可被修改为包括在从属于同一基础权利要求的任何其它权利要求中发现的一个或多个限定。其中元素以例如马库什(Markush)组格式列表表示的情况下，还公开了元素的每个子组，并且可从该组中移除任何一个或多个元素。应当理解，通常，在本发明或本发明的方面被称为包含特定元素和/或特征的情况下，本发明或本发明的方面的某些实施方案由这样的元素和/或特征组成或基本上由这样的元素和/或特征组成。为了简单起见，那些实施方案没有在本文中具体阐述。
还要注意的是，术语“包含”和“含有”旨在是开放的，并允许包括其他元素或步骤。在给出范围的地方，包括端点。此外，除非另外指明或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则在本发明的不同实施方案中表示为范围的值可以假定所述范围内的任何特定值或子范围，至所述范围的下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确指出。
本申请涉及各种公布的专利、公布的专利申请、期刊文章以及其它出版物，所有这些文献通过引用并入本文。如果任何并入的参考文献与本说明书存在冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术的本发明的任何特定实施方案可以被明确地排除在任何一个或多个权利要求之外。因为这样的实施方案被认为是本领域的普通技术人员已知的，所以即使在此没有明确阐述该排除，也可以将它们排除。无论由于何种原因，本发明的任何特定实施方案均可以从任何权利要求中排除，无论是否涉及现有技术的存在。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文中所描述的特定实施方案的许多等同物。本文描述的本实施方案的范围不旨在限于以上描述，而是如在所附权利要求书中阐述的。本领域的普通技术人员将理解，在不脱离如以下权利要求所限定的本发明的精神或范围的情况下，可以对本说明书进行各种改变和修改。
序列表
<110> 绿光生物科技股份有限公司
<120> 鞘翅目昆虫的控制
<130> G0830.70028WO00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/737,041
<151> 2018-09-26
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
ctaatgcatt gcgttgttca gatacaaacg tacgtgcagt tcagttcagt tcagttctcg 60
tatcgctagt ttgtcggagc aattggttca cttggtattt ggggcgattt taacgtgttt 120
tttacgaagg atcttataaa aatcatgcag tgttacagca tcatattttt tggtactgag 180
aaggcatgaa aatgaatcaa acatttccca caatcagcag ttactctgat cagacagaca 240
ataaccccaa acataaaagt ttttttgaag taaacgtcaa caattccgca ttggaggcga 300
gactgagaac atttgacaat tggccaagca cacaactatc caaggaagcg ctcgcgtctg 360
ccggttttga atacactgga caagatgaca ttgttttgtg tcgtttctgt aagatagaag 420
gatacaattg ggtatctgga gatgatccaa tggcagacca tcgagaatgg agtcctgact 480
gtccttttat tagaactgta gagaacggca ggtctgggag taatagaaac gcagatactt 540
gtggactgta cggcatagag gttcttccaa attccctccc ggaggacagg agatccattg 600
atttgcaaca gttgggaatc cacaaaggaa gtggaccaca caaccaggat aaaataacgg 660
taaatagtcg actagcaacg ttcgaaaact ggcccaagtc catcaagcag agacccgttg 720
atttggcaga agcgggattt tattataccg gtgtgggaga ccagacactt tgtttctact 780
gtggtggtgg tctaaaagac tgggaagaat ctgacgaacc ttgggaacaa cacgcccttt 840
ggttcagcaa gtgtgttttt ctaaatttga aaaaaggtaa agactttgtc gaaaaggtca 900
aacagagggc agaccctctc ttgtcgctcc ccggaacaag tcaagacaag accaaagagc 960
tagaagaacc taaagagccc tgcagtagga ctccagaaaa ggctgaaaag actactgaaa 1020
cggaagcaac agagaagact ttgtgtaaaa tctgttataa aaacgaactt ggtgttgtat 1080
tcttgccttg tggacatgtt gttgcttgtg tagattgtgc ttctgctttg aaaacttgtg 1140
ctgtctgtag gaaacctttg gaagcgacag ttcgagcatt tctctcataa tttttccatt 1200
ctttaatttt cgtttctcag atctagtcaa tttgaatttg attcttgaag gtttattaaa 1260
aagttttgtc aaaaattatt cttttcttgt tttaggatta gaagtaaatc tatttttata 1320
caatctgagt acaaattcca catacttttt tagttataag tttgaagcgc ttatgaaaca 1380
tacttttagt tcattaatga ctgcaaacca tatctttcgt acactaatac ttattagtta 1440
tcaagctctc gtgagtggaa cttccttatt agaacatttt attataaaac tgacacagag 1500
atatatctgt atgtttgtgt gtatgttcac taagtatgct aataatataa taatttatga 1560
aaaa 1564
<210> 2
<211> 1453
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
ctaatgcatt gcgttgttca gatacaaacg tacgtgcagt tcagttcagt tcagttctcg 60
tatcgctagt tggcatgaaa atgaatcaaa catttcccac aatcagcagt tactctgatc 120
agacagacaa taaccccaaa cataaaagtt tttttgaagt aaacgtcaac aattccgcat 180
tggaggcgag actgagaaca tttgacaatt ggccaagcac acaactatcc aaggaagcgc 240
tcgcgtctgc cggttttgaa tacactggac aagatgacat tgttttgtgt cgtttctgta 300
agatagaagg atacaattgg gtatctggag atgatccaat ggcagaccat cgagaatgga 360
gtcctgactg tccttttatt agaactgtag agaacggcag gtctgggagt aatagaaacg 420
cagatacttg tggactgtac ggcatagagg ttcttccaaa ttccctcccg gaggacagga 480
gatccattga tttgcaacag ttgggaatcc acaaaggaag tggaccacac aaccaggata 540
aaataacggt aaatagtcga ctagcaacgt tcgaaaactg gcccaagtcc atcaagcaga 600
gacccgttga tttggcagaa gcgggatttt attataccgg tgtgggagac cagacacttt 660
gtttctactg tggtggtggt ctaaaagact gggaagaatc tgacgaacct tgggaacaac 720
acgccctttg gttcagcaag tgtgtttttc taaatttgaa aaaaggtaaa gactttgtcg 780
