CN110506752B

CN110506752B - 用于控制虫害的组合物和方法

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Publication number: CN110506752B
Application number: CN201910823699.4A
Authority: CN
Inventors: J·A·鲍姆; B·D·亚德斯; J·A·克罗伊默; C·M·泰勒
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2014-04-01
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: US20220081695A1; EP3420809A1; WO2015153339A4; CN106413390B; WO2015153339A2; CN106413390A; WO2015153339A3; BR112016022711A2; EP3125676A2; US11091770B2; US20170183683A1; EP3125676A4; CN110506752A

Abstract

本文公开了控制侵染作物植物的虫害的方法，特别是草地夜蛾(草地粘虫)、豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)、Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和小菜蛾(菜蛾)，和提供抗这种害虫的植物的方法。还公开了用于这种方法的多核苷酸和重组DNA分子和构建体，杀虫组合物例如包含杀虫双链RNA的局部喷雾剂，和对这些昆虫侵扰具有改进抗性的植物。进一步公开了用于选择RNAi‑介导的沉默的靶基因和控制这些虫害的方法。

Description

用于控制虫害的组合物和方法

本申请是申请日为2015年3月27日、申请号为201580026900.6、发明名称为“用于控制虫害的组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用和结合序列表

本申请要求2014年4月1日提交的美国临时专利申请号61/973,484的权益，其全文通过引用并入本文。文件“40-21_70001_0000_US_ST25.txt”中所含的序列表(49千字节，于2014年4月1日创建，2014年4月1日与美国临时专利申请号61/973,484一起提交)，和文件“40-21_70001_0000_US_ST25.txt”中所含的替换序列表(49千字节，于2014年4月4日创建，2014年4月4日作为替换序列表提交以更正发明人的序列表)的全文并入本文。文件“40-21_70001_0000_WO_ST25.txt”中所含的序列表(70千字节，于2015年3月13日创建)在此提交并通过引用将其全文并入本文。

技术领域

本文公开的是用于控制尤其是植物中无脊椎害虫侵扰的方法，和在这种方法中有用的组合物和多核苷酸。更具体地，本发明涉及用于尤其通过RNA干扰改变无脊椎害虫中基因表达的多核苷酸及其使用方法。目标害虫物种包括侵扰作物植物的昆虫，例如，小菜蛾(Plutella xylostella，菜蛾)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda，草地粘虫)、豆荚草盲蝽(Lygus hesperus，西部无泽盲蝽)和Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)。

背景技术

经济作物经常是无脊椎害虫例如昆虫攻击的目标。用于控制植物中昆虫侵扰的组合物通常是化学杀虫剂的形式。然而，使用化学杀虫剂存在若干缺点。例如，化学杀虫剂通常是非选择性的，且应用旨在控制作物植物中虫害的化学杀虫剂可以在非目标昆虫和其他无脊椎动物上发挥它们的效果。化学杀虫剂通常持续存在于环境中且降解缓慢，因此可能在食物链中累积。此外，使用持续的化学杀虫剂可能导致目标昆虫物种产生抗性。因此对于对环境更友好的用于控制或消除植物上或植物中的昆虫侵扰的方法存在长期需求，即物种选择性、环境惰性、非持续性和生物可降解且良好适合抗虫性管理方案的方法。

包括苏芸金杆菌(“Bt”)细菌的杀虫组合物是可商购的且用作环境安全和可接受的杀虫剂已超过三十年。这些组合物的功效归因于仅由Bt菌产生的杀虫蛋白。杀虫Bt蛋白不会持续存在于环境中，对于受影响的目标物种具有高度选择性，仅通过目标昆虫的摄取发挥它们的效果，且已经证明对植物和其他非目标生物(包括人和其他脊椎动物)无害。包含一种或多种编码杀虫Bt蛋白的重组基因的转基因植物也是本领域可获得的，且对害虫侵扰有抗性。使用表达Bt蛋白的转基因植物的一个积极的环境结果是减少了在这种转基因作物田地中施用以控制害虫侵扰的化学杀虫剂的量，从而降低由非降解或过量化学杀虫剂导致的土壤和水的污染。此外，由于减少使用非选择性的化学杀虫剂，其中种植表达Bt蛋白的转基因作物植物的田地中的益虫的数量显著增加。

RNA干扰(RNAi，RNA-介导的基因抑制)是另一种用于害虫控制的方法。在无脊椎动物中，基于RNAi的基因抑制最初在线虫中被证实(Fire等,(1998)Nature,391:806-811；Timmons&Fire(1998)Nature,395:854)。随后，在大量物种中报道了利用重组核酸技术的基于RNAi的无脊椎动物基因的抑制，包括来自各种昆虫和线虫分类的农学或经济上重要的害虫，例如根瘤线虫(根结线虫属)，参见Huang等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:14302-14306,doi:10.1073/pnas.0604698103)；棉铃虫(Helicoverpa armigera)，参见Mao等(2007)Nature Biotechnol.,25:1307-1313,doi:10.1038/nbt1352；西部玉米根虫(Diabrotica virgifera LeConte)，参见Baum等(2007)Nature Biotechnol.,25:1322-1326,doi:10.1038/nbt1359；甜菜孢囊线虫(粟根线虫，Heterodera schachtii)，参见Sindhu等(2008)J.Exp.Botany,60:315-324,doi:10.1093/jxb/ern289；蚊子(埃及伊蚊，Aedes aegypti)，参见Pridgeon等(2008)J.Med.Entomol.,45:414-420,doi:full/10.1603/0022-2585％282008％2945％5B414％3ATAADRK％5D2.0.CO％3B2；果蝇(Drosophila melanogaster)、面象虫(Tribolium castaneum)、豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)、烟草天蛾(Manduca sexta)，参见Whyard等(2009)Insect Biochem.Mol.Biol.,39:824-832,doi:10.1016/j.ibmb.2009.09.00；菜蛾(Plutella xylostella)，参见Gong等(2011)Pest Manag.Sci.,67:514-520,doi:10.1002/ps.2086；桃蚜(Myzus persicae)，参见Pitino等(2011)PLoS ONE,6:e25709,doi:10.1371/journal.pone.0025709；褐飞虱(Nilaparvata lugens)，参见Li等(2011)Pest Manag.Sci.,67:852-859,doi:10.1002/ps.2124和白粉虱(烟粉虱，Bemisia tabaci)，参见Upadhyay等(2011)J.Biosci.,36:153-161,doi:10.1007/s12038-011-9009-1。

本发明涉及控制虫害、尤其是侵扰作物植物且之前已经发现对RNA介导的基因抑制方法有抗性的昆虫的方法，例如，小菜蛾(菜蛾)、草地夜蛾(草地粘虫)、豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)。已经鉴别用于测试抗性昆虫物种小菜蛾(菜蛾)、草地夜蛾(草地粘虫)、豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)的双链RNA(dsRNA)引发序列。这些引发剂被设计用于抑制新的靶基因，所述新的靶基因是之前被证实对西部玉米根虫(Diabrotica virgifera)中的RNAi-介导的死亡率是有效目标的基因的推定的同源基因。

本发明进一步涉及在控制虫害的方法中有用的多核苷酸和重组DNA分子和构建体。本发明进一步涉及杀虫组合物，和抗虫害侵扰的转基因植物。本发明还涉及用于鉴定对于控制虫害有效的双链RNA引发剂的方法，和用于鉴定可能代表实质功能的靶基因、使得这些基因成为RNAi-介导的沉默和控制虫害的优选目标的方法。

发明简述

本发明涉及控制昆虫物种，尤其是经济上或农学上重要的害虫。本发明的组合物和方法包括重组多核苷酸分子，例如用于制备抗昆虫物种侵扰的转基因植物的重组DNA构建体和例如作为局部应用试剂以引起昆虫物种中RNAi-介导的靶基因抑制且因此控制或预防那些昆虫物种侵扰的RNA“引发剂”。本发明的另一种应用是包含多核苷酸的组合物(例如，包含用于抑制靶基因的dsRNA引发剂的组合物)，其局部施用于昆虫物种或待保护以免受昆虫物种侵扰的植物、植物部分、或种子。本发明进一步涉及用于选择优选昆虫靶基因的方法，所述靶基因很可能是RNAi-介导的控制昆虫物种的有效目标。

一方面，本发明提供用于控制植物的昆虫侵扰的方法，包括用dsRNA接触侵扰植物的昆虫，其中所述dsRNA包括至少一个18个或更多个连续核苷酸的片断，所述核苷酸的序列与所述昆虫的靶基因的片段具有约95％到约100％的互补性，和其中所述靶基因的DNA序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44。在实施方式中，所述dsRNA包括具有与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列的RNA链。在实施方式中，所述dsRNA包括具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA链。在实施方式中，所述dsRNA引发剂抑制昆虫中的基因并且抑制或杀死昆虫。

另一方面，本发明提供在昆虫中引起死亡或发育障碍的方法，包括在昆虫的饮食中提供至少一种重组RNA，其包括至少一种与昆虫的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44，和其中通过昆虫摄取重组RNA导致昆虫的死亡或发育障碍。在实施方式中，所述沉默元件包括具有与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列的RNA链。在实施方式中，所述沉默元件包括具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA链。

另一方面，本发明提供包括杀虫有效量的重组RNA分子的杀虫组合物，其中所述重组RNA分子包括至少一个18个或更多个连续核苷酸的片断，所述核苷酸的序列与侵扰植物的昆虫的靶基因的片段具有约95％到约100％的互补性，和其中所述靶基因的DNA序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44。在实施方式中，所述重组RNA分子是dsRNA。在实施方式中，所述重组RNA分子包括至少一个片断(例如RNA链或RNA链的片断)，其具有与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列。在实施方式中，所述重组RNA分子包括至少一个片断(例如RNA链或RNA链的片断)，其具有选自SEQID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。

另一方面，本发明提供一种具有改进的抗虫性的植物，包括在植物中表达重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括编码至少一种与昆虫的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互补的沉默元件的DNA，其中所述靶基因序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44，和其中通过昆虫摄取重组RNA导致昆虫的死亡或发育障碍。在实施方式中，所述沉默元件是ssRNA。在其他实施方式中，所述沉默元件是dsRNA。在实施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA链或RNA链的片断)，其具有与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列。在实施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA链或RNA链的片断)，其具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。

另一方面，本发明提供包括异源启动子的重组DNA构建体，例如在细菌细胞或真核细胞(例如植物细胞或昆虫细胞)中具有功能的异源启动子，其可操作地与编码RNA转录物的DNA连接，其中所述RNA转录物包括具有与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列。在实施方式中，所述RNA转录物是ssRNA。在其他实施方式中，所述RNA转录物是dsRNA。在实施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA链或RNA链的片断)，其具有与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列。在实施方式中，所述沉默元件包括RNA(例如RNA链或RNA链的片断)，其具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列。

在相关方面，本发明提供包括本发明多核苷酸或引发剂的人造组合物，例如用于局部施用至需要保护以免受昆虫侵扰的植物或物质的dsRNA制剂、用于制备转基因植物细胞和转基因植物的重组构建体和载体、用于处理植物(包括植物种子或可繁殖部分例如块茎)的制剂和涂层、用本发明多核苷酸处理或包含本发明多核苷酸的植物种子或可繁殖部分例如块茎以及从这种植物、种子或可繁殖部分产生的商品和食物(尤其是具有可检测含量的本发明多核苷酸的商品和食物)。本发明的进一步方面是结合肽或蛋白质的多克隆或单克隆抗体，所述肽或蛋白质由选自SEQ ID NOs:1-12和43-44的序列或序列片段编码；本发明的另一方面是结合肽或蛋白质的多克隆或单克隆抗体，所述肽或蛋白质由选自SEQ IDNOs:13-26、28-29、30-42、45和46或其补体的序列或序列片段编码。这种抗体通过如本领域技术人员已知的常规方法来制备。

本发明的其他方面和具体实施方式在以下发明详述和工作实施例中公开。

附图说明

图1描绘了实施例2所述的在草地夜蛾(草地粘虫，FAW)SF9细胞中dsRNA引发剂(TOP PANEL)T34640(SEQ ID NO:17，靶向V-ATPase A亚基)、(MIDDLE PANEL)T34642(SEQID NO:18，靶向COPI coatomer beta亚基)或(BOTTOM PANEL)T34644(SEQ ID NO:19，靶向COPI coatomer beta主要亚基)的转染实验的结果。

图2描绘了实施例2所述的在小菜蛾(菜蛾，DBM)细胞中dsRNA引发剂(TOP PANEL)T42017(SEQ ID NO:21，靶向V-ATPase亚基A)、(TOP PANEL)T33310(SEQ ID NO:29，靶向V-ATPase亚基A)、(MIDDLE PANEL)T32938(SEQ ID NO:28，靶向COPI coatomer beta亚基)和(BOTTOM PANEL)T32937(SEQ ID NO:13，靶向COPI coatomer beta主要亚基)的转染实验的结果。

发明详述

除非另有定义，所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。通常，所使用的命名法和如下所述的制备或实验程序是本领域众所周知和通常使用的。这些程序使用常规方法，例如本领域和各种一般文献所提供的那些。当术语以单数形式提供时，本发明人也预期由该术语的复数形式所描述的本发明方面。当通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义中存在矛盾时，本申请中使用的术语具有给定的定义。所使用的其他技术术语具有其中使用它们的领域的普通含义，如各种领域-具体的词典所示，例如“The American

Science Dictionary”(Editorsof the American Heritage Dictionaries,2011,Houghton Mifflin Harcourt,Bostonand New York)、“McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms”(6^thedition,2002,McGraw-Hill,New York)或“Oxford Dictionary of Biology”(6^thedition,2008,Oxford University Press,Oxford and New York)。发明人不意欲限制于机制或作用方式。其参考文献仅为说明性目的而提供。

