BRPI0807428A2

BRPI0807428A2 - Molécula de dsrna, coleção de moléculas dsrna, planta transgênica, métodos para preparar uma planta transgênica, e para conceder resistência a nematódeo a uma planta, e, vetor de expressão

Info

Publication number: BRPI0807428A2
Application number: BRPI0807428-3A
Authority: BR
Inventors: Aaron Wiig
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2008-02-04
Publication date: 2014-07-22
Also published as: CN101605896A; MX2009007608A; EP2111451A1; CA2674494A1; US20100011463A1; AR065243A1; WO2008095886A1

Description

“MOLÉCULA DE dsRNA, COLEÇÃO DE MOLÉCULAS DE dsRNA, PLANTA TRAN S GÊNIC A, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, E PARA CONCEDER RESISTÊNCIA A NEMATÓDEO A UMA PLANTA, E, VETOR DE EXPRESSÃO”

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido Provisório US de Número de Série 60/899739 depositado aos 06 de Fevereiro de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO O campo desta invenção é o controle de nematódeos, em

particular o controle de nematódeos de cisto de feijão-soja. A invenção também se refere à introdução de material genético dentro de plantas que são suscetíveis aos nematódeos com o propósito de aumentar a resistência aos nematódeos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nematódeos são animais vermiformes microscópicos que se alimentam de raízes, folhas, e caules de mais do que 2.000 plantações de escala, verduras/hortaliças, frutas, e plantas ornamentais, causando uma perda de plantação mundial estimada de 100 bilhões. Um tipo comum de nematódeo 20 é o nematódeo de galhas (RKN)5 cuja alimentação causa as características galhas sobre raízes. Outros nematódeos que se alimentam de raiz são os dos tipos de cisto e lesão, que são mais hospedeiro-específicos.

Nematódeos estão presentes por toda parte nos Estados Unidos, mas são principalmente um problema em áreas quentes, úmidas do 25 Sul e do Oeste, em solos arenosos. Nematódeo do cisto de feijão-soja (SCN), Heterodera glycines, foi primeiro descoberto nos Estados Unidos na Carolina do Norte em 1954. É a mais séria peste das plantas de feijão-soja. Algumas áreas estão tão intensamente infestadas por SCN que a produção de feijãosoja não é mais economicamente possível sem medidas de controle. Embora feijão-soja seja a plantação econômica maior atacada por SCN, parasitas SCN somam no total cinqüenta hospedeiros, incluindo plantações de campo, verduras/hortaliças, plantas ornamentais, e ervas daninhas.

Sinais de dano de nematódeo incluem atrofiamento e 5 amarelecimento de folhas, e murchamento das plantas durante períodos quentes. Contudo, nematódeos, incluindo SCN, podem causar perda de rendimento sem sintomas óbvios acima do solo. Em adição, raízes infectadas com SCN são ananicadas ou atrofiadas. Infestação de nematódeo pode diminuir o número de nódulos fixadores de nitrogênio sobre as raízes, e 10 podem tomar as raízes mais suscetíveis aos ataques por patógenos de planta provenientes do solo.

O ciclo de vida de nematódeo tem três estágios maiores: ovo, juvenil, e adulto. O ciclo de vida varia entre as espécies de nematódeos. Por exemplo, o ciclo de vida de SCN pode costumeiramente ser completado em 15 24 a 30 dias sob condições ótimas enquanto que outras espécies podem demorar tão longamente quanto um ano, ou mais longo, para completar o ciclo de vida. Quando os níveis de temperatura e de umidade tomam-se adequados no verão, nematódeos juvenis vermiformes eclodem de ovos no solo. Estes nematódeos juvenis são apenas o estágio de vida do nematódeo 20 que infecta as raízes de feijão-soja.

O ciclo de vida de SCN tem sido submetido a muitos estudos e portanto pode ser usado como um exemplo para entender um ciclo de vida de nematódeo. Após penetrarem nas raízes de feijão-soja, nematódeos juvenis SCN movem-se através da raiz até contatarem tecido vascular, onde param e 25 começam a se alimentar. O nematódeo injeta secreções que modificam certas células da raiz e as transformam em sítios de alimentação especializados. As células de raiz são morfologicamente transformadas em sincícios multinucleados grandes (ou células gigantes no caso de RKN), que são usadas como uma fonte de nutrientes para os nematódeos. Os nematódeos ativamente se alimentando assim roubam nutrientes essenciais da planta resultando em perda de rendimento. À medida que os nematódeos se alimentam, incham e eventualmente os nematódeos fêmeas se tomam tão grandes que rompem o tecido da raiz e são expostos sobre a superfície da raiz.

Após um período de alimentação, nematódeos SCN machos,

que não estão inchados como adultos, migram para fora da raiz para dentro do solo e fertilizam as fêmeas adultas na forma de limão. Os machos então morrem, enquanto que as fêmeas permanecem fixadas no sistema de raiz e continuam a se alimentar. Os ovos nas fêmeas inchadas começam a se 10 desenvolver, inicialmente em uma massa ou saco de ovos fora do corpo, então mais tarde dentro da cavidade corporal. Eventualmente a cavidade corporal inteira da fêmea adulta está cheia de ovos, e o nematódeo fêmea morre. E o corpo cheio de ovos da fêmea morta que é chamado de cisto. Cistos eventualmente se desalojam e são encontrados livres no solo. As paredes do 15 cisto tomam-se muito resistentes, proporcionam excelente proteção para os aproximadamente 200 a 400 ovos contidos dentro das mesmas. Ovos de SCN sobrevivem dentro do cisto até ocorrerem condições apropriadas de eclosão. Embora muitos dos ovos possam eclodir dentro do primeiro ano, muitos também sobreviverão dentro dos cistos por vários anos.

Um nematódeo pode se mover por si mesmo através do solo

apenas umas poucas polegadas por ano. Contudo, infestação de nematódeo pode ser espalhada por distâncias substanciais em uma variedade de maneiras. Qualquer coisa que possa mover solo infestado é capaz de espalhar a infestação, incluindo maquinário, veículos e ferramentas de fazenda, vento, 25 água, animais, e trabalhadores de fazenda. Partículas de solo do tamanho de semente freqüentemente contaminam semente colhida. Conseqüentemente, infestação de nematódeo pode ser espalhada quando semente contaminada de campos infestados é plantada em campos não-infestados. Há até mesmo evidência de que certas espécies de nematódeos podem ser espalhadas por aves. Apenas algumas das causas podem ser prevenidas.

Práticas tradicionais para manejar infestação de nematódeo incluem: manutenção de níveis de pH de solo e de nutrientes de solo apropriados em terra infestada com nematódeo; controle de outras doenças de 5 planta, bem como de pestes de ervas daninhas e de insetos; usando práticas de sanitização tais com aração, plantio, e cultivo de campos infestados com nematódeos apenas após trabalhar campos não-infestados; limpeza cuidadosa de equipamento com vapor de água ou água de pressão alta após trabalho em campos infestados; não uso de semente crescida em terra infestada para 10 plantio de campos não-infestados a não ser que a semente tenha sido apropriadamente limpa; rotação de campos infestados e altemação de plantações hospedeiras com plantações não-hospedeiras; usando nematicidas; e plantio de variedades de planta resistentes.

Têm sido propostos métodos para a transformação genética de plantas com o objetivo de conceder resistência aumentada aos nematódeos parasitas de plantas. Patentes US Nos. 5.589.622 e 5.824.876 são direcionadas para a identificação de genes de planta expressados especificamente em ou adjacentemente aos sítio de alimentação da planta após fixação pelo nematódeo. Os promotores destes genes alvo de planta podem ser então usados para dirigir a expressão específica de enzimas ou proteínas prejudiciais, ou a expressão de RNA de anti-senso para o gene alvo ou os genes celulares gerais. Os promotores de planta também podem ser usados para conceder resistência a nematódeo especificamente no sítio de alimentação pela transformação da planta com um construto compreendendo o promotor do gene alvo da planta ligado em um gene cujo produto induz letalidade no nematódeo após ingestão

Recentemente, interferência de RNA (RNAi), também chamada de silenciamento de gene, tem sido proposta como um método para controlar nematódeos. Quando DNA de fita dupla (dsRNA) correspondendo essencialmente à seqüência de um gene alvo ou mRNA é introduzido em uma célula, expressão do gene alvo é inibida (veja e.g., Patente US No. 6.506.559). Patente US No. 6.506.559 demonstra a efetividade de RNAi contra genes conhecidos de Caenorhabditis elegans, mas não demonstra a utilidade de 5 RNAi para controlar nematódeos parasitas de planta.

Uso de RNAi para selecionar genes de nematódeo essenciais tem sido proposto, por exemplo, em Publicação PCT WO 01/96584, WO 01/17654, US 2004/0098761, US 2005/0091713, US 2005/0188438, US 2006/0037101, US 2006/0080749, US 2007/0199100, e US 2007/0250947.

Têm sido propostos numerosos modelos para ação de RNAi.