aaaaggtcaa acagagggca gaccctctct tgtcgctccc cggaacaagt caagacaaga 840
ccaaagagct agaagaacct aaagagccct gcagtaggac tccagaaaag gctgaaaaga 900
ctactgaaac ggaagcaaca gagaagactt tgtgtaaaat ctgttataaa aacgaacttg 960
gtgttgtatt cttgccttgt ggacatgttg ttgcttgtgt agattgtgct tctgctttga 1020
aaacttgtgc tgtctgtagg aaacctttgg aagcgacagt tcgagcattt ctctcataat 1080
ttttccattc tttaattttc gtttctcaga tctagtcaat ttgaatttga ttcttgaagg 1140
tttattaaaa agttttgtca aaaattattc ttttcttgtt ttaggattag aagtaaatct 1200
atttttatac aatctgagta caaattccac atactttttt agttataagt ttgaagcgct 1260
tatgaaacat acttttagtt cattaatgac tgcaaaccat atctttcgta cactaatact 1320
tattagttat caagctctcg tgagtggaac ttccttatta gaacatttta ttataaaact 1380
gacacagaga tatatctgta tgtttgtgtg tatgttcact aagtatgcta ataatataat 1440
aatttatgaa aaa 1453
<210> 3
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
ggtgtgggag accagacact ttgtttctac tgtggtggtg gtctaaaaga ctgggaagaa 60
tctgacgaac cttgggaaca acacgccctt tggttcagca agtgtgtttt tctaaatttg 120
aaaaaaggta aagactttgt cgaaaaggtc aaacagaggg cagaccctct cttgtcgctc 180
cccggaacaa gtcaagacaa gaccaaagag ctagaagaac ctaaagagcc ctgcagtagg 240
actccagaaa aggctgaaaa gactactgaa acggaagcaa cagagaagac tttgtgtaaa 300
atctgttata aaaacgaact tggtgttgta ttcttgcctt gtggacatgt tgttgcttgt 360
gtagattgtg cttctgcttt gaaaacttgt gctgtctgta ggaaaccttt ggaagcgaca 420
gttcgagcat tt 432
<210> 4
<211> 524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acgg 524
<210> 5
<211> 521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
ctaatgcatt gcgttgttca gatacaaacg tacgtgcagt tcagttcagt tcagttctcg 60
tatcgctagt ttgtcggagc aattggttca cttggtattt ggggcgattt taacgtgttt 120
tttacgaagg atcttataaa aatcatgcag tgttacagca tcatattttt tggtactgag 180
aaggcatgaa aatgaatcaa acatttccca caatcagcag ttactctgat cagacagaca 240
ataaccccaa acataaaagt ttttttgaag taaacgtcaa caattccgca ttggaggcga 300
gactgagaac atttgacaat tggccaagca cacaactatc caaggaagcg ctcgcgtctg 360
ccggttttga atacactgga caagatgaca ttgttttgtg tcgtttctgt aagatagaag 420
gatacaattg ggtatctgga gatgatccaa tggcagacca tcgagaatgg agtcctgact 480
gtccttttat tagaactgta gagaacggca ggtctgggag t 521
<210> 6
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
aatagaaacg cagatacttg tggactgtac ggcatagagg ttcttccaaa ttccctcccg 60
gaggacagga gatccattga tttgcaacag ttgggaatcc acaaaggaag tggaccacac 120
aaccaggata aaataacggt aaatagtcga ctagcaacgt tcgaaaactg gcccaagtcc 180
atcaagcaga gacccgttga tttggcagaa gcgggatttt attataccgg tgtgggagac 240
cagacacttt gtttctactg tggtggtggt ctaaaagact gggaagaatc tgacgaacct 300
tgggaacaac acgccctttg gttcagcaag tgtgtttttc taaatttgaa aaaaggtaaa 360
gactttgtcg aaaaggtcaa acagagggca gaccctctct tgtcgctccc cggaacaagt 420
caagacaaga ccaaagagct agaagaacct aaagagccct gcagtaggac tccagaaaag 480
gctgaaaaga ctactgaaac ggaagcaaca gagaagactt tg 522
<210> 7
<211> 521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
tgtaaaatct gttataaaaa cgaacttggt gttgtattct tgccttgtgg acatgttgtt 60
gcttgtgtag attgtgcttc tgctttgaaa acttgtgctg tctgtaggaa acctttggaa 120
gcgacagttc gagcatttct ctcataattt ttccattctt taattttcgt ttctcagatc 180
tagtcaattt gaatttgatt cttgaaggtt tattaaaaag ttttgtcaaa aattattctt 240
ttcttgtttt aggattagaa gtaaatctat ttttatacaa tctgagtaca aattccacat 300
acttttttag ttataagttt gaagcgctta tgaaacatac ttttagttca ttaatgactg 360
caaaccatat ctttcgtaca ctaatactta ttagttatca agctctcgtg agtggaactt 420
ccttattaga acattttatt ataaaactga cacagagata tatctgtatg tttgtgtgta 480
tgttcactaa gtatgctaat aatataataa tttatgaaaa a 521
<210> 8
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
gatgagtgac tgcagaatct ttgtttccgc tgaggttgtt ggcttgaaca ctaggaaaga 60
ggttatgaac cttggtaact acacaccatt tgatgcagca agcgtgatct tctaaattag 120
ttagcaatga aagcctttgt ctaaggggtg aaccagcgtg ccgagcctct ctagcccctc 180
tctgacacaa gtcaaaacat gatcattggg cttgtagagc ctcgagaggt ctgcagtaga 240