除非另有说明，在本说明书文本中的核酸序列当从左到右阅读时以5'到3'方向给出。本领域技术人员将了解给定的DNA序列理解为定义除了用尿嘧啶(U)核苷酸替换DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸之外与DNA序列相同的对应的RNA序列。因此，提供具体的DNA序列理解为定义准确的RNA等效物。给定的第一多核苷酸序列，不管DNA或RNA，进一步定义了其准确的补体(其可以是DNA或RNA)的序列，即通过形成Watson-Crick碱基配对与第一多核苷酸完美杂交的第二多核苷酸。与靶基因或靶基因片段“基本上同一”或“基本上互补”是指设计多核苷酸链(或双链多核苷酸的至少一条链)以使其与靶基因或靶基因片段或靶基因或靶基因片段的转录物杂交(通常在生理条件下，例如在活的植物或动物细胞中发现的那些)；本领域技术人员将理解这种杂交不一定需要100％的序列同一性或互补性。当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能上的关系时，第一核酸序列“可操作地”与第二核酸序列连接或联接。例如，如果启动子提供DNA的转录或表达，则启动子序列与DNA“可操作地连接”。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的。

术语“多核苷酸”通常是指包含多个核苷酸的DNA或RNA分子且通常是指“寡核苷酸”(长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子)和26个或更多个核苷酸的较长多核苷酸两者。如本领域通常实践的，多核苷酸也包括含有多个核苷酸(包括非规范核苷酸或化学修饰的核苷酸)的分子，例如参见技术手册“RNA Interference(RNAi)and DsiRNAs”,2011(Integrated DNA Technologies Coralville,IA)中公开的化学修饰。通常，本发明的多核苷酸或引发剂，不管DNA或RNA或两者，不管单链或双链，包括至少一个与靶基因DNA或靶基因的RNA转录物的同等大小的片段基本上同一或互补的18个或更多个连续核苷酸(或，在双链多核苷酸情况下，至少18个连续碱基对)的片断。在本公开中，“至少18个连续的”是指“从约18个到约10,000个，包括之间的每个整数点”。因此，本发明的实施方式包括包含长度为18-25个核苷酸(18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体或25聚体)的寡核苷酸、或长度为26个或更多个核苷酸的中等长度的多核苷酸(26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300个核苷酸的多核苷酸)、或长度超过约300个核苷酸的长多核苷酸(例如长度为约300-约400个核苷酸、约400-约500个核苷酸、约500-约600个核苷酸、约600-约700个核苷酸、约700-约800个核苷酸、约800-约900个核苷酸、约900-约1000个核苷酸、约300-约500个核苷酸、约300-约600个核苷酸、约300-约700个核苷酸、约300-约800个核苷酸、约300-约900个核苷酸或约1000个核苷酸、或甚至长度超过约1000个核苷酸，例如等于包括靶基因的编码或非编码或编码和非编码部分两者的靶基因的完整长度的多核苷酸)的组合物。当多核苷酸是双链，例如工作实施例中描述的dsRNA引发剂时，其长度可以类似地根据碱基对来描述。双链多核苷酸，例如工作实施例中描述的dsRNA引发剂，可以进一步根据一个或多个单链组分来描述。

通常设计本发明的多核苷酸或引发剂以抑制或沉默一种或多种基因(“靶基因”)。术语“基因”是指提供转录物的表达或编码转录物的核酸的任何部分。“基因”可以包括但不限于启动子区域、5'非翻译区、可以包括内含子区域的转录物编码区、3'非翻译区或这些区域的组合。在实施方式中，靶基因可以包括编码或非编码序列或两者。在其他实施方式中，靶基因的序列与信使RNA同一或互补，例如，在实施方式中，靶基因是cDNA。

通过用dsRNA接触控制植物的昆虫侵扰

本发明的第一方面提供用于控制植物的昆虫侵扰的方法，包括用双链RNA(dsRNA)接触侵扰植物的昆虫，其中所述dsRNA包括至少一个18个或更多个连续核苷酸的片断，所述核苷酸的序列与所述昆虫的靶基因的片段具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的互补性，和其中所述靶基因的DNA序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44。在本上下文中，“控制”包括诱导昆虫(成虫或幼虫或蛹)的生理或行为的变化，例如，但不限于，生长迟缓、死亡率增加、生殖能力降低、进食行为或运动降低或停止、或变形阶段发育降低或停止。“双链”是指通常在生理学相关的条件下在充分互补的、反平行核酸链之间发生的碱基配对以形成双链核酸结构。

在各种实施方式中，昆虫选自夜蛾属、草盲蝽属、美洲蝽属和菜蛾属。特别感兴趣的昆虫包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda，草地粘虫)、豆荚草盲蝽(Lygus hesperus，西部无泽盲蝽)、Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和小菜蛾(Plutella xylostella，菜蛾)。

所述方法的各种实施方式包括其中昆虫是草地夜蛾(草地粘虫)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:1-3的DNA序列；其中昆虫是豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆虫是Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:8-9的DNA序列；和其中昆虫是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:10-12的DNA序列的那些。所述方法的其他实施方式包括其中昆虫是草地夜蛾(草地粘虫)和dsRNA包括选自SEQ ID NOs:17-19的序列；其中昆虫是豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和dsRNA包括选自SEQ ID NOs:14-16、22、26、45和46的序列；其中昆虫是Euschistusheros(新热带区褐臭蝽)和dsRNA包括选自SEQ ID NOs:23-25的序列；和其中昆虫是小菜蛾(菜蛾)和dsRNA包括选自SEQ ID NOs:13、20-21和28-29的序列。其他实施方式包括其中dsRNA具有如实施例5所述修饰的序列以消除与非靶标生物，例如表6所公开的修饰序列(SEQ ID NOs:30-42)匹配的那些。

植物可以是经历昆虫侵扰的任何植物，所述昆虫侵扰可以通过本文公开的多核苷酸控制。特别感兴趣的植物包括商业重要的植物，包括中耕作物植物、蔬菜和水果，和其他农学或装饰性用途的植物。适合植物的实例提供于标题“植物”下。

在方法的实施方式中，dsRNA包括多个片段，每一个为18个或更多个连续核苷酸且其序列与所述昆虫的靶基因的片段具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的互补性。例如，dsRNA可以包括对应于靶基因的不同区域的片断，或可以包括片断的多个拷贝。在方法的其他实施方式中，dsRNA包括多个片断，每一个为18或更多个连续核苷酸且其序列与不同靶基因的片段具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的互补性；以这种方法可以抑制多个靶基因或多个昆虫物种。

在方法的实施方式中，dsRNA是平端。在其他实施方式中，dsRNA在一端或两端(末端)具有悬垂；悬垂可以是单个核苷酸或2、3、4、5、6或更多个核苷酸，且可以位于链的5'端或3'端上。dsRNA可以是化学合成的，或可以通过在微生物中表达、通过在植物细胞中表达、或通过微生物发酵来制备。dsRNA可以是化学修饰的，例如以改进稳定性或功效。

在所述方法的一些实施方式中，接触包括向昆虫表面或被昆虫侵扰的植物表面施用含有dsRNA的组合物。组合物可以包括或为固体、液体、粉末、悬浮液、乳剂、喷雾、包封剂、微珠、载体微粒、薄膜、基质或种子处理的形式。在实施方式中，例如可以通过在包括dsRNA的液体组合物中浸泡种子向种子施用组合物，其中种子将有效量dsRNA吸取或摄入种子内部或种子胚乳，以通过种子或植物或由种子生长的幼苗提供改进的抗虫性。在实施方式中，接触包括在组合物中提供dsRNA，所述组合物进一步包括一种或多种选自载体试剂、表面活性剂、有机硅酮化合物、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂、诱虫剂和昆虫生长调节剂的组分。在实施方式中，接触包括在组合物中提供dsRNA，所述组合物进一步包括至少一种选自马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白的杀虫剂。

在所述方法的一些实施方式中，接触包括在昆虫摄取的组合物中提供dsRNA，例如向昆虫进食的植物施用的液体、乳剂或粉末，或以诱饵形式。这种组合物可以进一步包括一种或多种选自载体试剂、表面活性剂、有机硅酮化合物、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂、诱虫剂和昆虫生长调节剂的组分。这种组合物可以进一步包括至少一种选自马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白的杀虫剂。在实施方式中，dsRNA和杀虫剂的组合提供协同作用的昆虫控制水平，即大于如果单独测试的dsRNA和杀虫剂组分的效果之和。

引起昆虫死亡或发育障碍的方法

本发明的另一方面提供引起昆虫死亡或发育障碍的方法，包括在昆虫的饮食中提供至少一种重组RNA，所述重组RNA包括至少一种与昆虫的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44，和其中通过昆虫摄取重组RNA导致昆虫的死亡或发育障碍。所述方法应用于各种生命阶段的昆虫。在实施方式中，所述方法引起昆虫幼虫或蛹的死亡或发育障碍。在其他实施方式中，所述方法引起成虫死亡。

在所述方法的实施方式中，所述重组RNA包括至少一条RNA链，所述RNA链的序列与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性。方法的实施方式包括其中昆虫是草地夜蛾(草地粘虫)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:1-3的DNA序列；其中昆虫是豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆虫是Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:8-9的DNA序列；和其中昆虫是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:10-12的DNA序列的那些。所述方法的其他实施方式包括其中昆虫是草地夜蛾(草地粘虫)和沉默元件包括选自SEQ ID NOs:17-19的序列；其中昆虫是豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和沉默元件包括选自SEQ ID NOs:14-16、22、26、45和46的序列；其中昆虫是Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和沉默元件包括选自SEQ ID NOs:23-25的序列；和其中昆虫是小菜蛾(菜蛾)和沉默元件包括选自SEQID NOs:13、20-21和28-29的序列。其他的实施方式包括其中重组RNA具有如实施例5所述修饰的序列以消除与非靶标生物，例如表6所公开的修饰序列(SEQ ID NOs:30-42)相匹配的那些。

在方法的实施方式中，所述重组RNA是dsRNA。在这些实施方式中，dsRNA可以是平端dsRNA，或可以是在一端或两端(末端)具有悬垂的dsRNA；悬垂可以是单个核苷酸或2、3、4、5、6或更多个核苷酸，且可以位于链的5'端或3'端上。dsRNA可以是化学合成的，或可以通过在微生物中表达、通过在植物细胞中表达、或通过微生物发酵来制备。dsRNA可以是化学修饰的，例如以改进稳定性或功效。

在其中所述重组RNA是dsRNA的方法的实施方式中，dsRNA包括至少一条RNA链，所述RNA链的序列与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％的同一性或互补性。

在所述方法的一些实施方式中，重组RNA以可摄取组合物的形式提供于昆虫的饮食中，例如提供于向昆虫进食的植物施用的液体、乳剂或粉末中，或以诱饵形式。这种组合物可以进一步包括一种或多种选自载体试剂、表面活性剂、有机硅酮化合物、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂、诱虫剂和昆虫生长调节剂的组分。这种组合物可以进一步包括至少一种选自马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白的杀虫剂。在实施方式中，重组RNA和杀虫剂的组合提供协同作用的昆虫控制水平，即大于如果单独测试的重组RNA和杀虫剂的效果之和。

杀虫组合物

本发明的另一方面提供包括杀虫有效量的重组RNA分子的杀虫组合物，其中所述重组RNA分子包括至少一个18个或更多个连续核苷酸的片断，所述核苷酸具有与侵扰植物的昆虫的靶基因片段具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)互补性的序列，和其中所述靶基因的DNA序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44。“杀虫有效”是指有效诱导侵扰植物的昆虫(成虫或幼虫或蛹)的生理或行为的变化，例如，但不限于，生长迟缓、死亡率增加、生殖能力降低或繁殖力降低、进食行为或运动降低或停止、或变形阶段发育降低或停止；在实施方式中，向植物施用杀虫有效量的重组RNA分子改进植物对昆虫侵扰的抗性。

在杀虫组合物的实施方式中，重组RNA分子包括至少一条RNA链，所述RNA链的序列与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性。在具体的实施方式中，重组RNA分子是包括具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的RNA链的dsRNA。在实施方式中，重组RNA分子是长度为至少50个碱基对的dsRNA。在方法的实施方式中，重组RNA分子是dsRNA。在实施方式中，重组RNA分子是dsRNA，其可以是平端dsRNA，或可以是在一端或两端(末端)具有悬垂的dsRNA；悬垂可以是单个核苷酸或2、3、4、5、6或更多个核苷酸，且可以位于链的5'端或3'端上。在实施方式中，重组RNA分子是可以是化学合成的dsRNA，或可以通过在微生物中表达、通过在植物细胞中表达、或通过微生物发酵来制备。在实施方式中，重组RNA分子是长度大于典型的天然存在的调控小RNA(例如内源产生的siRNA和成熟miRNA)的长度的dsRNA，即多核苷酸是长度为至少约30个连续碱基对的双链RNA。在实施方式中，重组RNA分子是长度为约50到约500个碱基对的dsRNA。

杀虫组合物的实施方式包括其中昆虫是草地夜蛾(草地粘虫)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:1-3的DNA序列；其中昆虫是豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和靶基因包括选自SEQID NOs:4-7、43和44的DNA序列；其中昆虫是Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和靶基因包括选自SEQ ID NOs:8-9的DNA序列；和其中昆虫是小菜蛾(菜蛾)和靶基因包括选自SEQID NOs:10-12的DNA序列的那些。杀虫组合物的其他实施方式包括其中昆虫是草地夜蛾(草地粘虫)和重组RNA分子包括至少一条RNA链，所述RNA链的序列与选自SEQ ID NOs:17-19的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性；其中昆虫是豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和重组RNA分子包括至少一条RNA链，所述RNA链的序列与选自SEQ ID NOs:14-16、22、26、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性；其中昆虫是Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和重组RNA分子包括至少一条RNA链，所述RNA链的序列与选自SEQ ID NOs:23-25的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性；和其中昆虫是小菜蛾(菜蛾)和重组RNA分子包括至少一条RNA链，所述RNA链的序列与选自SEQ ID NOs:13、20-21和28-29的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性的那些。杀虫组合物的具体实施方式包括其中昆虫是草地夜蛾(草地粘虫)和重组RNA分子是包括具有选自SEQ ID NOs:17-19的序列的RNA链的dsRNA；其中昆虫是豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)和重组RNA分子是包括具有选自SEQ ID NOs:14-16、22、26、45和46的序列的RNA链的dsRNA；其中昆虫是Euschistus heros(新热带区褐臭蝽)和重组RNA分子是包括具有选自SEQ ID NOs:23-25的序列的RNA链的dsRNA；和其中昆虫是小菜蛾(菜蛾)和重组RNA分子是包括具有选自SEQ ID NOs:13、20-21和28-29的序列的RNA链的dsRNA的那些。杀虫组合物的其他实施方式包括其中重组RNA分子具有如实施例5所述修饰的序列以消除与非靶标生物，例如表6所公开的修饰序列(SEQ ID NOs:30-42)相匹配的那些。0037