Em sistemas de mamífero, dsRNAs maiores do que 30 nucleotídeos causam indução de síntese de interferon e uma parada global de síntese de proteína, em uma maneira não específica de seqüência. Contudo, Patente US No. 6.506.559 revela que em nematódeos, o comprimento do dsRNA 15 correspondendo à seqüência de gene alvo pode ser pelo menos de 25, 50, 100, 200, 300, ou 400 bases, e que até dsRNAs maiores (742 nucleotídeos, 1033 nucleotídeos, 785 nucleotídeos, 531 nucleotídeos, 576 nucleotídeos, 651 nucleotídeos, 1015 nucleotídeos, 1033 nucleotídeos, 730 nucleotídeos, 830 nucleotídeos, veja Tabela 1) também foram eficazes na indução de RNAi em

r

C. elegans. E sabido que quando construtos de RNA grampo-de-cabelo compreendendo regiões de fita dupla variando de 98 a 854 nucleotídeos foram transformados em numerosas espécies de planta, os genes de planta alvo foram eficientemente silenciados. Há concordância geral de que em muitos organismos, incluindo nematódeos e plantas, pedaços grandes de dsRNA são 25 clivados em cerca de 19-24 fragmentos de 19-24 (siRNA) dentro de células, e que estes siRNAs são os mediadores reais do fenômeno de RNAi.

Embora tenha havido numerosos esforços para usar RNAi para controlar nematódeos parasitas de planta, até o presente momento nenhuma planta resistente a nematódeo tem sido desregulada em algum país. Conformemente, continua a haver uma necessidade para identificar composições e métodos seguros e eficazes para o controle de nematódeos parasitas de planta usando RNAi, e para a proteção de plantas tendo resistência aumentada aos nematódeos parasitas de planta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores têm descoberto um novo gene alvo de planta ("50657480") que é sobre-expressado em sincícios induzidos por infecção de raízes de feijão-soja por SCN. Os inventores têm adicionalmente descoberto que quando expressão do gene 50657480 é suprimida em um 10 sistema modelo de raiz de feijão-soja, a capacidade dos nematódeos para infectar tais raízes é diminuída.

Em uma primeira modalidade, portanto, a invenção fornece uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA) compreendendo a) uma primeira fita compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 e

b) uma segunda fita compreendendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita.

A invenção é adicionalmente representada como modalidade em uma coleção de moléculas de dsRNA compreendendo uma multiplicidade 20 de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo sendo substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta

transgênica resistente a nematódeo capaz de expressar um dsRNA que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA, sendo que cada molécula de dsRNA compreende uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19-24 nucleotídeos, e sendo que as moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo substancialmente idêntico a uma 5 porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de preparar uma planta transgênica capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA cada uma das quais é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 em uma 10 planta, dito método compreendendo as etapas de: a) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 uma vez 15 expressado na planta; b) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a progênie para expressão de dito transcrito.

A invenção adicionalmente fornece um método de conceder resistência a nematódeo a uma planta, dito método compreendendo as etapas 20 de: a) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 uma vez expressado na planta; b) transformar uma 25 planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a progênie para resistência a nematódeo.

A invenção adicionalmente fornece um vetor de expressão compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480. DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

Figuras la-lc: Tabela descrevendo iniciadores usados para gerar o construto de dsRNA RAW464 e os fragmentos RACE correspondendo a 50657480/

Figura 2: Alinhamento de seqüência de DNA de variante A de seqüência RACE (SEQID NO:7) com seqüência 50657480 cDNA (SEQID NO:l) Figura 3: Seqüência de consenso de contig (SEQ ID NO:8) de variante A de RACE e 50657480 descrevendo a matriz de leitura aberta em letras em negrito.

Figura 4: Tabela mostrando homólogos representativos de seqüência de aminoácidos de comprimento total de 50657480 descrita para SEQ ID NO: 10. A tabela mostra SEQ ID NO, tipo de seqüência, organismo, e Id de seqüência de GenBank para homólogos representativos.

Figura 5a-5c: Alinhamento de seqüência de aminoácidos dos

homólogos representativos de SEQIDNO:10.

Figura 6: Tabela de matriz descrevendo a identidade percentual de aminoácidos global dos homólogos representativos identificados.

Figura 7: Tabela de matriz descrevendo a identidade

percentual de nucleotídeos global das seqüências de DNA dos homólogos representativos identificados.

Figuras 8a a 8i: mostram vários 2lmers possíveis em SEQ ID NO: 8 por posição de nucleotídeo. Por exemplo o 2 Imer poderia compreender 25 nucleotídeos na posição 1 a 21, nucleotídeos na posição 2-22, nucleotídeos na posição 3-23, etc. Esta tabela também pode ser usada para calcular os 19, 20, 22, 23 ou 24-mers por adição ou subtração do número apropriado de nucleotídeos de cada 21mer.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção pode ser entendida mais prontamente referindo-se à seguinte descrição detalhada das modalidades preferidas da invenção e dos exemplos aqui incluídos. A não ser que seja indicado de outra maneira, os termos aqui usados são para serem entendidos de acordo com o 5 uso convencional por aquelas pessoas ordinariamente experientes na arte relevante. Em adição às definições de termos fornecidos abaixo, definições de

termos comuns em biologia molecular também podem ser encontrados em

• th Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5 Ed.,

Berlin: Springer- Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M.

Ausubel et al., Eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre

Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998

r

Supplement). E para ser entendido que como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, "um" ou "uma" pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado. Assim, por exemplo, referência a "uma célula" 15 pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada. É para ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever modalidades específicas e não é intencionada para ser limitante. Em todo este pedido, são feitas referências a várias publicações de patente e de literatura. As revelações de todas estas publicações e daquelas referências 20 citadas dentro daquelas publicações em suas totalidades são por meio deste incorporados como referências neste pedido com o propósito de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual este invenção pertence.

De acordo com a invenção, uma planta é transformada com um ácido nucleico ou um dsRNA, que especificamente inibe a expressão de um 25 gene alvo 50657480, um gene semelhante a 50657480, ou um homólogo de 50657480 na raiz de planta que é essencial para o desenvolvimento ou a manutenção de um sítio de alimentação, sincícios, ou célula gigante; basicamente afetando a sobrevivência, a metamorfose, ou a reprodução do nematódeo. Em uma modalidade preferida, inibição do gene alvo 50657480, um gene semelhante a 50657480, ou um homólogo de 50657480 ocorre usando dsRNA capaz de selecionar dito gene, cujo dsRNA tem sido transformado em um ancestre da planta infectada. Preferivelmente, a seqüência de ácido nucleico expressando o dsRNA está sob o controle de 5 transcrição de um promotor específico de raiz ou um promotor específico de sítio de alimentação de nematódeo parasita ou de um promotor induzível por nematódeo.

Como aqui usados os termos "gene alvo", "gene alvo 50657480", "gene semelhante a 50657480" e "gene 50657480" refere-se aos 10 genes, que são pelo menos cerca de 50-60%, pelo menos cerca de 60-70%, ou pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95%, e também podem ser pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idênticos ao polinucleotídeo compreendendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, 15 nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8. Alternativamente, genes alvo 50657480 adequados compreendem um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:l nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO:

I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8. O termo "homólogo 50657480" inclui genes ou seqüências, que podem ser identificadas pelo uso de uma parte ou do comprimento total de qualquer uma das seqüências aqui reveladas, em particular SEQ ID NO: 8, 9, 17, 19, 21, 23,25,27,29 ou SEQID NO: 4, 5,14 ou 15.

Como aqui usado, "RNAi" ou "interferência de RNA" refere25 se a um processo de silenciamento de gene pós-transcricional específico de seqüência em plantas, mediado por RNA de fita dupla (dsRNA). Como aqui usado, "dsRNA" refere-se a RNA que é de fita parcial ou completamente dupla. RNA de fita dupla também é chamado de um RNA interferente curto ou pequeno (siRNA), ácido nucleico interferente curto (siRNA), RNA interferente curto, micro-RNA (miRNA), e semelhantes. No processo de RNAi, dsRNA compreendendo uma primeira fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene alvo e uma segunda fita que é complementar à primeira fita é introduzido em uma planta. Após introdução 5 na planta, o dsRNA específico de gene alvo é processado em fragmentos relativamente pequenos (siRNAs) e pode ser subseqüentemente tomado distribuído em toda a planta, causando uma mutação de perda-de-fiinção tendo um fenótipo que, durante um período de regeneração, pode se tomar muito proximamente parecido com o fenótipo decorrente de uma deleção 10 parcial ou completa do gene alvo. Alternativamente, o dsRNA específico de gene alvo está operacionalmente associado em um elemento regulatório ou promotor que resulta em expressão do dsRNA em um tecido, maneira temporal, espacial ou induzível e pode ser adicionalmente processado em fragmentos relativamente pequenos por uma célula de planta contendo o 15 maquinário de processamento de RNAi, e é obtido o fenótipo de perda-defunção. Também, o elemento regulatório ou promotor pode dirigir a expressão quer constitutivamente naqueles tecidos quer sob indução pela alimentação do nematódeo ou nematódeo juvenil, tal como nematódeos J2.