acaccagacc aggctggaaa gtctcctgaa acagatccac cagaggagac gtagttgaaa 300
atccgttata gaatcgaact tcgcgttgta ccacggcttt ataggcaacc agttacttgt 360
ctagattgtg cttcagctac tagaaattgt gctgaaagga ggaaaccact gcaagggctg 420
gaacggggat ta 432
<210> 9
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
agtgttttaa aaacgcccct ttttggctac tgtagttgta gtttcaaaaa ctgtgaagaa 60
tcggacgatc attgggaaca acacgcgctt tcgttcagca agtggacttc tagaactttg 120
aaaaaaggta atgacacagt tgaggaggtc aaactgaggg cacacgctct cttgtcgcag 180
ccgggaacaa gacaagacat gaccaataag atagaaggac atacaggctc attgagtagg 240
gctcgagaaa aaggtcaaaa gactactgat acggaacccc cacagcacac attgtctact 300
atctgaccta agatctgacc tggtgttata ttcttgacct gtggacctgt tgtggcttgc 360
ctagattgag ctactgacat gaaaatatct gatgtctgta ggaagcatac ggaagcgacg 420
gcatgcgcat tt 432
<210> 10
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
gttgtgggag accagtctat gtggtgcaac tatactggtg gtcataaaaa ctgggacata 60
tcagacgtac ctcgggtaga acccgcgctt gggttcagga agtgtgtttt gctaaaaatg 120
atataagctc aagactttgt cgaaaacgac aaccagaggg aagaacatct cttgtcgctc 180
tccgaaacaa ctcaaaacaa gaccaaaaag atagaggtat cggaagagcc cagcagtagg 240
agcctcgaac aggctgaaga gactactaag agggacgcta cagagcacac tttgactaag 300
atctgttaaa aagacgagct tggtttagtt ttcttacctg gttgacttgt tgttgcctgt 360
cgaaattgtg cttctgcttt gaaaacttgt gctgtctgta ggcaaccttt ggaatcgaca 420
gttagcgcat tc 432
<210> 11
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
ggtgtaggag accagacact ctgtttctac tgaggtgctc gtctaggaga ccgtgtagaa 60
tctaacgaac cttgggaaca acacgccctt tgtttcagcc agtgtgattt tcaaaatgtg 120
aaataaggtt aagactttgt cggcaaggtc aaacagaggc cagaccatct cttgacgcgc 180
cccgtaacaa gtcaagaaaa taccaacgag ctacaagaac ataaagagcg ctgcagtagg 240
actccggaaa aggttgagaa gactactgaa agggaagcaa gaggtaaggc tatgtgttaa 300
ttcttttata aagactttct tggtgtcgta tatttgcctt gtggccatgt tgttgctcgt 360
gtaggttgtt cttctgctta agcaacttgt gctgtatgta gcaaactttt gccagcggca 420
gttcgagcat tt 432
<210> 12
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
ggtgtgggag agcagacact tcgtttctac agtggtggcg gtctaaaaga ctgggaagaa 60
tctgacgagc cttgcgaaca acaggcactt gggttcagca agtttgcttt tctgaatttg 120
aaaaaatgtt aagaccttgt cggaaaggtc aaacagaggc cagaccctct cttgtggcac 180
ccctgaacaa gtcaagacaa gaccacaggc cgagaagaac ctaaagagcc ctgcagcagg 240
actccagaca aggctgaaaa gactactgca acggaagcag gagaaaaggc tttgtgtaaa 300
atctgttcta aaaacgaact tggagttgta ttctggcctt gtggccatgt tgttgcgggt 360
gtcgattgtg cgtctgcttt gaatacttgt gctgtcctta ggaaaccttt ggaagcgaca 420
gttcgagcaa tt 432
<210> 13
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 13
ggtgtgggag accagacact ttgtttctac tgtgatggtg gtctaaaaga ctgggaaaaa 60
tctgacgaac cttgggtaca acacggcctt tggttcagca agtgtgtctt tataaatttg 120
aaaaaaggta aagactttgg cgaaaaggtc aagcagaggg caatccctct cttgtcgcac 180
cccggaacaa gtcaagacaa gaccaaagag ctagacgaac ctaaagagcc ctgcagtagg 240
actccagaaa aggctgaaaa gactactgaa acggaagcca cagagaagac tttgtgtaaa 300
atctgttata aaaaccaact tgatgttgtt ttcttgccat gtggacattt tgttgcttgt 360
ggagcttgtg cttctgcttt gaaaacttgt gctgtctgta ggaaaccttt ggaagcgaca 420
gttcgagcat tc 432
<210> 14
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 14
gcagaccctc tcttgtcgct ccccggaaca agtcaagaca agaccaaaga gctagaagaa 60
cctaaagagc cctgcagtag gactccagaa aaggctgaaa agactactga aacggaagca 120
acagagaaga ctttgtgtaa aatctgttat aaaaacgaac ttggtgttgt attcttgcct 180
tgtggacatg ttgttgcttg 200
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 15
gaacaagtca agacaagacc aaagagctag aagaacctaa agagccctgc agtaggactc 60
cagaaaaggc tgaaaagact actgaaacgg aagcaacaga gaagactttg tgtaaaatct 120
gttataaaaa cgaacttggt gttgtattct 150
<210> 16
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 16
gctagaagaa cctaaagagc cctgcagtag gactccagaa aaggctgaaa agactactga 60
aacggaagca acagagaaga ctttgtgtaa aatctgttat 100
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 17
