CN102985545A - 新型微小rna前体及其在调控靶基因表达中的用途 - Google Patents

Abstract

提供了通过表达重组微小RNA前体，调节植物中的靶基因表达的方法。也提供了所述重组微小RNA前体用于控制线虫，特别地控制大豆孢囊线虫的用途。还提供了将遗传材料导入易感线虫的植物中从而增加对线虫的抗性的方法。

Description

新型微小RNA前体及其在调控靶基因表达中的用途

摘要

本申请是植物分子生物学的领域并提供了通过表达重组微小RNA前体来调节植物中的靶基因表达的方法。本申请还涉及此类重组微小RNA前体用于控制线虫，特别是控制大豆孢囊线虫的用途。本申请还涉及将遗传材料导入到易感线虫的植物中，从而增加对线虫的抗性。

发明描述

植物中的基因表达是高度受控的机制，涉及的所有步骤均受调控。例如转录装置对基因组DNA的可接近性或信使的稳定性调控。过去数年里显示，RNA分子(例如信使RNA)的稳定性和可接近性受小干扰RNA(siRNA)(例如微小RNA、ta-siRNA等)的高度调控。

微小RNA是作为动物和植物中进化保守的、基于RNA的基因表达调控子出现的。微小RNA(约18至25nt)来自更大的前体——pre-miRNA，具有从非蛋白质编码基因转录而来的茎环结构。

目前已知植物微小RNA抑制大量在发育过程中有功能的基因的表达，表示基于微小RNA的调控与控制生长和发育的途径是一个整体。抑制基因表达的植物微小RNA通常含有与靶位点接近完美的互补性，所述靶位点通常位于mRNA的蛋白质编码区(Llave C等人，(2002)Science 297，2053-2056；Rhoades MW等人，(2002)Cell 110，513-520)。结果是，在植物中，大部分的抑制基因表达的植物微小RNA在指导靶RNA切割中发挥功能(Jones-Rhoades MW和Bartel DP(2004)Mol.Cell 14，787-799；Kasschau KD等人，(2003)Dev.Cell 4，205-217)。

各种出版物描述了微小RNA的功能，及其通过在植物中过表达内源或重组微小RNA来作为下调靶基因表达的工具的用途。Ossowski等人，(2008)给出了使用人工siRNA(例如微小RNA)沉默基因的方法的综述。

Schwab等人(2006)在拟南芥中显示，当用于改造抑制靶基因时，并非所有的微小RNA前体都等同良好地用于沉默。例如，经过改造用于靶向相同靶基因的前体MIR319a和MIR172a表现出不同程度的对靶基因的下调，MIR319a更有效地沉默相应的靶基因。

此外，良好地适合在一个物种中有效沉默靶基因的微小RNA前体可能不能在另一个物种中发挥同等良好的作用(Alvarez J P等人，2006植物细胞18：1134-1151)。

因此，本发明的一个已有的目标是提供其他的微小RNA前体，其通过递送小调节RNA(如微小RNA、ta-siRNA、siRNA、激活RNA等)可用作植物中靶基因沉默的有效工具。本发明的另一个目标是提供这样的微小RNA前体，所述微小RNA前体可用作大豆属植物中，优选大豆(Glycinemax)中靶基因沉默的有效工具。

此类重组微小RNA前体是例如用于调节参与植物和病原体(如线虫)相互作用的基因的有效工具，从而预防感染和增加植物(如大豆)的病原体抗性。

线虫是以2000多种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物为食的微小线虫动物，在全世界引起大约1千亿美元的作物损失。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根癌线虫(root-knot nematode)(RKN)、胞囊形成线虫(cyst-forming nematode)和病变形成线虫(lesion-forming nematode)。以在进食位点引起根虫瘿形成为特征的根癌线虫，具有相对广的宿主范围并因此在多种作物物种上是致病的。胞囊形成线虫和病变形成线虫具有较为有限的宿主范围，但是仍在易感作物中引起相当大的损失。

致病线虫目前遍及整个美国，在南部和西部的温暖、潮湿区域以及在沙质土壤中发生最为密集。1954年，首次在美国北卡罗莱纳州发现了大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode)(Heterodera glycines)，其是大豆植物最严重的害虫。一些地区受到大豆胞囊线虫(SCN)侵染太严重，以至于不采取控制措施，大豆产量将不再是经济上可行的。尽管大豆是受到SCN攻击的主要经济作物，但是SCN总共寄生大约50种宿主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。

线虫损害的病征包括在炎热时期叶子的矮化和黄化，以及植物枯萎。然而，线虫感染可以在没有任何明显的地上疾病症状的情况下引起显著的产量损失。产量降低的主要原因是由于地下的根损伤。受到SCN感染的根会矮化或者发育不良。线虫感染也可以减少根上固氮根瘤的数量，并可以使根更易于受到其他土传植物病原体的攻击。

线虫的生活史具有三个主要的阶段：卵、幼体和成体。线虫物种之间生活史不同。例如，在最佳的条件下，SCN的生活史通常可以在24到30天内完成，然而其他物种可能需要1年或者更长以完成生活史。在春天，当温度和湿度水平变得有利的时候，在土壤中，虫状的幼体从卵中孵化。只有在幼体发育阶段的线虫能感染大豆根。

SCN的生活史是很多研究的主题，并且其是理解线虫生活史的有用的实例。在渗透入大豆根后，SCN幼体移动穿过根直到它们接触到维管组织，在那时，它们停止迁移并开始进食。通过口针，线虫注射修饰某些根细胞的分泌物并将它们转变成专门的进食位点。根细胞在形态上被转化成作为线虫的营养来源的大型多核合胞体(或者在RKN的情况下为巨大细胞)。因此，主动进食线虫从植物中盗取基本营养物质，造成了产量损失。随着雌性线虫进食，它们开始膨大并最终变得太大以至于它们的身体突破了根组织并暴露于根的表面。

在一段时间的进食后，没有如成体膨大的雄性SCN线虫，迁移到根的外面进入土壤中并使增大的成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍依附于根系统并继续进食。在膨大的雌性内的卵开始发育，最初在体外的团块(mass)或卵囊内，并然后随后在线虫体腔内。最终，整个成年雌性体腔都充满了卵，且线虫死去。死亡雌性的充满卵的身体称为胞囊。胞囊最终扩散并在土壤中可随意发现。胞囊的壁变得非常坚硬，为包含在其中的大约200至400个卵提供良好的保护。SCN的卵在胞囊中存活直到合适的孵化条件出现。尽管许多卵可以在第一年内孵化，但是许多卵也会在保护性胞囊中存活几年。

线虫在土壤中以其自身的能力每年仅可以移动几英寸。然而，线虫感染可以以多种方式传播相当远的距离。任何移动受感染土壤的东西都能传播感染，包括农业机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人。土壤的种子大小颗粒常常污染收获的种子。因此，当从受感染的田地的受污染的种子播种在未受感染的田地的时候，线虫感染可以传播。甚至有证据表明，某些线虫物种可以通过鸟类传播。这些原因中仅有一些可以预防。

用于管理线虫感染的常规方法包括：在受线虫感染的土地中保持合适的土壤营养和土壤pH水平；控制其他植物疾病，以及昆虫和杂草害虫；仅在耕种了未感染田地后使用卫生实践，如线虫感染田地的耕作、种植和栽培；在受感染的田地作业后，用高压水或者蒸汽彻底清洁设备；不使用在受感染的土地上生长的种子用于种植未感染的田地，除非种子已经适当地清洁；轮作受感染的田地并用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和种植抗性植物品种。

已经提出了用于植物的基因转化的方法以赋予对植物寄生线虫增加的抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及在受到线虫附着后在植物的进食位点内或者附近特异表达的植物基因的鉴定。这些植物靶基因的启动子随后可用于指导有害蛋白质或者酶的特异表达，或者靶基因或一般细胞基因的反义RNA的表达。此植物启动子也可以用于通过用包含连接于其产物诱导线虫摄食之后死亡的基因的植物靶基因启动子的构建体转化植物，从而在进食位点特异地赋予线虫抗性。

尽管已经有许多努力使用基因抑制方法控制寄生线虫，到目前为止，在任何国家中还没有解除对转基因线虫抗性的植物的管制。因此，仍然存在使用RNAi或重组微小RNA前体来鉴定用于控制植物寄生线虫和生产具有增加的植物寄生线虫抗性的植物的安全且有效的组合物和方法的需要。

发明详述

本发明的第一个实施方案涉及分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含核酸分子，所述核酸分子包含在下述组中：

I)由SEQ ID NO：1、3和10所示核酸分子，和

II)具有SEQ ID NO：1所述序列的至少100个，优选至少143个(例如150个)，更优选至少195个(例如200个)，更优选至少250个，甚至更优选355个，最优选500个连续的碱基对的核酸分子，其中分别地，至少100bp包含SEQ ID NO：1的第151至250位碱基对，至少143bp(例如150)包含SEQ ID NO：1的第139至281位碱基对，至少195bp(例如200bp或250bp)包含SEQ ID NO：1的第127至321位碱基对，和至少355bp(例如500bp)包含SEQ ID NO：1的第10至363位碱基对，和

III)与SEQ ID NO：1所述序列的至少100个，优选至少143个(例如150个)，更优选至少195个(例如200个)，更优选至少250个，更优选355个，甚至更优选500个，最优选793个连续的碱基对的序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少85％或90％，甚至更优选至少95％、97％。98％，最优选99％的同一性的核酸分子，其中分别地，至少100bp包含SEQ ID NO：1的第151至250位碱基对，至少143bp(例如150)包含SEQ ID NO：1的第139至281位碱基对，至少195bp(例如200bp或250bp)包含SEQ ID NO：1的第127至321位碱基对，且至少355bp(例如500bp)包含SEQ ID NO：1的第10至363位碱基对，和

IV)与SEQ ID NO：1所述序列的至少100个，优选至少143个(例如150个)，更优选至少195个(例如200个)，更优选至少250个，甚至更优选355个，最优选500个连续碱基对的核酸分子在严谨条件下，优选高严谨条件下，最优选非常高严谨条件下杂交的，至少100，优选150，更优选200，甚至更优选250，最优选500bp的核酸分子，其中分别地，至少100bp包含SEQ ID NO：1的第151至250位碱基对，至少143bp(例如150)包含SEQ ID NO：1的第139至281位碱基对，至少195bp(例如200bp或250bp)包含SEQ ID NO：1的第127至321位碱基对，且至少355bp(例如500bp)包含SEQ ID NO：1的第10至363位碱基对，和

V)能够形成或形成与由SEQ ID NO：1形成的二级结构同源，优选地相同的二级结构的核酸分子

VI)如I)至V)中任一项所限定的任何序列的互补序列。

SEQ ID NO：1或10所示核酸分子编码源自大豆的新型植物微小RNA前体。SEQ ID NO：3所示核酸分子表示由SEQ ID NO：1或10所示的各自的微小RNA前体基因的基因组克隆。此类前体分子一旦转录成RNA，就折叠为包含茎环结构(也被称为发夹结构)的特异性二级结构，其中茎可以包含非互补碱基对的或仅在茎一侧插入到茎中的碱基对的突起。植物细胞装置识别折叠成其各自二级结构的前体分子，然后加工前体分子并释放包含在各个前体分子中的微小RNA分子序列。至少包含由SEQ ID NO：1的碱基对139至281所示的所述发夹结构的SEQ ID NO：1的片段表示前体微小RNA分子的有功能的片段，并也包括在本发明中。

可以例如通过使用核酸二级结构预测软件(例如CentroidFold(Michiaki Hamada等人(2009))、CONTRAfold(Do等人(2006))、KineFold(Xayaphoummine等人(2005))、Mfold(Zuker和Stiegler(1981))、Pknots(Rivas和Eddy(1999))、PknotsRG(Reeder等人(2007))、RNAfold(Hofacker等人(1994))、RNAshapes(Giegerich等人(2004))、RNAstructure(Mathews等人(2004))、Sfold(Ding等人(2004))或UNAFold(Markham和Zuker(2008)))来预测微小RNA的结构。

如图1所示的包含SEQ ID NO：1的碱基对139至281的发夹结构是本发明的一个实施方案，所述发夹结构包含在含有微小RNA序列的SEQID NO：1、3和10中。植物细胞装置识别该结构，并加工该结构以释放包含在SEQ ID NO：1的碱基对139至281的所述二级结构中的的微小RNA。微小RNA位于碱基对225和235之间，微小RNA星位于SEQ IDNO：1的碱基对159和179之间。

使用生物信息学工具Mfold(Zuker(2003))，使用下列设置已经预测了二级结构：限定RNA为线性，折叠温度固定为37℃，离子条件设置为1M NaCl，无二价离子，次优百分比设置为5，计算折叠数的上限设为50，窗口参数为默认的，最大内部/突起环大小设为30，内部/突起环的最大不对称性设为30，配对碱基之间的最大距离不限。本领域技术人员理解可以使用其他参数或另一程序来不同地预测二级结构。起始于SEQ IDNO：1的碱基对139和281之间的序列的5’端，上文V)中限定的本发明核酸分子的发夹结构可以描述为包含：

8bp茎、1bp突起、5bp茎、1bp错配、11bp茎、2bp错配、6bp茎、2bp错配、5bp茎、4bp突起、2bp茎、2bp突起、6bp茎、1bp突起、3bp茎、9bp环、3bp茎、2bp突起、6bp茎、1bp突起、2bp茎、2bp突起、5bp茎、2bp错配、6bp茎、2bp错配、11bp茎、1bp错配、5bp茎、2bp突起、4bp茎、6bp环、4bp茎、3bp突起、8bp茎。

如上文V)所限定的有功能的核酸分子在本发明的一个实施方案中可以具有可变大小的环、突起和/或茎。此外，错配和突起的数量可以改变。在本发明的另一个实施方案中，相比SEQ ID NO：1的碱基对139和281，图1所描述的二级结构可以包含至少20个，优选至少15个，更优选至少10个，甚至更优选至少5个，最优选4、3、2或1个额外的碱基对。在本发明的其他实施方案中，二级结构可以包含比SEQ ID NO：1的碱基对139和281少20个或更少，优选少15个或更少，更优选少10个或更少，甚至更优选少5个或更少，最优选少4、3、2或1个的碱基对。

例如，第一环的大小可以在4和14bp之间改变，优选5至13，优选6至12，更优选7至11，最优选8至10，其中包括了边界值。

在本发明的其他实施方案中，第二环的大小可以在2和10bp之间改变，优选3至9，优选4至9，更优选5至8，最优选5至7，其中包括了边界值。如图1显示的二级结构的一个或两个环的大小都可以改变。

本发明的二级结构的任何茎的大小可以增加例如5个、优选4个、更优选3个、甚至更优选2个、最优选1个碱基对。本发明的微小RNA前体分子的二级结构中可以再导入至多10个错配，例如9或8或7个，优选6或5或4个，更优选3个，甚至更优选2个，最优选1个错配。在本发明的另一个实施方案中，错配的数量可以降低至0，优选1，更优选2，甚至更优选3，最优选4个错配。

此外，二级结构中的突起数量可以增加或减少2个，优选1个突起。突起的大小可以增加至多6个碱基，例如5个碱基，优选4个，更优选3个，甚至更优选2个，最优选1个碱基。突起的大小还可以减少2个，优选1个碱基。