在各种实施方式中，杀虫组合物包括杀虫有效量的由天然存在的核糖核苷酸(例如在天然存在的RNA中发现的那些)组成的重组RNA分子。在某些实施方式中，多核苷酸是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合，例如，合成多核苷酸主要由核糖核苷酸组成但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸。在某些实施方式中，多核苷酸包括非规范核苷酸例如次黄嘌呤核苷、硫尿核苷或假尿嘧啶核苷。在某些实施方式中，多核苷酸包括化学修饰的核苷酸。化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸的实例是本领域众所周知的；参见例如美国专利公开2011/0171287、美国专利公开2011/0171176、美国专利公开2011/0152353、美国专利公开2011/0152346和美国专利公开2011/0160082，其通过引用并入本文。说明性实例包括但不限于，可以用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合修饰来部分或完全修饰的天然存在的寡核苷酸或多核苷酸的磷酸二脂主链，修饰的核苷碱基或修饰的糖可用于寡核苷酸或多核苷酸合成，且寡核苷酸或多核苷酸可以用荧光性部分(例如荧光素或若丹明)或其他标记(例如生物素)标记。

重组RNA分子通过本领域已知的合适手段提供。实施方式包括其中重组RNA分子是化学合成的(例如通过体外转录、例如利用T7聚合酶或其他聚合酶的转录)、通过在微生物中或在细胞培养物(例如在培养物中生长的植物或昆虫细胞)中表达产生、通过在植物细胞中表达产生或通过微生物发酵产生。

在实施方式中，在该方法中使用的重组RNA分子作为分离的RNA片段(不是表达构建体的一部分，即，缺少额外元件例如启动子或终止子序列)提供。这种重组RNA分子可以较短，例如约18到约300或约50到约500个核苷酸(对于单链多核苷酸)或约18到约300或约50到约500个碱基对(对于双链多核苷酸)的单链或双链RNA分子。实施方式包括其中多核苷酸是包括具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的片断的dsRNA。

在实施方式中，杀虫组合物可以为选自固体、液体、粉末、悬浮液、乳剂、喷雾、包封剂、微珠、载体微粒、薄膜、基质、土壤浇灌、昆虫饮食或昆虫诱饵和种子处理的形式。在实施方式中，例如可以通过在包括dsRNA的液体杀虫组合物中浸泡种子来向种子施用杀虫组合物，其中种子将有效量的dsRNA吸取或摄入种子内部或种子胚乳内，以通过种子或植物或由种子生长的幼苗提供对改进的抗虫性。在一些实施方式中，杀虫组合物以被昆虫摄取的形式提供，例如提供于向昆虫进食的植物施用的液体、乳剂或粉末中，或以诱饵形式。所述杀虫组合物可以进一步包括一种或多种选自载体试剂、表面活性剂、有机硅酮化合物、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂、诱虫剂和昆虫生长调节剂的组分。杀虫组合物可以进一步包括至少一种选自马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白的杀虫剂。在实施方式中，重组RNA分子和杀虫剂的组合提供协同作用的昆虫控制水平，即大于如果单独测试的重组RNA分子和杀虫剂组分的效果之和。

本发明的相关方面是用本文所述的杀虫组合物处理的植物或处理植物的种子，其中所述植物显示改进的抗虫性。在实施方式中，与没有用杀虫组合物处理的植物相比，所述显示改进的抗虫性的植物的特征在于提高的产量。

提供具有改进的抗虫性的植物的方法

本发明的另一方面提供一种提供具有改进的抗虫性的植物的方法，包括在植物中表达包括编码RNA的DNA的重组DNA构建体，所述RNA包括至少一个与昆虫的靶基因序列的片段基本上同一或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44，和其中通过昆虫摄取RNA导致昆虫的死亡或发育障碍。

在方法的实施方式中，沉默元件的序列与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)的同一性或互补性。在具体的实施方式中，沉默元件是由两条分离的、基本上互补的链形成双链RNA的RNA，其中至少一条RNA链包括与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)同一性或互补性的序列。在其他实施方式中，沉默元件是由单个自杂交发夹转录物形成双链RNA的RNA，其中发夹的一条“臂”包括与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)同一性或互补性的序列。其他实施方式包括其中沉默元件具有如实施例5所述修饰的序列以消除与非靶标生物，例如表6所公开的修饰序列(SEQ ID NOs:30-42)相匹配的那些。

在方法的实施方式中，重组DNA构建体进一步包括与编码RNA的DNA可操作地连接的异源启动子，所述RNA包括至少一个沉默元件，其中所述异源启动子在植物细胞中具有功能。在植物细胞中具有功能的启动子包括标题“启动子”下所列的那些。

在方法的实施方式中，重组DNA构建体通过转基因表达或瞬时表达在植物中表达。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在植物中表达至少一种选自马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白的杀虫剂。杀虫剂可以由包括编码至少一个沉默元件的DNA的相同的重组DNA构建体表达，或由不同的重组DNA构建体表达。

本发明的相关方面是具有改进的抗虫性的植物，或这种植物的种子，其中所述植物通过包括在植物中表达重组DNA构建体的方法来提供，所述重组DNA构建体包括编码RNA的DNA，所述RNA包括至少一个与昆虫的靶基因序列片段基本上同一或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44，和其中通过昆虫摄取RNA导致昆虫的死亡或发育障碍。在实施方式中，与没有用杀虫组合物处理的植物相比，显示改进的抗虫性的植物的特征在于提高的产量。本发明也涵盖通过这种方法提供并显示改进的抗虫性的植物的果实、种子或可繁殖部分。

本发明的相关方面是具有改进的抗虫性的植物或幼苗，其中所述植物或幼苗由用重组DNA构建体处理的种子生长，所述重组DNA构建体包括编码RNA的DNA，所述RNA包括至少一个与昆虫的靶基因序列片段基本上同一或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44；或者所述植物由用RNA直接处理的种子生长，所述RNA包括至少一个与昆虫的靶基因序列片段基本上同一或基本上互补的沉默元件，其中所述靶基因序列选自SEQ ID NOs:1-12和43-44。在实施方式中，通过在包括重组DNA构建体(或包括至少一个沉默元件的编码的RNA)的液体组合物中浸泡种子来施用重组DNA构建体(或包括至少一个沉默元件的编码的RNA)，其中种子将有效量DNA或编码的RNA吸取或摄入种子内部或种子胚乳内，以通过由种子生长的植物或幼苗提供改进的抗虫性。

用于昆虫控制的编码RNA的重组DNA构建体

本发明的另一方面提供包括与编码RNA转录物的DNA可操作连接的异源启动子的重组DNA构建体，所述RNA转录物包括与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)同一性或互补性的序列。

在具体的实施方式中，RNA转录物由分离的、基本上互补的链(例如其中一条链在分离的DNA构建体上编码或其中两条链在编码RNA转录物的DNA的分离部分上编码，和其是单独转录或单独制备，例如在重组酶或核酸酶的作用下)形成双链RNA，其中至少一条RNA链包括与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)同一性或互补性的序列。在其他实施方式中，RNA转录物由单个自杂交发夹转录物形成双链RNA，其中发夹的一条“臂”包括与选自SEQID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％(例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％)同一性或互补性的序列。

重组DNA构建体的实施方式包括其中异源启动子对于在细菌中表达RNA转录物具有功能的那些。在其中重组DNA构建体将在细菌中表达的实施方式中，所述细菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、杆菌属(Bacillus species)、假单胞细菌属(Pseudomonasspecies)、致病杆菌属(Xenorhabdus species)或发光杆菌属(Photorhabdus species)。在其他实施方式中，重组DNA构建体包括在植物细胞中具有功能的异源启动子。在实施方式中，将重组DNA构建体包含于重组载体，例如重组植物病毒载体或重组杆状病毒载体中。在实施方式中，将重组DNA构建体例如通过稳定转化整合入植物染色体或质体中。

本发明的相关方面包括其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物细胞，和包括这种转基因植物细胞的转基因植物。转基因植物细胞和植物通过本领域已知的方法制备，例如在标题“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”下描述的那些。本发明的进一步方面包括由这种转基因植物制备的商品，和转基因植物的转基因后代种子或可繁殖植物部分。

相关的信息和技术

植物

用于处理和保护植物免受昆虫侵扰的本文描述的方法和组合物可用于大量植物。其中可使用本文公开的方法和组合物的适合的植物包括但不限于谷物和饲草(水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、珍珠稷、龙爪稷、冷季型饲草和百喜草)、油籽作物(大豆、包括加拿大油菜和油籽油菜的油籽芸苔、向日葵、花生、亚麻、芝麻和红花)、豆类颗粒和饲料(菜豆、豇豆、豌豆、蚕豆、小扁豆、宽叶菜豆、亚洲豆、木豆、野豌豆、鹰嘴豆、羽扇豆、紫花苜蓿和苜蓿)、温带水果和坚果(苹果、梨、桃、李、浆果作物、樱桃、葡萄、橄榄、杏仁和胡桃)、热带和亚热带水果和坚果(柑橘属果树，包括酸橙、桔子和葡萄柚；香蕉和车前草、菠萝、木瓜、芒果、鳄梨、奇异果、百香果和柿)、蔬菜作物(茄科植物，包括番茄、茄子和胡椒；蔬菜芸苔；萝卜、胡萝卜、葫芦、葱属、芦笋和叶菜)、糖、块茎和纤维作物(甘蔗、甜菜、甜菊、马铃薯、甘薯、木薯和棉花)、种植作物、观赏植物和草皮草(烟草、咖啡、可可、茶、橡胶树、药用植物、观赏植物和草皮草)和森林树种。

额外的构建体元件

本发明的多核苷酸和核酸分子的实施方式可以包括额外元件，例如启动子、小RNA识别位点、适配子或核酶、额外和额外的用于表达编码序列(例如，为表达转基因如杀虫蛋白或选择标记)或非编码序列(例如，为表达额外的抑制元件)的表达盒。例如，本发明的一方面提供包括与编码RNA转录物的DNA可操作连接的异源启动子的重组DNA构建体，所述RNA转录物包括与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列。在其他实施方式中，将包括与DNA可操作连接的启动子的重组DNA构建体整合入植物基因组，所述DNA编码：(a)包括与选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列具有约95％到约100％同一性或互补性的序列的RNA转录物，和(b)适配子，其中包括RNA适配子和RNA沉默元件的RNA转录物在植物细胞中表达；适配子用于将RNA沉默元件引导到细胞的期望位置。在另一个实施方式中，包括小RNA(例如通过仅在特定细胞或组织中表达的miRNA或siRNA)结合和切割的一个或多个识别位点允许植物中更精确的表达模式，其中当小RNA表达时，重组DNA构建体的表达被抑制。这种额外元件描述如下。

启动子

本发明使用的启动子在其中构建体意欲转录的细胞中具有功能。通常这些启动子是异源启动子，如重组构建体中所使用，即，它们本质上不被认为是可操作地与本发明构建体中所使用的其他核酸元件连接。在各种实施方式中，启动子选自组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子。在许多实施方式中，启动子是在植物中具有功能的启动子，例如pol II启动子、pol III启动子、pol IV启动子或pol V启动子。

适用于本发明重组DNA构建体的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可以包括细胞器-、细胞-、组织-或器官-特异性启动子(例如用于分别在质体、根、花粉或种子中表达的质体特异性、根特异性、花粉特异性或种子特异性启动子)。在许多情况下种子-特异性、胚胎-特异性、糊粉-特异性或胚乳-特异性启动子特别有用。时间特异性启动子可以包括倾向于在植物生长周期中某些发育阶段期间、或在白天或夜晚的不同时间期间、或在一年的不同季节促进表达的启动子。诱导型启动子包括通过化学品或通过环境条件例如但不限于生物或非生物胁迫(例如水分不足或干旱、热、冷、高或低的营养或盐水平、高或低的光照水平、或害虫或病原体侵染)诱导的启动子。MicroRNA启动子是有用的，尤其是具有时间特异性、空间特异性或诱导型表达模式的那些；miRNA启动子的实例以及鉴别具有特异性表达模式的miRNA启动子的方法提供于美国专利申请公开2006/0200878、2007/0199095和2007/0300329中，其特别通过引用并入本文。表达特异性启动子也可以包括一般通过组成型表达但以不同程度或“强度”表达的启动子，包括通常认为是“强启动子”或“弱启动子”的启动子。

特别感兴趣的启动子包括以下实例：从农杆菌的T-DNA分离的蛋白石合酶启动子；花椰菜花叶病毒35S启动子；增强的启动子元件或嵌合的启动子元件例如与增强子元件(来自玉米的热休克蛋白70的内含子)连接的增强的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；根特异性启动子例如美国专利5,837,848；6,437,217和6,426,446中公开的那些；美国专利6,433,252公开的玉米L3油质蛋白启动子；美国专利申请公开2004/0216189中公开的编码位于质体的醛缩酶的植物核基因的启动子；美国专利6,084,089公开的冷诱导型启动子；美国专利6,140,078公开的盐诱导型启动子；美国专利6,294,714公开的光诱导型启动子；美国专利6,252,138公开的病原体诱导型启动子；和美国专利申请公布2004/0123347A1公开的水分不足-诱导型启动子。公开了启动子及其使用，尤其是在植物中具有功能的重组DNA构建体的所有以上描述的专利和专利公开通过引用并入本文。

感兴趣的植物导管或韧皮部特异性启动子包括发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的rolC或rolA启动子、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA基因5的启动子、水稻蔗糖合酶RSs1基因启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子、椰子叶腐病毒启动子、水稻东格鲁杆状病毒启动子、豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因启动子、马铃薯转化酶基因的invCD111和invCD141启动子、Kertbundit等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.,88:5212-5216的从拟南芥分离的在烟草中显示具有韧皮部特异性表达的启动子、VAHOX1启动子区域、豌豆细胞壁转化酶基因启动子、来自胡萝卜的酸转化酶基因启动子、硫酸盐转运基因Sultr1；3的启动子、植物蔗糖合酶基因的启动子和植物蔗糖转运基因的启动子。