agtaggactc cagaaaaggc tgaaaagact actgaaacgg aagcaacaga gggagaagat 60
ctagtaggac tccagaaaag gctgaaaaga ctactgaaac ggaagcaaca gaggtacctc 120
tccc 124
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<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 18
gaaaaggctg aaaagactac tgaaagggag aagatctgaa aaggctgaaa agactactga 60
aaggtacctc tccc 74
<210> 19
<211> 1564
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 19
cuaaugcauu gcguuguuca gauacaaacg uacgugcagu ucaguucagu ucaguucucg 60
uaucgcuagu uugucggagc aauugguuca cuugguauuu ggggcgauuu uaacguguuu 120
uuuacgaagg aucuuauaaa aaucaugcag uguuacagca ucauauuuuu ugguacugag 180
aaggcaugaa aaugaaucaa acauuuccca caaucagcag uuacucugau cagacagaca 240
auaaccccaa acauaaaagu uuuuuugaag uaaacgucaa caauuccgca uuggaggcga 300
gacugagaac auuugacaau uggccaagca cacaacuauc caaggaagcg cucgcgucug 360
ccgguuuuga auacacugga caagaugaca uuguuuugug ucguuucugu aagauagaag 420
gauacaauug gguaucugga gaugauccaa uggcagacca ucgagaaugg aguccugacu 480
guccuuuuau uagaacugua gagaacggca ggucugggag uaauagaaac gcagauacuu 540
guggacugua cggcauagag guucuuccaa auucccuccc ggaggacagg agauccauug 600
auuugcaaca guugggaauc cacaaaggaa guggaccaca caaccaggau aaaauaacgg 660
uaaauagucg acuagcaacg uucgaaaacu ggcccaaguc caucaagcag agacccguug 720
auuuggcaga agcgggauuu uauuauaccg gugugggaga ccagacacuu uguuucuacu 780
gugguggugg ucuaaaagac ugggaagaau cugacgaacc uugggaacaa cacgcccuuu 840
gguucagcaa guguguuuuu cuaaauuuga aaaaagguaa agacuuuguc gaaaagguca 900
aacagagggc agacccucuc uugucgcucc ccggaacaag ucaagacaag accaaagagc 960
uagaagaacc uaaagagccc ugcaguagga cuccagaaaa ggcugaaaag acuacugaaa 1020
cggaagcaac agagaagacu uuguguaaaa ucuguuauaa aaacgaacuu gguguuguau 1080
ucuugccuug uggacauguu guugcuugug uagauugugc uucugcuuug aaaacuugug 1140
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aaguuuuguc aaaaauuauu cuuuucuugu uuuaggauua gaaguaaauc uauuuuuaua 1320
caaucugagu acaaauucca cauacuuuuu uaguuauaag uuugaagcgc uuaugaaaca 1380
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auauaucugu auguuugugu guauguucac uaaguaugcu aauaauauaa uaauuuauga 1560
aaaa 1564
<210> 20
<211> 1453
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 20
cuaaugcauu gcguuguuca gauacaaacg uacgugcagu ucaguucagu ucaguucucg 60
uaucgcuagu uggcaugaaa augaaucaaa cauuucccac aaucagcagu uacucugauc 120
agacagacaa uaaccccaaa cauaaaaguu uuuuugaagu aaacgucaac aauuccgcau 180
uggaggcgag acugagaaca uuugacaauu ggccaagcac acaacuaucc aaggaagcgc 240
ucgcgucugc cgguuuugaa uacacuggac aagaugacau uguuuugugu cguuucugua 300
agauagaagg auacaauugg guaucuggag augauccaau ggcagaccau cgagaaugga 360
guccugacug uccuuuuauu agaacuguag agaacggcag gucugggagu aauagaaacg 420
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gauccauuga uuugcaacag uugggaaucc acaaaggaag uggaccacac aaccaggaua 540
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gacccguuga uuuggcagaa gcgggauuuu auuauaccgg ugugggagac cagacacuuu 660
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acgcccuuug guucagcaag uguguuuuuc uaaauuugaa aaaagguaaa gacuuugucg 780
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cuacugaaac ggaagcaaca gagaagacuu uguguaaaau cuguuauaaa aacgaacuug 960
guguuguauu cuugccuugu ggacauguug uugcuugugu agauugugcu ucugcuuuga 1020
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uaugaaacau acuuuuaguu cauuaaugac ugcaaaccau aucuuucgua cacuaauacu 1320
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<210> 21
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 21
ggugugggag accagacacu uuguuucuac ugugguggug gucuaaaaga cugggaagaa 60
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cccggaacaa gucaagacaa gaccaaagag cuagaagaac cuaaagagcc cugcaguagg 240
acuccagaaa aggcugaaaa gacuacugaa acggaagcaa cagagaagac uuuguguaaa 300
aucuguuaua aaaacgaacu ugguguugua uucuugccuu guggacaugu uguugcuugu 360
guagauugug cuucugcuuu gaaaacuugu gcugucugua ggaaaccuuu ggaagcgaca 420
guucgagcau uu 432
<210> 22
<211> 524