Como aqui usado, tomando-se em consideração a substituição 20 de timina por uracila quando se comparam seqüências de RNA e DNA, o termo "substancialmente idêntico" como aplicado a dsRNA significa que a seqüência de nucleotídeos de uma fita do dsRNA é pelo menos 80%-90% idêntica a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, mais preferivelmente, pelo menos 90-95%, idêntico a 20 ou mais nucleotídeos 25 contíguos do gene alvo, e mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou absolutamente idêntica a 20 ou mas nucleotídeos contíguos do gene alvo. 20 ou mais nucleotídeos contíguos significa uma porção, sendo pelo menos cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, ou 2000 bases ou até o comprimento total do gene alvo. Como aqui usado, polinucleotídeos "complementares" são aqueles que são capazes de parear bases de acordo com as regras de complementaridade padrão de Watson-Crick. Especificamente, purinas parearão com pirimidinas para formar uma combinação de guanina pareada 5 com citosina (G:C) e quer adenina pareada com timina (A:T) no caso de

r

DNA, quer adenina pareada com uracila (A:U) no caso de RNA. E entendido que dois polinucleotídeos podem hibridizar um com o outro até mesmo se não forem complementares entre si, desde que cada um tenha pelo menos uma região que é substancialmente complementar a do outro. . Como aqui usado, o termo "substancialmente complementar" significa que duas seqüências de ácido nucleico são complementares em mais de pelo menos 80% de seus nucleotídeos. Preferivelmente, as duas seqüências de ácido nucleico são complementares em mais de pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de seus nucleotídeos. Alternativamente, "substancialmente complementar" significa que duas seqüências de ácido nucleico podem hibridizar sob condições de estringência. Como aqui usado, o termo "substancialmente idêntico" ou "correspondendo a" significa que duas seqüências de ácido nucleico têm pelo menos 80% de identidade de seqüência. Preferivelmente, as duas seqüências de ácido nucleico têm pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência.

Também como aqui usados, os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" referem-se a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um seu híbrido. O termo também inclui híbridos de RNA/DNA. Quando dsRNA é produzido sinteticamente, bases menos 25 comuns, tais como inosina, 5-metil-citosina, 6-metil-adenina, hipoxantina e outras também podem ser usadas para pareamento de anti-senso, dsRNA, e ribozima. Por exemplo, tem sido mostrado que polinucleotídeos que contêm análogos de C-5 propino de uridina e citidina se ligam em RNA com afinidade alta e são inibidores de anti-senso potentes da expressão de gene. Outras modificações, tais como modificações na estrutura principal de fosfodiéster, ou na 2'-hidroxila no grupo açúcar ribose do RNA também podem ser feitas.

Como aqui usado, o termo "controle", quando usado no 5 contexto de uma infecção, refere-se à redução ou prevenção de uma infecção. Redução ou prevenção de uma infecção por um nematódeo fará com que uma planta tenha resistência aumentada ao nematódeo, contudo, tal resistência aumentada não implica que a planta necessariamente tenha resistência de 100% à infecção. Em modalidades preferidas, a resistência à infecção por um 10 nematódeo em uma planta resistente é maior do que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% em comparação com uma planta de tipo selvagem que não é resistente a nematódeos. Preferivelmente a planta de tipo selvagem é uma planta de um genótipo similar, mais preferivelmente idêntico ao da planta tendo resistência aumentada ao nematódeo. A resistência da 15 planta à infecção pelo nematódeo pode ser devido à morte, esterilidade, parada no desenvolvimento, ou mobilidade prejudicada do nematódeo sob exposição à planta compreendendo dsRNA específico para um gene essencial para o desenvolvimento ou a manutenção de um sítio de alimentação funcional, sincícios, ou célula gigante. O termo "resistente à infecção por 20 nematódeo" ou "uma planta tendo resistência ao nematódeo" como aqui usado refere-se à capacidade de uma planta, em comparação com uma planta de tipo selvagem, para evitar infecção por nematódeos, para matar nematódeos ou para impedir, reduzir ou parar o desenvolvimento, o crescimento ou a multiplicação de nematódeos. Isto pode ser conseguido por um processo 25 ativo, e.g. pela produção de uma substância prejudicial para o nematódeo, ou por um processo passivo, como ter um valor nutricional reduzido para o nematódeo ou não desenvolver estruturas induzidas pelo sítio de alimentação de nematódeo como sincícios ou células gigantes. O nível de resistência de nematódeo de uma planta pode ser determinado em várias maneiras, e.g. pela contagem dos nematódeos que são capazes de estabelecer parasitismo sobre aquela planta, ou pela medição dos tempos de desenvolvimento de nematódeos, pela proporção de nematódeos machos e fêmeas ou, para nematódeos de cisto, pela contagem do número de cistos ou ovos de 5 nematódeo produzidos sobre raízes de uma planta infectada ou um sistema de ensaio de planta.

O termo "planta" é intencionado para incluir plantas em qualquer estágio de maturidade ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de planta) obtidos de ou derivados de qualquer tal 10 planta a não ser que seja indicado diferentemente pelo contexto. Partes de planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, flores, óvulos, estames, sementes, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos, culturas de raiz peluda, e semelhantes. A presente invenção 15 também inclui sementes produzidas pelas plantas da presente invenção. Em uma modalidade, as sementes são geração verdadeira para uma resistência aumentada à infestação por nematódeo em comparação com uma variedade de tipo selvagem da semente de planta. Como aqui usada, uma "célula de planta" inclui, mas não é limitada a, um protoplasto, célula produtora de gametas, e 20 uma célula que regenera em uma planta inteira. Cultura de tecido de vários tecidos de plantas e regeneração de plantas a partir dos mesmos são bem conhecidas na arte e estão amplamente publicadas.

Como aqui usado, o termo "transgênico" refere-se a qualquer planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta que contém 25 todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante está estavelmente integrado(a) em um cromossomo ou elemento extra-cromossômico estável, de modo que é passado para as gerações sucessivas. Para os propósitos da invenção, o termo "polinucleotídeo recombinante" refere-se a um polinucleotídeo que tem sido alterado, rearranjado, ou modificado por engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, ou polinucleotídeos, que estão ligados ou unidos em seqüências heterólogas. O termo "recombinante" não se refere às alterações de polinucleotídeos que 5 resultam de eventos naturalmente ocorrentes, tais como mutações espontâneas, ou de mutagênese não-espontânea seguida por geração seletiva.

Como aqui usado, o termo "quantidade suficiente para inibir expressão" refere-se a uma concentração ou quantidade do dsRNA que é suficiente para reduzir níveis ou estabilidade de mRNA ou proteína 10 produzido(a) a partir de um gene alvo em uma planta. Como aqui usado, "inibir expressão" refere-se à ausência ou decréscimo observável no nível de proteína e/ou produto de mRNA a partir de um gene alvo. Inibição de expressão de gene alvo pode ser letal para o nematódeo parasita quer direta quer indiretamente através de modificação ou erradicação do sítio de 15 alimentação, sincícios, ou célula gigante, ou tal inibição pode retardar ou prevenir a entrada em uma etapa desenvolvente particular (e.g., metamorfose), se acesso a um sítio de alimentação totalmente funcional, sincícios, ou célula gigante estiver associado com um estágio particular do ciclo de vida de nematódeo parasita. As conseqüências de inibição podem ser 20 confirmadas pelo exame da raiz da planta para redução ou eliminação de cistos ou outras propriedades do nematódeo ou da infestação por nematódeo (como apresentado abaixo no Exemplo 2).

A molécula de dsRNA da invenção compreende uma primeira fita que é substancialmente idêntica a pelo menos uma porção do gene alvo 25 50657480, o gene semelhante a 50657480, ou homólogo de 50657480. Preferivelmente a porção do gene é de comprimento total do gene alvo 50657480 como mostrado em SEQ ID NO:8, ou dos genes semelhantes a 50657480 e homólogos de 50657480 como mostrado em SEQ ID NOs:17, 19,

21, 23, 25, 27 ou 29. Mais preferivelmente, o dsRNA da invenção compreende uma primeira fita que é substancialmente idêntica a de cerca de

19 a cerca de 477 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: 1, 5 SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; b) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com SEQ ID NO.l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; c) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com 10 um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8 d) um polinucleotídeo sendo obtenível com iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 4, 5, 14, ou 15, e) um polinucleotídeo 15 compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou 29, f) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 40% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma 20 seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28. O dsRNA da invenção adicionalmente compreende uma segunda fita que é substancialmente idêntica à primeira fita. O dsRNA da invenção, pode ser preparado por técnicas de síntese padrão, e.g., usando um sintetizador de DNA automatizado.