适合与本发明重组DNA构建体或多核苷酸一起使用的启动子包括聚合酶II(“polII”)启动子和聚合酶III(“pol III”)启动子。RNA聚合酶II转录长度通常短于400个核苷酸的结构或催化性RNA，并将T残余物的简单运行识别为终止信号；它已经用于转录siRNA双链体(参见例如Lu等.(2004)Nucleic Acids Res.,32:e171)。因此Pol II启动子在其中将由本发明重组DNA构建体来制备短RNA转录物的一些实施方式中是优选的。在一个实施方式中，重组DNA构建体包括Pol II启动子以表达侧翼为自切割核酶序列(例如自切割锤头核酶)的RNA转录物，产生经加工的RNA，例如结合Leptinotarsa靶基因的转录物的单链RNA，其具有确定的5'和3'端，不含潜在的干扰侧翼序列。另一种方法使用pol III启动子以生成具有相对确定的5'和3'端的转录物，即转录具有最少5'和3'侧翼序列的RNA。在一些实施方式中，Pol III启动子(例如U6或H1启动子)对于增加导致转录RNA中2个碱基对悬垂(UU)的短的富含AT的转录终止位点而言是优选的；这可例如用于表达siRNA型构建体。已经报道使用pol III启动子来驱动siRNA构建体的表达；参见van de Wetering等.(2003)EMBO Rep.,4:609-615,和Tuschl(2002)Nature Biotechnol.,20:446-448。杆状病毒启动子例如杆状病毒多角体蛋白和p10启动子是本领域已知且可商购的；例如参见Invitrogen的“Guide toBaculovirus Expression Vector Systems(BEVS)and Insect Cell CultureTechniques”,2002(Life Technologies,Carlsbad,CA)和F.J.Haines等“BaculovirusExpression Vectors”,未标注日期的(Oxford Expression Technologies,Oxford,UK)。

启动子元件可以包括非天然存在的启动子或启动子元件或其同源物但可以调节基因表达的核酸序列。这种“与基因无关的”调控序列的实例包括包含配体结合区域或适配子(参见下文“适配子”)和调控区域(其可以是顺式作用)的天然存在或人工设计的RNA序列。参见例如Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.,22:841-847,Bayer and Smolke(2005)Nature Biotechnol.,23:337-343,Mandal and Breaker(2004)Nature Rev.Mol.CellBiol.,5:451-463,Davidson and Ellington(2005)Trends Biotechnol.,23:109-112,Winkler等(2002)Nature,419:952-956,Sudarsan等(2003)RNA,9:644-647,and Mandaland Breaker(2004)Nature Struct.Mol.Biol.,11:29-35。可以为具体的空间或时间特异性选择或设计这种“核糖调节子”，例如，仅在存在(或不存在)合适配体的给定浓度的情况下调控DNA的翻译，所述DNA编码用于抑制靶基因的沉默元件。一个实例是在胁迫下(例如非生物胁迫例如水、温度或营养胁迫、或生物胁迫例如粘附害虫或病原体)植物产生的对内源性配体(例如茉莉酮酸或水杨酸)起反应的核糖调节子；在胁迫下，内源性配体的水平增加到足以使核糖调节子开始转录DNA的水平，所述DNA编码用于抑制靶基因的沉默元件。

重组酶位点

在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体或多核苷酸包括编码一个或个位点特异性重组酶识别位点的DNA。在一个实施方式中，重组DNA构建体包括至少一对loxP位点，其中loxP位点之间的DNA的位点特异性重组通过Cre重组酶介导。选择loxP位点的位置和相对方向以实现期望的重组；例如，当loxP位点处于相同方向时，loxP位点之间的DNA以环形切除。在另一个实施方式中，重组DNA构建体包括编码一个loxP位点的DNA；在Cre重组酶和另一个具有loxP位点的DNA存在下，两个DNA重组。

适配子

在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体或多核苷酸包括加工至RNA适配子的DNA，即通过并非主要基于Watson-Crick碱基配对的结合机制结合配体的RNA(例如，与互补的反平行核酸链之间发生的以形成双链核酸结构的碱基配对相反)。例如参见Ellingtonand Szostak(1990)Nature,346:818-822。适配子的实例可以例如发现于公众适配子数据库，于aptamer.icmb.utexas.edu在线可得(Lee等.(2004)Nucleic Acids Res.,32(1):D95-100)。然而，本发明中可用的适配子可以是单价的(结合单个配体)或多价的(结合超过一个单独配体，例如结合两个或更多个不同配体的一个单元)。

可用于本发明的配体包括核酸次级结构通过并非主要基于Watson-Crick碱基配对的机制可以识别并结合的任何分子(或分子部分)。以这种方法，配体和适配子的识别和结合类似于抗原和抗体那样，或生物效应子和受体那样。配体可以包括单个分子(或分子部分)、或两个或更多个分子(或分子部分)的组合，且可以包括一个或多个高分子络合物(例如聚合物、脂质双层、脂质体、细胞膜或其他的细胞结构或细胞表面)。具体的配体实例包括维生素例如辅酶B₁₂和焦磷酸硫胺素、黄素单核苷酸、鸟嘌呤、腺苷、S-腺苷甲硫氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、辅酶A、赖氨酸、酪氨酸、多巴胺、葡糖胺-6-磷酸酯、咖啡因、茶碱、抗生素例如氯霉素和新霉素、除草剂例如草甘磷和麦草畏；蛋白质，包括病毒或噬菌体外壳蛋白和无脊椎动物表皮或消化道表面蛋白质；和RNA，包括病毒RNA、转运RNA(t-RNA)、核糖体RNA(rRNA)和RNA聚合酶例如RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRP)。可用于本发明的一类RNA适配子是不结合配体但热响应的“热开关”，即适配子的构象由温度决定；参见例如Box 3in Mandal andBreaker(2004)Nature Rev.Mol.Cell Biol.,5:451-463。

转基因转录单位

在一些实施方式中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括转基因转录单位。转基因转录单位包括编码目的基因例如天然蛋白质或异源蛋白质的DNA序列。目的基因可以是来自任何物种(包括但不限于非真核生物例如细菌和病毒；真菌、原生生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物)的任何编码或非编码序列。特定的目的基因是编码至少一种选自马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白的杀虫剂的基因。根据转基因的转录需要，转基因转录单位可以进一步包括5'或3'序列或两者。

内含子

在一些实施方式中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码可剪切内含子的DNA。“内含子”通常是指位于外显子(DNA的蛋白质编码片断或相应的转录RNA)之间的DNA片断(或由这种片断转录的RNA)，其中，在信使RNA成熟期间，所存在的内含子通过在真核生物的核中发生的切割/连接过程从RNA链酶促“剪切出去”或去除。术语“内含子”也适用于非编码DNA序列，其转录为可以从成熟RNA转录物剪切出去但不是在蛋白质编码的外显子之间发现的内含子的RNA片断。这样的一个实例是植物中能够增强下游编码序列表达(有时，尤其在单子叶植物中)的可剪切序列；这些可剪切序列天然位于一些植物基因的5'非翻译区，以及一些病毒基因中(例如烟草花叶病毒5'前导序列或由Gallie and Walbot(1992)Nucleic Acids Res.,20:4631-4638描述为增强植物基因表达的“Ω”前导序列)。这些可剪切序列或“增强表达的内含子”可以人工插入启动子和任何蛋白质编码外显子之间的植物基因的5'非翻译区。这种增强表达的内含子的实例包括但不限于玉米乙醇脱氢酶(Zm-Adh1)、玉米Bronze-1增强表达的内含子、水稻肌动蛋白1(Os-Act1)内含子、Shrunken-1(Sh-1)内含子、玉米蔗糖合酶内含子、热休克蛋白18(hsp18)内含子和82千道尔顿热休克蛋白(hsp82)内含子。通过引用特别引入本文的美国专利5,593,874和5,859,347描述了通过在位于基因启动子的3'和第一个蛋白质编码外显子的5'的非翻译前导序列中引入源自70千道尔顿玉米热休克蛋白(hsp70)的增强表达的内含子来改进用于植物的重组DNA构建体的方法。

核酶

在一些实施方式中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码一种或多种核酶的DNA。特别感兴趣的核酶包括自切割核酶、锤头核酶、或发夹核酶。在一个实施方式中，重组DNA构建体包括编码一种或多种用来切割转录RNA以提供确定的RNA片断(例如用于抑制Leptinotarsa靶基因的沉默元件)的核酶的DNA。

基因抑制元件

在一些实施方式中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码额外的基因抑制元件的DNA，所述额外的基因抑制元件用于抑制除Leptinotarsa靶基因以外的靶基因。待抑制的靶基因可以包括编码或非编码序列或两者。

适合的基因抑制元件详细描述于美国专利申请公开2006/0200878，其公开通过引用特别引入本文，且包括一个或多个：

(a)包括至少一个反义DNA片断(即对至少一个待抑制的基因片断是反义的)的DNA；

(b)包括至少一个反义DNA片断(即对至少一个待抑制的基因片断是反义的)的多个拷贝的DNA；

(c)包括至少一个有义DNA片断(即至少一个待抑制的基因片断)的DNA；

(d)包括至少一个有义DNA片断(即至少一个待抑制的基因片断)的多个拷贝的DNA；

(e)转录为通过形成双链RNA来抑制待抑制的基因的RNA且包括至少一个反义DNA片断(即对至少一个待抑制的基因片断是反义的)和至少一个有义DNA片断(即至少一个待抑制的基因片断)的DNA；

(f)转录为通过形成单个双链RN来抑制待抑制的基因的RNA且包括多个串联的反义DNA片断(即对至少一个待抑制的基因片断是反义的)和多个串联的有义DNA片断(即至少一个待抑制的基因片断)的DNA；

(g)转录为通过形成多个双链RNA来抑制待抑制的基因的RNA且包括多个反义DNA片断(即对至少一个待抑制的基因片断是反义的)和多个有义DNA片断(即至少一个待抑制的基因片断)的DNA，其中所述多个反义DNA片断和多个有义DNA片断排列在一系列反向重复序列中；

(h)包括源自植物miRNA的核苷酸的DNA；

(i)包括siRNA核苷酸的DNA；

(j)转录为能够结合配体的RNA适配子的DNA；和

(k)转录为能够结合配体的RNA适配子的DNA，和转录为能够调控待抑制基因的表达的调控RNA的DNA，其中所述调控依赖于调控RNA的构象，调控RNA的构象受RNA适配子的结合状态的变构影响。

在一些实施方式中，内含子用于在缺少任何蛋白编码外显子(编码序列)的情况下递送基因抑制元件。在一个实施例中，通过将基因抑制元件埋入内含子来中断内含子例如表达增强内含子(在某些实施方式中是优选的)，其中在转录时，基因抑制元件从内含子切除。因此，不要求蛋白编码外显子提供本文公开的重组DNA构建体的基因抑制功能。

转录调控元件

在一些实施方式中，本发明的重组DNA构建体或多核苷酸包括编码转录调控元件的DNA。转录调控元件包括调控本发明重组DNA构建体的表达水平(相对于缺少这种调控元件情况下的它的表达)的元件。适合的转录调控元件的实例包括核糖开关(顺式或反式作用)、转录稳定序列和miRNA识别位点，如美国专利申请公布2006/0200878所详细描述，通过引用特别引入本文。

制备和使用转基因植物细胞和转基因植物

植物转化可以包括任何若干种众所周知的方法和组合物。用于植物转化的适合的方法几乎包括可以将DNA引入细胞的任何方法。植物转化的一种方法是微粒轰击，例如，如美国专利5,015,580(大豆)、5,538,880(玉米)、5,550,318(玉米)、5,914,451(大豆)、6,153,812(小麦)、6,160,208(玉米)、6,288,312(水稻)、6,365,807(水稻)和6,399,861(玉米)和6,403,865(玉米)所述，所有专利通过引用引入以能够生产转基因植物。

植物转化的另一种有用的方法是借助于包含二元Ti质粒系统的农杆菌的农杆菌介导的转化，其中农杆菌携带第一Ti质粒和包含至少一种野生型Ti质粒的T-DNA边界的第二嵌合质粒、在转化的植物细胞中具有功能且可操作地连接至本发明多核苷酸或重组DNA构建体的启动子。参见例如通过引用引入的美国专利5,159,135中描述的二元系统。还参见De Framond(1983)Biotechnology,1:262-269；and Hoekema et al.,(1983)Nature,303:179。在这种二元系统中，包含一个或多个T-DNA边界的较小质粒可在适合的选择性寄主例如大肠杆菌中方便地构建和操作，然后转入农杆菌。