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 22
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<210> 23
<211> 521
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
cuaaugcauu gcguuguuca gauacaaacg uacgugcagu ucaguucagu ucaguucucg 60
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ccgguuuuga auacacugga caagaugaca uuguuuugug ucguuucugu aagauagaag 420
gauacaauug gguaucugga gaugauccaa uggcagacca ucgagaaugg aguccugacu 480
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<210> 24
<211> 522
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
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<211> 521
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
uguaaaaucu guuauaaaaa cgaacuuggu guuguauucu ugccuugugg acauguuguu 60
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caaaccauau cuuucguaca cuaauacuua uuaguuauca agcucucgug aguggaacuu 420
ccuuauuaga acauuuuauu auaaaacuga cacagagaua uaucuguaug uuugugugua 480
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<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
gaugagugac ugcagaaucu uuguuuccgc ugagguuguu ggcuugaaca cuaggaaaga 60
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gaacggggau ua 432
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
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<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
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aucuguuaaa aagacgagcu ugguuuaguu uucuuaccug guugacuugu uguugccugu 360
cgaaauugug cuucugcuuu gaaaacuugu gcugucugua ggcaaccuuu ggaaucgaca 420
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<210> 29
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 29
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guucgagcau uu 432
<210> 30
<211> 432
<212> RNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
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<220>
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<213> 人工序列
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<223> 合成多核苷酸
<400> 32
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 34
gcuagaagaa ccuaaagagc ccugcaguag gacuccagaa aaggcugaaa agacuacuga 60
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<212> RNA
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<220>
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<400> 35
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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uugauaacua auaaguauua guguacgaaa gauaugguuu gcagucauua augaacuaaa 180
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acuuuuuaau aaaccuucaa gaaucaaauu caaauugacu agaucugaga aacgaaaauu 360
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acagcacaag uuuucaaagc agaagcacaa ucuacacaag caacaacaug uccacaaggc 480
aagaauacaa caccaaguuc guuuuuauaa cagauuuuac acaaagucuu cucuguugcu 540
uccguuucag uagucuuuuc agccuuuucu ggaguccuac ugcagggcuc uuuagguucu 600
ucuagcucuu uggucuuguc uugacuuguu ccggggagcg acaagagagg gucugcccuc 660
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ccacaguaga aacaaagugu cuggucuccc acaccgguau aauaaaaucc cgcuucugcc 840
aaaucaacgg gucucugcuu gauggacuug ggccaguuuu cgaacguugc uagucgacua 900
uuuaccguua uuuuauccug guuguguggu ccacuuccuu uguggauucc caacuguugc 960
aaaucaaugg aucuccuguc cuccgggagg gaauuuggaa gaaccucuau gccguacagu 1020
ccacaaguau cugcguuucu auuacuccca gaccugccgu ucucuacagu ucuaauaaaa 1080
ggacagucag gacuccauuc ucgauggucu gccauuggau caucuccaga uacccaauug 1140
uauccuucua ucuuacagaa acgacacaaa acaaugucau cuuguccagu guauucaaaa 1200
ccggcagacg cgagcgcuuc cuuggauagu ugugugcuug gccaauuguc aaauguucuc 1260
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 39
aaaugcucga acugucgcuu ccaaagguuu ccuacagaca gcacaaguuu ucaaagcaga 60
agcacaaucu acacaagcaa caacaugucc acaaggcaag aauacaacac caaguucguu 120
uuuauaacag auuuuacaca aagucuucuc uguugcuucc guuucaguag ucuuuucagc 180