Genes semelhantes a 50657480 e homólogos de 50657480

adicionais podem ser identificados com técnicas conhecidas na arte, tais como, mas não excluindo outras, hibridização, RT-PCR, PCR, e semelhantes. Por exemplo, genes semelhantes a 50657480 e homólogos de 50657480 são obteníveis com iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 4, 5, 12, 13, 14, ou 15. Homólogos de 50657480 têm pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou 29, ou têm pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28. Preferivelmente Têm pelo menos 50%, 60%, 70, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, ou têm pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10. Também são preferidos genes semelhantes a 50657480 e homólogos de 50657480 tendo pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou 29, ou têm pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificadora de um gene semelhante a 50657480 ou homólogo de 50657480 pode ser isolada de um polinucleotídeo derivado de uma planta que hibridiza sob condições estringentes com uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:l, SEQ ID 25 NO: 7 ou SEQ ID NO:8. Um tal polinucleotídeo pode ser isolado de bibliotecas de cDNA de tecido de planta. Alternativamente, mRNA pode ser isolado de células de planta (e.g., pelo procedimento de extração em tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294- 5299), e cDNA pode ser preparado usando transcriptase reversa (e.g., transcriptase reversa de Moloney MLV, disponível na Gibco/BRL, Bethesda, MD; ou transcriptase reversa de AMV, disponível na Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para amplificação por reação em cadeia da polimerase podem ser projetados 5 baseados na seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8. Moléculas de ácido nucleico correspondendo aos genes alvos de planta da invenção podem ser amplificadas usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um modelo e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com técnicas de amplificação por 10 PCR padrão. As moléculas de ácido nucleico assim amplificadas podem ser clonadas em vetores apropriados e caracterizadas por análise de seqüência de DNA. As seqüências de ácido nucleico determinadas da clonagem dos genes de feijão-soja permitem a geração de sondas e indiciadores projetados para uso em identificação e/ou clonagem de genes semelhantes a 50657480 e 15 homólogos de 50657480 em outros tipos de célula e organismos, bem como homólogos de outras espécies de planta. E.g. iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 4, 5, 12, 13, 14, ou 15 podem ser usados em identificação e/ou clonagem de genes semelhantes a 50657480 e homólogos de 50657480.

Tais iniciadores também podem ser usados para clonar

variantes de genes semelhantes a 50657480 e homólogos de 50657480. Variantes são costumeiramente variantes de seqüência tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência co, uma seqüência de nucleotídeos ou uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID 25 NO: 8, 9 ou 10. Preferivelmente tais variantes são obtidas de plantas da família Fabaceae, em particular do gênero Glycine.

Como discutido acima, fragmentos de dsRNA maiores do que cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento são clivados intracelularmente por nematódeos e plantas para siRNAs de cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento, e estes siRNAs são os mediadores reais do fenômeno de RNAi. Assim o dsRNA da presente invenção pode variar em comprimento de cerca de 19 nucleotídeos a até o comprimento total do gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480. Preferivelmente, o dsRNA da invenção tem 5 um comprimento de cerca de21 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos. Mais preferivelmente, o dsRNA da invenção tem um comprimento de cerca de21 nucleotídeos a cerca de 500 nucleotídeos, ou de cerca de21 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos.

Quando dsRNA da invenção tem um comprimento maior do 10 que cerca de 21 nucleotídeos, por exemplo de cerca de50 nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos, ele será clivado aleatoriamente para dsRNAs de cerca de 21 nucleotídeos dentro da célula da planta ou do nematódeo parasita, os siRNAs. A clivagem de um dsRNA mais longo da invenção dará uma coleção de cerca de 2 Imer dsRNAs (variando de cerca del9mers a cerca de 24mers), 15 derivados do dsRNA mais longo. Esta coleção de cerca de 2 Imer dsRNAs é também incluída dentro do escopo da presente invenção, gerada intracelularmente dentro da planta ou do nematódeo ou sinteticamente usando métodos conhecidos de síntese de oligonucleotídeo.

Os dsRNAs ou siRNAs da invenção têm seqüências 20 correspondendo a fragmentos de cerca de 19-24 nucleotídeos contíguos ao longo da seqüência inteira do gene semelhante a 50657480 ou do homólogo de 50657480. Figuras 8a-8e mostram 21-mers exemplares derivados de SEQ ID NO:8. Em uma maneira similar, 19-20, 22, 23, e 24-mers derivados de SEQ ID NO:8 são incluídos pela presente invenção.

A invenção é adicionalmente representada por modalidade

como uma coleção de moléculas de dsRNA derivadas de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480, ou homólogo de 50657480. Por exemplo, uma coleção de siRNA da invenção derivada do gene 50657480 como mostrado em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO:8 pode compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA que são selecionadas do grupo consistindo de oligonucleotídeos substancialmente idênticos aos 2Imer nucleotídeos de SEQ ID NO:8 como revelado em Figuras 8a-8e ou qualquer gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480. Uma 5 coleção de siRNA da invenção derivada do gene semelhante a 50657480 ou do homólogo de 50657480 e.g. de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO:8 também pode compreender qualquer combinação das moléculas de RNA específicas tendo qualquer uma das seqüências de 21 nucleotídeos contíguos derivadas de 21 SEQ ID NO:8 como mostradas em Figuras 8a-8e. 10 A tabela de Figuras 8a-8e também pode ser usada para calcular vários 19, 20,

22, 23 ou 24-mers ou início e término de uma porção do gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480. Quais 19, 20, 22, 23 ou 24-mers ou qual porção são / é a melhor escolha para uma planta particular pode(m) ser determinado(s) com a informação dada em Figuras 5, 6 e 7. Os 19, 20, 22, 23 15 ou 24-mers ou a porção tendo a identidade de seqüência mais alta com um gene semelhante a 50657480 particular ou um homólogo de 50657480 de uma planta particular ou mostrando um grau alto de conservação de seqüência em genes semelhantes a 50657480 ou um homólogo de 50657480s é o (a) mais preferido(a) 19, 20, 22, 23 ou 24-mer ou porção.

Um dsRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos

idêntica a uma porção do gene 50657480, gene semelhante a 50657480 ou homólogo de 50657480 é preferido para inibição. Como aqui revelado 100% de identidade de seqüência entre o RNA e o gene 50657480, gene semelhante a 50657480 ou homólogo de 50657480 é preferida, mas não exigida para 25 praticar a presente invenção. Uma pessoa experiente na arte reconhecerá que o siRNA pode ter uma má combinação com o gene alvo de pelo menos 1, 2, ou mais nucleotídeos. Ademais, estas más combinações são intencionadas para serem incluídas na presente invenção. Por exemplo, é contemplado na presente invenção que as seqüências de 2 Imer dsRNA exemplificadas em Figuras 8a-8e podem conter uma adição ou substituição de 1, 2, ou mais nucleotídeos e a seqüência resultante ainda interferir com a função do gene 50657480, gene semelhante a 50657480 ou homólogo de 50657480. Assim, a invenção tem a vantagem de ser capaz de tolerar variações de seqüência que 5 podem ser esperadas devido à síntese ou manipulação de gene, mutação genética, polimorfismo de cepa, ou divergência evolucionária.

O grau de identidade de seqüência entre o dsRNA e o gene 50657480, gene semelhante a 50657480 ou homólogo de 50657480 pode ser otimizado por algoritmos de alinhamento e comparação de seqüências 10 conhecidos na arte (veja Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, e referências lá citadas) e cálculo da diferença percentual entre as seqüências de nucleotídeos, por exemplo, pelo algoritmo de Smith-Waterman e como implementado no programa de computador BESTFIT usando parâmetros padrão (e.g., University of Wisconsin Genetic 15 Computing Group). Mais do que 80 % de identidade de seqüência, 90% de identidade de seqüência, ou até mesmo 100% de identidade de seqüência, entre o RNA inibitório e a porção do gene alvo é preferida. Alternativamente, a região duplex do RNA pode ser definida funcionalmente como uma seqüência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar com uma porção do gene 20 alvo transcrita sob condições estringentes (e.g., NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, hibridização a 60°C por 12-16 horas; seguida por lavagem a 65°C com 0,1%SDS e 0,1% SSC por cerca de 15-60 minutos). O comprimento da porção ou das seqüências de nucleotídeos de fita dupla substancialmente idênticas pode ser pelo menos cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 25 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, ou 2000 bases ou até o comprimento total do gene. Em uma modalidade preferida, o comprimento da porção é aproximadamente de cerca de 19 a cerca de 500 nucleotídeos em comprimento. Em outra modalidade a porção é de cerca de50 a cerca de 700 nucleotídeos em comprimento, em uma modalidade mais preferida a porção se de cerca de 100 a cerca de 600 nucleotídeos em comprimento, em uma modalidade ainda mais preferida a porção é de cerca de200 a 500 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade a porção consiste de cerca de 19 nucleotídeos a 25% do comprimento total do gene alvo, mais 5 preferido de 25% a 50% ainda mais preferido de 50% a 75% e muito mais preferido de 75% a 100% do comprimento total do gene alvo.