农杆菌介导的植物(特别是作物植物)转化的详细程序包括美国专利5,004,863、5,159,135和5,518,908(棉花)；5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301(大豆)；5,591,616和5,981,840(玉米)、5,463,174(芸苔，包括加拿大油菜)、7,026,528(小麦)和6,329,571(水稻)和美国专利申请公布2004/0244075(玉米)和2001/0042257A1(甜菜)中公开的程序，所有专利通过引用特别引入以能够生产转基因植物。美国专利申请公开2011/0296555在实施例5中公开了转化载体(包括载体序列)和转化玉米、大豆、加拿大油菜、棉花和甘蔗的详细方案，其通过引用特别引入以能够生产转基因植物。在双子叶植物和单子叶植物的许多植物品种中已经报道了类似的方法，尤其包括花生(Cheng等(1996)Plant CellRep.,15:653)；芦笋(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:5345)；大麦(Wanand Lemaux(1994)Plant Physiol.,104:37)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology,6:10；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.,7:379；小麦(Vasil等(1992)Bio/Technology,10:667；Becker等(1994)Plant J.,5:299)，紫花苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.,5:313)；和番茄(Sun等(2006)Plant Cell Physiol.,47:426-431)。还参见通过引用引入的美国专利申请公开2003/0167537A1中的载体、转化方法和生产转化的拟南芥(Arabidopsisthaliana)植物的描述，其中转录因子通过CaMV35S启动子组成性表达。尤其对茄科植物有用的转化方法是本领域众所周知的。例如参见番茄(Sharma等(2009),J.Biosci.,34:423-433)、茄子(Arpaia等(1997)Theor.Appl.Genet.,95:329-334)、马铃薯(Bannerjee等(2006)Plant Sci.,170:732-738；Chakravarty等(2007)Amer.J.Potato Res.,84:301-311；S.Millam“Agrobacterium-mediated transformation of potato.”Chapter 19(pp.257-270),“Transgenic Crops of the World:Essential Protocols”,Ian S.Curtis(editor),Springer,2004)和胡椒(Li等(2003)Plant Cell Reports,21:785-788)的公开描述的转化方法。稳定的转基因马铃薯、番茄和茄子已经商业化引入各种区域；参见例如K.Redenbaugh等“Safety Assessment of Genetically Engineered Fruits andVegetables:A Case Study of the FLAVR SAVR^TM Tomato”,CRC Press,Boca Raton,1992，和GM作物数据库中商业的转基因作物的广泛公开可获得的记录，参见：CERA.(2012).GMCrop Database.Center for Environmental Risk Assessment(CERA),ILSI ResearchFoundation,Washington D.C.，在www.cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database上电子可获得。其他植物品种的各种转化方法是本领域众所周知的，例如参见百科全书参考文献，“Compendium of Transgenic Crop Plants”，由Chittaranjan Kole和Timothy C.Hall编辑，Blackwell Publishing Ltd.,2008；ISBN 978-1-405-16924-0(在mrw.interscience.wiley.com/emrw/9781405181099/hpt/toc电子可获得)，其描述了谷物和饲草(水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、珍珠稷、龙爪稷、冷季型饲草和百喜草)、油籽作物(大豆、油籽芸苔、向日葵、花生、亚麻、芝麻和红花)、豆类颗粒和饲料(菜豆、豇豆、豌豆、蚕豆、小扁豆、宽叶菜豆、亚洲豆、木豆、野豌豆、鹰嘴豆、羽扇豆、紫花苜蓿和苜蓿)、温带水果和坚果(苹果、梨、桃、李、浆果作物、樱桃、葡萄、橄榄、杏仁和胡桃)、热带和亚热带水果和坚果(柑橘属果树、葡萄柚、香蕉和车前草、菠萝、番木瓜、芒果、鳄梨、奇异果、鸡蛋果和柿)、蔬菜作物(番茄、茄子、胡椒、蔬菜芸苔、萝卜、胡萝卜、葫芦、葱属、芦笋和叶菜)、糖、块茎和纤维作物(甘蔗、甜菜、甜菊、马铃薯、甘薯、木薯和棉花)、种植作物、观赏植物和草皮草(烟草、咖啡、可可粉、茶、橡胶树、药用植物、观赏植物和草皮草)和森林树种的转化方案。

提供包含稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选在培养基的组织培养物中和在受控环境中实践。“培养基”是指用于体外(即在完整活生物之外)生长细胞的多种营养素混合物。受体细胞靶标包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚胎或胚胎部分和配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。可以从其再生可育植物的任何细胞用作实践本发明的受体细胞。愈伤组织可以源自各种组织来源，包括但不限于未成熟胚胎或胚胎部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。像愈伤组织一样能够繁殖的那些细胞可以用作遗传转化的受体细胞。用于制备本发明转基因植物的实际的转化方法和材料(例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚胎的转化和随后可育转基因植物的再生)例如公开于通过引用特别引入的美国专利6,194,636和6,232,526和美国专利申请公布2004/0216189中。

在一般的转化实践中，在任何一个转化实验中仅将DNA引入小百分比的靶细胞中。标记基因通常用于提供鉴别通过将转基因DNA构建体接受和整合入它们的基因组中稳定转化的那些细胞的有效系统。优选的标记基因提供赋予对选择剂例如抗生素或除草剂的抗性的选择性标志。植物细胞抵抗的任何抗生素或除草剂可以是用于选择的有用试剂。将潜在的转化细胞暴露于选择剂。在存活细胞群中存在其中通常整合了抗性赋予基因并以足够水平表达以允许细胞存活的那些细胞。可以进一步测试细胞以证实重组DNA的稳定整合。通常使用的选择性标记基因包括赋予对抗生素例如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)和庆大霉素(aac3和aacC4)的抗性或对除草剂例如草丁膦(bar或pat)和草甘磷(EPSPS)的抗性的那些。有用的选择性标记基因和选择试剂的实例阐明于美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中，所有专利通过引用具体引入。也可使用可筛选标记或报道基因，例如提供视觉鉴别转化体的能力的标记。有用的可筛选标记包括例如表达通过作用于显色底物产生可检测颜色的蛋白的基因(例如β葡糖苷酸酶(GUS)(uidA)或荧光素酶(luc))，或蛋白本身是可检测的，例如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本领域技术人员将理解可以应用许多其他有用的标记或报道基因。

检测或测量转基因植物细胞中重组DNA构建体的转录可以通过任何适合的方法实现，包括蛋白质检测方法(例如蛋白质印迹、ELISA、和其他免疫化学方法)、测量酶活性或核酸检测方法(例如Southern印迹、Northern印迹、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)。

其他用于检测或测量植物细胞中本发明的靶向昆虫靶基因的重组多核苷酸的转录的适合的方法包括测量与不存在重组多核苷酸情况下观察的表达水平相比，作为昆虫中的靶基因表达水平的直接或代表指示的任何其他性状，例如昆虫的生长率、死亡率或再生率或补充率，或测量植物中或受昆虫侵染的植物田间的损伤(例如根损伤)或产量损失。通常，用于检测或测量植物细胞中目标重组多核苷酸的转录的适合的方法包括，例如总体或微观的形态学性状、生长率、产量、再生率或补充率、对害虫或病原体的抗性、或对生物或非生物胁迫(例如水分不足胁迫、盐胁迫、营养素胁迫、热或冷胁迫)的抗性。这种方法可以使用表型性状的直接测量或代表性分析(例如，在植物中，这些分析包括植物部分分析，例如叶或根分析以测定非生物胁迫的耐受性)。这种方法包括直接测量对无脊椎害虫或病原体的抗性(例如对植物组织的损害)或代表性分析(例如植物产量分析、或无脊椎害虫生物学分析例如西部玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)幼虫的生物学分析，如通过引用特别引入的国际专利申请公布WO2005/110068 A2和美国专利申请公布US2006/0021087 A1中所描述；或如Steeves等(2006)Funct.Plant Biol.,33:991-999所描述的大豆孢囊线虫病生物学分析，其中测量每棵植物的孢囊、每克根的孢囊、每棵植物的虫卵、每克根的虫卵和每个孢囊的虫卵；或本文工作实施例中描述的生物学分析。

本发明的重组DNA构建体可以例如通过表达或抑制其他基因来用其他重组DNA堆叠以赋予额外的性状(例如在转化植物情况下，性状包括除草剂抗性、抗虫性、冷萌芽耐受性、水分不足耐受性等)。用于协调降低和增加基因表达的构建体公开于通过引用特别引入的美国专利申请公布2004/0126845 A1中。

可以收获可育转基因植物的种子并用于生长在其基因组中包含重组DNA构建体的本发明转基因植物的后代，包括杂合代。因此，除用本发明重组DNA构建体直接转化植物之外，本发明的转基因植物可以通过使具有重组DNA的第一植物与缺乏所述构建体的第二植物杂交来制备。例如，可以将重组DNA引入适合转化的株系以生产转基因植物，其可以与第二株系杂交以将重组DNA基因渗入由此产生的后代中。本发明的转基因植物可以与具有赋予一种或多种额外性状(例如但不限于除草剂抗性、害虫或疾病抗性、环境胁迫抗性、改变的营养含量和产量提高)的其他重组DNA的株系杂交以生产具有赋予期望的靶序列表达行为和额外性状两者的重组DNA的后代植物。

在这种组合性状的育种中，赋予额外性状的转基因植物可以是雄系(授粉器)，携带基本性状的转基因植物可以是雌系。这种杂交的后代分离，使得一些植物将携带两个亲本性状的DNA和一些将携带一个亲本性状的DNA；这种植物可以通过与亲本重组DNA有关的标记来鉴别。携带两个亲本性状的DNA的后代植物可以与雌性亲本系回交多次，例如通常为6到8代，以生产具有与原始转基因亲本系基本上相同的基因型以及其他转基因亲本系的重组DNA的纯合子后代。

本发明的又一方面是由本发明转基因种子生长的转基因植物。本发明预期直接由包含重组DNA的转基因种子生长的转基因植物以及植物的后代，包括通过将直接由转基因种子生长的转基因植物与不由相同的转基因种子生长的第二植物杂交制备的近交或杂合株系。杂交例如可包括以下步骤：

(a)种植第一亲本植物(例如非转基因或转基因)和根据本发明转基因的第二亲本植物的种子；

(b)使第一和第二亲本植物的种子生长为携带花的植物；

(c)用来自第二亲本的花粉对来自第一亲本的花授粉；和

(d)收获在携带受精花的亲本植物上产生的种子。

通常期望的是将重组DNA基因例如通过回交渗入优良品种，以将特异性期望性状从一种来源转移入缺乏这种性状的近交种或其他植物。这可以例如通过首先将高级近交种(“A”)(回交亲本)与携带所讨论的性状的适当基因(例如根据本发明制备的构建体)的供体近交种(“B”)(非回交亲本)杂交来实现。在生成的后代中首先选择具有待从非回交亲本“B”中转移的期望性状的杂交后代，然后将所选择的后代与高级回交亲本“A”回交。选择期望性状五代或更多代回交代之后，后代的控制待转移特征的基因座基本上是半合子的，但大多数或几乎所有的其他基因类均似于高级亲本。将最后的回交代自交以提供待转移基因是纯种育种的后代，即一个或多个转化事件。

通过一系列育种操作，可将所选择的DNA构建体从一个品系移入完全不同的品系中，而无需进一步的重组操作。因此可以生产对于一个或多个DNA构建体是真正育种的近交种植物。通过杂交不同的近交种植物，可以生产大量具有DNA构建体的不同组合的不同杂交种。以这种方法，可以生产植物，其具有经常与杂交种有关的期望的农学性质(“杂交种优势”)，以及通过一个或多个DNA构建体赋予的期望的特征。

在本发明的某些转基因植物细胞和转基因植物中，有时期望同时表达目的基因，同时还调节Leptinotarsa靶基因的表达。因此，在一些实施方式中，转基因植物包含进一步包括用于表达至少一种目的基因的基因表达元件的重组DNA，且本发明重组DNA构建体的转录优选用基因表达元件的同时发生的转录实现。

在一些实施方式中，本发明重组DNA构建体可以在任何植物细胞或组织或在任何发育阶段的整个植物中转录。转基因植物可以源自任何单子叶或双子叶植物，例如但不限于，商业或农学目的的植物，例如作物植物(尤其是用于人食物或动物饲料的作物植物)、生产木材或纸浆的树、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。目的植物的实例包括谷类作物植物(例如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、稷、高粱、奎藜籽、苋属植物和荞麦)；饲料作物植物(例如饲草和饲料双子叶植物，包括紫花苜蓿、野豌豆、三叶草等)；油籽作物植物(例如棉花、红花、向日葵、大豆、加拿大油菜、油菜籽、亚麻、花生和油棕)；木本坚果(例如胡桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、海枣、橄榄、甜菜、茶和咖啡；生产木材或纸浆的树；蔬菜作物植物例如豆科植物(例如豆、豌豆、小扁豆、紫花苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜萝卜、芸苔(例如卷心菜、羽衣甘蓝、芥末和其他叶状芸苔、椰菜、花椰菜、芽甘蓝、芜菁、甘蓝)、食用葫芦(例如黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜)、食用葱属植物(例如洋葱、大蒜、韭葱、葱、细香葱)、食用茄科成员(例如番茄、茄子、马铃薯、胡椒、酸浆)和食用藜科成员(例如甜菜、君达菜、菠菜、奎藜籽、苋属植物)；水果作物植物例如苹果、梨、柑桔类水果(例如橙、酸橙、柠檬、葡萄柚和其他)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、奇异果、木瓜、鳄梨和浆果；为生物质或生物燃料而生长的植物(例如芒草、柳枝稷、麻风树、油棕、真核微藻例如布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、小球藻属(Chlorella spp.)和盐藻属(Dunaliella spp.)和真核大藻例如江蓠属(Gracilaria spp.)和马尾藻属(Sargassum spp.)；和观赏植物，包括观赏开花植物、观赏树木、装饰地被植物和观赏禾草。

本发明还提供由本发明转基因植物细胞、植物或种子产生的商品，包括但不限于收获的叶、根、枝、块茎、茎、果实、种子或植物的其他部分、膳食、油、提取物、发酵或消化产品、植物的压碎或整粒或种子、或包括由本发明转基因植物细胞、植物或种子产生的这种商品的任何食品或非食品产品。在本文预期的一种或多种商品或商品产品中检测到本发明的重组DNA构建体的一个或多个核酸序列事实上是该商品或商品产品包含或源自于本发明转基因植物细胞、植物或种子的证据。

通常在其基因组中具有本发明重组DNA构建体的转基因植物表现出对昆虫侵扰的增加的抗性。在各种实施方式中，例如，当转基因植物表达与赋予额外性状的其他重组DNA堆叠的本发明重组DNA构建体时，相对于缺乏所述重组DNA构建体的植物，转基因植物具有至少一种选自以下的额外改变的性状：

(a)改进的非生物胁迫耐受性；

(b)改进的生物胁迫耐受性；

(c)改变的初级代谢物组成；

(d)改变的次级代谢物组成；

(e)改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；

(f)提高的产量；

(g)改进的使用氮、磷酸酯或其他营养素的能力；

(h)改变的农艺性状；

(i)改变的生长或再生特征；和

(j)改进的收获、储存或加工质量。

在一些实施方式中，转基因植物的特征在于：改进的非生物胁迫耐受性(例如水分不足或干旱、热、冷、非最佳营养或盐水平、非最佳光照水平的耐受性)或改进的生物胁迫耐受性(例如群集、植化相克或创伤)；改变的初级代谢物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变的次级代谢物(例如生物碱、萜、聚酮化合物、非核糖体肽和混合的生物合成来源的次级代谢物)组成；改变的微量元素(例如铁、锌)、类胡萝卜素(例如β叶红素、番茄红素、叶黄素、玉米黄素或其他的类胡萝卜素和叶黄素)或维生素(例如生育酚)组成；提高的产量(例如在非胁迫条件下提高的产量或在生物或非生物胁迫下提高的产量)；改进的使用氮、磷酸酯或其他营养素的能力；改变的农艺性状(例如延迟成熟；延迟衰老；早熟或晚熟；改进的耐阴性；改进的对根或茎倒伏的抗性；改进的对茎“绿色折断”的抗性；改变的光周期反应)；改变的生长或再生特征(例如有意的矮化；例如用于改进的杂交程序的有意的雄性不育；改进的植物生长率；改进的萌芽；改进的雄性或雌性生育力)；改进的收获、储存或加工质量(例如在储存期间改进的抗虫性、改进的抗破裂性、改进的对消费者的吸引力)；或这些性状的任何组合。