在限定的条件下，上文V)限定的本发明的结构的热动力学值是dG＝-60.80。

本领域技术人员可知热动力学值可以与该值不同而不丧失各自二级结构的功能，因而所述微小RNA前体分子的二级结构仍可被植物细胞识别和加工，从而释放包含在所述微小RNA前体分子中的微小RNA分子。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的二级结构的dG值可以在40和80之间，优选45和75之间，更优选50和70之间，甚至更优选55和65之间，最优选57或58或59和64或63或62之间，其中包括了边界值。

当用相同程序和相同条件计算时，包含在由上文II)至VI)限定的序列所表示的核酸分子中的发夹结构的dG值，可以与图1所示SEQ ID NO：1的碱基对139至281所表示的分子的计算的dG值偏离50％或更少，优选30％或更少，更优选25％或更少，甚至更优选10％或更少。在最优选的实施方案中，包含在由上文II)至VI)限定的序列所表示的核酸分子中的发夹结构的dG值等于包含在SEQ ID NO：1的碱基对139至281中的发夹结构的dG值。

在如上述所限定的分离的核酸分子中：

a)SEQ ID NO：1的bp 225-245或上文的II)至VI)限定的核酸分子的相应碱基对被与靶基因互补的、包含至少20或21或22bp，优选21bp的核酸序列或其多个取代，和

b)SEQ ID NO：1的bp 159-179或上文的II)至VI)限定的核酸分子的相应碱基对被与a)互补的、包含至少20或21或22bp，优选21bp的核酸序列或其多个取代，且其中a)和b)和分隔a)和b)的核酸分子能够形成茎环结构。

是本发明的其他实施方案。

上文a)和b)限定的碱基对表示包含在上文限定的微小RNA前体分子中的微小RNA和微小RNA星分子。在加工所述前体分子后，在植物细胞中从前体分子中释放包含微小RNA和微小RNA星分子的双链分子。

微小RNA星序列可以与微小RNA序列完全互补，或者较之微小RNA序列，可以包含1个或多个，例如1个或2个或更多个，例如2个或3个或更多个，例如3个或4个或更多个，例如4个错配。

在一个实施方案中，分离的核酸分子包含1个或多个之间的微小RNA和微小RNA星分子。在优选的实施方案中，分离的核酸分子包含在1个和50个之间的微小RNA和微小RNA星分子。在更优选的实施方案中，核酸分子包含在1个和10个之间，甚至更优选在1个和5个之间，在最优选的实施方案中，其包含1个或2个，优选1个微小RNA和微小RNA星分子。

上文使用的“相应碱基对”意指包含在由上文II)至VI)限定的序列所表示的各自核酸分子中的碱基对，所述各自核酸分子分别表示微小RNA和微小RNA星分子。本领域技术人员普遍了解如何鉴别此类相应的碱基对。例如，可以通过比对SEQ ID NO：1和上文II)至VI)限定的序列来鉴别。分别与SEQ ID NO：1的bp 159-179和bp 225-245比对的序列表示各自相应的碱基对。

本领域技术人员了解设计和合成在植物细胞中有调节靶基因表达的功能的微小RNA的方法。

如上文限定的分离的核酸是本发明的另外的实施方案，其中SEQ IDNO：1的bp 225-245或上文II)至VI)限定的核酸分子的相应碱基对被选自下述组的序列取代：

a.SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示的核酸分子，或其多个，或

b.具有SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所描述的序列的至少15个或16个，优选17个，更优选18个，甚至更优选19个，最优选20个连续碱基对的核酸分子，或其多个，或

c.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项的全部序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选90％，甚至更优选95％，最优选97、98或99％同一性的核酸分子，或其多个，或

d.较之SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项包含5个错配，优选4个错配，优选3个错配，更优选2个错配，最优选1个错配的核酸分子，或其多个，或

e.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述核酸序列在高严谨条件下杂交的核酸分子，或其多个。

包含上文限定的分离的核酸分子的植物表达构建体是本发明的另外的主题。

用于本文中的植物表达构建体意指能够指导特别的核苷酸序列在植物的恰当部分或植物细胞中表达的核酸分子，其包含在其所导入的所述植物或植物细胞中的有功能的启动子，所述启动子与本发明的分离的核酸分子有效连接，所述分离的核酸分子任选地与一个或多个终止信号有效连接。

优选的有功能的启动子或与本发明的分离的核酸分子有效连接的启动子(在本文中同义的使用)是组成型启动子、诱导型启动子(优选病原体诱导型启动子，例如线虫诱导型启动子)、组织特异性，优选根特异性或线虫进食位点特异性的启动子和/或发育特异性的启动子。

本发明还涉及包含上文限定的分离的核酸分子的植物表达载体或上文限定的表达构建体。优选的，植物表达载体是病毒载体、质粒载体或二元载体。

包含上文限定的分离的核酸分子，或上文限定的表达构建体，或上文限定的植物表达载体的植物、植物细胞或植物种子是本发明的其他实施方案。优选的，所述构建体或表达载体(至少部分)被插入到植物细胞或植物的基因组中。本发明的另一个实施方案涉及本发明植物的经转化的种子。

本发明提供了克服或减轻有价值的农作物(例如大豆和土豆)被线虫侵袭的核酸、转基因植物和方法。本发明的核酸能够通过提供重组的微小RNA前体来减少植物靶基因的表达。

在另一个实施方案中，本发明提供了线虫抗性转基因植物，所述植物能够表达至少一种本发明的重组微小RNA前体，其中源自所述重组微小RNA前体的微小RNA抑制植物根或线虫中的靶基因表达，并赋予对线虫感染的抗性。

本发明的一个额外的实施方案是用于较之各自的参照植物来调节靶基因在植物或其部分中表达的方法，包括步骤为：

a)功能性连接的

i)在植物中有功能的至少一个调控性核酸分子与

ii)与i)异源的重组微小RNA前体分子，其在植物细胞中可被切割生产至少一种调控性核酸分子，和

b)将该核酸分子导入到植物或其部分中

其中，至少一种调控性核酸分子的序列与所述微小RNA前体分子的序列是异源的，且

其中，至少一种调控性核酸分子的序列与植物中的至少一种靶序列结合，且

其中，微小RNA前体分子选自包含在以下组中的核酸分子：

I)SEQ ID NO：1所示核酸分子，和

II)具有SEQ ID NO：1所述序列的至少100个，优选至少143个(例如150个)，更优选至少195个(例如200个)，更优选至少250个，甚至更优选355个，最优选500个连续的碱基对的核酸分子，其中分别地，至少100bp包含SEQ ID NO：1的第151至250位碱基对，至少143bp(例如150)包含SEQ ID NO：1的第139至281位碱基对，至少195bp(例如200bp或250bp)包含SEQ ID NO：1的第127至321位碱基对，并且至少355bp(例如500bp)包含SEQ ID NO：1的第10至363位碱基对，和

III)与SEQ ID NO：1所述序列的至少100个，优选至少143个(例如150个)，更优选至少195个(例如200个)，更优选至少250个，更优选355个，甚至更优选500个，最优选793个连续的碱基对的序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少85％或90％，甚至更优选至少95％、97％、98％或99％，最优选100％的同一性的核酸分子，其中分别地，至少100bp包含SEQ ID NO：1的第151至250位碱基对，至少143bp(例如150)包含SEQ ID NO：1的第139至281位碱基对，至少195bp(例如200bp或250bp)包含SEQ ID NO：1的第127至321位碱基对，并且至少355bp(例如500bp)包含SEQ ID NO：1的第10至363位碱基对，和

IV)核酸分子，其与至少100，优选150，更优选200，甚至更优选250，最优选500bp的核酸分子在高严谨条件下杂交，所述核酸分子与SEQID NO：1所述序列的至少100个，优选至少143个(例如150个)，更优选至少195个(例如200个)，更优选至少250个，甚至更优选355个，最优选500个连续的碱基对的核酸分子在严谨条件下，优选高严谨条件下，最优选非常高严谨条件下杂交，其中分别地，至少100bp包含SEQ ID NO：1的第151至250位碱基对，至少143bp(例如150)包含SEQ ID NO：1的第139至281位碱基对，至少195bp(例如200bp或250bp)包含SEQID NO：1的第127至321位碱基对，至少355bp(例如500bp)包括SEQID NO：1的第10至363位碱基对，和

V)能够形成与SEQ ID NO：1所形成的二级结构同源，优选相同的二级结构的核酸分子，

VI)I)至V)限定的任何序列的互补序列。

本领域技术人员将意识到功能性连接两个或多个核酸分子的多种方法。此类方法可涵盖限制性酶切/连接、不依赖连接酶的克隆、重组改造、重组或合成。可以使用其他方法功能性连接两个或多个核酸分子。

从重组微小RNA前体释放的至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子可以源自在野生型植物中天然存在的微小RNA，但所述微小RNA与SEQ ID NO：1限定的微小RNA前体或上文II)至VI)中限定的其衍生物异源。至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子还可以源自天然存在于野生型植物中的另一个小调控RNA分子，例如siRNA、ta-siRNA或激活RNA等。至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子还可以是非天然存在于植物中并是由人设计的人工序列。

可以将包含至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子的重组微小RNA前体作为核酸寡核苷酸(例如DNA或RNA，其可以包含或不包含天然存在的核酸的衍生物)导入到植物细胞、植物或其部分中。

还可以通过包含在表达构建体中，将其导入到植物中，所述表达构建体可以包含在病毒载体、质粒载体或二元载体中。上文限定了优选的表达构建体和载体。

可以通过瞬时的或稳定的转化，将重组微小RNA前体分子导入到植物细胞、植物或其部分中。本领域技术人员普遍了解用于瞬时或稳定转化植物细胞、植物或其部分的多种方法。产生本文使用的植物包括稳定转化的方法，例如通过农杆菌介导的转化、原生质体转化、颗粒轰击等手段，将重组DNA构建体导入到植物或其部分中，之后任选地再生转基因植物。还包含瞬时转化植物或其部分的方法，例如病毒感染或农杆菌渗透。本领域技术人员了解用于稳定和/或瞬时转化植物或其部分的其他方法。还可以使用例如育种方法或原生质体融合的方法用于生产本发明的植物，并包括在本文内。优选的实施方案是稳定转化，优选稳定的农杆菌介导的转化。

当在植物细胞中加工重组微小RNA前体时，从本发明的重组微小RNA前体中释放的至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子结合靶序列，因此，调控性核酸分子至少部分地与靶序列互补。至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子可以与靶序列完全互补并因此当与靶序列比较时，不包含任何错配，或者可以包含1个或多个，例如1个或2个或更多个，例如2个或3个或更多个，例如3个或4个或更多个，例如4个错配。在优选的实施方案中，至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子不包含与靶序列的错配或包含1个错配。

至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子靶向的序列可以包含在植物细胞的基因组DNA中或在RNA分子中。靶序列可以包含在启动子序列、编码序列、非编码RNA序列、内含子、5′或3′UTR等中。

本发明已有的其他方面是上文限定的方法，其中

a)与微小RNA前体分子异源的至少一种调控性核酸分子序列取代了bp 225-245或上文II)至VI)限定的核酸分子序列中的各自的碱基对，和

b)与至少一种调控性核酸分子序列互补的至少一种调控性核酸分子星序列取代了SEQ NO：1的bp 159-179或上文的II)至VI)限定的核酸分子序列中的各自的碱基对，和

其中a)和b)和分隔a)和b)的核酸分子能够形成茎环结构。

本发明的其他实施方案是上文限定的方法，其中取代bp 225-245或上文第II)至VI)点所限定的核酸分子序列中的各自的碱基对的序列选自：

a.SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示的核酸分子或其多个，或

b.具有SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述序列的至少15个或16个，优选17个，更优选18个，甚至更优选19个，最优选20个连续碱基对的核酸分子，或其多个，或

c.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项的全部序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选90％，甚至更优选95％，最优选97、98或99％同一性的核酸分子，或其多个，或

d.当与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项相比较时，包含5个错配，优选4个错配，优选3个错配，更优选2个错配，最优选1个错配的核酸分子，或其多个，或

e.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述核酸序列在高严谨条件下杂交的核酸分子，或其多个。

本发明的另一个实施方案是上文限定的方法，其中取代bp 225-245的至少一个调控性核酸分子序列和与至少一个调控性核酸分子序列互补的至少一个调控性核酸分子星序列由20或21或22bp或多个20或21或22bp或其多个组成。在优选的实施方案中，至少一个调控性核酸分子序列由21bp或其多个组成。

在一个实施方案中，分离的核酸分子包含一个或多个调控性核酸分子序列。在优选的实施方案中，分离的核酸分子包含1和50个之间的调控性核酸分子序列。在更优选的实施方案中，核酸分子包括1和10个之间，甚至更优选1和5个之间的调控性核酸分子序列，在最优选的实施方案中，包含1或2个，优选1个调控性核酸分子序列。

在优选的实施方案中，本发明的方法可用于双子叶植物。在本发明的方法的甚至更优选的实施方案中，方法用于蝶形花科(Fabacea)，优选大豆属(Glycine)，最优选大豆(Glycine max)的植物。

本发明还已包括上文限定的分离的核酸分子或上文限定的表达构建体用于调节靶基因在植物或其部分中的表达的用途。

本发明的另一个实施方案是用于生产转基因植物的方法，包括步骤：

1、提供上文限定的分离的核酸、上文限定的植物表达构建体和/或植物表达载体，和

2、将所述分离的核酸、植物表达构建体和/或植物表达载体导入到植物细胞或植物部分中，和

3、从所述植物细胞或植物部分再生转基因植物。

本发明还涵盖了通过使转基因植物能够表达重组微小RNA前体来赋予植物线虫抗性的方法，所述重组微小RNA前体含有包含在以下组中的任何序列：

a.SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示的核酸分子或其多个，或

b.具有SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示序列的至少15个或16个，优选17个，更优选18个，甚至更优选19个，最优选20个连续碱基对的核酸分子，或其多个，或

c.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项的全部序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选90％，甚至更优选95％，最优选97、98或99％同一性的核酸分子，或其多个，或

d.当与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项比较时，包含5个错配，优选4个错配，优选3个错配，更优选2个错配，最优选1个错配的核酸分子，或其多个，或

e.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述核酸序列在高严谨条件下杂交的核酸分子，或其多个，

所述方法包括步骤：

(a)制备包含编码本发明的重组微小RNA前体的核酸的表达构建体或表达载体；

(b)用所述表达构建体或表达载体转化受体植物；

(c)生产所述受体植物的一个或多个转基因后代；和

(d)就对线虫感染的抗性来选择后代。

通过应用本发明的方法赋予植物线虫抗性，所再生的转基因植物能够控制线虫感染。植物可以表现出降低的线虫感染或对线虫感染的完全抗性。

生产本文中使用的植物包含稳定转化的方法，例如将通过农杆菌介导的转化、原生质体转化、颗粒轰击等手段将重组DNA构建体导入到植物或其部分中和任选地之后再生转基因植物。还包含瞬时转化植物或其部分的方法，例如病毒感染或农杆菌渗透。本领域技术人员了解用于稳定和/或瞬时转化植物或其部分的其他方法。还可以使用例如育种方法或原生质体融合的方法来生产本发明的植物并包括在本文内。优选的实施方案是稳定转化，优选农杆菌介导的转化。