O dsRNA da invenção pode opcionalmente compreender uma saliência de fita simples em cada uma ou em ambas as extremidades. A estrutura de fita dupla pode ser formada por uma fita de RNA autocomplementar simples (i.e. formando uma alça de grampo-de-cabelo) ou duas fitas de RNA complementares. Formação de duplex de RNA pode ser iniciada quer dentro quer fora da célula. Quando o dsRNA da invenção forma uma alça de grampo-de-cabelo, ele pode opcionalmente compreender um íntron, como mostrado em US 2003/0180945A1 ou um espaçador de nucleotídeo, que é um segmento de seqüência entre as fitas de RNA complementares para estabilizar o transgene de grampo-de-cabelo em células. Métodos para preparar várias moléculas de dsRNA são mostrados, por exemplo, em WO 99/53050 e em Pat. US No. 6.506.559. O RNA pode ser introduzido em uma quantidade que permite liberação de pelo menos uma cópia por célula. Doses mais altas de material de fita dupla podem dar inibição mais eficaz.

Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor de expressão recombinante isolado compreendendo um ácido nucleico codificador de uma molécula de dsRNA como descrita acima, sendo que a expressão do vetor em uma célula hospedeira de planta resulta em resistência 25 aumentada a um nematódeo parasita em comparação com uma variedade de tipo selvagem da célula hospedeira de planta. Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico no qual tem estado ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira de planta na qual estão introduzidos. Outros vetores são integrados no genoma 5 de uma célula hospedeira de planta sob introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes nos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores são aqui chamados de "vetores de expressão". Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA 10 recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" pode ser usado intercambiavelmente porque o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada. Contudo, a invenção é intencionada para incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (e.g., vírus X da batata, vírus 15 das manchas cloróticas amarelas do tabaco, e Geminivirus), que servem com funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira de planta, o que 20 significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais seqüências regulatórias, selecionadas baseando-se nas células hospedeiras de planta a serem usadas para expressão, que está operacionalmente ligado na seqüência de ácido nucleico a ser expressada. Com respeito a um vetor de expressão recombinante, os termos "operacionalmente ligado" e "em 25 associação operativa" são intercambiáveis e são intencionados para significar que a seqüência de ácido nucleico de interesse está ligada na(s) seqüência(s) regulatória(s) em uma maneira que permite a expressão da seqüência de nucleotídeos (e.g., em uma célula hospedeira de planta quando o vetor é introduzido na célula hospedeira de planta). O termo "seqüência regulatória" é intencionado para incluir promotores, intensificadores, e outros elementos de controle de expressão (e.g., sinais de poliadenilação). Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 5 (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluindo as referências dos mesmos. Seqüências regulatórias incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas 10 que dirigem a expressão da seqüência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Será reconhecido por aquelas pessoas experientes na arte que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão de dsRNA desejado, etc. Os vetores de expressão da 15 invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras de planta para deste modo produzirem moléculas de dsRNA da invenção codificadas por ácido nucleicos como aqui descrito.

De acordo com a invenção, o vetor de expressão recombinante compreende uma seqüência regulatória, e.g. um promotor, operacionalmente 20 ligado em uma seqüência de nucleotídeos que é um modelo para uma ou ambas as fitas das moléculas de dsRNA da invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico adicionalmente compreende um promotor flanqueando qualquer extremidade da molécula de ácido nucleico, sendo que os promotores dirigem a expressão de cada fita individual de DNA, gerando 25 deste modo dois RNAs complementares que hibridizam e formam o dsRNA. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos que é transcrita em ambas as fitas do dsRNA em uma unidade de transcrição, sendo que a fita de senso é transcrita da extremidade 5' da unidade de transcrição e a fita de anti-senso é transcrita da extremidade 3', sendo que as duas fitas são separadas por cerca de 3 a cerca de 500 pares de bases, e sendo que após a transcrição, o transcrito de RNA dobra-se sobre si mesmo para formar um grampo-de-cabelo. De acordo com a invenção, a região espaçadora no transcrito de grampo-de-cabelo pode ser qualquer fragmento de DNA.

De acordo com a presente invenção, o polinucleotídeo introduzido pode ser mantido na célula de planta estavelmente se ele é incorporado em um replicon autônomo de não-cromossomo ou integrado nos cromossomos da planta. Alternativamente, o polinucleotídeo introduzido pode 10 estar presente em um vetor não-replicativo extra-cromossômico e ser transientemente expressado ou transientemente ativo. Se presente em um vetor não-replicativo extra-cromossômico ou um vetor que está integrado em um cromossomo, o polinucleotídeo preferivelmente reside em um cassete de expressão em planta. Um cassete de expressão em planta preferivelmente 15 contém seqüências regulatórias capazes de dirigir a expressão de gene em células de planta que estão operacionalmente ligadas de modo que cada seqüência possa realizar sua função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação preferidos são aqueles originários de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tal como o gene 3 20 conhecido como octopina sintase do plasmídeo-Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou seus equivalentes funcionais, mas também outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados. Como o vetor de expressão de gene de planta é muito freqüentemente não limitado aos níveis transcricionais, um cassete de expressão em planta contém outras 25 seqüências overdrive contendo seqüência líder 5'-não-traduzida do vírus do mosaico do tabaco intensificando a razão de polipeptídeo por RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Exemplos de vetores de expressão em planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D. et al., 1992, "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the Ieft border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12:8711- 8721; e "Vectors for Gene Transfer in Higher Plants"; em: Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 5 1993, S. 15-38.

Expressão de gene de planta deve estar operacionalmente ligada em um promotor apropriado que concede expressão de gene em uma maneira temporal-preferida, espacial-preferida, tipo-de-célula-preferida, e/ou tecido-preferida. Promotores úteis os cassetes de expressão da invenção 10 incluem qualquer promotor que é capaz de iniciar transcrição em uma célula de planta presente nas raízes de planta. Tais promotores incluem, mas não são limitados àqueles que podem ser obtidos de plantas, vírus de planta e bactérias que contêm genes que são expressados em plantas, tais como Agrobacterium e Rhizobium. Preferivelmente, o cassete de expressão da 15 invenção compreende um promotor específico para raiz, um promotor induzível por patógeno ou um promotor induzível por nematódeo. Mais preferivelmente o promotor induzível por nematódeo é um promotor específico de sítio de alimentação de nematódeo parasita. Um promotor específico de sítio de alimentação de nematódeo parasita pode ser específico 20 para células sinciciais ou células gigantes ou específico para ambos os tipos de células. Um promotor é induzível, se sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzido sob controle do promotor é pelo menos 30%, 40%, 50% preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% mais preferido pelo menos 100%, 200%, 300% maior em seu estado induzido, do que em seu 25 estado não-induzido. Um promotor é específico para célula, tecido ou órgão, se sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzida sob controle do promotor, for pelo menos 30%, 40%, 50% preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% mais preferido pelo menos 100%, 200%, 300% maior em um tipo de célula, tecido ou órgão particular, do que em outros tipos de célula, ou tecidos da mesma planta, preferivelmente os outros tipos de célula ou tecidos são tipos de célula ou tecidos do mesmo órgão de planta, e.g. uma raiz. No caso de promotores específicos para órgão, a atividade de promotor tem que ser comparada com a atividade de promotor em outros órgãos de planta, e.g. folhas, caules, flores ou sementes.

O promotor pode ser constitutivo, induzível, preferido para estágio desenvolvente, preferido para tipo de célula, preferido para tecido ou preferido para órgão. Promotores constitutivos são ativos sob a maioria das condições. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem os 10 promotores 19S e 35S de CaMV (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), o promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), o promotor Sep 1, o promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), o promotor de actina de Arabidopsis, o promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu 15 (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), o promotor 35S do vírus do mosaico de escrofulária, o promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), o promotor GRP1-8, o promotor de cinamil álcool desidrogenase (Patente US No. 5.683.439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, tais como promotor de manopina sintase, promotor de 20 nopalina sintase, e promotor de octopina sintase, o promotor de subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO), e semelhantes. Promotores que expressam o dsRNA em uma célula que é contatada por nematódeos parasitas são preferidos. Alternativamente, o promotor pode conduzir expressão do dsRNA em um tecido de planta remoto do sítio de 25 contato com o nematódeo, e o dsRNA pode ser então transportado pela planta para uma célula que é contatada pelo nematódeo parasita, em particular células de ou próximas pelos sítio de alimentação, e.g. células sinciciais ou células gigantes.

Promotores induzíveis são ativos sob certas condições, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou metabólito, calor, frio, luz, ataque patogênico, condições anaeróbicas, e semelhantes. Por exemplo, tem sido mostrado que os promotores TobRB7, AtRPE, AtPyklO, Gemini 19, e AtHMGI são induzidos por nematódeos (para uma revisão de promotores 5 induzíveis por nematódeos, veja Ann. Rev. Phytopathol. (2002) 40:191-219; veja também Pat. US No. 6.593.513). Método para isolar promotores adicionais, que são induzíveis por nematódeos são mostrados em Pat. US Nos. 5.589.622 e 5.824.876. Outros promotores induzíveis incluem o promotor hsp80 de Brassica3 sendo induzível por choque térmico; o promotor PPDK é 10 induzido por luz; o promotor PR-I de tabaco, Arabidopsis, e milho são induzíveis por infecção com um patógeno; e o promotor Adhl é induzido por hipoxia e estresse frio. Expressão de gene de planta também pode ser facilitada via um promotor induzível (para revisão, veja Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Promotores quimicamente 15 induzíveis são especialmente adequados se for desejada expressão de gene tempo-específica. Exemplos não-limitantes de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico (Pedido PCT No. WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2:397-404) e um promotor induzível por etanol (Pedido PCT No. WO 93/21334).