在另一个实施方式中，转基因种子或由转基因植物产生的种子具有改变的初级代谢物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成、改变的次级代谢物组成、改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素组成、改进的收获、储存或加工质量或这些的组合。在另一个实施方式中，期望改变转基因植物或转基因植物的种子的天然组分的水平，例如降低过敏蛋白或糖蛋白或毒性代谢物的水平。

通常，各自从转基因植物细胞再生的转基因植物的群体进行筛选以鉴别发育成具有期望性状的转基因植物的转基因植物细胞。分析转基因植物以检测增强的性状，例如增强的水使用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮气使用效率、增强的种子蛋白质和增强的植物油。筛选方法包括在温室或田间试验中直接筛选性状或筛选代表性状。这种分析涉及检测植物的化学组成、生物质、生理特性或形态的变化。化学组成例如谷物的营养组成的变化通过分析种子组成和蛋白质、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉、生育酚或其他营养素的含量来检测。生长或生物质特性的变化通过测量株高、茎径、节间长、根和枝干重和(对于生产谷物的植物例如玉米、水稻或小麦)穗或种子头长和直径来检测。生理特性的变化通过评价对胁迫条件的响应来鉴别，例如在作用胁迫条件例如水分不足、氮或磷酸酯不足、冷或热的生长条件、病原体或昆虫攻击、光照不足或增加的植株密度下的分析。其他的选择性质包括开花天数、花粉脱落天数、果实成熟天数、产生的果实或块茎质量或含量、玉米抽丝天数、叶伸长率、叶绿素含量、叶温、高度(stand)、幼苗活力、节间长、株高、叶数、叶面积、舵柄、支持根、保持绿色、茎倒伏、根倒伏、植物健康、生育力、绿色折断和抗虫性。此外，可以评估收获的果实、种子或块茎的表型特性。

具体实施方式

实施例1

该实施例阐明了编码用于控制昆虫物种和用于制备本发明组合物和植物的靶基因的DNA序列的非限制性实施方式，并鉴别了可用于控制昆虫物种的dsRNA引发剂序列。从之前没有报告对经口递送的RNA敏感的昆虫物种中鉴别了之前在西部玉米根虫中显示对于RNAi-介导的死亡是有效靶标的同源基因。这些同源靶基因和dsRNA引发剂序列的实例提供于表1。

表1

*引发剂序列以5'到3'方向的dsRNA引发剂的有义链提供。

被证实以序列特异性方式有效抑制靶基因的dsRNA引发剂序列可用于鉴别有效的RNA递送剂和制剂。包含dsRNA引发剂的制剂的杀虫活性可以通过各种技术来优化，例如改变制剂中的化学实体或改变制剂中化学组分的比例。递送剂和制剂的非限制性实例提供于实施例6和8。

实施例2

该实施例阐明了可用于抑制或沉默昆虫细胞中的靶基因或引起昆虫发育障碍或死亡的dsRNA引发剂序列的非限制性实施方式和用于确认dsRNA引发剂功效或用于引起昆虫发育障碍或死亡的方法。更具体地，该实施例阐明使用dsRNA引发剂以序列特异性降低昆虫细胞中靶基因mRNA转录物水平。

将培养的草地夜蛾(草地粘虫)SF9细胞与dsRNA引发剂T34640(SEQ ID NO:17，靶向V-ATPase A亚基)、T34642(SEQ ID NO:18，靶向COPI coatomer B(beta)亚基)或T34644(SEQ ID NO:19，靶向COPI coatomer B’(beta主要)亚基)或用对照引发剂T35763(SEQ IDNO:27,300bp dsRNA引发剂，靶向绿色荧光性蛋白)(参见表1)一起孵育。用商业转染剂

II(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY 14072)配制dsRNA引发剂。图1描述了转染实验的结果，表明昆虫细胞中的dsRNA引发剂引起的靶基因特异性抑制(通过Quantigene分析测量的靶基因mRNA水平降低)。对照dsRNA引发剂T35763对昆虫靶基因mRNA水平没有影响。

用小菜蛾(菜蛾，DBM)细胞进行类似的实验。结果显示类似的对DBM引发剂的靶基因特异性细胞毒性响应，但对靶向绿色荧光性蛋白的非特异性引发剂没有靶基因特异性细胞毒性响应。将培养的小菜蛾(菜蛾)PxE-PO#5A3细胞与dsRNA引发剂T42017(SEQ ID NO:21，靶向V-ATPase亚基A)、T33310(SEQ ID NO:29，靶向V-ATPase亚基A)、T32938(SEQ IDNO:28，靶向COPI coatomer beta亚基)和T32937(SEQ ID NO:13，靶向COPI coatomer beta主要亚基)或用对照引发剂T35763(SEQ ID NO:27,300bp dsRNA引发剂，靶向绿色荧光性蛋白)(参见表1)一起孵育。用商业转染剂

II(Life Technologies,Inc.,GrandIsland,NY 14072)配制dsRNA引发剂。图2描述了转染实验的结果，表明昆虫细胞中的dsRNA引发剂引起的靶基因特异性抑制(通过Quantigene分析测量的靶基因mRNA水平降低)。对照dsRNA引发剂T35763对昆虫靶基因mRNA水平没有影响。在该具体的实验中，与cellfectinII或cellfectin II+T35763(SEQ ID NO:27)处理相比，在所有DBM-特异性引发剂处理中观察到mRNA水平的一些降低。T32937(SEQ ID NO:13，靶向COPI coatomer beta主要亚基)和T32938(SEQ ID NO:28，靶向COPI coatomer beta亚基)处理出现明显可见的病理，其中转染48小时后在转染孔中发生一些细胞死亡、变圆和移动。用T42017(SEQ ID NO:21)和T33310(SEQ ID NO:29)处理显示靶基因V-ATPase亚基A mRNA敲除，但在用那些引发剂转染的细胞中没有明显可见的病理。

实施例3

该实施例阐明了可用于抑制或沉默昆虫细胞中的靶基因或引起昆虫发育障碍或死亡的dsRNA引发剂序列的非限制性实施方式和用于确认dsRNA引发剂功效或用于引起昆虫发育障碍或死亡的方法。更具体地，该实施例阐明经口递送dsRNA引发剂以引起昆虫发育障碍或死亡。

采用以人工饲料为食的Euschistus heros(新热带区褐臭蝽，NBSB)幼虫的分析用于测试特异性设计为靶向Euschistus heros基因的dsRNA引发剂的功效。采用该分析，观察到靶向E.heros泛素C基因的～500个碱基对的dsRNA引发剂T33199在E.heros幼虫中引起剂量依赖性发育障碍和死亡响应。基于T33199序列设计了较短(302bp)的dsRNA引发剂T44042(SEQ ID NO:26)用于配制经口或局部递送。

实施例4

该实施例阐明了可用于抑制或沉默昆虫细胞中的靶基因或引起昆虫发育障碍或死亡的dsRNA引发剂序列的非限制性实施方式和用于确认dsRNA引发剂功效或用于引起昆虫发育障碍或死亡的方法。更具体地，该实施例阐明用于引起昆虫发育障碍或死亡的dsRNA引发剂的实施方式，并阐明这些引发剂的系统RNAi功效。

表2提供了在豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)幼虫中通过显微注射递送的测试dsRNA引发剂。非草盲蝽特异性引发剂T35763(SEQ ID NO:27,300bp dsRNA引发剂，靶向绿色荧光性蛋白)用作对照。

表2

表3显示在豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)幼虫中通过显微注射递送的测试dsRNA引发剂T34617(SEQ ID NO:15，靶向豆荚草盲蝽V-ATPase亚基A)和34622(SEQ ID NO:16，靶向豆荚草盲蝽COPI coatomer beta主要亚基)的死亡率结果。对照幼虫用T35763(靶向绿色荧光性蛋白)或用去离子水显微注射。在5天观察期内，每天观察到草盲蝽靶基因特异性处理组(T34617和T34622)与阴性对照处理组相比百分比死亡率增加。

表3

表4显示在豆荚草盲蝽(西部无泽盲蝽)幼虫中通过显微注射递送的测试dsRNA引发剂T34616(SEQ ID NO:14，靶向豆荚草盲蝽核糖体蛋白rpL19)、T34622(SEQ ID NO:16，靶向豆荚草盲蝽COPI coatomer beta主要亚基)和T42772(SEQ ID NO:22，靶向豆荚草盲蝽泛素C)的死亡率结果。对照幼虫用T35763(靶向绿色荧光性蛋白)显微注射。在6天观察期内，每天观察到草盲蝽靶基因特异性处理组(T34616、T34622和T42772)与阴性对照处理组相比百分比死亡率增加。T34622的重复活性证实了在较早试验中观察到的该引发剂的活性(表3)。

表4

实施例5

该实施例公开了与具有包含特定修饰例如核苷酸替换的核苷酸序列的多核苷酸分子有关的实施方式。这种修饰的实施方式包括修饰的dsRNA引发剂，其提供目标虫害的预定靶基因和其他非靶标物种的遗传序列之间的改进的序列识别力。

表5鉴别了表1提供的靶基因序列和非靶标生物(NTO)中鉴定的序列之间的匹配的实例，其中匹配是至少19个连续核苷酸的片断。表5进一步提供了序列修饰(例如，原始靶基因序列中指定位置处核苷酸变化)以消除与非靶标生物匹配的序列的实例。

表5

表6鉴别了表1提供的dsRNA引发剂序列和非靶标生物(NTO)中鉴定的序列之间的匹配的实例，其中匹配是至少19个连续核苷酸的片断。表6进一步提供了序列修饰(例如，原始dsRNA引发剂序列中指定位置处核苷酸变化)的实例，其消除至少19个连续核苷酸与非靶标生物的具体序列匹配。表6进一步提供了修饰的引发剂序列的非限制性实施方式，其中已经对表6中记载的给定的初始引发剂序列的所有的核苷酸进行变化以消除至少19个连续核苷酸与非靶标生物的所有记载的匹配。例如，与具有SEQ ID NO:15的原始dsRNA引发剂相比，具有SEQ ID NO:31的修饰的dsRNA引发剂在213位具有一个核苷酸变化(A→U)；该单个变化消除了至少19个连续核苷酸与两种非靶标生物熊蜂(Bombus impatiens)和地熊蜂(Bombus terrestris)的匹配。在另一个实施例中，与具有SEQ ID NO:20的原始dsRNA引发剂相比，具有SEQ ID NO:35的修饰的dsRNA引发剂(在42、79、124和194位)具有四个核苷酸变化；这些变化消除了至少19个连续核苷酸与NTO黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)的四种匹配。在另一个实施例中，与具有SEQ ID NO:20的原始dsRNA引发剂相比，具有SEQ ID NO:37的修饰的dsRNA引发剂(在64、72、131和280位)具有四个核苷酸变化；这些变化消除了至少19个连续核苷酸与NTO熊蜂、地熊蜂、智人(Homo sapiens)和黑脉金斑蝶的四种匹配。

表6

实施例6

该实施例公开了与设计用于沉默或抑制目的虫害的靶基因的多核苷酸分子例如dsRNA引发剂有关的实施方式，以及用于测定这种分子在抑制靶基因或控制虫害中的功效的技术。该实施例公开了将可摄取组合物形式的多核苷酸例如重组RNA分子或dsRNA引发剂提供给昆虫的方法。

测定多核苷酸分子在抑制靶基因或控制害虫草盲蝽物种的功效的一种方法是蔗糖饲养试验。简言之，该试验包括将西部无泽盲蝽(豆荚草盲蝽)幼虫与可摄取组合物形式的dsRNA引发剂接触，然后用人工饲料维持上并监控幼虫的情况。

制备包含2毫升15％蔗糖溶液的石蜡膜小袋用于饲养实验，其中处理小袋包含500微克/毫升(或百万分之一，ppm)或1000微克/毫升(或百万分之一，ppm)的dsRNA引发剂。在一些实验中，蔗糖溶液进一步包括5毫克/毫升酵母tRNA以抑制可能的核酸酶活性。还采用包含2毫升西部无泽盲蝽(豆荚草盲蝽)人工饲料的石蜡膜小袋制备人工饲料小袋，所述人工饲料通过在表面杀菌的搅拌机中混合高压灭菌的沸水(518毫升)和156.3克

饲料F9644B(Bio-Serv,Frenchtown,NJ)来制备。

在二氧化碳蒸气下麻醉三龄豆荚草盲蝽幼虫并分配在4盎司玻璃罐(40–75个体/处理)中。将一张纸巾添加至各罐中以吸引蜜露。各实验进行7天。允许幼虫在蔗糖小袋上进食72小时的周期(3天)，然后在7天观察期的剩余4天去除蔗糖小袋并用人工饲料小袋替换。在单个场地观察单个处理组的所有昆虫，在27摄氏度、60％相对湿度孵育。所有情况下，第0天(72小时蔗糖饲养阶段开始)的初始死亡率是0。从实验开始第3天(即72小时蔗糖饲养阶段结束时)到7天记录死亡率。对于基因表达研究，在72小时蔗糖饲养阶段结束之后立即从各罐移除12只活的幼虫并立即在单独的基质管中的干冰上冷冻以作为RNA测量分析的样品。