本发明的方法可用于任何植物，例如裸子植物或被子植物，优选被子植物，例如双子叶或单子叶植物，优选双子叶植物。优选的单子叶植物是例如玉米、小麦、稻、大麦、高粱、芭蕉、甘蔗、芒草和短柄草，尤其优选的单子叶植物是玉米、小麦和稻。优选的双子叶植物是例如大豆、油菜籽、油菜、亚麻、棉花、土豆、甜菜、万寿菊和拟南芥，尤其优选的双子叶植物是例如大豆、油菜、蓖麻和土豆。在优选的实施方案中，本发明的方法用于双子叶植物，优选蝶形花科，更优选大豆属，最优选大豆。

本发明的其他实施方案是上文限定的分离的核酸分子、植物表达构建体或植物表达载体，其中取代表示上文限定的微小RNA分子和微小RNA星分子的碱基对的碱基对选自：

a.SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示的核酸分子或其多个，或

b.具有SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示序列的至少15个或16个，优选17个，更优选18个，甚至更优选19个，最优选20个连续碱基对的核酸分子，或其多个，或

c.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项的全部序列具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选90％，甚至更优选95％，最优选97、98或99％同一性的核酸分子，或其多个，或

d.当与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项比较时，包含5个错配，优选4个错配，优选3个错配，更优选2个错配，最优选1个错配的核酸分子，或其多个，或

e.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述核酸序列在高严谨条件下杂交的核酸分子，或其多个。

如此处所用，当用于感染的背景时，术语“控制”指减少或者预防感染。减少或者预防线虫感染将使得植物具有增加的线虫抗性；然而，这种增加的抗性并不意指该植物必然具有100％感染抗性。在优选的实施方案中，与不具有线虫抗性的野生型植物相比，在抗性植物中线虫感染抗性大于前者10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。优选地，野生型植物是这样的植物，其与具有增加的线虫抗性的植物的有相似的基因型，更优选地是有相同的基因型，但并不包含靶向靶基因的微小RNA前体。植物的线虫感染抗性可能是由于线虫暴露于植物基因特异性的微小RNA前体时，线虫死亡，不育，发育停滞，或者线虫的移动性受损，所述双链RNA在进食位点发育，维持或者在进食位点提供线虫营养的总体能力上具有某些效用。此处所用术语“对线虫感染有抗性的”或者“具有线虫抗性的植物”指与野生型植物相比，植物避免线虫感染，杀死线虫或者阻碍，减少或者终止线虫发育，生长或者繁殖的能力。这可以由主动方法完成，例如，通过产生对线虫有害的物质，或者由被动的方法完成，如具有减少的对线虫的营养价值或者不发展线虫进食位点诱导的结构如合胞体或者巨大细胞。植物线虫抗性的水平可以由多种方法确定，例如，通过计算能够在该植物上建立寄生的线虫，或者测量线虫发育次数(times)，线虫雌雄比例，或者，对于胞囊线虫，计算生产于受感染植物的根部或者植物测定系统的胞囊或者线虫卵的数目。

如此处所用，术语“抑制表达的足够量”指此重组微小RNA前体的浓度或者数量足够减少mRNA或者蛋白质的水平或者稳定性，所述mRNA或者蛋白质由植物中靶基因产生。如此处所用，“抑制表达”指来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物消失或者可见的水平下降。抑制植物靶基因表达可能导致寄生线虫死亡，或者如果植物疾病与寄生线虫生活史的特定阶段相关，则此抑制会延迟或预防进入特定的发育步骤(如，变态)。抑制的结果可以由线虫外部特性检测确定(如下述实施例所示)。

根据本发明，植物转录重组微小RNA前体，其特异性地抑制影响线虫进食位点发展、进食位点维持、线虫存活、线虫变态或线虫繁殖的植物靶基因的表达。在优选的实施方案中，重组微小RNA前体由转化到受感染植物的祖先中的表达载体编码。更优选的，表达载体包含编码重组微小RNA前体的核酸，所述核酸处于根特异性启动子或寄生线虫诱导的进食细胞特异性启动子的转录控制下。最优选的，表达载体包含编码重组微小RNA前体的核酸，所述核酸处于寄生线虫诱导的进食细胞特异性启动子的转录控制下。

不论存在于染色体外的非复制载体中，还是存在于整合到染色体中的载体中，多核苷酸优选处于植物表达盒中。植物表达盒优选含有有效连接的、能够驱动植物细胞中的基因表达的调控序列，使得每种序列都可以完成它的功能，例如通过多聚腺苷酸信号终止转录。优选的多聚腺苷酸信号源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)t-DNA，如被称为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合酶的基因3(Gielen等人，1984，EMBO J.3：835)或其功能等价物，但所有其他在植物中有功能活性的终止子也都是合适的。由于植物基因表达通常不限于转录水平，植物表达盒优选含有其他有效连接的序列，如翻译增强子，例如增强多肽/RNA比例的、含有来自烟草花叶病毒的5’-非翻译前导序列的超驱动序列(Gallie等人，1987，Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括详细描述在Becker，D.等人，1992，New plant binary vectors with selectable markers locatedproximal to the left border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；和Vectors for Gene Transfer in Higher Plants中的；在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编著：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，S.15-38中的。

植物基因表达应该与恰当的启动子有效连接，所述启动子赋予时间优选的、空间优选的、细胞类型优选的和/或组织优选的基因表达方式。用于本发明表达盒的启动子包括存在于植物根中的、能够起始植物细胞中的转录的任何启动子。此类启动子包括但不限于可获得自植物、植物病毒和含有在植物中表达的基因的细菌(例如，农杆菌和根瘤菌)中的那些。优选地，本发明的表达盒包含根特异性的启动子、病原体诱导型启动子或线虫诱导型启动子。更优选地，线虫诱导型启动子是寄生线虫进食位点特异性的启动子。寄生线虫进食位点特异性的启动子可以是合胞体细胞或巨细胞特异性的，或者对两种细胞都是特异性的。如果测量的启动子控制下生产的RNA的量，启动子的活性在其诱导状态比其非诱导状态高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，则所述启动子是诱导型的。如果测量的启动子控制下生产的RNA的量，特定细胞类型、组织或器官中的启动子活性比在相同植物的其他细胞类型或组织(优选地其他细胞类型或组织是相同植物器官，例如根的细胞类型或组织)中的活性高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，则启动子是细胞、组织或器官特异性的。在器官特异性启动子的情况下，启动子活性必须与其他植物器官(例如叶、茎、花或种子)中的启动子活性比较。

启动子可以是组成型的，诱导型的，发育阶段优选的，细胞类型优选的，组织优选的或者器官优选的。组成型的启动子在大多数的情况下是有活性的。组成型启动子的非限制实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等人，1987，Science 236：1299-1302)、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell 2：163-171)，拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.18：675-689)；pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)，玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J.3：2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)，来自农杆菌T-DNA的启动子，如甘露碱合酶，胭脂碱合酶，和章鱼碱合酶，核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基(ssuRUBISCO)的启动子等。优选在寄生线虫接触的细胞中表达重组微小RNA前体的启动子。备选地，启动子可以驱动重组微小RNA前体在远离线虫接触位点的植物组织中表达，然后重组微小RNA前体可通过植物运输到寄生线虫接触的细胞，特别是线虫进食位点的细胞或靠近线虫进食位点的细胞，例如合胞体细胞或巨细胞。

诱导型启动子在某些环境条件下是活性的，例如存在或缺少营养物或代谢物、热或冷、光、病原体攻击、厌氧条件等。例如，启动子TobRB7、AtRPE、AtPyk10、Gemini19和AtHMG1表现出被线虫诱导(关于线虫诱导型启动子的综述，参见Ann.Rev.Phytopathol.(2002)40：191-219；还参见美国专利号6,593,513)。美国专利号5,589,622和5,824,876中示出了分离可被线虫诱导的额外的启动子的方法。其他诱导型启动子包括受热激诱导的芸苔属hsp80启动子；受光诱导的PPDK启动子；受病原体感染诱导的来自烟草、拟南芥和玉米的PR-1启动子；和受低氧和冷胁迫诱导的Adh1启动子。还可以通过诱导型启动子促进植物基因表达(综述参见Gatz，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。如果需要时间特异性的基因表达，则化学诱导型启动子是特别合适的的。此类启动子的非限制性实例是水杨酸诱导型启动子(PCT申请号WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)和乙醇诱导型启动子(PCT申请号WO 93/21334)。

发育阶段优选的启动子优先在发育的某些阶段表达。组织和器官优选的启动子包括优先在某些组织或器官例如叶、根、种子或木质部表达的启动子。组织优选的和器官优选的启动子实例包括但不限于果实优选的、胚珠优选的、雄性组织优选的、种子优选的、珠被优选的、块茎优选的、茎优选的、果皮优选的和叶优选的、柱头优选的、花粉优选的、花药优选的、花瓣优选的、萼片优选的、花梗优选的、长角果优选的、茎优选的、根优选的等。种子优选的启动子优先在种子发育和/或萌发过程中表达。例如，种子优选的启动子可以是胚胎优选的、内胚层优选的和种皮优选的。参见Thompson等人，1989，BioEssays 10：108。种子优选的启动子的实例包括但不限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米蛋白(cZ19B1)等。

其他合适的组织优选或器官优选的启动子包括但不限于油菜籽的napin基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等人，1991，Mol Gen Genet.225(3)：459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(PCT申请号WO 98/45461)、来自肾豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆球蛋白启动子(美国专利号5,504,200)、来自芸苔的Bce4启动子(PCT申请号WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)，和在单子叶植物(如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等)中赋予种子特异性表达的启动子。应注意的合适启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(PCT申请号WO 95/15389和PCT申请号WO 95/23230)，或PCT申请号WO99/16890中描述的(来自大麦醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻醇溶谷蛋白基因、小麦麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。

用于本发明表达盒的其他启动子包括但不限于主要的叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、napin启动子、大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米蛋白启动子、22kD玉米蛋白启动子、27kD玉米蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、waxy、shrunken 1、shrunken 2和bronze启动子、Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)，和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)，和合成的或其他天然启动子。

在本发明中有特定用途的是合胞体位点优选的，或线虫进食位点诱导的启动子，包括但不限于来自WO 2008/095887中公开的Mtn3样启动子、WO 2007/096275中公开的Mtn21样启动子、WO 2008/077892中公开的过氧化物酶样启动子、WO 2008/071726中公开的海藻糖-6-磷酸磷酸酶样启动子和WO 2008/095888中公开的At5g12170样启动子。

转化或转染宿主细胞包括植物细胞的适宜的方法为植物生物技术领域所公知。任何方法都可用于转化重组表达载体到植物细胞中以产生本发明的转基因植物。一般地转化双子叶植物的方法公开于，例如，在美国专利号4,940,838、5,464,763等中。转化特定双子叶植物例如，棉花的方法，陈述于美国专利号5,004,863；5,159,135；和5,846,797中。可以用美国专利号4,992,375；5,416,011；5,569,834；5,824,877；6,384,301和EP 0301749B1中示出的大豆转化方法。转化方法可以包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US4,536,475)、用基因枪的生物射弹方法(Fromm ME等人，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603，1990)，电穿孔法、在包含DNA的溶液中孵育干胚，和显微注射。在这些直接转化方法的情况下，使用的质粒不必满足任何特定的要求。可以使用简单的质粒，例如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等。如果要从转化的细胞中再生完整的植物，优选地在质粒上定位额外的可选择的标记基因。直接转化技术同等地适于双子叶植物和单子叶植物。

转化也可以通过借助土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌感染(例如EP 0116718)、借助病毒载体的病毒感染(EP 0067553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO 93/03161)或者借助花粉(EP 0270356；WO 85/01856；US 4,684,611)来实施。基于土壤杆菌属的转化技术(特别对于双子叶植物)是本领域熟知的。土壤杆菌属菌株(例如根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或者发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)包含质粒(Ti或者Ri质粒)和用土壤杆菌属感染后转移到植物中去的T-DNA元件。T-DNA(转移DNA)整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可以定位在Ti或者Ri质粒上或者单独地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌属介导的转化的方法描述于，例如，Horsch RB等(1985)Science 225：1229中。土壤杆菌属介导的转化最适合于双子叶植物，但是也已经适应于单子叶植物。通过土壤杆菌转化植物描述于，例如，White FF，Vectors for Gene Transferin Higher Plants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，第15-38页；Jenes B等Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225中。转化可以造成瞬时或稳定转化和表达。虽然本发明的核苷酸序列可以插入到任何落入该广义类别的植物和植物细胞中，但其在作物植物细胞中特别有用。

本发明的转基因植物可以是使用已知的植物育种方法，与类似的转基因植物或者用缺乏本发明的核酸的转基因植物或者用非转基因植物杂交来制备种子。此外，本发明的转基因植物可以包含，和/或是与另一种包含一种或者多种核酸的转基因植物杂交，因此在植物和/或其后代中产生转基因的“堆积”。然后，将种子生长以获得包含本发明核酸的杂交可育转基因植物。杂交可育转基因植物可以具有通过母代亲本或者通过父代亲本遗传而来的特定表达盒。第二植物可以是近交系植物。杂交可育转基因植物可以是杂种。任何这些杂交可育转基因植物的种子也包括于本发明中。本发明的种子可以收获自可育转基因植物并用于生长本发明的转化植物的后代，包括包含DNA构建体的杂交植物株系。

“基因堆积”也可以通过植物转化来转移两种或多种基因到细胞核中来完成。在转化期间，可以将多个基因依次或者同时引入到细胞核中。通过用靶向多个相连的部分目标序列的单一转基因，通过基因沉默机制，可以下调植物或靶标病原体物种的多个基因。也可以过表达在单独启动子控制下的堆积的多个基因以达到需求的单一或多个表现型。也可以向植物中引入包含过表达基因和沉默靶标的基因堆积的构建体产生单一或者多个农艺学重要的表现型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与任何感兴趣的多核苷酸序列的组合堆积来创造需要的表现型。组合可以产生具有多种性状组合的植物，所述性状组合包括但不限于疾病抗性、除草剂耐受、产量增强、寒冷和干旱耐受。可以通过任意方法，包括但不限于通过常规方法或遗传转化杂交育种植物，来产生这些堆积的组合。如果通过遗传转化堆积性状，目标多肽序列可以以任何顺序依次地或者同时组合。例如，如果要引入两种基因，那么两种序列可以包含于分开的转化盒中或者在相同的转化盒上。序列的表达可以通过相同或者不同的启动子驱动。

由于增加的线虫感染抗性是希望被遗传入多种植物的一般性状。增加的线虫感染抗性是希望被遗传入多种植物的一般性状。本发明可以用于减少任何植物寄生线虫造成的作物破坏。优选地，寄生线虫属于诱导巨大细胞或合胞体细胞的线虫科，比如长针科(Longidoridae)，毛刺科(Trichodoridae)，异皮科(Heterodidae)，根结科(Meloidogynidae)，短体科(Pratylenchidae)或小垫刃科(Tylenchulidae)。特别地，在异皮科和根结科中。