cuuuucugga guccuacugc agggcucuuu agguucuucu agcucuuugg ucuugucuug 240
acuuguuccg gggagcgaca agagaggguc ugcccucugu uugaccuuuu cgacaaaguc 300
uuuaccuuuu uucaaauuua gaaaaacaca cuugcugaac caaagggcgu guuguuccca 360
agguucguca gauucuuccc agucuuuuag accaccacca caguagaaac aaagugucug 420
gucucccaca cc 432
<210> 40
<211> 524
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 40
ccguccucga uguuguggcg gaucuugaag uucaccuuga ugccguucuu cugcuugucg 60
gccaugauau agacguugug gcuguuguag uuguacucca gcuugugccc caggauguug 120
ccguccuccu ugaagucgau gcccuucagc ucgaugcggu ucaccagggu gucgcccucg 180
aacuucaccu cggcgcgggu cuuguaguug ccgucguccu ugaagaagau ggugcgcucc 240
uggacguagc cuucgggcau ggcggacuug aagaagucgu gcugcuucau guggucgggg 300
uagcggcuga agcacugcac gccguagguc agggugguca cgaggguggg ccagggcacg 360
ggcagcuugc cgguggugca gaugaacuuc agggucagcu ugccguaggu ggcaucgccc 420
ucgcccucgc cggacacgcu gaacuugugg ccguuuacgu cgccguccag cucgaccagg 480
augggcacca ccccggugaa cagcuccucg cccuugcuca ccau 524
<210> 41
<211> 521
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 41
acucccagac cugccguucu cuacaguucu aauaaaagga cagucaggac uccauucucg 60
auggucugcc auuggaucau cuccagauac ccaauuguau ccuucuaucu uacagaaacg 120
acacaaaaca augucaucuu guccagugua uucaaaaccg gcagacgcga gcgcuuccuu 180
ggauaguugu gugcuuggcc aauugucaaa uguucucagu cucgccucca augcggaauu 240
guugacguuu acuucaaaaa aacuuuuaug uuugggguua uugucugucu gaucagagua 300
acugcugauu gugggaaaug uuugauucau uuucaugccu ucucaguacc aaaaaauaug 360
augcuguaac acugcaugau uuuuauaaga uccuucguaa aaaacacguu aaaaucgccc 420
caaauaccaa gugaaccaau ugcuccgaca aacuagcgau acgagaacug aacugaacug 480
aacugcacgu acguuuguau cugaacaacg caaugcauua g 521
<210> 42
<211> 522
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 42
caaagucuuc ucuguugcuu ccguuucagu agucuuuuca gccuuuucug gaguccuacu 60
gcagggcucu uuagguucuu cuagcucuuu ggucuugucu ugacuuguuc cggggagcga 120
caagagaggg ucugcccucu guuugaccuu uucgacaaag ucuuuaccuu uuuucaaauu 180
uagaaaaaca cacuugcuga accaaagggc guguuguucc caagguucgu cagauucuuc 240
ccagucuuuu agaccaccac cacaguagaa acaaaguguc uggucuccca caccgguaua 300
auaaaauccc gcuucugcca aaucaacggg ucucugcuug auggacuugg gccaguuuuc 360
gaacguugcu agucgacuau uuaccguuau uuuauccugg uugugugguc cacuuccuuu 420
guggauuccc aacuguugca aaucaaugga ucuccugucc uccgggaggg aauuuggaag 480
aaccucuaug ccguacaguc cacaaguauc ugcguuucua uu 522
<210> 43
<211> 521
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 43
uuuuucauaa auuauuauau uauuagcaua cuuagugaac auacacacaa acauacagau 60
auaucucugu gucaguuuua uaauaaaaug uucuaauaag gaaguuccac ucacgagagc 120
uugauaacua auaaguauua guguacgaaa gauaugguuu gcagucauua augaacuaaa 180
aguauguuuc auaagcgcuu caaacuuaua acuaaaaaag uauguggaau uuguacucag 240
auuguauaaa aauagauuua cuucuaaucc uaaaacaaga aaagaauaau uuuugacaaa 300
acuuuuuaau aaaccuucaa gaaucaaauu caaauugacu agaucugaga aacgaaaauu 360
aaagaaugga aaaauuauga gagaaaugcu cgaacugucg cuuccaaagg uuuccuacag 420
acagcacaag uuuucaaagc agaagcacaa ucuacacaag caacaacaug uccacaaggc 480
aagaauacaa caccaaguuc guuuuuauaa cagauuuuac a 521
<210> 44
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 44
uaauccccgu uccagcccuu gcagugguuu ccuccuuuca gcacaauuuc uaguagcuga 60
agcacaaucu agacaaguaa cugguugccu auaaagccgu gguacaacgc gaaguucgau 120
ucuauaacgg auuuucaacu acgucuccuc ugguggaucu guuucaggag acuuuccagc 180
cuggucuggu guucuacugc agaccucucg aggcucuaca agcccaauga ucauguuuug 240
acuuguguca gagaggggcu agagaggcuc ggcacgcugg uucaccccuu agacaaaggc 300
uuucauugcu aacuaauuua gaagaucacg cuugcugcau caaauggugu guaguuacca 360
agguucauaa ccucuuuccu aguguucaag ccaacaaccu cagcggaaac aaagauucug 420
cagucacuca uc 432
<210> 45
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 45
aaaugcgcau gccgucgcuu ccguaugcuu ccuacagaca ucagauauuu ucaugucagu 60
agcucaaucu aggcaagcca caacaggucc acaggucaag aauauaacac caggucagau 120
cuuaggucag auaguagaca augugugcug uggggguucc guaucaguag ucuuuugacc 180