进行采用上述方案的一系列饲养实验以评估dsRNA引发剂T34616(SEQ ID NO:14)、T34617(SEQ ID NO:15)、T34619(SEQ ID NO:45)、T34622(SEQ ID NO:16)、T42772(SEQID NO:22)、T42768(SEQ ID NO:46)和T44045(SEQ ID NO:26)对豆荚草盲蝽的活性。还在美国牧草盲蝽上测试dsRNA引发剂T42772(SEQ ID NO:22)和T44045(SEQ ID NO:26)。分析中使用对照引发剂T35763(SEQ ID NO:27,300bp dsRNA引发剂，靶向绿色荧光性蛋白)。在500微克/毫升(500ppm)，与存在(表7)或不存在酵母tRNA补充(表8)的对照处理相比，对所有的草盲蝽特异性dsRNA引发剂均观察到增强的死亡率。T34622(SEQ ID NO:16)(靶向具有SEQID NO:6的假定的COPI coatomer beta主要亚基基因)和T42772(SEQ ID NO:22)(靶向具有SEQ ID NO:7的假定的泛素C基因)始终是表现最好的引发剂。均靶向假定的泛素C基因(SEQID NO:7)的引发剂T42772(SEQ ID NO:22)和T44045(SEQ ID NO:26)在西部无泽盲蝽豆荚草盲蝽中显示类似活性(表9A)；两种引发剂在相关的害虫物种无泽盲蝽美国牧草盲蝽中似乎也具有活性(虽然作用较缓慢)(表9B)。

三次重复实验在豆荚草盲蝽上以1000微克/毫升(1000ppm)测试了泛素C引发剂T44045(SEQ ID NO:26)和T42768(SEQ ID NO:46)；结果表明，与用单独的15％蔗糖或15％蔗糖加上1000微克/毫升(1000ppm)的对照引发剂T35763(SEQ ID NO:27)的对照处理相比，泛素C引发剂处理在第3、4、5、6和7天的昆虫死亡率显示统计上显著的差异(表10)。

表7：昆虫死亡率(表示为处理中总昆虫数的百分比)，dsRNA引发剂以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下测试

表8：昆虫死亡率(表示为处理中总昆虫数的百分比)，dsRNA引发剂以500ppm测试(无酵母tRNA)

表9A：豆荚草盲蝽死亡率(表示为处理中总昆虫数的百分比)，dsRNA引发剂以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下测试

表9B：美国牧草盲蝽死亡率(表示为处理中总昆虫数的百分比)，dsRNA引发剂以500ppm在5mg/mL酵母tRNA的存在下测试

表10：豆荚草盲蝽死亡率(表示为处理中总昆虫数的百分比)，dsRNA引发剂以1000ppm测试

*sd＝平均标准差，以百分比给出

通过Quantigene分析三个靶基因(COPI coatomer beta主要亚基、V-ATPase亚基A和COPI coatomer beta亚基)评估在豆荚草盲蝽中的靶基因抑制。如上所述，采用在15％蔗糖中以500或100ppm测试的dsRNA引发剂T34616(SEQ ID NO:14)、T34617(SEQ ID NO:15)、T34619(SEQ ID NO:45)、T34622(SEQ ID NO:16)、T42772(SEQ ID NO:22)和T44045(SEQ IDNO:26)进行蔗糖饲养试验。在72小时蔗糖饲养阶段结束之后立即将幼虫单独冷冻并进行Quantigene分析。将所有值根据两个参考基因(EF1α和肌动蛋白)的表达水平标准化。结果(表11A-C)表明三个测试的靶基因的每一个被相应的dsRNA引发剂特异性抑制，这与仅用蔗糖或用对照GFP引发剂T35763(SEQ ID NO:27)处理相比观察到的增加的死亡率一致。在六个引发剂实验中的五个观察到与蔗糖对照相比显著(p＝0.05)的靶基因抑制(靶基因表达降低)；在第六个引发剂实验(1000ppm的T34622，参见表11A)中，刚好在显著性水平下观察到可见抑制。这些结果支持在15％蔗糖饲料试验中观察到的死亡率是由RNAi介导的这一结论。

表11A：靶基因：豆荚草盲蝽COPI coatomer beta主要亚基(F38E11)，SEQ ID NO:6

表11B：靶基因：豆荚草盲蝽V-ATPase A亚基(CG3762)，SEQ ID NO:4

表11C：靶基因：豆荚草盲蝽COPI coatomer beta亚基(CG6223)，SEQ ID NO:43

n/a＝不适用。

实施例7

通常将本发明多核苷酸设计为通过诱导昆虫靶基因的调控或抑制来调节表达，并设计为具有与昆虫靶基因或cDNA的核苷酸序列(例如SEQ ID NOs:1-12和43-44)或与从昆虫靶基因转录的RNA序列基本上同一或基本上互补的核苷酸序列，其可以是编码序列或非编码序列。这些有效的调节表达的多核苷酸分子在本文中称为“引发剂”。该实施例描述用于设计和选择作为调节昆虫靶基因的表达的“引发剂”的多核苷酸的非限制性技术。

通过“划分(Tiling)”选择多核苷酸引发剂

用于本发明的多核苷酸不需要是全长的靶基因，且在许多实施方式中较之靶基因长度要短得多。用于选择有效的引发剂的技术的实例是“划分”，或评估对应于靶基因的相邻或部分重叠的片断的多核苷酸。

有效的多核苷酸“引发剂”可以通过在选择的长度片段(例如长度为200–300个核苷酸的片段，其中沿着靶基因的长度具有例如约25个核苷酸的部分重叠的区域)中“划分”基因靶标来鉴定。为抑制单个基因，将引发剂序列设计为对应于(与其具有核苷酸同一性或互补性)靶基因独特的区域；选择的靶基因区域可以包括编码序列或非编码序列(例如启动子区域、3'非翻译区、内含子等)或两者的组合。

当有兴趣设计有效抑制多个靶基因的靶标时，将多个靶基因序列进行比对，并设计多核苷酸引发剂来对应于在多个靶标中共有的高序列同源性的区域。相反，当有兴趣设计有效地选择性抑制多个靶序列之一的靶标时，将多个靶基因序列进行比对，并设计多核苷酸引发剂来对应于在多个靶标中没有或共有的低序列同源性的区域。

在非限制性实施例中，为表1所列每一个靶基因设计如下反义单链RNA引发剂。设计多个反义单链RNA引发剂，其中每一个长度为200–300个核苷酸且其序列对应于(即，对于反义引发剂，与其互补)具有选自SEQ ID NOs:1-12和43-44的序列的靶基因的片段，使得各引发剂的序列与下一个相邻引发剂序列的约25个核苷酸重叠，如此以致多个引发剂的组合覆盖靶基因的全长。(有义引发剂以类似的方式设计，其中引发剂序列与靶基因片段相同。类似地，双链引发剂可以通过提供有义和反义引发剂对来设计，各对引发剂与下一对相邻的引发剂重叠)。

通过任何方便的手段测试多核苷酸引发剂在沉默昆虫靶基因中的功效。适合的测试的实例包括本文实施例中描述的生物学分析。另一个测试包括将多核苷酸引发剂直接局部施用到单个昆虫或保护其免受昆虫侵扰的植物表面。用本发明多核苷酸处理的一个期望的结果是预防或控制昆虫侵扰，即通过诱导昆虫的生理或行为的变化，例如但不限于，生长迟缓、死亡率增加、生殖能力降低、进食行为或运动降低或停止、或变形阶段发育降低或停止。用本发明多核苷酸处理的另一个期望的结果是提供对于昆虫侵扰显示改进的抗性的植物。

如果需要，划分程序可以重复。发现提供期望活性的多核苷酸引发剂本身可以进行划分程序。例如，设计多个重叠反义单链RNA引发剂，其中每个长度为50–60个核苷酸，且其序列对应于(即，对于反义引发剂，与其互补)选自SEQ ID NOs:1-12和43-44的序列的靶基因的片段，发现300个核苷酸的单个多核苷酸引发剂是有效的。可以进行额外轮的划分分析，其中测试短至18或19个核苷酸的引发剂。

在本发明的各种方法中可以单独或组合使用任何大小的有效的多核苷酸引发剂。在一些实施方式中，单个多核苷酸引发剂用于制备本发明组合物(例如用于局部施用的组合物，或用于制备转基因植物的重组DNA构建体)。在其他实施方式中，使用不同的多核苷酸引发剂的混合物或组合；在这种情况下，多核苷酸引发剂可用于单个靶基因或用于多个靶基因。在一些实施方式中，设计多核苷酸引发剂以靶向靶基因的不同区域，即引发剂可以包括对应于靶基因的不同外显子区域的多个片断；和不对应于靶基因的“间隔基”核苷酸可以任选地用于片断之间或邻接片断。

选择多核苷酸引发剂中的热力学考虑

可以设计多核苷酸引发剂或利用热力学考虑优化它们的序列。例如，可以基于控制一条核酸链(例如多核苷酸引发剂或单个siRNA)和另一条(例如靶基因转录物)之间的杂交的热力学来选择多核苷酸引发剂。

用于预期在靶基因的RNAi-介导的沉默中可能有效的核苷酸序列的方法和算法是本领域已知的。这种方法和算法的非限制性实例包括Ichihara等(2007)Nucleic AcidsRes.,35(18):123e描述的“i-得分”；可在rna.urmc.rochester.edu/servers/oligowalk上公开地获得并由Lu等(2008)Nucleic Acids Res.,36:W104-108描述“Oligowalk”；和Khovorova等(2004)Nature Biotechnol.,22:326-330描述的“Reynolds得分”。

允许的错配

“基本上同一”或“基本上互补”是指引发剂多核苷酸(或双链多核苷酸的至少一条链)与靶基因或由靶基因转录的RNA(例如转录物)具有足够的同一性或互补性以抑制靶基因的表达(例如，引起靶基因转录物和/或编码蛋白的水平或活性降低)。本发明的多核苷酸不需要与靶基因或由靶基因转录的RNA具有100％同一性以抑制靶基因的表达(例如，引起靶基因转录物或编码蛋白的水平或活性降低，或提供昆虫物种的控制)。在一些实施方式中，多核苷酸或其部分设计为与靶基因或由靶基因转录的RNA中的至少18或19个连续核苷酸的序列基本上同一或互补。在一些实施方式中，当与内源性靶基因或由靶基因转录的RNA中的18个或更多个连续核苷酸的序列相比时，“基本上同一”的多核苷酸具有100％序列同一性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性。在某些实施方式中，当与靶基因或由靶基因转录的RNA中的18个或更多个连续核苷酸的序列相比时，“基本上互补”的多核苷酸具有100％序列互补性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列互补性。

包含与靶基因或转录物的错配的多核苷酸可用于本发明组合物和方法的某些实施方式中。在一些实施方式中，多核苷酸包括与靶基因或靶基因转录物的等效长度的片断基本上同一或基本上互补的至少18或至少19个连续的核苷酸。在某些实施方式中，与靶基因或靶基因转录物的等效长度的片断基本上同一或基本上互补的19个连续核苷酸的多核苷酸可以具有与靶基因或转录物的1个或2个错配(即多核苷酸的19个连续核苷酸和靶基因或靶基因转录物的等效长度的片断之间的1个或2个错配)。在某些实施方式中，包含与靶基因或靶基因转录物的等效长度的片断同一或互补的连续的19个核苷酸跨度的20个或更多个核苷酸的多核苷酸可以具有与靶基因或转录物的1或2个错配。在某些实施方式中，与靶基因或靶基因转录物的等效长度的片断基本上同一或基本上互补的21个连续核苷酸的多核苷酸可以具有与靶基因或转录物的1、2或3个错配。在某些实施方式中，包含与靶基因或靶基因转录物的等效长度的片断同一或互补的连续的21个核苷酸跨度的22个或更多个核苷酸的多核苷酸可以具有与靶基因或转录物的1、2或3个错配。

在设计与内源性靶基因或由靶基因转录的RNA具有错配的多核苷酸时，可以使用更可能被耐受的某些类型和某些位置的错配。在某些示例性的实施方式中，使用腺嘌呤和胞嘧啶或鸟嘌呤核苷和尿嘧啶残基之间的错配，如Du et al.(2005)Nucleic Acids Res.,33:1671-1677所描述。在一些实施方式中，19个碱基对重叠区中的错配位于低耐受性5、7、8或11位(从19个核苷酸靶标的5'端)、位于中等耐受性3、4和12-17位(从19个核苷酸靶标的5'端)、和/或在互补性区域的任一端的高耐受性位置，即1、2、18和19位(从19个核苷酸靶标的5'端)，如Du et al.(2005)Nucleic Acids Res.,33:1671-1677所描述。耐受的错配可以在常规试验例如本文实施例中描述的那些中凭经验测定。

在一些实施方式中，由于稳定性原因或为了在克隆或合成中方便，多核苷酸包括额外的核苷酸。在一个实施方式中，多核苷酸是包括RNA链的dsRNA，所述RNA链具有选自SEQID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的至少21个连续核苷酸的片断，并进一步包括邻接片断的额外的5'G或额外的3’C或两者。在另一个实施方式中，多核苷酸是包括额外的核苷酸以形成悬垂的双链RNA，例如包括2个脱氧核糖核苷酸以形成3'悬垂的dsRNA。

将活性引发剂埋入中性序列

在实施方式中，将生物活性引发剂(即具有对应于靶基因的序列的多核苷酸且其引起靶基因中观察到的抑制)埋入“中性”序列，即插入与靶基因不具有同一性或互补性的额外的核苷酸中。中性序列可以是期望的，例如增加多核苷酸的整体长度。例如，为稳定性、制造成本有效或生物活性的理由，可以期望多核苷酸是特定大小。

已经报道，在另一种鞘翅类昆虫物种玉米根虫(Diabrotica virgifera)中，大于或等于约60个碱基对(bp)的dsRNA是人工饲料生物学分析中的生物活性所需要的；参见Bolognesi等(2012)PLoS ONE7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534。因此，在一个实施方式中，将对应于表1中的靶基因且发现提供昆虫侵扰控制的21个碱基对的dsRNA引发剂埋入额外的39个碱基对的中性序列中，由此形成约60个碱基对的多核苷酸。在另一个实施方式中，发现当埋入较大部分的中性序列时(即总多核苷酸长度为约60到约300个碱基对)，单个21个碱基对的引发剂是有效的。在另一个实施方式中，将选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的至少21个连续核苷酸的至少一个片断埋入较大部分的中性序列以提供有效的引发剂。另一个实施方式中，将来自选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的多个序列的片断埋入较大部分的中性序列以提供有效的引发剂。