当寄生线虫是球胞囊线虫属(Globodera)时，示例性靶向的物种包括，但不限于，蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、G.mexicana、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、乔巴特棘皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)、和弗吉亚球胞囊线虫(G.virginiae)。当寄生线虫是异皮线虫属(Heterodera)时，示例性靶向的物种包括，但不限于，燕麦异皮线虫(H.avenae)、胡萝卜异皮线虫(H.carotae)、鹰嘴豆异皮线虫(H.ciceri)、十字花科异皮线虫(H.cruciferae)、龙爪稷异皮线虫(H.delvii)、微褐藻异皮线虫(H.elachista)、菲利普异皮线虫(H.filipjevi)、冈比亚异皮线虫(H.gambiensis)、大豆异皮线虫(H.glycines)、豌豆异皮线虫(H.goettingiana)、荞麦异皮线虫(H.graduni)、啤酒花异皮线虫(H.humuli)、大麦异皮线虫(H.hordecalis)、麦类异皮线虫(H.latipons)、燕麦异皮线虫(H.major)、苜蓿异皮线虫(H.medicaginis)、水稻同居异皮线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦异皮线虫(H.pakistanensis)、玫瑰异皮线虫(H.rosii)、甘蔗异皮线虫(H.sacchari)、甜菜异皮线虫(H.schachtii)、蜀黍异皮线虫(H.sorghi)、三叶草异皮线虫(H.trifolii)、荨麻异皮线虫(H.urticae)、木豆异皮线虫(H.vigni)和玉米异皮线虫(H.zeae)。当寄生线虫是根结线虫属(Meloidogyne)时，示例性靶向的物种包括，但不限于，高粱根结线虫(M.acronea)、(M.arabica)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(M.indica)、M.inornata、爪哇根结线虫(M.javanica)、M.lini、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.微小cephala)、小突根结线虫(M.微小tyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和花生根结线虫(M.thamesi)。

下述实施例并不意为限制本发明权利要求的范围，而是意为某些实施方案的示例。任何在示例性的方法中对于本领域技术人员可见的变化意为落入本发明范围。

限定

缩写：GFP：绿色荧光蛋白；GUS：β-葡糖醛酸酶；BAP：6-苄基氨基嘌呤；2，4-D：2，4-二氯苯氧基乙酸；MS：Murashige和Skoog培养基；NAA：1-萘乙酸；MES：2-(N-吗啉代-乙磺酸；IAA：吲哚乙酸：Kan：硫酸卡那霉素；GA3-赤霉酸；Timentin^TM：替卡西林二钠/克拉维酸钾。

应该理解，本发明不限于特定的方法学或规程。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并非意在限制本发明的范围，后者仅由所附权利要求限定。必须注意到，如本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文中另外明确指出，否则单数形式“a”，“an”和“the”包括了复数指代。因此，例如，提及“载体”是提及了一个或多个载体并包括本领域技术人员已知的的等价形式等。术语“约”在本文中意指大概、近似、左右，或在某一范围内。当术语“约”与数值范围连用时，其通过延伸边界至高于或低于所述数值，来修饰范围。一般而言，术语“约”以20％，优选10％上下(更高或更低)的变化在本文中修饰高于或低于所述值的数值。如本文中使用的，词语“或”意指特定列举中的任一成员，还包括了列举中的任何成员组合。当用于本说明书和下列权利要求中时，词语“包括”意在说明存在一个或多个所述特征、整数、组分或步骤，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、组分、步骤或其组。为了清楚，说明书中使用的某些术语限定和使用如下：

反平行：“反平行”在本文中指通过互补碱基残基之间的氢键配对的两条核苷酸序列，在其中一条核苷酸序列中磷酸二酯键按5′-3′的方向延伸，而在另一条核苷酸序列中则按3′-5′的方向延伸。

反义：术语“反义”指相对于其转录或功能的正常的定向而言倒置的核苷酸序列，并因此表达与宿主细胞中的靶基因mRNA分子互补(例如，其可以通过Watson-Crick碱基配对与靶基因mRNA分子或单链基因组DNA杂交)或者与靶DNA分子(例如存在于宿主细胞中的基因组DNA)互补的RNA转录物。

编码区：如本文中使用的，术语″编码区″当用于指结构基因时，表示编码可见于由于mRNA分子的翻译的新生多肽中的氨基酸的核苷酸序列。编码区是有边界的，在真核细胞中，5’端是编码起始甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”，而3’端是三种特异性终止密码子(即，TAA、TAG、TGA)的三联体中的一种。除含有内含子外，基因的基因组形式还可以包括RNA转录物中存在的、位于序列5’和3’端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于RNA转录物中的非翻译序列的5’或3’端)。5’侧翼区域可以含有控制或影响基因转录的调控序列，例如启动子和增强子。3’侧翼区域可以含有指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。

互补：“互补”或“互补性”指包含在反平行的核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键时能够(通过碱基配对规则)彼此配对的反平行核苷酸序列的两条核苷酸序列。例如，5′-AGT-3′的序列与序列5′-ACT-3′互补。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补性是根据碱基配对规则，一个或多个核酸碱基不是匹配的。在核酸分子之间的“全部”或“完全”互补性是根据碱基配对规则，每一个核酸碱基都与另一个碱基匹配。核酸分子链之间的互补性程度对核酸分子链之间的杂交效率和强度具有显著影响。如本文中使用的，核酸序列的“互补序列”指这样的核苷酸序列，其核酸分子与核酸序列的核酸分子表现出完全互补性的。

如本文中使用的，“连续的碱基对”意指核酸的不间断的序列。当涉及核酸分子的片段时，例如“序列1的50个连续的碱基对”，意指与序列1相同的50个核酸的序列，不被错配、缺失或插入中断。

双链RNA：“双链RNA”分子或“dsRNA”分子包含核苷酸序列的有义RNA片段和核苷酸序列的反义RNA片段，两者都包含彼此互补的核苷酸序列，从而允许有义和反义RNA片段配对并形成双链RNA分子。

内源的：“内源的”核苷酸序列指存在于未转化的植物细胞的基因组中的核苷酸序列。

增强的表达：植物细胞中的核酸分子的“增强的”或“增加的”表达在本文中等价地使用，意指在应用本发明的方法后，植物、植物部分或植物细胞中的核酸分子的表达水平高于在应用所述方法前的植物、植物部分或植物细胞中的表达，或者较之缺少本发明的重组核酸分子的对照植物的表达更高。例如，对照植物包含这样的构建体，所述构建体是仅缺少与包含srRNA序列的至少一部分前体分子互补的各个部分的同一构建体。如本文中使用的，术语“增强的”或“增加的”是同义的，在本文中意指待表达的核酸分子的更高的，优选显著更高的表达。如本文中使用的，物质(agent)(例如蛋白质、mRNA或RNA)的水平“增强”或“增加”意指相对于缺少本发明的重组核酸分子(例如缺少与包含srRNA序列的至少一部分前体分子互补的各个部分、本发明的重组构建体或重组载体)的、生长在基本相同的条件下的基本相同的植物、植物部分或植物细胞，水平是增加的。如本文中使用的，物质(例如由靶基因表达的preRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由其编码的蛋白质产物)的水平“增强”或“增加”，意指相对于缺少本发明的重组核酸分子的细胞或生物体，所述水平增加50％或更多，例如100％或更多，优选200％或更多，更优选5倍或更多，甚至更优选10倍或更多，最优选20倍或更多，例如50倍。可以通过本领域技术人员熟悉的方法确定增强或增加。因此，例如可以通过蛋白质的免疫学检测，确定核酸或蛋白质量的增强或增加。此外，可以使用技术，例如蛋白质测定、荧光、Northern杂交、核酸酶保护测定、逆转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、Western印迹、放射性免疫测定(RIA)或其他的免疫测定和荧光激活的细胞分析(FACS)，来测量植物或植物细胞中的特定蛋白质或RNA。根据诱导的蛋白质产物的类型，还可以确定它对生物体或细胞的表现型的活性或影响。用于定量蛋白质的方法是熟练的技术人员已知的。可以提及的实例为：微-Biuret方法(Goa J(1953)Scand J Clin Lab Invest 5：218-222)、Folin-Ciocalteau方法(Lowry OH等人(1951)J Biol Chem 193：265-275)或测量CBB G-250的吸收(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72：248-254)。作为定量蛋白质活性的一个实例，下文实施例中描述了检测荧光素酶的活性。

表达：“表达”可以指基因产物的生物合成，优选指细胞中的核苷酸序列(例如内源的基因或异源的基因)的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录为mRNA，和任选地之后将mRNA翻译成一种或多种多肽。术语“表达”还可以指含有RNA分子的DNA的转录。表达还可以指植物或其部分中的各自RNA的稳态水平的改变，例如由于各自RNA的稳定性改变。

表达构建体：如本文中使用的，“表达构建体”意指能够指导特定核苷酸序列在恰当的植物部分或植物细胞中表达的DNA序列，包含在其将被导入的所述植物部分或植物细胞中有功能的启动子，所述启动子与目标核苷酸序列有效连接，任选地，所述目标核苷酸序列与终止信号有效连接。如果需要翻译，还通常包括核苷酸序列的正确翻译所必需的序列。编码区可以编码目标蛋白质，还可以编码有义或反义的方向的有功能的目标RNA，例如RNAa、siRNA、snoRNA、snRNA、微小RNA、ta-siRNA或任何其他的非编码调控RNA。包含目标核苷酸序列的表达构建体可以是嵌合的，意指它的一个或多个组分相对于它的一个或多个其他组分是异源的。表达构建体还可以是天然存在、但以可用于异源表达的重组形式获得的。然而，通常表达构建体对于宿主是异源的，即，表达构建体的特定DNA序列不是天然存在于宿主细胞中的，而必须通过转化事件，被导入到宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达构建体中的核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，后者仅当宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才起始转录。在植物的情况下，启动子还可以是特定组织或器官或发育阶段特异性的。

外源的：术语“外源的”指通过实验操作导入到细胞基因组中的任何核酸分子(例如，基因序列)并可以包括可见于所述细胞中的序列，只要所导入的序列含有一些修饰(例如，点突变、存在可选择的标志物基因等)并因而与天然存在的序列是不同的。

有功能的连接：术语“有功能的连接”或“功能性连接的”理解为意指例如，调控元件(例如，启动子)和待表达的核酸序列，以及恰当的其他调控元件(例如，终止子或增强子)的依序排列使得每种调控元件都可以完成它的预期功能，以允许修饰、促进或影响所述核酸序列的表达。词语“有效连接”或“有效连接的”可以作为同义词使用。根据核酸序列相对于有义或反义RNA的排列，可以获得表达。出于该目的，化学意义上的直接连接不是必需的。遗传控制序列(例如增强子序列)在离开或远离其他DNA分子的位置上也可以发挥其对靶序列的功能。优选的排列是其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列之后的排列，使得两条序列彼此共价连接。在启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选少于200个碱基对，特别优选少于100个碱基对，非常特别优选少于50个碱基对。在优选的实施方案中，待转录的核酸序列位于启动子后，使得转录起始与想要的本发明的嵌合RNA起始相同。可以通过所描述的定制的重组和克隆技术来生成有功能的连接和表达构建体(例如，在Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience；Gelvin等人(编著)(1990)Plant Molecular BiologyManual；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands中)。然而，还可以在两条序列之间放置例如作为具有限制性酶的特异性切割位点的接头或作为信号肽的其他序列。插入序列还可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调控区(如启动子)和待表达的核酸序列连接组成的表达构建体，可以以整合载体的形式存在，并可以例如通过转化插入到植物基因组中。

基因：术语“基因”指与能够以一些方式调控基因产物(例如，多肽或有功能的RNA)表达的、恰当的调控序列有效连结的区域。基因包括在编码区(开放阅读框，ORF)之前(上游)或之后(下游)的DNA的非翻译的调控区(例如，启动子、增强子、抑制子等)，以及在单个编码区(即，外显子)之间适当处的间插序列(即，内含子)。如本文中使用的，术语“结构基因”意指转录成mRNA，然后翻译成特异性多肽特征性的氨基酸序列的DNA序列。

基因组和基因组DNA：术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物体的可遗传的遗传信息。所述基因组DNA包含细胞核DNA(也被称为染色体DNA)以及质体(例如，叶绿体)和其他细胞器(例如，线粒体)的DNA。优选的，术语基因组或基因组DNA指细胞核的染色体DNA。

异源的：关于核酸分子或DNA的术语“异源的”，指与第二种核酸分子有效连接或经过操作变得有效连接的核酸分子，所述第二种核酸分子是其在自然界中未有效连接的，或者在自然界中的不同位置上有效连接的。包含核酸分子和与其相连的一个或多个调控性核酸分子(例如启动子或转录终止信号)的异源的表达构建体是例如源自实验操作的构建体，其中a)所述核酸分子，或b)所述调控性核酸分子或c)两者(即，(a)和(b))没有位于其天然的(天然)遗传环境中，或者已经被实验操作修饰过，修饰的实例是替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然的遗传环境指源生物体中的天然染色体基因座，或指存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选保留了、至少部分地保留了核酸分子序列的天然遗传环境。环境至少位于核酸序列一侧的侧翼，并具有至少50bp、优选至少500bp，特别优选至少1,000bp，非常特别优选至少5,000bp的序列长度。当其被非天然的、合成的“人工”方法(例如诱变处理)修饰时，天然存在的表达构建体(例如天然存在的启动子与相应基因的组合)成为了转基因的表达构建体。已经描述了此类方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，认为与非天然启动子的启动子有效连接的编码蛋白质的核酸分子对于所述启动子而言是异源的。优选地，对于其所导入的细胞而言，异源DNA不是内源的或不是天然相关的，而是获得自另一种细胞的或合成的。异源DNA还包括含有一些修饰的内源DNA序列、非天然存在的，多拷贝的内源DNA序列，或与其物理相连的另一DNA序列不是天然相关的DNA序列。一般而言，虽然不是必要的，但异源DNA编码表达它的细胞通常不生产的RNA或蛋白质。

杂交：如本文中使用的，术语“杂交”包括核酸分子链通过碱基配对与互补链连结的任何过程(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology，Stockton Press，New York)。杂交和杂交强度(即，核酸分子之间缔合的强度)受这些因素的影响，如核酸分子之间的互补性程度，涉及条件的严谨度，形成的杂合体的T_m和核酸分子中的G：C比。如本文中使用的，术语“T_m”用于指代“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群中的一半解离为单链的温度。用于计算核酸分子的T_m的等式是本领域普遍已知的。如标准参考文献所示，当核酸分子处于1M NaCl的水性溶液中时，可以通过等式：T_m＝81.5+0.41(％G+C)简单估算T_m值(参见例如，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization，in Nucleic Acid Hybridization(1985)]。其他参考文献包括更复杂的计算，其中考虑结构和序列特征用于计算T_m。严谨条件是本领域技术人员已知的，可见于Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。