Promotores preferidos para estágio desenvolvente são

preferivelmente expressados em certos estágios de desenvolvimento. Promotores específicos de tecido e de órgão incluem aqueles que são preferencialmente expressados em certos tecidos ou órgãos, tais como, mas não limitados a folhas, raízes, sementes, ou xilema. Exemplos de promotores 25 preferidos para tecido e preferidos para órgão incluem, mas não são limitados a promotores preferidos para fruta, preferidos para óvulo, preferidos para tecido masculino, preferidos para semente, preferidos para tegumento, preferidos para tubérculo, preferidos para pedúnculo, preferidos para pericarpo, preferidos para folha, preferidos para estigma, preferidos para pólen, preferidos para antera, um preferido para pétala, preferidos para sépala, preferidos para pedicelo, preferidos para síliqua, preferidos para caule, preferidos para raiz e semelhantes. Promotores preferidos para semente são preferivelmente expressados durante desenvolvimento e/ou germinação de 5 semente. Por exemplo, promotores preferidos para semente podem ser preferidos para embrião, preferidos para endosperma e preferidos para capa de semente. Veja Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferidos para semente incluem, mas não limitados a celulose sintase (celA), Cim 1, gama-zeína, globulina-1, zeína de 19 kD de milho 10 (cZ 19B1) e semelhantes.

Outros promotores preferidos para tecido ou preferidos para órgão adequados incluem, mas não são limitados a, o promotor de gene de napina de colza (Patente US No. 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459-67), o promotor de 15 oleosina de Arabidopsis (Pedido PCT No. WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente US No. 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (Pedido PCT No. WO 91/13980), ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), bem como promotores que concedem expressão específica em semente em plantas 20 monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados para anotar são o promotor de gene Ipt2 ou Iptl de cevada (Pedido PCT No. WO 95/15389 e Pedido PCT No. WO 95/23230) ou aqueles descritos em Pedido PCT No. WO 99/16890 (promotores do gene de hordeína de cevada, gene de glutelina de arroz, gene orizina de arroz, gene prolamina 25 de arroz, gene gliadina de arroz, gene glutelina de trigo, gene de glutelina de aveia, gene casirina de sorgo, e gene de secalina de centeio).

Outros promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem, mas não são limitados a, o promotor de proteína ligante de clorofila a/b maior, promotores de histona, o promotor Ap3, o promotor de βconglicina, o promotor de napina, o promotor de leeitina de feijão-soja, o promotor de zeína de 15kD de milho, o promotor de zeína de 22kF, o promotor de zeína de 27kD, o promotor de g-zeína, os promotores ceroso, shrunken 1, shrunken 2, e bronze, o promotor Zm 13 (Patente US No.

5.086.169), os promotores de poligalaeturonase (PG) de milho (Patentes US Nos. 5.412.085 e 5.545.546), e o promotor SGB6 (Patente US No. 5.470.359), bem como promotores sintéticos e outros promotores naturais.

De acordo com a presente invenção, o cassete de expressão compreende uma seqüência de controle de expressão operacionalmente ligada em uma seqüência de nucleotídeos que é um modelo para uma ou ambas as fitas do dsRNA. O modelo dsRNA compreende (a) uma primeira fita tendo uma seqüência substancialmente idêntica a de cerca de 19 a cerca de 500, ou até o comprimento total de, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO:8; e (b) uma segunda fita tendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita. Em outras modalidades, um promotor flanqueia qualquer extremidade da seqüência de nucleotídeos modelo, sendo que os promotores conduzem a expressão de cada fita de DNA individual, gerando deste modo dois RNAs complementares que hibridizam e formam o dsRNA. Em modalidades alternativas, a seqüência de nucleotídeos é transcrita em ambas as fitas do dsRNA na mesma unidade de transcrição, sendo que a fita de senso é transcrita da extremidade 5' da unidade de transcrição e a fita de anti-senso é transcrita da extremidade 3', sendo que as duas fitas estão separadas por cerca de 3 a cerca de 500 pares de base, e sendo que após a transcrição, o transcrito de RNA dobra-se sobre si mesmo para formar um grampo-de-cabelo.

Em outra modalidade, o vetor contém um promotor bidirecional, dirigindo a expressão das duas moléculas de ácido nucleico, deste modo uma molécula de ácido nucleico codifica a seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 e a outra molécula de ácido nucleico codifica uma segunda seqüência sendo substancialmente complementar à primeira fita e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as seqüências são transcritas. Um promotor bidirecional é um promotor capaz de mediar expressão em duas 5 direções.

Em outra modalidade, o vetor contém dois promotores um mediando a transcrição da seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 e outro promotor mediando a transcrição de uma segunda seqüência sendo 10 substancialmente complementar à primeira fita e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as seqüências são transcritas. O segundo promotor pode ser um promotor diferente. Um promotor diferente significa um promotor tendo uma atividade diferente em relação à especificidade de célula ou tecido, ou mostrando expressão em indutores diferentes por exemplo, patógenos, 15 estresse abiótico ou agentes químicos. Por exemplo, um promotor pode ser constitutivo ou específico para tecido e outro pode ser específico para tecido ou induzível por patógenos. Em uma modalidade um promotor medeia a transcrição de uma molécula de ácido nucleico adequada para sobreexpressão de um gene 50657480, enquanto que outro promotor medeia 20 transcrição específica para célula ou tecido ou expressão induzível por patógeno do ácido nucleico complementar.

A invenção também é representada como modalidade em uma planta transgênica capaz de expressar o dsRNA da invenção e deste modo inibir os genes semelhantes a 50657480 ou homólogo 50657480 (gene alvo) nas raízes, no sítio de alimentação, nos sincícios e/ou na célula gigante.

A planta ou planta transgênica pode ser qualquer planta, tal como, mas não limitada a árvores, flores cortadas, plantas ornamentais, verduras/hortaliças ou plantas de colheita. A planta pode ser de um gênero selecionado do grupo consistindo de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea5 Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, 5 Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, 10 Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium, ou a planta pode ser selecionada de um gênero selecionado do grupo consistindo de Arabidopsis, Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Brachipodium, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, 15 Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, 20 Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium. Em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

Preferivelmente a planta é uma planta de colheita. Plantas de 25 colheita são todas as plantas, usadas em agricultura. Conformemente em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea, preferivelmente uma planta da família Poaceae, Musaceae, Liliaceae ou Bromeliaceae, preferivelmente da família Poaceae. Conformemente, em ainda uma outra modalidade a planta é uma planta Poaceae do gênero Zea, Triticum, Oryza, Hordeum, Secale, Avena, Saccharum, Sorghum, Pennisetum, Setaria, Panieum, Eleusine, Miscanthus, Brachypodium, Festuca ou Lolium. Quando a planta é do gênero Zea, a espécie preferida é Z. mays. Quando a planta é do gênero Triticum, a espécie preferida é T. aestivum, T. speltae ou T. durum.

5 Quando a planta é do gênero Oryza, a espécie preferida é O. sativa. Quando a planta é do gênero Hordeum, a espécie preferida é H. vulgare. Quando a planta é do gênero Secale, a espécie preferida é S. cereale. Quando a planta é do gênero Avena, a espécie preferida é A. sativa. Quando a planta é do gênero Saccarum, a espécie preferida é S. officinarum. Quando a planta é do gênero 10 Sorghum, a espécie preferida é S. vulgare, S. bicolor ou S. sudanense. Quando a planta é do gênero Pennisetum, a espécie preferida é P. glaucum. Quando a planta é do gênero Setaria, a espécie preferida é S. italica. Quando a planta é do gênero Panieum, a espécie preferida é P. miliaceum ou P. virgatum. Quando a planta é do gênero Eleusine, a espécie preferida é E. coracana. 15 Quando a planta é do gênero Miscanthus, a espécie preferida é M. sinensis. Quando a planta é uma planta do gênero Festuca, a espécie preferida é F. arundinaria, F. rubra ou F. pratensis. Quando a planta é do gênero Lolium, a espécie preferida é L. perenne ou L. multiflorum. Alternativamente, a planta pode ser Triticosecale.