与由单独的重组RNA或单独的非多核苷酸杀虫剂得到的效果相比，预期本发明的某些重组RNA(例如具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的dsRNA引发剂，或这些引发剂的活性片段)和一种或多种非多核苷酸杀虫剂的组合将导致预防或控制昆虫侵扰的协同改进。常规的昆虫生物学分析例如本文的工作实施例中描述的生物学分析可利用本发明多核苷酸和一种或多种非多核苷酸杀虫剂(例如马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白)的组合来定义幼虫死亡率或生长抑制的剂量响应。本领域技术人员可以在常规的生物学分析中测试多核苷酸和非多核苷酸杀虫剂的组合以鉴别具有协同作用和期望用于保护植物免受昆虫侵扰的生物活性物质的组合。

实施例8

该实施例阐明将本发明多核苷酸用于局部施用的组合物中以预防或控制昆虫侵扰的非限制性实施方式。

包含本发明一种或多种多核苷酸的组合物可用作其中期望预防或控制Leptinotarsa物种侵扰的植物、动物或环境的局部处理。在实施方式中，将有效量的具有选自SEQ ID NOs:1-12和43-44的序列的靶基因(即如之前的实施例所描述的表1中鉴定的靶基因)的多核苷酸引发剂引入设计为直接(例如通过接触或摄取)向昆虫物种、或其中期望预防或控制昆虫侵扰的植物或环境提供的组合物中。在实施方式中，将有效量的具有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的靶基因的多核苷酸引发剂引入这种组合物中。在实施方式中，将有效量的含有选自SEQ ID NOs:13-26、28-29、30-42、45和46的序列的链的dsRNA引发剂或这些引发剂的活性片段引入这种组合物中。这种组合物根据现有技术配制和制备，并可以为任何方便的形式，例如溶液或溶液混合物、乳剂、悬浮液、可分散粉末、固体或液体诱饵、种子包衣或土壤浇灌。这种组合物的实施方式包括其中将本发明多核苷酸提供于活的或死的微生物例如细菌或真菌或酵母细胞中，或作为微生物发酵产品提供，或提供于活的或死的植物细胞中，或作为合成的重组多核苷酸提供的那些。在实施方式中，组合物包括包含本发明多核苷酸的微生物的非致病性菌株；摄取或摄入微生物导致虫害的发育障碍或死亡；适合的微生物的非限制性实例包括大肠杆菌、苏云金芽胞杆菌(B.thuringiensis)、假单胞细菌属、发光杆菌属(Photorhabdus sp.)、致病杆菌属、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)或和相关沙雷氏菌属、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、日本甲虫芽孢杆菌(B.popilliae)、双酶梭菌和其他梭菌种，或其他形成孢子的革兰氏阳性细菌。在实施方式中，组合物包括包含本发明多核苷酸的植物病毒载体；通过用植物病毒载体处理的植物上的昆虫进食导致昆虫的发育障碍或死亡。在实施方式中，组合物包括包含本发明多核苷酸的杆状病毒载体；摄取或摄入载体导致昆虫的发育障碍或死亡。在实施方式中，将本发明多核苷酸包封于合成基质例如聚合物中或附着于微粒并局部施用于植物表面；通过被局部处理的植物上的昆虫进食导致昆虫的发育障碍或死亡。在实施方式中，将本发明多核苷酸以表达多核苷酸的植物细胞形式(例如本发明转基因植物细胞)提供；通过昆虫摄取植物细胞或植物细胞内容物导致昆虫的发育障碍或死亡。

组合物的实施方式任选包括有效叶状覆盖所需的适当的粘着剂和湿润剂以及保护多核苷酸例如dsRNA免受UV损伤的UV保护剂。这种添加剂通常用于生物杀虫剂工业并且是本领域技术人员已知的。向土壤施用的组合物可以包括作为昆虫幼虫的诱饵的颗粒制剂。实施方式包括载体试剂、表面活性剂、有机硅酮、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂、诱虫剂和昆虫生长调节剂。在实施方式中，所述组合物进一步包括至少一种选自马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白的杀虫剂。

这种组合物以任何方便的方式施用，例如，通过直接向昆虫喷雾或撒粉，或向其中期望预防或控制昆虫侵扰的植物或环境喷雾或撒粉，或通过向植物表面施用涂层，或通过向为种子的种植准备的种子(或种用马铃薯)施用涂层，或通过在期望预防或控制昆虫侵扰的植物的根周围施用土壤浇灌。

本发明多核苷酸的有效量是足以提供昆虫控制或足以预防昆虫侵扰的量；本发明多核苷酸的有效量使用常规试验例如本文工作实施例中描述的那些来测定。尽管用于本文提供的方法和组合物的本发明多核苷酸的浓度和剂量不存在上限，较低有效浓度和剂量将是效率和经济所常规寻求的。多核苷酸的有效量的非限制性实施方式包括喷雾在植物上的液体形式的约10毫微克每毫升到约100微克每毫升的多核苷酸，或向植物田间施用的约10毫克每英亩到约100克每英亩的多核苷酸，或用于饲养昆虫的人工饲料中约0.001到约0.1微克每毫升的多核苷酸。当向植物局部施用本发明组合物时，可以考虑向植物叶片或其他的植物部分表面例如花朵花瓣、茎、块茎、果实、花药、花粉、叶、根或种子施用的喷雾或处理的体积来调节浓度。在一个实施方式中，使用本发明25聚体多核苷酸的草本植物的有用的处理是约1纳摩尔(nmol)的多核苷酸/植物，例如约0.05-1nmol多核苷酸/植物。其他用于草本植物的实施方式包括约0.05-约100nmol、或约0.1-约20nmol、或约1nmol-约10nmol的多核苷酸/植物的有用范围。在某些实施方式中，施用约40-约50nmol的本发明ssDNA多核苷酸。在某些实施方式中，施用约0.5nmol-约2nmol的本发明dsRNA。在某些实施方式中，施用包含约0.5-约2.0毫克每毫升、或约0.14毫克每毫升的本发明dsRNA或ssDNA(21聚体)的组合物。在某些实施方式中，施用约0.5-约1.5毫克每毫升的约50-约200或更多个核苷酸的本发明dsRNA多核苷酸的组合物。在某些实施方式中，向植物施用约1nmol-约5nmol的本发明dsRNA。在某些实施方式中，向植物局部施用的多核苷酸组合物包含至少一种浓度为约0.01-约10毫克每毫升、或约0.05-约2毫克每毫升、或约0.1-约2毫克每毫升的本发明多核苷酸。非常大的植物、树或藤本植物可能需要相应地较大量的多核苷酸。当使用可以加工成多个寡核苷酸(例如本发明单个重组DNA分子编码的多个引发剂)的本发明的长dsRNA分子时，可以使用较低浓度。有效的多核苷酸处理方案的非限制性实例包括约0.1-约1nmol的多核苷酸分子/植物、或约1nmol-约10nmol的多核苷酸分子/植物、或约10nmol-约100nmol的多核苷酸分子/植物的处理。

本发明组合物的实施方式包括“转移剂”，即当与向生物表面局部施用的包括本发明多核苷酸的组合物结合时，能够使多核苷酸进入该生物的细胞的试剂。这种转移剂可以作为包括本发明多核苷酸的组合物的一部分，或可以在施用包括本发明多核苷酸的组合物之前、同时或之后施用。在实施方式中，转移剂是促进昆虫对本发明多核苷酸的吸收的试剂。在实施方式中，转移剂是调节植物组织例如种子、叶、茎、根、花或果实的表面以使本发明多核苷酸渗透进入植物细胞的试剂。在实施方式中，转移剂为本发明多核苷酸穿过角质层蜡质屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障进入植物细胞提供了一条途径。

适合的转移剂包括增加生物外部对本发明多核苷酸的渗透性或增加生物细胞对本发明多核苷酸的渗透性的试剂。适合的转移剂包括化学试剂、或物理试剂、或其组合。用于调节或转移的化学试剂包括(a)表面活性剂、(b)有机溶剂或水性溶液或有机溶剂的水性混合物、(c)氧化剂、(d)酸、(e)碱、(f)油、(g)酶，或其组合。在实施方式中，施用本发明组合物和转移剂可以任选地包括孵育步骤、中和步骤(例如，中和酸、碱或氧化剂，或者使酶失活)、冲洗步骤或其组合。适合的转移剂可以是乳剂、反相乳剂、脂质体或其它类胶束组合物的形式，或可以引起多核苷酸组合物为乳剂、反相乳剂、脂质体或其它类胶束组合物的形式。转移剂的实施方式包括平衡离子或已知与核酸分子有关的其它分子，例如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺(诸如精胺、亚精胺或腐胺)及其它阳离子。转移剂的实施方式包括有机溶剂，例如DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇，或与水可混溶或将磷酸核苷酸溶解于非水系统(诸如用于合成反应中)中的其它溶剂。转移剂的实施方式包括含或不含表面活性剂或乳化剂的天然来源或合成的油，例如植物来源的油、作物油(诸如第9版Compendium of Herbicide Adjuvants中所列的那些，在网络的herbicide.adjuvants.com上公开可用)、石蜡油、多元醇脂肪酸酯，或具有用酰胺或多胺(诸如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷)修饰的短链分子的油。

转移剂的实施方式包括有机硅酮制剂。例如，适合的转移剂是以SILWET

牌表面活性剂可商购的有机硅酮制剂，该表面活性剂具有CAS编号27306-78-1和EPA编号：CAL.REG.NO.5905-50073-AA，并且目前可从Momentive Performance Materials，Albany,New York获得。在使用SILWET

牌表面活性剂有机硅酮制剂作为植物叶或其它植物表面的喷雾处理形式的转移剂(与包括本发明多核苷酸的组合物之前、同时或之后施用)的实施方案中，新鲜制备的以重量计为约0.015到约2％(wt％)范围内(例如约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的浓度可有效准备叶或其它植物表面以使本发明的多核苷酸通过局部施用于该表面转移到植物细胞中。一个实施方式包括包含本发明多核苷酸和包括以重量计为约0.015到约2％(wt％)范围内(例如约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的有机硅酮制剂(例如Silwet L-77)转移剂的组合物。一个实施方式包括包含本发明多核苷酸和包括以重量计为约0.3到约1％(wt％)或约0.5到约1％(wt％)范围内的SILWET

牌表面活性剂的转移剂的组合物。

在本发明中用作转移剂的有机硅酮化合物包括但不限于，包括以下的化合物：(a)共价连接的三硅氧烷头基；(b)共价连接的烷基连接基，包括但不限于，正丙基连接基；(c)共价连接的聚二醇链；(d)端基。这种有机硅酮化合物的三硅氧烷头基包括但不限于，七甲基三硅氧烷。烷基连接基可以包括但不限于，正丙基连接基。聚二醇链包括但不限于，聚乙二醇或聚丙二醇。聚二醇链可以包含一种提供平均链长度“n”为约“7.5”的混合物。在某些实施方案中，平均链长度“n”可以在约5到约14间变化。端基可以包括但不限于，烷基，诸如甲基。在本发明中用作转移剂的有机硅酮化合物包括但不限于，三硅氧烷乙氧化物表面活性剂或聚环氧烷改性的七甲基三硅氧烷。用于本发明的转移剂的实例是化合物I：

(化合物I：聚环氧烷七甲基三硅氧烷，平均n＝7.5)。

在本发明中用作转移剂的有机硅酮化合物例如以新鲜制备的以重量计为约0.015到约2％(wt％)范围内(例如约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt％)的浓度使用。

转移剂的实施方式包括一种或多种盐，例如氯化铵、四丁基溴化磷和硫酸铵，与包括本发明多核苷酸的组合物一起提供或使用。在实施方式中，氯化铵、四丁基溴化磷和/或硫酸铵以约0.5％到约5％(w/v)、或约1％到约3％(w/v)、或约2％(w/v)的浓度使用。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括浓度大于或等于300毫摩尔的铵盐。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括浓度为约0.015-约2wt％(wt％)的有机硅酮转移剂以及浓度为约80-约1200mM或约150mM-约600mM的硫酸铵。

转移剂的实施方式包括磷酸盐。用于包括本发明多核苷酸的组合物的磷酸盐包括但不限于，磷酸钙、镁、钾或钠盐。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括浓度为至少约5毫摩尔、至少约10毫摩尔、或至少约20毫摩尔的磷酸盐。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括约1mM-约25mM或约5mM-约25mM的磷酸盐。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括浓度为至少约5毫摩尔、至少约10毫摩尔、或至少约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括浓度为约5毫摩尔、约10毫摩尔、或约20毫摩尔的磷酸钠。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括约1mM-约25mM或约5mM-约25mM的磷酸钠。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括约10mM-约160mM或约20mM-约40mM的磷酸钠。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物包括pH为约6.8的磷酸钠缓冲液。

转移剂的实施方式包括表面活性剂和/或其中所包含的有效分子。表面活性剂和/或其中所包含的有效分子包括但不限于脂肪酸的钠或锂盐(例如牛脂或牛脂胺或磷脂)和有机硅酮表面活性剂。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物用平衡离子或已知与核酸分子结合的其它分子来配制。非限制性实例包括四烷基铵离子、三烷基铵离子、锍离子、锂离子和多胺例如精胺、亚精胺或腐胺。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物用非多核苷酸除草剂例如草甘磷、植物生长素样苯甲酸除草剂包括麦草畏、草灭平、和TBA、草丁膦、植物生长素样除草剂包括苯氧基羧酸除草剂、吡啶羧酸除草剂、喹啉羧酸除草剂、嘧啶羧酸除草剂和草除灵乙基除草剂、磺酰脲、咪唑啉酮、茅草枯(delapon)、环己二酮(cyclohezanedione)、原卟啉原氧化酶抑制剂、和4-羟苯基-丙酮酸盐双加氧酶抑制除草剂配制。在某些实施方式中，包括本发明多核苷酸的组合物用非多核苷酸杀虫剂例如马铃薯糖蛋白、植物血凝素、植物蜕皮甾体、苏芸金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌属杀虫蛋白、发光杆菌属杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白配制。

本文公开并要求保护的所有材料和方法可以通过以上公开按照指示无需过度实验制备和使用。虽然已经根据优选的实施方式和说明性的实施例描述了本发明的材料和方法，对本领域技术人员显而易见的是，在不离开本发明概念、精神和范围的情况下本文描述的材料和方法可以加以变化。对本领域技术人员显而易见的所有这种类似的替代和修改被认为在如附加的权利要求所定义的本发明精神、范围和概念内。