当用于指核酸杂交时，中等严谨条件包含与这样的条件等价的条件，即，在68℃，在由5x SSPE(43.8g/L NaCl，6.9g/L NaH₂PO₄.H₂O和1.85g/L EDTA，用NaOH调节pH为7.4)、1％SDS、5x Denhardt试剂【每500mL 50x Denhardt含有：5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)】和100μg/mL变性鲑鱼精子DNA组成的溶液中结合或杂交；然后在包含1xSSC(1×SSC是0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠)和0.1％SDS的溶液中，在室温或优选37℃(使用长度优选为约100至约500个核苷酸的DNA探针时)洗涤(优选1次15分钟，更优选2次15分钟，更优选3次15分钟)。

当用于指核酸杂交时，高严谨条件包含与这样的条件等价的条件，即，在68℃，在由5x SSPE(43.8g/L NaCl，6.9g/L NaH₂PO₄.H₂O和1.85g/LEDTA，用NaOH调节pH为7.4)、1％SDS、5x Denhardt试剂【每500mL 50x Denhardt含有：5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)】和100μg/mL变性鲑鱼精子DNA组成的溶液中，结合或杂交；然后在包含0.1xSSC(1×SSC是0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠)和1％SDS的溶液中，室温或优选37℃(使用长度优选为约100至约500个核苷酸的DNA探针时)洗涤(优选1次15分钟，更优选2次15分钟，更优选3次15分钟)。

当用于指核酸杂交时，非常高严谨条件包含与这样的条件等价的条件，即，在68℃，在由5x SSPE、1％SDS、5x Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑鱼精子DNA组成的溶液中结合或杂交；然后在包含0.1xSSC(1×SSC是0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠)和1％SDS的溶液中，在68℃(使用长度优选为约100至约500个核苷酸的DNA探针时)洗涤(优选1次15分钟，更优选2次15分钟，更优选3次15分钟)。

“同一性”：当用于关于两个或多个核酸或氢基酸分子的比较时，“同一性”意指所述分子的序列共享一定程度的序列相似性，序列是部分相同的。

为了确定两条氨基酸序列或两条核酸分子的百分比同一性(在本文中与同源性可互换的使用)，将一条序列书写在另一条下方进行最佳比较(例如，可以在蛋白质序列或核酸序列中插入空位，从而生成与其他蛋白质或核酸的最佳比对)。

然后，比较在对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核酸分子。如果一条序列中的位置被其他序列的对应位置上相同的氨基酸残基或相同的核酸分子占据，则分子在该位置是同源的(即，在本文中使用的氨基酸或核酸“同源性”对应于氨基酸或核酸“同一性”。两条序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数x 100)。术语“同源性”和“同一性”因此被认为是同义词。

为了确定两条或多条氨基酸或两条或多条核苷酸序列的百分比同一性，开发了若干计算机软件程序。可以用例如软件fasta(目前使用版本fasta3)计算两条或多条序列的同一性(W.R.Pearson和D.J.Lipman，PNAS 85，2444(1988)；W.R.Pearson，Methods in Enzymology 183，63(1990)；W.R.Pearson和D.J.Lipman，PNAS 85，2444(1988)；W.R.Pearson，Enzymology 183，63(1990))。用于计算不同序列的同一性的另一有用程序是标准的blast程序，其包括在Biomax pedant软件中(Biomax，Munich，德意志联邦共和国)。由于blast并非总是包括对象和查询的完整序列，因此有时不幸导致次优的结果。然而，该程序非常有效，可用于比较大量的序列。此类序列比较通常使用下列设置：

-p：程序名称[String]；-d：数据库[String]；默认值＝nr；-i：查询文件[File In]；默认值＝stdin；-e：期望值(E)[Real]；默认值＝10.0；-m：比对观察选项：0＝配对；1＝查询-比上区域，显示同一性；2＝查询-比对上区域，不显示同一性；3＝查询-比对上区域的屏文形式，显示同一性；4＝查询-比对上区域的屏文形式，不显示同一性；5＝查询-比对上区域，不显示同一性，平末端；6＝查询-比对上区域的屏文形式，不显示同一性，平末端；7＝XML格式输出Blast；8＝列表；9带注释行的列表[Integer]；默认值＝0；-o BLAST报告输出文件[File Out]任选；默认值＝stdout；-F过滤查询序列(DUST使用blastn，SEG使用其他)[String]；默认值＝T；-G：打开空位花费(0则调用默认行为)[Integer]；默认值＝0；-E：延伸空位花费(0则调用默认行为)[Integer]；默认值＝0；-X：空位比对的X跌落值(按比特计)(0则调用默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，其余15[Integer]；默认值＝0；-I Show GI′s in deflines[T/F]；默认值＝F；-q：核苷酸错配罚分(仅blastn)[Integer]；默认值＝-3；-r：核苷酸匹配得分(仅blastn)[Integer]；默认值＝1；-v：显示(V)的一条描述的数据库序列数[Integer]；默认值＝500；-b：显示(B)比对的数据库序列数[Integer]；默认值＝250；-f：延伸命中阈值，默认值为0；blastp 11，blastn 0，blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[Integer]；默认值＝0；-g：实施空位比对(tblastx中不可用)[T/F]；默认值＝T；-Q：待用的查询遗传密码子[Integer]；默认值＝1；-D：DB遗传密码子(仅对于tblast[nx])[Integer]；默认值＝1；-a：待用进程数[Integer]；默认值＝1；-O SeqAlign文件[File Out]任选；-J Believe the query defline[T/F]；默认值＝F；-M矩阵[String]；默认值＝BLOSUM62；-W：字大小；0为默认值(blastn为11，megablast为28，其他为3)[Integer]；默认值＝0；-z：数据库的有效长度(使用0为实际大小)[Real]；默认值＝0；-K：保留区域的最佳命中数(默认关闭，推荐使用100的值)[Integer]；默认值＝0；-P 0用于多个命中，1用于单个命中[Integer]；默认值＝0；-Y：检索空间的有效长度(使用0为实际大小)[Real]；默认值＝0；-S：在数据库检索的查询链(对于blast[nx]和tblastx)；3是两者，1是上面，2是下面)[Integer]；默认值＝3；-T：产生HTML输出[T/F]；默认值＝F；-l：限制数据库检索为GI列表[String]任选；-U：使用小写字母过滤FASTA序列[T/F]任选；默认值＝F；-y无空位延伸的X跌落值(以比特计)(0.0则调用默认行为)；blastn 20，megablast 10，其余7[Real]；默认值＝0.0；-Z最终空位比对的X跌落值(以比特计)(0.0则调用默认行为)；blastn/megablast 50，tblastx 0，其余25[Integer]；默认值＝0；-RPSI-TBLASTN检查点文件[File In]任选；-n MegaBlast查询[T/F]；默认值＝F；-L：查询序列位置[String]任选；-A多命中窗口大小，0为默认值(blastn/megablast 0，其余均为40)[Integer]；默认值＝0；-w：读码框移动罚分(blastx使用OOF算法)[Integer]；默认值＝0；-t：tblastn用于连接HSP所允许的最大内含子长度(0禁止连接)[Integer]；默认值＝0。

使用Needleman和Wunsch，或Smith和Waterman的算法获得高质量的结果。因此，优选基于上述算法的程序。有利地，可以用基于Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))的程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351(1987)，Higgins等人，CABIOS 5，151(1989))或优选地程序“Gap”和“Needle”，以及用基于Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))的“BestFit”进行序列比较。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包的一部分(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等人，(Nucleic Acids Res.25，3389(1997))，“Needle”是欧洲分子生物学开放软件套装(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))的一部分(Trendsin Genetics 16(6)，276(2000))。因此，优选使用程序“Gap”或“Needle”针对整个序列进行确定百分比序列同一性的计算。对于“Needle”，使用下列标准调整进行核酸序列比较：矩阵：EDNAFULL；空位罚分：10.0；延伸罚分：0.5。对于“Gap”，使用下列标准调整进行核酸序列比较：空位权重：50；长度权重：3；平均匹配：10.000；平均错配：0.000。

例如，与序列SEQ ID NO：1在核酸水平具有80％同一性的序列理解为表示这样的序列，当其通过上述程序“Needle”使用上述参数设置与SEQ ID NO：1所示序列的比较时，具有80％同一性。优选地，针对查询序列全长计算同一性，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的碱基对139至281。

同基因的：除了存在或缺少异源DNA序列的差异外，遗传相同的生物体(例如，植物)。

分离的：如本文中使用的，术语″分离的″意指通过人力移出并离开其原始的，天然的环境而存在的材料，因此不是天然的产物。分离的材料或分子(例如，DNA分子或酶)可以以纯化的形式存在，或存在于非天然的环境中，例如，转基因宿主细胞中。例如，存在于活的植物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中共存的一些或全部材料分离开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分，和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，只要此类载体或组合物不是其原始环境的一部分，则所述多核苷酸就是分离的。优选地，当使用术语″分离的″涉及核酸分子时，如“分离的核酸序列”中所用，指从在其天然来源中通常与其相关的至少一种污染核酸分子中鉴别和分开的核酸序列。分离的核酸分子是以不同于自然界中所见的其形式或环境存在的核酸分子。相反，非分离的核酸分子是以自然界中存在的状态被发现的核酸分子，例如DNA和RNA。例如，在与相邻基因靠近的宿主细胞染色体上发现给定的DNA序列(例如，基因)；在细胞中发现作为与编码多种蛋白质的多种其他mRNA的混合物的RNA序列(例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)。然而，作为示例，包含例如SEQ ID NO：1的分离的核酸序列包括此类核酸序列，所述核酸序列位于通常含有SEQ IDNO：1的细胞内，其中核酸序列在不同于天然细胞的、染色体的或染色体外的位置上，或者侧翼是不同于天然发现的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸序列用于表达蛋白质时，核酸序列最少含有最少一部分的有义链或编码链(即，核酸序列可以是单链的)。备选地，其可以含有有义和反义链(即，核酸序列可以是双链的)。

最小启动子：在缺少上游激活的条件下，失活的或具有极大降低的启动子活性的启动子元件，特别是TATA元件。在存在合适的转录因子的条件下，最小启动子发挥允许转录的功能。

在植物中“调节基因的表达”意指较之没有施用本发明方法的野生型或对照植物，增加的、增强的、抑制的或下调的靶基因的表达。

非编码：术语″非编码″指不编码部分或全部的表达的蛋白质的核酸分子序列。非编码序列包括但不限于内含子、增强子、启动子区域、3′非翻译区和5′非翻译区。

核酸和核苷酸：术语″核酸″和″核苷酸″指天然存在的或合成的或人工的核酸或核苷酸。术语“核酸”和″核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸，或核糖核苷酸，或任何核苷酸类似物和聚合物，或其单链或双链的，有义或反义形式的杂合体。除非另外指出，特定的核酸序列还暗示地涵盖了其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。术语″核酸″在本文中与″基因″、″cDNA”、″mRNA″、″寡核苷酸″和″多核苷酸″可互换使用。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸的化学结构中具有修饰的核苷酸，包括但不限于5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、胞嘧啶环外氨基的修饰、5-溴尿嘧啶替换等；和2′位糖修饰，包括但不限于其中2′-OH被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN的基团取代的糖基修饰的核糖核苷酸。短发夹RNA(shRNA)还可以包含非天然的元件，例如非天然的碱基，如肌苷和黄嘌呤；非天然的糖，如2′-甲氧基核糖；或非天然的磷酸二酯键，如甲基磷酸酯、磷硫酰和肽。

核酸序列：词组″核酸序列″指从5′-至3′-端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。包括染色体DNA、自主复制质粒、DNA或RNA的感染性聚合物，和主要实施结构作用的DNA或RNA。″核酸序列″还指表示核苷酸的缩写、字母、字或词的连续列表。在一个实施方案中，核酸可以是相对短的核酸″探针″，通常长度少于100个核苷酸。通常，核酸探针的长度是从约50个核苷酸至约10个核苷酸。核酸的“靶区域”是鉴别为目标的核酸的部分。核酸的″编码区″是当处于恰当的调控序列控制下时，以序列特异性的方式转录和翻译以生产特定的多肽或蛋白质的核酸的部分。编码区被称为编码此类多肽或蛋白质。

寡核苷酸：术语″寡核苷酸″指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物，以及具有功能相似的非天然存在部分的寡核苷酸。因为理想的特性，例如，增强的细胞摄入、增强的对核酸靶的亲和力，和存在核酸酶时增加的稳定性，此类修饰的或取代的寡核苷酸通常比天然形式更优选。寡核苷酸优选地包括通过键(例如磷酸二酯键)或取代键彼此共价耦合的两个或多个核苷酸单体。

突出端：″突出端″是在双链寡核苷酸分子的5′-或3′-羟基端的相对短的单链核苷酸序列(也被称为“延伸”、“突起末端”或“粘性末端”)。

植物：一般理解为意指能够光合作用的任何真核单细胞或多细胞生物，或其细胞、组织、器官、部分或繁殖材料(例如种子或果实)。出于本发明的目的，包括了植物界的高等和低等植物的所有属和种。优选一年生、多年生、单子叶和双子叶的植物。术语包括了成熟的植物、种子、枝条和幼苗，及其衍生部分、繁殖材料(例如种子或小孢子)、植物器官、组织、原生质体、愈伤组织和其他培养物(例如细胞培养物)，和分类为产生功能或结构单元的任何其他类型的植物细胞。成熟的植物指处于除幼苗外的任何需要的发育阶段的植物。幼苗指处于早期发育阶段的幼年未成熟植物。一年生、多年生、单子叶和双子叶的植物是生成转基因植物优选的宿主生物。在所有的观赏植物、有用的或观赏树种、花、切花、灌木或草坪中表达基因也是有利的。作为示例而非限制可以提及的植物是被子植物；苔藓植物，例如苔纲(Hepaticae)(地钱)和藓纲(Musci)(藓类)；蕨类植物，例如蕨类、问荆和石松；裸子植物，例如针叶树、苏铁植物、银杏和买麻藤亚纲(Gnetidae)；藻类，例如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)，红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻类)和裸藻纲(Euglenophyceae)。优选的是用作食品或饲料目的的植物，例如豆科(Leguminosae)，如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科(Gramineae)，如稻、玉米、小麦、大麦、高粱、小米、黑麦、黑小麦或燕麦；伞形科(Umbelliferae)，特别是胡萝卜属(Daucus)，尤其特别是胡萝卜，和芹属(Apium)，尤其特别是芹菜(Graveolens dulce)(芹菜)及其他多种；茄科(Solanaceae)，特别是番茄属(Lycopersicon)，非常特别是番茄(esculentum)种(西红柿)，和茄属(Solanum)，非常特别是马铃薯(tuberosum)(土豆)和茄子(melongena)(茄子)及其他多种(例如烟草)；和辣椒属(Capsicum)，非常特别是辣椒(annuum)(辣椒)及其他多种；豆科，特别是大豆属(Glycine)，非常特别是大豆(max)(大豆)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、豆类和花生及其他多种；蝶形花科(Cruciferae)(十字花科(Brassicacae))，特别是芸苔属(Brassica)，非常特别是甘蓝型油菜(Brassica napus)(油菜)、甜菜(Brassica campestris)(甜菜)、球叶甘蓝(Brassica oleraceacv Tastie)(卷心菜)、雪球甘蓝(Brassica oleracea cv Snowball Y)(花椰菜)和帝甘蓝(Brassica oleracea cv Emperor)(西兰花)种，和拟南芥属(Arabidopsis)，非常特别是拟南芥(Arabidopsis thaliana)及其他多种；菊科(Compositae)，非常特别是莴苣属(Lactuca)，非常特别是莴苣(Lactuca sativa)(生菜)及其他多种；菊科(Asteraceae)，如向日葵、万寿菊、生菜或金盏花，及其他多种；葫芦科(Cucurbitaceae)，如甜瓜、南瓜(pumpkin)/南瓜(squash)、西葫芦(zucchini)和亚麻籽。其他优选的是棉花、甘蔗、大麻、亚麻、辣椒、和多种树、坚果类和藤类物种。