Alternativamente, em uma modalidade a planta é uma planta

dicotiledônea, preferivelmente uma planta da família Fabaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Linacea, Euphorbiaceae, Convolvulaceae Rosaceae, Cucurbitaceae, Theaceae, Rubiaceae, Sterculiaceae ou Citrus. Em uma modalidade a planta é uma 25 planta da família Fabaceae, Solanaceae ou Brassicaceae. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Fabaceae, preferivelmente do gênero Glycine, Pisum, Arachis, Cicer, Vicia, Phaseolus, Lupinus, Medicago ou Lens. Espécies preferidas da família Fabaceae são M. truncatula, M, sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba, P. vulgaris, Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius ou Lens eulinaris. Mais preferidas são as espécies G. max A. hypogea e M. sativa. Mais preferida é a espécie G. max. Quando a planta é da família Solanaceae, o gênero preferido é Solanum, Lycopersicon, Nicotiana ou Capsicum. Espécies preferidas da 5 família Solanaceae são S. tuberosum, L. esculentum, N. tabaccum ou C. chinense. Mais preferido é S. tuberosum. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Brassicaceae, preferivelmente do gênero Brassica ou Raphanus. Espécies preferidas da família Brassicaceae são as espécies B. napus, B. oleracea, B. juncea ou B. rapa. Mais preferida é a 10 espécie B. napus. Quando a planta é da família Chenopodiaceae, o gênero preferido é Beta e a espécie preferida é a B. vulgaris. Quando a planta é da família Asteraceae, o gênero preferido é Helianthus e a espécie preferida é H. annuus. Quando a planta é da família Malvaceae, o gênero preferido é Gossypium ou Abelmoschus. Quando o gênero é Gossypium, a espécie 15 preferida é G. hirsutum ou G. barbadense e a espécie mais preferida é G. hirsutum. A espécie preferida do gênero Abelmoschus é a espécie A. escuientus. Quando a planta é da família Linacea, o gênero preferido é Linum e a espécie preferida é L. usitatissimum. Quando a planta é da família Euphorbiaceae, o gênero preferido é Manihot, Jatropa ou Rhizinus e as 20 espécies preferidas são M. esculenta, J. curcas ou R. comunis. Quando a planta é da família Convolvulaceae, o gênero preferido é Ipomea e a espécie preferida é I. batatas. Quando a planta é da família Rosaceae, o gênero preferido é Rosa, Malus, Pyrus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium ou Fragaria e a espécie preferida é o híbrido Fragaria x ananassa. Quando a planta é da 25 família Cucurbitaceae, o gênero preferido é Cucumis, Citrullus ou Cucurbita e a espécie preferida é Cucumis sativus, Citrullus lanatus ou Cucurbita pepo. Quando a planta é da família Theaceae, o gênero preferido é Camellia e a espécie preferida é C. sinensis. Quando a planta é da família Rubiaceae, o gênero preferido é Coffea e a espécie preferida é C. arabica ou C. canephora. Quando a planta é da família Sterculiaceae, o gênero preferido é Theobroma e a espécie preferida é T. cacao. Quando a planta é do gênero Citrus, a espécie preferida é C. sinensis, C. limon, C. reticulata, C. maxima e híbrido de espécie Citrus, ou semelhantes. Em uma modalidade preferida da invenção, a planta é 5 uma planta de feijão-soja, uma planta de batateira ou uma planta de milho.

Métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedeiras incluindo células de planta são bem conhecidos na arte de biotecnologia de planta. Qualquer método pode ser usado para transformar o vetor de expressão recombinante para dentro de células de planta para dar as 10 plantas transgênicas da invenção. Métodos gerais para transformar plantas dicotiledôneas são revelados, por exemplo, em Pat. US Nos. 4.940.838; 5.464.763, e semelhantes. Métodos para transformar plantas dicotiledôneas específicas, por exemplo, algodoeiro, são mostrados em Pat. US Nos. 5.004.863; 5.159.135; e 5.846.797. Métodos de transformação de feijão-soja 15 são mostrados em Pat. US Nos. 4.992.375; 5.416.011; 5.569.834; 5.824.877; 6.384.301 e em EP 0301749B1 podem ser usados.

Métodos de transformação podem incluir métodos diretos e indiretos de transformação. Métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por poli(etileno-glicol), transformação mediada por lipossomo 20 (US 4.536.475), métodos biolísticos usando pistola de gene (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), eletroporação, incubação de embriões secos em solução compreendendo DNA, e microinjeção. No caso destes métodos diretos de transformação, os plasmídeos usados não necessitam atender às exigências 25 particulares. Plasmídeos simples, tais como aqueles da série pUC, pBR322, da série M13mp, pACYC184 e semelhantes podem ser usados. Se plantas intactas são para serem regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável é preferivelmente localizado no plasmídeo. As técnicas de transformação diretas são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Transformação também pode ser realizada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo EP O 116 718), infecção viral por intermédio de vetores virais (EP 0.067.553; US 4.407.956; WO 5 95/34668; WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0.270.356; WO 85/01856; US 4.684.611). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na arte. A cepa de Agrobacterium (e.g., Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo 10 (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula de planta. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeoRi ou -Ti ou está separadamente compreendido em um denominado vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são 15 descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229. A transformação mediada por Agrobacterium é melhor adequada para plantas dicotiledôneas mas também tem sido adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita em, por exemplo, White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, 20 Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225.

Transformação pode resultar em expressão e transformação

estável ou transiente. Embora uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção possa ser inserida em qualquer planta e célula de planta caindo dentro destas classes amplas, é particularmente útil em células de planta de colheita. As plantas transgênicas da invenção podem ser cruzadas com plantas transgênicas similares ou com plantas transgênicas faltantes dos ácido nucleicos da invenção ou com plantas não-transgênicas, usando métodos conhecidos de geração de planta, para preparar sementes. Ademais, a planta 5 transgênica da presente invenção pode compreender, e/ou ser cruzada com outra planta transgênica que compreende um ou mais ácido nucleicos, criando assim uma "pilha" de transgenes na planta e/ou sua progênie. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica fértil cruzada compreendendo o ácido nucleico da invenção. A planta transgênica fértil 10 cruzada pode ter o cassete de expressão particular herdado através de uma planta parental fêmea ou através de uma planta parental macho. A segunda planta pode ser uma planta congênita. A planta transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também estão incluídas dentro da presente invenção sementes de qualquer uma destas plantas transgênicas férteis cruzadas. As 15 sementes desta invenção podem ser colhidas das plantas transgênicas férteis e usadas para crescer gerações de progênie de plantas transformadas desta invenção incluindo linhagens de planta híbridas compreendendo o construto de DNA.

"Empilhamento de gene" também pode ser realizado por 20 transferência de dois ou mais genes para dentro do núcleo de célula por transformação de planta. Genes múltiplos podem ser introduzidos no núcleo de célula durante transformação quer seqüencialmente quer simultaneamente. Genes múltiplos em plantas ou espécies de patógeno alvo podem ser infraregulados por mecanismos de silenciamento de gene, especialmente RNAi, 25 pelo uso de um único transgene selecionando múltiplas seqüências parciais ligadas de interesse. Múltiplos genes, empilhados, sob o controle de promotores individuais também podem ser sobre-expressados para alcançar um fenótipo único ou múltiplo desejado. Construtos contendo pilhas de gene de ambos os genes sobre-expressados e os alvos silenciados também podem ser introduzidos em plantas dando fenótipos único ou múltiplos agronomicamente importantes. Em certas modalidades as seqüências de ácido nucleico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeo de interesse para criar fenótipos 5 desejados. As combinações podem produzir plantas com uma variedade de combinações de feições incluindo mas não limitadas a resistência à doença, tolerância a herbicida, intensificação de rendimento, tolerância ao frio e à estiagem. Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo mas não limitado a geração cruzada de plantas por métodos 10 convencionais ou por transformação genética. Se as feições são empilhadas por transformação genética, as seqüências de polinucleotídeo de interesse podem ser seqüencial ou simultaneamente combinadas em qualquer ordem. Por exemplo se dois genes são para serem introduzidos, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados ou no mesmo 15 cassete de transformação. A expressão das seqüências pode ser conduzida por promotores iguais ou diferentes.

De acordo com esta modalidade, a planta transgênica da invenção é produzida por um método compreendendo as etapas de fornecer uma preparação de um cassete de expressão tendo uma primeira região que é 20 substancialmente idêntica a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480, e uma segunda região que é complementar à primeira região, transformar o cassete de expressão em uma planta, e selecionar a progênie da planta transformada que expressa o construto de dsRNA da invenção.

A presente invenção pode ser usada para reduzir a destruição

de plantação por qualquer nematódeo parasita de planta. Preferivelmente, os nematódeos parasitas pertencem às famílias de nematódeos induzindo células gigantes ou sinciciais. Nematódeos induzindo células gigantes ou sinciciais são encontrados nas famílias Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae ou Tylenehulidae. Em particular nas famílias Heterodidae e Meloidogynidae.