uuuuucucga gcccuacuca augagccugu auguccuucu aucuuauugg ucaugucuug 240
ucuuguuccc ggcugcgaca agagagcgug ugcccucagu uugaccuccu caacuguguc 300
auuaccuuuu uucaaaguuc uagaagucca cuugcugaac gaaagcgcgu guuguuccca 360
augaucgucc gauucuucac aguuuuugaa acuacaacua caguagccaa aaaggggcgu 420
uuuuaaaaca cu 432
<210> 46
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 46
gaaugcgcua acugucgauu ccaaagguug ccuacagaca gcacaaguuu ucaaagcaga 60
agcacaauuu cgacaggcaa caacaaguca accagguaag aaaacuaaac caagcucguc 120
uuuuuaacag aucuuaguca aagugugcuc uguagcgucc cucuuaguag ucucuucagc 180
cuguucgagg cuccuacugc ugggcucuuc cgauaccucu aucuuuuugg ucuuguuuug 240
aguuguuucg gagagcgaca agagauguuc uucccucugg uugucguuuu cgacaaaguc 300
uugagcuuau aucauuuuua gcaaaacaca cuuccugaac ccaagcgcgg guucuacccg 360
agguacgucu gauauguccc aguuuuuaug accaccagua uaguugcacc acauagacug 420
gucucccaca ac 432
<210> 47
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 47
aaaugcucga acugccgcug gcaaaaguuu gcuacauaca gcacaaguug cuuaagcaga 60
agaacaaccu acacgagcaa caacauggcc acaaggcaaa uauacgacac caagaaaguc 120
uuuauaaaag aauuaacaca uagccuuacc ucuugcuucc cuuucaguag ucuucucaac 180
cuuuuccgga guccuacugc agcgcucuuu auguucuugu agcucguugg uauuuucuug 240
acuuguuacg gggcgcguca agagaugguc uggccucugu uugaccuugc cgacaaaguc 300
uuaaccuuau uucacauuuu gaaaaucaca cuggcugaaa caaagggcgu guuguuccca 360
agguucguua gauucuacac ggucuccuag acgagcaccu caguagaaac agagugucug 420
gucuccuaca cc 432
<210> 48
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 48
aauugcucga acugucgcuu ccaaagguuu ccuaaggaca gcacaaguau ucaaagcaga 60
cgcacaaucg acacccgcaa caacauggcc acaaggccag aauacaacuc caaguucguu 120
uuuagaacag auuuuacaca aagccuuuuc uccugcuucc guugcaguag ucuuuucagc 180
cuugucugga guccugcugc agggcucuuu agguucuucu cggccugugg ucuugucuug 240
acuuguucag gggugccaca agagaggguc uggccucugu uugaccuuuc cgacaagguc 300
uuaacauuuu uucaaauuca gaaaagcaaa cuugcugaac ccaagugccu guuguucgca 360
aggcucguca gauucuuccc agucuuuuag accgccacca cuguagaaac gaagugucug 420
cucucccaca cc 432
<210> 49
<211> 432
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 49
gaaugcucga acugucgcuu ccaaagguuu ccuacagaca gcacaaguuu ucaaagcaga 60
agcacaagcu ccacaagcaa caaaaugucc acauggcaag aaaacaacau caaguugguu 120
uuuauaacag auuuuacaca aagucuucuc uguggcuucc guuucaguag ucuuuucagc 180
cuuuucugga guccuacugc agggcucuuu agguucgucu agcucuuugg ucuugucuug 240
acuuguuccg gggugcgaca agagagggau ugcccucugc uugaccuuuu cgccaaaguc 300
uuuaccuuuu uucaaauuua uaaagacaca cuugcugaac caaaggccgu guuguaccca 360
agguucguca gauuuuuccc agucuuuuag accaccauca caguagaaac aaagugucug 420
gucucccaca cc 432
<210> 50
<211> 200
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 50
caagcaacaa cauguccaca aggcaagaau acaacaccaa guucguuuuu auaacagauu 60
uuacacaaag ucuucucugu ugcuuccguu ucaguagucu uuucagccuu uucuggaguc 120
cuacugcagg gcucuuuagg uucuucuagc ucuuuggucu ugucuugacu uguuccgggg 180
agcgacaaga gagggucugc 200
<210> 51
<211> 150
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 51
agaauacaac accaaguucg uuuuuauaac agauuuuaca caaagucuuc ucuguugcuu 60
ccguuucagu agucuuuuca gccuuuucug gaguccuacu gcagggcucu uuagguucuu 120
cuagcucuuu ggucuugucu ugacuuguuc 150
<210> 52
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 52
auaacagauu uuacacaaag ucuucucugu ugcuuccguu ucaguagucu uuucagccuu 60
uucuggaguc cuacugcagg gcucuuuagg uucuucuagc 100
<210> 53
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 53
ucuguugcuu ccguuucagu agucuuuuca gccuuuucug gaguccuacu 50
<210> 54
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 54
uuucaguagu cuuuucagcc uuuuc 25

Claims (38)

1.一种多核苷酸，其特异性抑制鞘翅目凋亡抑制剂(IAP)基因的表达。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述鞘翅目IAP基因包含SEQ ID NO：1的脱氧核酸(DNA)序列。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸为核糖核酸(RNA)。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述RNA为双链RNA(dsRNA)，其包含与由鞘翅目IAP基因编码的信使RNA(mRNA)互补的第一链，以及与所述第一链互补的第二链。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述mRNA包含SEQ ID NO：19的RNA序列。