多肽：术语″多肽″、″肽″、″寡肽″、″多肽″、″基因产物″、″表达产物″和″蛋白质″在本文中可互换使用，指具有连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。

前蛋白质：通常靶向细胞器(例如叶绿体)且仍包含其转运肽的蛋白质。

初级转录物：如本文中使用的，术语“初级转录物”指基因的未成熟的RNA转录物。“初级转录物”仍包含例如内含子，和/或仍然不包含polyA尾或帽结构，和/或缺少对于作为转录物正确行使功能必需的其他修饰，例如，修剪或编辑。

启动子：术语″启动子″或″启动子序列″是等价的，如本文中使用的，指当与目标核苷酸序列连接时能够控制目标核苷酸序列转录为RNA的DNA序列。此类启动子可见于例如下列公众数据库：http://www.grassius.org/grasspromdb.html，

http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php？topic＝plantprom，http: //ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp/cgi-bin/index.cgi。其中列举的启动子可用于本发明的方法，因而通过引用囊括到本文中。启动子位于受其控制转录为mRNA的目标核苷酸序列的5′(即，上游)，临近转录起始位点，并提供了RNA聚合酶和用于起始转录的其他转录因子特异性结合的位点。所述启动子包含转录起始位点临近例如至少10kb，例如5kb或2kb。其还可以包含转录起始位点临近至少1500bp，优选至少1000bp，更优选至少500bp，甚至更优选至少400bp，至少300bp，至少200bp或至少100bp。在另外优选的实施方案中，启动子包含转录起始位点临近至少50bp，例如，至少25bp。启动子不包含外显子和/或内含子区或5′非翻译区。例如启动子对于各个植物而言可以是异源的或同源的。如果多核苷酸序列源自外源物种，或者如果源自相同物种但对于其原始形式是修饰的，则所述多核苷酸序列对生物体或第二个多核苷酸序列而言是″异源的″。例如，与异源编码序列有效连接的启动子指，所述编码序列来自不同于启动子来源物种的物种，或者如果来自相同的物种，则编码序列不是与启动子天然相关联的(例如，遗传改造的编码序列或其来自不同生态型或变种的等位基因)。合适的启动子可以源自其中应该发生表达的宿主细胞的基因，或源自该宿主细胞的病原体(例如，植物或植物病原体如植物病毒)。植物特异性启动子是适合调控在植物中的表达的启动子。其可以源自植物，但也可以源自植物病原体，或者其可以是由人设计的合成的启动子。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率应答于诱导剂而增加。启动子也可以以组织特异性或组织优选的方式受调控，使其仅在或主要在转录特定的组织类型(例如叶、根或分生组织)的相关编码区中具有活性。术语“组织特异性”当用于启动子时，指能够指导目标核苷酸序列对特定组织类型(例如花瓣)的选择性表达的启动子，而同一目标核苷酸序列在不同类型的组织(例如根)中相对缺少表达。可以如下评估启动子的组织特异性，例如，有效连接报告子基因和启动子序列以生成报告子构建体，将所述报告子构建体导入到植物基因组中，使所述报告子构建体整合到所获得的转基因植物的每种组织中，并检测报告子基因在转基因植物的不同组织中的表达(例如，检测mRNA、蛋白质、或报告子基因编码的蛋白质的活性)。检测到报告子基因在一种或多种组织中的表达水平高于报告子基因在其他组织中的表达水平显示启动子是检测到较高表达水平的组织特异性的。术语″细胞类型特异性″用于启动子时，指能够指导目标核苷酸序列在特定类型的细胞中选择性表达的启动子，而同一目标核苷酸序列在相同组织的不同类型的细胞中相对缺少表达。当用于启动子时，术语″细胞类型特异性″也意指启动子能够促进在单个组织内的区域中目标核苷酸序列的选择性表达。可以使用本领域普遍已知的方法评估启动子的细胞类型特异性，例如GUS活性染色、GFP蛋白或免疫组化染色。当提及启动子或源于启动子的表达时，术语″组成型″意指启动子能够在缺少刺激(例如，热激、化学品、光等)的条件下，在植物或植物部分的基本全部生活史中指导有效连接的核酸分子在大部分植物组织和细胞中的转录。通常，组成型启动子能够指导转基因在基本任何细胞和任何组织中的表达。

启动子特异性：当涉及启动子时，术语“特异性”意指由各个启动子所赋予的表达模式。特异性描述了植物或其部分的组织和/或发育状态，其中启动子赋予在各个启动子控制下的核酸分子的表达。启动子的特异性还可以包含环境条件，在所述环境条件下，启动子可以被活化或下调，例如受生物学或环境胁迫(例如冷、干旱、创伤或感染)的诱导或抑制。

纯化的：如本文中使用的，术语″纯化的″指从其天然环境中移出、分离或分开的为核酸或氨基酸序列的分子。″基本上纯化的″分子是至少60％不含，优选至少75％不含，和更优选至少90％不含与其天然相关的其他组分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。

重组：术语″重组″涉及核酸分子时，指通过重组DNA技术生产的核酸分子。重组核酸分子还可以包含不是天然存在，而是经修饰、改变、突变或被人操作过的分子。优选地，″重组核酸分子″是非天然存在的核酸分子，其与天然存在的核酸分子的序列相差至少一个核苷酸。“重组核酸分子”还可以包含“重组构建体”，其包含优选地有效连接的、处于非天然存在的顺序的核酸分子序列。生产所述重组核酸分子的优选的方法可包含克隆技术、定向或非定向诱变、合成或重组技术。

“重组微小RNA前体分子”理解为经修饰的微小RNA前体分子，所述修饰是通过用至少一个其他微小RNA分子或调控性核酸分子(从而是与所述微小RNA前体异源的至少一个其他微小RNA和微小RNA星或调控核酸或调控核酸星序列)替换天然包含于所述前体分子中的微小RNA分子(从而替换微小RNA和微小RNA星序列)，因此其与所述前体分子同源。与微小RNA前体分子异源的微小RNA分子或调控性核酸分子意指不与微小RNA前体分子天然相连的微小RNA分子或调控性核酸分子，因此其不存在于野生型植物中。异源的微小RNA分子或调控性核酸分子可以是天然存在于野生型植物中的微小RNA分子或调控性核酸分子，但在所述野生型植物中它包含在另一种微小RNA前体分子中，或者异源的微小RNA分子或调控性核酸分子可以是人造的，不存在于野生型植物中。异源的微小RNA分子或调控性核酸分子可以靶向在野生型植物中由其他微小RNA所靶向的靶基因，或者可以靶向在野生型植物中不被微小RNA分子或调控性核酸分子所靶向的靶基因。异源微小RNA分子或调控性核酸分子可以靶向靶基因的编码区、靶基因的内含子或5′或3′UTR，或靶基因的调控序列如启动子。

如本文中使用的，“调控性核酸分子”优选地意指小调控RNA分子或srRNA分子，并理解为由核酸或其衍生物组成的分子。它们可以是双链或单链的，并在约15和约30bp之间，例如15和30bp之间，更优选在约19和约26bp之间，例如19和26bp之间，甚至更优选在约20和约25bp之间，例如20和25bp之间。在特别优选的实施方案中，寡核苷酸在约21和约24bp之间，例如21和24bp之间。在最优选的实施方案中，小核酸分子是约21bp和约24bp，例如21bp和24bp。通过调节由调控性核酸分子所靶向的各个RNA的转录或稳定性，调控性核酸分子调节植物细胞、植物或其部分中的RNA(例如mRNA)或其他调控性核酸分子的稳定状态水平。

“抑制”或“下调”核酸分子在植物细胞中的表达在本文中是等价使用的，意指较之在应用方法前核酸分子在植物、植物部分或植物细胞中的表达，或较之缺少本发明的重组核酸分子的参照植物，在应用本发明的方法后核酸分子在植物、植物部分或植物细胞中的表达较低。例如，参照植物包含仅缺少各前体分子的同一构建体。如本文中使用的，术语“抑制的”或“下调的”是同义词，在本文中意指待表达的核酸分子较低的，优选显著较低的表达。如本文中使用的，物质(例如蛋白质、mRNA或RNA)水平的“抑制”或“下调”意指相对于生长在基本相同条件下的基本相同的、但缺少本发明的重组核酸分子(例如缺少与srRNA前体分子的至少一部分互补的区域、缺少本发明的重组构建体或重组载体)的植物、植物部分或植物细胞，水平是降低的。如本文中使用的，物质(例如，由靶基因表达的preRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或其编码的蛋白质产物)水平的“抑制”或“下调”意指相对于缺少本发明的重组核酸分子的细胞或生物体，量降低10％或更多，例如20％或更多，优选30％或更多，更优选50％或更多，甚至更优选70％或更多，最优选80％或更多，例如90％。可以通过本领域技术人员熟悉的方法，确定抑制或下调。因此，例如通过蛋白质的免疫检测，可以确定核酸或蛋白质量的提高或增加。此外，可以使用技术，例如蛋白质测定、荧光、Northern杂交、核酸酶保护测定、逆转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、Western印迹、放射免疫测定(RIA)或其他免疫测定，和荧光活化的细胞分析(FACS)来测量植物或植物细胞中的特定蛋白质或RNA。根据所诱导的蛋白质产物的类型，还可以确定它对生物体或细胞表现型的活性或影响。确定蛋白质的量的方法是熟练的技术人员已知的。可以提及的实例是：micro-Biuret方法(Goa J(1953)Scand J Clin Lab Invest 5：218-222)、Folin-Ciocalteau方法(Lowry OH等人(1951)J Biol Chem 193：265-275)或测量CBB G-250的吸光度(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72：248-254)。定量蛋白质活性的另一个实例检测荧光素酶活性描述在下文实施例中。

有义：术语″有义″理解为意指具有与靶序列互补或相同的序列的核酸分子，例如结合蛋白质转录因子并参与给定基因表达的的序列。根据优选的实施方案，核酸分子包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。

核酸分子的二级结构指单个分子内或相互作用的分子集内的碱基配对的相互作用，可以表示在核酸分子中配对的碱基的列表。由于其形成源自核糖中额外的羟基的氢键的能力增加，单链RNA形成复杂的碱基配对相互作用。二级结构包含例如茎环结构，也称为发夹结构。当同一链的两个区域的核苷酸序列按相反方向阅读时部分或完全互补，就形成该结构，碱基对形成以未配对的环终止的双螺旋。

预测核酸分子二级结构的工具是例如CentroidFold(MichiakiHamada，Hisanori Kiryu，Kengo Sato，Toutai Mituyama，Kiyoshi Asai(2009).″Predictions of RNA secondary structure using generalizedcentroid estimators″.Bioinformatics 25(4)：465-473)、CONTRAfold(DoCB，Woods DA，Batzoglou S(2006).″CONTRAfold：RNA secondarystructure prediction without physics-based models″.Bioinformatics 22(14)：e90-8)、KineFold(Xayaphoummine A，Bucher T，Isambert H(2005).″Kinefold web server for RNA/DNA folding path and structure predictionincluding pseudoknots and knots″.Nucleic Acids Res.33(Web Serverissue)：W605-10)、Mfold(Zuker M，Stiegler P(1981).″Optimal computerfolding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliaryinformation″.Nucleic Acids Res.9(1)：133-48.)、Pknots(Rivas E，EddySR(1999).″A dynamic programming algorithm for RNA structureprediction including pseudoknots″.J.Mol.Biol.285(5)：2053-68)，PknotsRG(Reeder J，Steffen P，Giegerich R(2007).″pknotsRG：RNApseudoknot folding including near-optimal structures and slidingwindows″.Nucleic Acids Res.35(Web Server issue)：W320-4)、RNAfold(I.L.Hofacker，W.Fontana，P.F.Stadler，S.Bonhoeffer、M.Tacker，P.Schuster(1994).″Fast Folding and Comparison of RNA SecondaryStructures.″.Monatshefte f.Chemie 125：167-188)、RNAshapes(R.Giegerich，B.Voβ、M.Rehmsmeier(2004).″Abstract shapes of RNA.″.Nucleic Acids Res.32(16)：4843-4851)、RNAstructure(D.H.Mathews，M.D.Disney，J.L.Childs，S.J.Schroeder、M.Zuker，D.H.Turner(2004).″Incorporating chemical modification constraints into a dynamicprogramming algorothm for prediction of RNA secondary structure.″Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 101：7287-7292.)、Sfold(Ding Y，Chan CY，Lawrence CE(2004).″Sfold web server forstatistical folding and rational design of nucleic acids″.Nucleic Acids Res.32(Web Server issue)：W135-41)或UNAFold(Markham NR，Zuker M(2008).″UNAFold：software for nucleic acid folding and hybridization.″.Methods Mol Biol 453：3-31)。

显著增加或减少：增加或减少，例如酶促活性或基因表达的增加或减少，是大于测量技术本身的误差幅度的，优选比对照酶的活性或对照细胞中的表达增加或减少约2倍或更多，更优选增加或减少约5倍或更多，最优选的增加或减少约10倍或更多。

基本互补：就最广含义而言，当在本文中用于相对于参照或靶核苷酸序列的核苷酸序列时，术语″基本互补″意指在基本互补的核苷酸序列和所述参照或靶核苷酸序列的准确互补序列之间，所述核苷酸序列具有至少60％，更理想至少70％，更理想至少80％或85％，优选至少90％、更优选至少93％、仍然更优选至少95％或96％，仍然更优选至少97％或98％，仍然更优选至少99％或最优选100％的百分比同一性(最后一种等同于本文中的术语“相同的”)。优选地，在至少19个核苷酸长，优选至少50个核苷酸长，更优选全长核酸序列上对于所述参照序列评估同一性(如果下文中没有另外具体说明)。使用基于Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48：443-453；如上文限定的)的、University of Wisconsin GCG、GAP的SEQWEB应用的默认的GAP分析，进行序列比较。与参照核苷酸序列″基本互补″的核苷酸序列在中等严谨条件下，优选高严谨条件下，最优选的非常高严谨条件下(如上文限定的)，与参照核苷酸序列杂交。

转基因：如本文中使用的，术语″转基因″指通过实验操作导入到细胞中的任何核酸序列。转基因可以是″内源DNA序列″或”异源DNA序列″(即，″外源DNA″)。术语″内源DNA序列″指在其所导入的细胞中天然发现的核苷酸序列，只要其相对于天然存在的序列不含有某些修饰(例如，点突变、存在可选择的标志物基因等)。

转基因的：当涉及生物体时，术语转基因的意指用优选包含与目标DNA序列有效连接的合适启动子的重组DNA分子转化的，优选稳定转化的。

载体：如本文中使用的，术语″载体″指能够运输与其连接的另一种核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合型载体，或″整合型载体″，其可以整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是附加体型载体，即，能够染色体外复制的核酸分子。能够指导与其有效连接的基因表达的载体在本文中被称为″表达载体″。在本说明书中，“质粒”和″载体″是可互换使用的，除非上下文中另外明确过。设计在体外或体内生产本文所述RNA的表达载体可以含有被任何RNA聚合酶(包括线粒体RNA聚合酶、RNA pol I、RNA pol II和RNA pol III)识别的序列。这些载体可用于在细胞中转录根据本发明所需的RNA分子。植物转化载体被理解为适合植物转化过程的载体。

野生型：涉及生物体、多肽或核酸序列时，术语″野生型″、″天然的″或″天然来源″意指所述生物体是天然存在的或是从至少一种没有改变、突变或被人另外操作过的、天然存在的生物体中获得的。

实施例

化学品和常规方法

除非另外指出，如所述(Sambrook等人，1989)实施出于本发明目而进行的克隆程序，包括限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、核酸纯化、核酸连接、转化、细菌细胞的选择和培养。用使用Sanger技术(Sanger等人，1977)的激光荧光DNA测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)实施重组DNA的序列分析。除非另外描述，化学品和试剂获得自SigmaAldrich(Sigma Aldrich，St.Louis，美国)、Promega(Madison，WI，美国)、Duchefa((Haarlem，荷兰)或IHvitrogen(Carlsbad，CA，美国)。限制性内切酶来自New England Biolabs(Ipswich，MA，美国)或RocheDiagnostics GmbH(Penzberg，德国)。寡核苷酸是由Eurofins MWGOperon(Ebersberg，德国)合成的。

实施例1：鉴别大豆miR166前体(Gm pre-miR166)Gm pre-miR166h(SEQ ID NO：1)：Hyseq 47124994

gatttcgtctctcaaactcgtttgtgctgagagaaccaagggtttcttcccttgcagagaagaaaatttggatacatatggttaagtttatttagatatcttgtttgttctttcatctttctcagatatggtttggaaatgggagattggggatgatgggaatgttgtttggctcgagaaaaagctttaaaggttggattttgaggctatccctttatgtgatctcggaccaggcttcattcccgtcaaccttatctctctctcttgagatcttctcccatggaggggtgatggcttatgtatataggtttcccagctgtagcatctttagggtttgagattcctaaccatctttacttcctgtcaagtttcagtccatgtggttggcttcattttttcagcccaggtgaatagagaaaagtgctgagaagatgcatgaagttaagatgaattaatggatctaaaacataacaaaattggtggcacacaatgcatacagaattttcctttcatttgttggttatcacttcatcgtttttcttgcttgtttctaccaaaataaaaggcgaaagagggagtgttgtggtggtggttgggctagcctgaaaaattgtaattcctaccaaggttttaaaaaatatcagtaacaggaatttcaatcacaatatcaagctttgtgggcgattgcatcttgtggtgacatcatcggtcatatttttccacaatgtcaggaatcacaaccacactttaaaacctttatacaattttcctaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaa

注意：miR166来自核苷酸225-245，而miR166＊来自核苷酸159-179。

Gm-miR166序列：5’ucggaccaggcuucauucccc 3’(SEQ ID NO：2)，最后一个核苷酸不同于gm_miR166h。

通过使用大豆miR166核苷酸序列(5’ucggaccaggcuucauucccc 3’)针对BPS专利所有的大豆Hyseq数据库Hyseq_Soybean_EST.nt进行BLAST来鉴别该EST克隆。用E值4e-04检索到Hyseq克隆47124994。序列分析指出它含有miR166序列(与gm_miR16620/21相同)和miR166＊序列(与gm_miR16619/21相同并折叠成典型的miRNA茎环结构，且miR166和miR166＊区是茎的一部分。因此，我们预测Hyseq 47124994是Gm_miR166前体的EST克隆。我们将其命名为Gm pre-miR166h。使用来自Hyseq 47124994中的核苷酸10-361的352bp片段作为用于在植物中表达Gm-miR166或人工的Gm-miR166的前体。

通过使用来自大豆W82的基因组DNA，通过PCR获得对应于352bpGm pre-miR166h的基因组片段。

基因组pre-miR166(SED ID NO：3)

Tctcaaactcgtttgtgctgagagaaccaagggtttcttcccttgcagagaagaaaatttggatacatatggttaagtttatttagatatcttgtttgttctttcatctttctcagatatggtttggaaatgggagattggggatgatgggaatgttgtttggctcgaggtaactgcatggtcttaattttgttcatcttttgaagctttaatttatttatgggtttcaatcttttttgatcccttgaaacagaaaaagctttaaaggttggattttgaggctatccctttatgtgatctcggaccaggcttcattcccgtcaaccttatctctctctcttgagatcttctcccatggaggggtgatggcttatggtaattaattaaggcgatgtcaaaacaagactcttgtgatagatatatctggtcaatgatgacattaaaactctcttgtttgttattttttatcggtaaatatgttacttgttaaaatattagttttgttattaagattgatctgtaattttttttcttaaccatccaatctattatatatctcctatacttatttgttttgtttgtgtttgtaaattcagacattgcatgggacaaaacttgaaacatttgtcaagaactctattgaacaagatgcctttgaccttgttgtaattggtgctttgttttttgtcatctttcttatggctccattatactttatatatcttcatttctttcaacatctctctcgatcgtgagttaatttaacggttgagacttgagatttgtgctattatatattatgtctatctaaaaggatcaggctccaaaatctttatatagtatataattatttttcttggattatgattagtgagtaattggtattaacttttttaagttaaatattctgcgttgagaaacccaaggatctttgaaattctgtattttgtcagtatataggtttcccagctgtagcatctttagggtttgagattcctaaccatctttacttcctgtc

通过与Hyseq 47124994中的其cDNA序列相比较，我们鉴别了位于该1018bp基因组序列中的2个内含子。核苷酸2-169是外显子1，后接170-253作为内含子1，以及254-375作为外显子2和376-953作为内含子2。核苷酸954-1018是部分外显子3。有趣的是，miR166＊被内含子1分为两部分。第一部分含有来自150-169的20bp，而第二部分含有miR166＊中位于第254位的最后一个核苷酸。MiR166位于第300-320位的外显子2中。

Gm pre-miR166h是大豆中的新miR166前体，但与其他的大豆miR166前体共享一定的同源性。在所有已知的大豆miR166前体中，gmpre-miR166h与Reinhart、Brenda和David Bartel等人的专利US2005144669_A1中公开的序列#1087共享最高的同源性(68％)，序列#1087的174个核苷酸中的119个与我们鉴别的gm prw-miR166h前体相同。

实施例2：使用靶向八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的Gm pre-miR166 制备人工miRNA进行概念验证

已经根据Schwab等人(2006)改造了天然的植物微小RNA前体，以生产特异性下调靶基因表达的人工miRNA。设计有功能的微小RNA的其他方法是Stephan Ossowski等人(2008)描述的工具WMD3。该工具可获得自互联网，使用下列URLhttp://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi)。

我们使用cDNA gm_miR166h前体在大豆中表达受欧芹泛素启动子驱动的人工微小RNA miRPDS3。用靶向植物PDS基因保守区的21-nt序列miRPDS35’tcatatgtgttcttcagttat 3’(SEQ ID NO：4)取代21-nt miR166序列。用miRPDS3＊序列5’aactgacgaacacatatgaga 3’(SEQ ID NO：5)取代gm_miR166h miR166＊区域。该实验中使用具有野生型gm_miR166h序列的对照载体作为对照。将植物表达载体MW120(miR166h)和MW121(miRPDS3)都转化到农杆菌中并用于大豆TRAP根转化。收集转基因TRAP根，并在ABI7900上使用Tagman测定来检测PDS表达水平。分析了来自MW120和MW121的12个独立的转基因事件。PDS Tagman测定结果显示，相比对照构建体MW120，在miRPDS3构建体MW121中大豆TRAP根中的PDS转录物降低了70％，MW121事件中的平均PDS转录物水平为2.90，而MW120事件中为9.83。PDS转录物水平的差异是统计学显著的，P值为0.03。

构建体MW120和MW121还用于在拟南芥和大豆全株植物转化中表达抗PDS人工miRNA miRPDS3。在拟南芥中，12％的用MW121转化的转基因植物(138株植物中的16株)表现出严重的光漂白表现型，所述表现型对于植物中的PDS缺陷是典型的。作为对照，用MW120转化的所有植物都保持绿色。在大豆中，也偶尔观察到光漂白表现型，但表现型的频率和程度不一致。

实施例3：表征不同长度的Gm pre-miR166

设计和测试两个缩短版本的大豆miR166h前体。设计了143bp和195bp版本。设计两种版本都表达let-7微小RNA。

143bp版本的Gm pri-miR166h由原始的355bp Gm pri-miR166h序列(SEQ ID NO：10)的碱基130至272组成。最终143bp大豆miR166h前体序列(143bp Gm pri-miR166h)如下所示，在人工let-7微小RNA：5’TGAGGTAGTAGGTTGTATAGT 3’(SEQ ID NO：6)序列下面划线。

ATGGGAGATTGGGGATGAACTATACATCCTACTACCACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCAACCTTATCTCTCTCTCTTGAGATCTTCTCCCAT

195bp版本的Gm pri-miR166h由原始的355bp Gm pri-miR166h序列(SEQ ID NO：10)的碱基118至312组成。最终195bp大豆miR166h前体序列(143bp Gm pri-miR166h)如下所示，在人工let-7微小RNA序列下面划线。

TATGGTTTGGAAATGGGAGATTGGGGATGAACTATACATCCTACTACCACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCAACCTTATCTCTCTCTCTTGAGATCTTCTCCCATGGAGGGGTGATGGGTTATGTATATAGGTTTCCCAGCTGTA

从转基因根中提取总RNA。使用T4RNA聚合酶，将具有下述序列的嵌合的RNA/DNA 3’接头“R5”连接到总RNA中，所述序列为P-AUGCGGTGGTGGCTGAGCGGGCTGGCAAGGC-idT，其中前4个碱基是RNA，其余的DNA在3’端具有倒置的胸腺嘧啶。然后，使用该3’连接的RNA作为模板用于一步RT-PCR，所述RT-PCR使用具有与缺少预测的miRNA的3’端的3个核苷酸所对应的碱基的预测的miRNA序列相同的序列5’TGAGGTAGTAGGTTGTAT 3’的正向寡“let-7-3”，和具有与3’接头互补的序列GCCTTGCCAGCCCGCTCAG的反向寡“JMprim357”。使用Invitrogen的试剂盒SuperScript III One-StepRT-PCR System和Plantinum Taq DNA聚合酶(货号12574-026)实施RT-PCR，使用下列条件：1个循环，55℃30分钟；1个循环，94℃2分钟；40个循环，94℃15秒，50℃30秒，68℃20秒；和68℃5分钟。为了确定PCR扩增产物的存在和大小，在15％丙烯酰胺/TBE凝胶上，在NewEngland Biolabs的低分子量DNA Ladder(货号N3234S)旁边，运行一部分RT-PCR产物。

两种缩短版本的Gm pri-miR166h都生产预期大小的单条带，表示它们是有功能的并且产生正确的微小RNA。

实施例4：使用Gm pre-miR166制备miRNA堆积构建体

串联堆积两种大豆miR166h前体，其生产一种转录物，当加工所述转录物时，所述转录物生产两种不同的成熟微小RNA。用两种355bp和两种195bp版本的大豆miR166h前体制备堆积的微小RNA盒。

堆积的355bp前体序列如下(SEQ ID NO：7)。每种前体表达不同的miRNA。第一种前体表达miR let-7，而第二种前体表达靶向线虫基因let-70的人工miRNA，5’TGGATGGTCAGAAAGAAGACGT 3’(SEQ IDNO：8)。两种前体被SwaI限制性位点分开。在每种前体中的miRNA序列下面划线。

TCTCAAACTCGTTTGTGCTGAGAGAACCAAGGGTTTCTTCCCTTGCAGAGAAGAAAATTTGGATACATATGGTTAAGTTTATTTAGATATCTTGTTTGTTCTTTCATCTTTCTCAGATATGGTTTGGAAATGGGAGATTGGGGATGAACTATACATCCTACTACCACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCAACCTTATCTCTCTCTCTTGAGATCTTCTCCCATGGAGGGGTGATGGCTTATGTATATAGGTTTCCCAGCTGTAGCATCTTTAGGGTTTGAGATTCCTAACCATCTTTACTTCCTGTATTTAAATTCTCAAACTCGTTTGTGCTGAGAGAACCAAGGGTTTCTTCCCTTGCAGAGAAGAAAATTTGGATACATATGGTTAAGTTTATTTAGATATCTTGTTTGTTCTTTCATCTTTCTCAGATATGGTTTGGAAATGGGAGATTGGGGATGACGTCTTCTATCTGACCATACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGGATGGTCAGAAAGAAGACGTCAACCTTATCTCTCTCTCTTGAGATCTTCTCCCATGGAGGGGTGATGGCTTATGTATATAGGTTTCCCAGCTGTAGCATCTTTAGGGTTTGAGATTCCTAACCATCTTTACTTCCTGT

堆积的195bp前体序列如下(SEQ ID NO：9)。每种前体表达不同的miRNA。第一种前体表达miR let-7，而第二种前体表达靶向线虫基因let-70的人工miRNA。两种前体被SwaI选择性位点分开。在每种前体中的miRNA序列下面划线。

TATGGTTTGGAAATGGGAGATTGGGGATGAACTATACATCCTACTACCACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTCAACCTTATCTCTCTCTCTTGAGATCTTCTCCCATGGAGGGGTGATGGCTTATGTATATAGGTTTCCCAGCTGTAATTTAAATTATGGTTTGGAAATGGGAGATTGGGGATGAACTCTTCTATCTGACCATACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGGATGGT CAGAAAGAAGACGTCAACCTTATCTCTCTCTCTTGAGATCTTCTCCCATGGAGGGGTGATGGCTTATGTATATAGGTTTCCCAGCTGTA

生产两种堆积的miRNA盒的转基因根。从表达这些构建体的大豆根中提取总RNA，并用于用Illumina技术进行小RNA测序。结果表明let-7和let-70人工miRNA都如预期表达，且let-7miRNA表达水平比let-70miRNA高(～30倍)。

原始的355bp Gm pri-miR166h序列(SEQ ID NO：10)

TCTCAAACTCGTTTGTGCTGAGAGAACCAAGGGTTTCTTCCCTTGCAGAGAAGAAAATTTGGATACATATGGTTAAGTTTATTTAGATATCTTGTTTGTTCTTTCATCTTTCTCAGATATGGTTTGGAAATGGGAGATTGGGGATGATGGGAATGTTGTTTGGCTCGAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTCGGACCAGGCTTCATTCCCGTCAACCTTATCTCTCTCTCTTGAGATCTTCTCCCATGGAGGGGTGATGGCTTATGTATATAGGTTTCCCAGCTGTAGCATCTTTAGGGTTTGAGATTCCTAACCATCTTTACTTCCTGT

实施例5：用于控制线虫的改造的miRNA-载体构建

使用由外部的DNA合成公司的DNA合成，来分离用于构建表1所述和实施例2所讨论的二元载体的DNA片段。将所述的DNA合成产物克隆到DNA合成公司专利所有的载体中，并通过测序验证插入片段。使用该方法来分离由序列pr-GM pre-miR166h CDPK-152(SEQ ID NO：11)、pr-GM pre-miR166h Hg inx-3-937(SEQ ID NO：12)和pr-2x pre-miRopr3-541；ZF-40(SEQ ID NO：13)所描述的合成miRNA前体。当在植物中表达时，SEQ ID NO：11所述miRNA前体序列被加工生成SEQ ID NO：18(CDPK-152miRNA)所述的miRNA，如表1所示。当在植物中表达时，SEQ ID NO：12所述miRNA前体序列被加工生成SEQ ID NO：19(inx-3-937miRNA)所述的miRNA，如表1所示。当在植物中表达时，SEQID NO：13所述miRNA前体序列被加工生成SEQ ID NO：20(opr3-541miRNA)和SEQ ID NO：21(ZF-40miRNA)所述的miRNA，如表1所示。

miRNA靶序列是Gm CDPK(SEQ ID NO：14)(US60/900466)、GmInx-3(SEQ ID NO：15)(US61/049001)、Gm opr3(SEQ ID NO：16)(US60/900146)和Gm ZF 40(SEQ ID NO：17)(US61/16776)。

使用大豆孢囊线虫(SCN)诱导型启动子或组成型启动子来生成表达SEQ ID NO：11-13所述miRNA构建体的植物转化二元载体。对于此，将SEQ ID NO：11-13所述基因片段与SCN诱导型GmMTN3启动子(WO2008/095887)、SCN诱导型At海藻糖-6-磷酸磷酸酶样启动子(WO2008/071726)，或组成型超级启动子(US 5,955,646)有效连接，如表1所示。所获得的植物二元载体含有植物转化可选择的标志物，所述标志物由赋予对除草剂Arsenal(BASF Corporation，Florham Park，NJ)抗性的、经修饰的拟南芥AHAS基因组成。

表1.