6.根据权利要求4或5所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段70％至100％互补的RNA序列。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％或98％至100％互补的RNA序列。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述mRNA的区段的长度为至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含至少18至21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段至少90％至100％，95％至100％，或至少98％至100％互补。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与SEQID NO：37的RNA序列或所述RNA序列的区段具有70％至100％同一性的RNA序列。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含与SEQ ID NO：37的RNA序列或所述RNA序列的区段具有75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，或98％至100％同一性的RNA序列。
12.根据权利要求10或11所述的多核苷酸，其中SEQ ID NO：37的RNA序列的区段的长度为至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述dsRNA的第一链包含至少18至21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与SEQ ID NO：37的RNA序列具有至少90％至100％，95％至100％，或至少98％至100％同一性。
14.根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述RNA为单链RNA(ssRNA)，其与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA结合。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述mRNA包含SEQ ID NO：19的RNA序列。
16.根据权利要求14或15所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段70％至100％互补的RNA序列。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与由所述鞘翅目IAP基因编码的mRNA或所述mRNA的区段75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％或98％至100％互补的RNA序列。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述mRNA的区段的长度为至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含至少18至21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与所述mRNA至少90％至100％，95％至100％，或至少98％至100％互补。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与SEQ ID NO：37的RNA序列具有70％至100％同一性的RNA序列。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含与SEQ ID NO：37的RNA序列或所述RNA序列的区段具有75％至100％，80％至100％，85％至100％，90％至100％，95％至100％，或98％至100％同一性的RNA序列。
22.根据权利要求21所述的多核苷酸，其中所述SEQ ID NO：37的RNA序列的区段的长度为至少18至500个核苷酸，至少21至500个核苷酸，至少50至500个核苷酸，至少100至500个核苷酸，或至少200至500个核苷酸。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的多核苷酸，其中所述ssRNA包含至少18至21个连续核苷酸，所述连续核苷酸与SEQ ID NO：37的RNA序列具有至少90％至100％，95％至100％，或至少98％至100％同一性。
24.一种组合物，其包含根据权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物
(a)还包含至少一种添加剂，所述添加剂选自由以下组成的组：佐剂，引诱剂，生长调节物质，昆虫饲料，信息素，蛋白质，碳水化合物，聚合物，有机化合物，生物制剂和杀虫剂；
(b)被配制成液体，溶液，悬浮液，乳液，可乳化浓缩物，浓缩物溶液，低浓度溶液，超低体积浓缩物溶液，水溶性浓缩物溶液，诱饵，反乳液，可流动剂，气雾剂，烟，雾剂，可流动剂，均质混合物，非均质混合物，固体，粉尘，粉剂，颗粒剂，丸剂，胶囊剂，熏剂，包囊制剂或微包囊制剂；或
(c)以喷雾、雾剂、种子处理、浸液、滴灌、在犁沟中、以昆虫食物或诱饵递送。
26.根据权利要求24-26中任一项所述的组合物，其以0.001μg/cm2至10μg/cm2的浓度配制。
27.一种脱氧核糖核酸(DNA)，其编码根据权利要求3-26中任一项所述的RNA。
28.一种用于防治鞘翅目昆虫侵袭的方法，所述方法包含将根据权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸分子或根据权利要求24-27中任一项所述的组合物递送至植物、地面、鞘翅目昆虫或鞘翅目昆虫的食物。
29.一种用于防治鞘翅目昆虫侵袭的方法，所述方法包含将特异性抑制鞘翅目凋亡抑制剂(IAP)基因表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的组合物递送至植物、地面、鞘翅目昆虫或鞘翅目昆虫的食物。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中将所述组合物递送至所述植物的叶、茎、种子、根或土壤。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述植物选自由以下组成的组：茄科植物，十字花科植物，禾本科植物，葫芦科植物，豆科植物，伞形科植物，苋科植物，以及锦葵科植物。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中以足以引起鞘翅目昆虫的发育迟缓、死亡、摄食减少或抑制繁殖的量递送所述多核苷酸或组合物。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫属于选自由以下组成的组的物种：金花虫属种，条跳甲属种，Cerotoma属种，Diabrotica属种，拟谷盗属种，花象属种以及Alticini属种。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫为金花虫属种昆虫。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述金花虫属种昆虫为科罗拉多马铃薯甲虫。
36.根据权利要求28-35中任一项所述的方法，其中所述递送步骤包含将所述多核苷酸以至少0.001μg/cm2，0.001μg/cm2至10μg/cm2或0.001μg/cm2至0.1μg/cm2的浓度施用于所述植物的表面、所述地面、所述鞘翅目昆虫或所述鞘翅目昆虫的食物。
37.根据权利要求29-36中任一项所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天后，所述鞘翅目昆虫的死亡率百分比增加至至少30％。
38.根据权利要求28-37中任一项所述的方法，其中相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸少于10天后，植物脱叶百分比降低至小于15％；或相对于对照，任选地在未处理条件下，在鞘翅目昆虫暴露于所述多核苷酸后至少10天后，植物脱叶百分比保持小于15％。
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