实施例6：线虫生物测定

在共有的共同未决美国专利公开2008/0153102中公开的生根植物测定系统中使用表1中描述的双元载体。在用实施例1中描述的双元载体转化后产生转基因根。将多重转基因根株系传代培养并以大约500J2/孔的水平，用表面净化的race 3 SCN第二阶段幼虫(J2)接种。线虫接种后4周，计数每一孔中的胞囊数目。对于每一转化构建体，计算每一株系的胞囊数目以测定构建体的平均胞囊数和标准误差。将每一转化构建体的胞囊数值与平行测试的空载体对照的胞囊数值对比以确定测试的构建体是否导致胞囊数的减少。含有分别包含SEQ ID NO：18、19、20和/或21所述miRNA序列的SEQ ID NO：11、12或13所示重组微小RNA前体分子的构建体的生物测定结果导致在指定的构建体中测试的很多株系中减少的大豆胞囊线虫胞囊计数的一般趋势，所述指定的构建体含有与表1所述的每种miRNA有效连接的SCN诱导型启动子或组成型启动子。

实施例7.比较两种不同大豆miRNA前体生产人工miRNA的效力

A.从大豆微小RNA前体pri-miR166h表达的人工miRNA

使用大豆的miR166h前体序列作为表达人工微小RNA的模板。

用于生产人工miRNA的miR166h的大豆前体

在具有序列TCGGACCAGGCTTCATTCCCG的21nt miR166h下面划线。

用于从pri-miR166h表达miR-let-7的人工前体

为了创造当在大豆中表达时将生产let-7微小RNA的序列，如下修饰序列pri-miR166h：

1.用含有miR-let-7(下划线)和miR-let-7星(下划线)的序列GATGAACTATACATCCTACTACCACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGAGGTAGT AGGTTGTATAGTTCAA

取代跨pri-mir166h的核苷酸143-240、包括miR166h(下划线)和miR166h星(下划线)的序列GATGATGGGAATGTTGTTTGGCTCGAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTCGGACCAG GCTTCATTCCCGTCAA。

用于从pri-miR166h表达miR-let-70-143的人工前体

为了创造当在大豆中表达时将生产let-70-143微小RNA的序列，如下修饰序列pri-miR166h：

1.用含有miR-let-70-143(下划线)和miR-let-70-143星(下划线)的序列GATGACGTCTTCTATCTGACCATACAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTGGATGGTC AGAAAGAAGACGTCAA

取代跨pri-mir166h的核苷酸143-240、包括miR166h(下划线)和miR166h星(下划线)的序列GATGATGGGAATGTTGTTTGGCTCGAGAAAAAGCTTTAAAGGTTGGATTTTGAGGCTATCCCTTTATGTGATCTCGGACCAG GCTTCATTCCCGTCAA。

B.从大豆微小RNA前体pri-miR-GMmerge_4110158表达的人工miRNA

从我们的小RNA深度测序和后续生物信息学分析中，鉴别miR-GMmerge_4110158的大豆前体序列。该前体被用作表达人工微小RNA的模板。

miR-GMmerge_4110158的大豆前体

在具有序列CTATTTAAGGGAACATGTTTG的21ntmiR-GMmerge_4110158下面划线。

用于从pri-miR-GMmerge 4110158表达miR-let-7的人工前体

为了创造当在大豆中表达时将生产let-7微小RNA的序列，如下修饰序列pri-miR-GMmerge_4110158：

1.用含有miR-let-7(下划线)和miR-let-7星(下划线)的序列ACCATTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTATTGACTAGGCTATGCTAGCAAGGGAATTGATAGTTCTTGATAATGTTGATCAAGTTGGACTCCGCTTTACAACTTAGAGGCTTCAAGATACTTT

取代跨pri-miR-GMmerge_4110158的核苷酸148-270、包括miR-GMmerge_4110158(下划线)和miR-GMmerge_4110158star(下划线)的序列ACCATCTATTTAAGGGAACATGTTTGTTATTGACTAGGCTATGCTAGCAAGGGAATTGATAGTTCTTGATAATGTTGATCAAGTTGGACTCCTAAAGATGTTTCCAAGGAGTAGAGATACTTT。

用于从pri-miR-GMmerge 4110158表达miR-let-70-143的人工前体

为了创造当在大豆中表达时将生产let-70-143微小RNA的序列，如下修饰序列pri-miR-GMmerge_4110158：

1.用含有miR-let-70-143(下划线)和miR-let-70-143星(下划线)的序列ACCATTCTTCTATCTGACCATACAGATTATTGACTAGGCTATGCTAGCAAGGGAATTGATAGTTCTTGATAATGTTGATCAAGTTGGACTCCTCTCTATGGTTAGTAGGGGAGAAGATACTTT

取代跨pri-miR-GMmerge_4110158的核苷酸148-270、包括miR-GMmerge_4110158(下划线)和miR-GMmerge_4110158星(下划线)的序列ACCATCTATTTAAGGGAACATGTTTGTTATTGACTAGGCTATGCTAGCAAGGGAATTGATAGTTCTTGATAATGTTGATCAAGTTGGACTCCTAAAGATGTTTCCAAGGAGTAGAGATACTTT。

C.载体构建

构建四种二元载体：RTP2466、RTP8113、RTP2276和RTP8111，使得每种miRNA前体都由超级启动子和NOS终止子驱动，来表达人工的微小RNA(表2和3)。合成微小RNA前体，并使用限制性位点AscI和SbfI将其克隆到二元载体中。

表2

表3

D.转化大豆根和分析miRNA表达

在共有的共同未决美国专利公开2008/0153102中公开的生根植物测定系统中使用表2和3中描述的二元载体。亚培养和收获每个构建体的多个转基因根系。用TRIzol试剂提取总RNA。从Applied Biosystems定制了分别对let-7和let-70-143特异性的基于qRT-PCR的miRNA测定。测定用于根据生产商的说明来测定人工miRNA的表达。使用大豆甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为归一化miRNA表达的内部参照物。使用统计学分析来确定两种前体表达let-7和let-70-143的效力。

结果显示，较之GMmerge_4110158前体，miR166h前体能够生产高273倍的let-7miRNA(P＜0.01)和高700倍的let-70-143miRNA(P＜0.01)。因此，对于在大豆中生产人工miRNA而言，大豆miR166h前体远好于GMmerge_4110158前体。

附图简介

图1

用mfold(Zuker(2003))预测的SEQ ID NO：1的碱基对139至281的二级结构，使用下列设置：限定RNA为线性，折叠温度固定为37℃，离子条件设置为1M NaCl，无二价离子，次优百分比设置为5，计算的折叠数的上限设为50，窗口参数为默认的，最大内部/突起环大小设为30，内部/突起环的最大不对称性设为30，配对碱基之间的最大距离无限制。

用方框标记微小RNA序列和微小RNA星序列。

a)环

b)突起

Claims (16)

1.分离的核酸分子，其包含核酸分子，所述核酸分子包含于下述组中，所述组由下述组成：

I)SEQ ID NO：1所示核酸分子，和

II)具有SEQ ID NO：1所述序列的至少100个连续的碱基对的核酸分子，和

III)与SEQ ID NO：1所述序列的至少100个连续的核酸碱基对的序列具有至少70％同一性的核酸分子，和

IV)与SEQ ID NO：1所述核酸分子的至少100个连续的碱基对的核酸分子在严谨条件下杂交的至少100bp的核酸分子，和

V)能够形成与由SEQ ID NO：1所形成的二级结构同源的二级结构的核酸分子，

VI)I)至V)所限定的序列中任一项的互补序列。

2.权利要求1的分离的核酸分子，其中

a)SEQ ID NO：1的bp 225-245或如权利要求1的II)至VI)中所限定的核酸分子的相应碱基对被与靶基因互补的、包含至少20或21或22bp的核酸序列或其多个取代，和

b)SEQ ID NO：1的bp 159-179或如权利要求1的II)至VI)中所限定的核酸分子的相应碱基对被与a)互补的、包含至少20或21或22bp核酸序列或其多个取代，且其中a)和b)和分隔a)和b)的核酸分子能够形成茎环结构。

3.权利要求1或2的分离的核酸，其中SEQ ID NO：1的bp 225-245或如权利要求1的II)至VI)中所限定的核酸分子的相应碱基对被选自以下的序列取代：

a.SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示的核酸分子或其多个，或

b.具有SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述序列的至少15个连续碱基对的核酸分子，或其多个，或

c.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项的全部序列具有至少70％同一性的核酸分子，或其多个，或

d.较之SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项包含5个错配的核酸分子，或其多个，或

e.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述的核酸分子在高严谨条件下杂交的核酸分子，或其多个。

4.包含如权利要求1至3中任一项所限定的分离的核酸分子的植物表达构建体。

5.包含如权利要求1至3中任一项所限定的分离的核酸分子或如权利要求4中所限定的表达构建体的植物表达载体。

6.包含如权利要求1至3中任一项所限定的分离的核酸分子或如权利要求4中所限定的表达构建体，或如权利要求5中所限定的植物表达载体的植物、植物细胞或植物种子。

7.调节靶基因较之各参照植物在植物或其部分中的表达的方法，所述方法包括步骤：

a)功能性连接的

i)至少一个在植物中有功能的调控性核酸分子，和

ii)与i)异源的重组微小RNA前体分子，其可在植物细胞中被切割以生产所述至少一种调控性核酸分子，和

b)将该核酸分子导入到植物或其部分中

其中，至少一种调控性核酸分子的序列与所述微小RNA前体分子是异源的，且

其中，至少一种调控性核酸分子的序列与植物中的至少一种靶序列结合，且

其中，微小RNA前体分子选自包含于以下组的核酸分子：

I)SEQ ID NO：1所示核酸分子，和

II)具有SEQ ID NO：1所述序列的至少100个连续的碱基对的核酸分子，和

III)与SEQ ID NO：1所述序列的至少100个连续的核酸碱基对的序列具有至少70％同一性的核酸分子，和

IV)与SEQ ID NO：1所述核酸分子的至少50个连续的碱基对的核酸分子在严谨条件下杂交的核酸分子，和

V)能够形成与由SEQ ID NO：1所形成的二级结构同源的二级结构的核酸分子，

VI)如I)至V)所限定的序列中任一项的互补序列。

8.权利要求7的方法，其中

a)与微小RNA前体分子异源的至少一种调控性核酸分子序列取代了bp 225-245或如权利要求6的II)至VI)中所限定的核酸分子序列中的各碱基对，和

b)与至少一种调控性核酸分子序列互补的至少一种调控性核酸分子星序列取代了SEQ NO：1的bp 159-179或如权利要求7的II)至VI)中所限定的核酸分子序列中的各碱基对，和

其中a)和b)和分隔a)和b)的核酸分子能够形成茎环结构。

9.权利要求6或7的方法，其中取代了bp 225-245或如权利要求6的II)至VI)中所限定的核酸分子序列中的各碱基对的序列选自：

a.SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示的核酸分子或其多个，或

b.具有SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示序列的至少15个连续碱基对的核酸分子，或其多个，或

c.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项的全部序列具有至少70％同一性的核酸分子，或其多个，或

d.较之SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项，包含5个错配的核酸分子，或其多个，或

e.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述核酸序列在高严谨条件下杂交的核酸分子，或其多个。

10.权利要求7至9中任一项的方法，其中取代bp 225-245的至少一种调控性核酸分子序列和与调控性核酸分子序列互补的至少一种调控性核酸分子星序列由20或21或22bp或多个20或21或22bp组成。

11.权利要求7至10的任一项的方法，其中植物是双子叶植物，优选是大豆属(Glycine)。

12.如权利要求1至3中任一项所限定的分离的核酸分子或如权利要求4中所限定的表达构建体用于调节靶基因在植物或其部分中的表达的用途。

13.生产转基因植物的方法，所述方法包括步骤：

I.提供如权利要求1至3中任一项所限定的分离的核酸，如权利要求4中所限定的植物表达构建体和/或如权利要求5中所限定的植物表达载体，和

II.向植物细胞或植物部分中导入如权利要求1至3中任一项所限定的分离的核酸，如权利要求4中所限定的植物表达构建体和/或如权利要求5中所限定的植物表达载体，和

III.从所述植物细胞或植物部分再生转基因植物。

14.权利要求2的分离的核酸分子，权利要求4的植物表达构建体或权利要求5的植物表达载体，其中如权利要求2a)和/或b)中所限定的碱基对选自：

a.SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示的核酸分子，或

b.具有SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所示序列的至少15个连续碱基对的核酸分子，或

c.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项的全部序列具有至少70％同一性的核酸分子，或

d.较之SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项，包含5个错配的核酸分子，或

e.与SEQ ID NO：18、19、20和/或21中任一项所述核酸序列在高严谨条件下杂交的核酸分子。

15.赋予植物抗线虫抗性的方法，所述方法包括步骤：

I.制备如权利要求3所限定的分离的核酸分子，如权利要求4所限定的表达构建体或如权利要求5所限定的表达载体；

II.用所述分离的核酸分子、表达构建体或表达载体转化受体植物；

III.生产所述受体植物的一个或多个转基因后代；和

IV.就线虫抗性对后代进行选择。

16.权利要求15的方法，其中包含于本发明的表达构建体和/或载体中的分离的核酸分子包含于SEQ ID NO：11、12和/或13的组中。