Conformemente, nematódeos parasitas selecionados pela presente invenção pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de 5 Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera, Longidorus ou Meloidogyne. Em uma modalidade preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera ou Meloidogyne. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasias 10 pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Globodera, Heterodera, ou Meloidogyne. Em uma modalidade ainda mais preferida os nematódeos parasias pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Globodera ou Heterodera. Em outra modalidade os nematódeos parasitas pertencem ao gênero Meloidogyne.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Globodera, as

espécies são preferivelmente do grupo consistindo de G. achilleae, G. artemisiae, G. hypolysi, G. mexicana, G. millefolii, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis, G. tabacum, e G. virginiae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Globodera incluem pelo menos uma das espécies G. 20 pallida, G. tabacum, ou G. rostochiensis. Quando os nematódeos parasitas são do gênero Heterodera, as espécies podem ser preferivelmente do grupo consistindo de H. avenae, H. carotae, H. ciceri, H. cruciferae, H. delvii, H. elachista, H. filipjevi, H. gambiensis, H. glycines, H. goettingiana, H. graduni,

H. humuli, H. hordecalis, H. latipons, H. major, H. medicaginis, H. oryzicola, 25 H. pakistanensis, H. rosii, H. sacchari, H. schachtii, H. sorghi, H. trifolii, H. urticae, H. vigni e H. zeae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Heterodera incliem pelo menos uma das espécies H. glycines, H. avenae, H. cajani, H. gottingiana, H. trifolii, H. zeae ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos uma das espécies H. glycines ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida o nematódeo parasita é a espécie H. glycines.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Meloidogyne, os nematódeos parasitas podem ser selecionados do grupo consistindo de M.

acronea, M. arabica, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. chitwoodi, M. cofeicola, M. esigua, M. graminicola, M. hapla, M. incógnita, M. indica, M. inomata, M. javanica, M. lini, M. mali, M. microcephala, M. microtyla, M. naasi, M. salasi e M. thamesi. Em uma modalidade preferida os nematódes parasitas incluem pelo menos uma das 10 espécies M. javanica, M. incógnita, M. hapla, M. arenaria ou M. chitwoodi.

A presente invenção também fornece um método para inibir a expressão de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480, ou um homólogo de 50657480. De acordo com esta modalidade, o método compreende a etapa de administrar à planta um dsRNA da invenção.

Os seguintes exemplos não são intencionados para limitar o

escopo das reivindicações da invenção, mas são em vez disso intencionados para serem exemplares de certas modalidades. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que estão dentro do nível ordinário de perícia na arte são intencionadas para caírem dentro do escopo da presente invenção.

EXEMPLO 1: CLONAGEM DE 50657480 DE FEIJÃO-SOJA Excisão de sincícios a laser

Glycine max cv. Williams 82 foi germinada sobre placas de ágar por três dias e então transferida para bolsas de germinação. Um dia mais tarde, cada planta jovem foi inoculada com nematódeos juvenis de segundo 25 estágio (J2) de H. glycines race 3. Seis dias após a inoculação, tecido de raiz novo foi fatiado em pedaços de 1 cm de comprimento, fixado, embebido em um criomolde, e seccionado usando métodos conhecidos. Células de sincícios foram identificadas por sua morfologia singular de tamanho de célula aumentado, parede celular espessada, e citoplasma denso e dissecadas em tampão de extração de RNA usando um microscópio PALM (P.A.L.M. Microlaser Technologies GmbH, Bemried, Alemanha). RNA celular total foi extraído, amplificado, e fluorescentemente marcado usando métodos conhecidos. Como controles, RNA total foi isolado de ambos "não-sincícios" 5 e raízes de controle não tratadas submetido ao mesmo processo de amplificação de RNA. O RNA amplificado foi hibridizado para arranjos de cDNA de feijão-soja patenteados.

Como demonstrado em Tabela 2, clone 50657480 de cDNA de feijão-soja foi identificado como estando supra-regulado em sincícios de 10 raízes de feijão-soja infectadas com SCN. A seqüência de aminoácidos de clone 50657480 de cDNA de feijão-soja (SEQ ID NO: 1) é descrita como SEQ ID NO: 3. Seqüência de cDNA 50657480 (SEQ ID NO:l) determinada foi de comprimento não-total porque não havia códon de iniciação ATG.

Tabela 2

Nome do Gene Sincícios #1(N) Sincícios #2 (N) Não-Sincícios Raízes de Controle 50657480* 299±47 (4) 369±157 (5) não detectados não detectados EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE RAIZ PELUDA DE FEIJÃO-SOJA TRANSGÊNICO E BIOMASSA DE NEMATÓDEOS

Este método exemplificado emprega vetores binários contendo fragmentos do gene alvo 50657480. O vetor consiste de um fragmento de anti-senso do gene alvo 50657480, um espaçador, um fragmento de senso do 20 gene alvo e uma estrutura principal de vetor. A seqüência do clone 50657480 de cDNA é descrita como SEQ ID NO:l. O fragmento de gene alvo descrito por SEQ ID NO:2 correspondendo aos nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO:l foi usado para construir o vetor binário RAW464. Em RAW464 o dsRNA para o gene alvo 50657480 foi expressado sob um promotor p-At5g05340 25 preferido para sincícios ou raiz (Pedido Provisório US No: 60/899.693 SEQ ID NO: 6), um promotor de gene de peroxidase. Este promotor condiz a expressão de transgene preferencialmente em raízes e/ou sincícios ou células gigantes. O marcador selecionável de planta nos vetores binários é uma forma resistente a herbicida do gene de aceto-hidróxi-ácido sintase (AHAS) de Arabidopsis thaliana conduzido pelo promotor Arabidopsis AHAS nativo (Sathasivan et al., Plant Phys. 97:1044-50, 1991). ARSENAL (imazapyr, BASF Corp, Florham Park, NJ) foi usado como o agente de seleção.

O vetor binário RAW464 foi transformado em cepa K599 de Agrobacterium rhizogenes por eletroporação e raízes peludas transgênicas foram geradas usando métodos conhecidos. Várias linhagens de raízes peludas transgênicas independentes foram geradas da transformação. Raízes 10 peludas não-transgênicas de feijão-soja cultivar Williams 82 (suscetível a SCN) e Jack (resistente a SCN) também foram geradas pelo uso de A. rhizogenes não-transformada, para servir como controles para crescimento de nematódeo neste ensaio. Culturas de raiz peluda de cada linhagem foram inoculadas com nematódeos juvenis de segundo estágio (J2) SCN race 3. 15 Quatro semanas após inoculação com nematódeo, o número de cistos em cada cavidade foi contado. Para linhagens de raízes transgênicas RAW464 houve múltiplas linhagens demonstrando contagens médias de cistos de cerca de 6-7 e 11-18 em comparação com uma contagem média de cistos de 24 e 26 para a linhagem suscetível Williams 82 (W82) e I e 1 para a linhagem resistente 20 conhecida, Jack, respectivamente. Estes resultados de bioensaio indicam que o RNA de fita dupla expressado em RAW464 resulta em contagem de cistos reduzida.

EXEMPLO 3 RACE PARA DETERMINAR SEQÜÊNCIA TRANSCRITA TOTAL PARA 50657480 (SEP ID NO: D Amplificação de seqüência de transcrito de comprimento total

correspondendo à seqüência de cDNA descrita por 50657480 (SEQ ID NO:l) foi realizada usando o GeneRacer Kit (LI502-01) de Invitrogen seguindo as instruções do fabricante. Os iniciadores usados para a reação PCR primária são descritos por SEQ ID NOs 12 e 14. Os iniciadores de reação PCR aninhada secundária são descritos por SEQ ID NOs 13 e 15.

Como mostrado em Figura 2, SEQ ID NO:7 é o fragmento 5' de 50657480. Baseado no alinhamento de SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:l mostrado em Figura 2, uma seqüência de contig de comprimento total 5 putativa foi isolada e é descrita por SEQ ID NO:8. Há uma matriz de leitura aberta em seqüência de contig SEQ ID NO:8 que abarca das bases 124 até 1440 como mostrado em Figura 3. A seqüência de matriz de leitura aberta é descrita por SEQ ID NO:9. A seqüência de aminoácidos da matriz de leitura aberta descrita por SEQ ID NO:9 é mostrada como SEQ ID NO: 10.

EXEMPLO 4 DESCRIÇÃO DE HOMÓLOGOS ÍNUCLEOTÍDEO E AA)

Como revelado em Exemplo 3, a seqüência de transcrito de comprimento total putativa do gene correspondendo a SEQ ID NO:l contém uma matriz de leitura aberta com a seqüência de aminoácidos revelada como SEQ ID NO: 10. A identificação de homólogos de gene à seqüência de 15 aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 10 identifica seqüências adicionais. Uma amostra de genes com seqüências de aminoácidos e de DNA homólogas às SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO:9, respectivamente, foi identificada e é descrita por SEQ ID NOs 16 a 29 e mostrada em Figura 4. O alinhamento de aminoácidos dos homólogos truncados identificados com SEQ ID NO: 10 é 20 mostrado em Figura 5. Uma tabela de matriz mostrando a identidade percentual de aminoácido entre os homólogos identificados e SEQ ID NO: 10 é mostrada em Figura 6. Uma tabela de matriz mostrando a identidade percentual de DNA entre os homólogos identificados e SEQ ID NO:9 é mostrada em Figura 7.

Aquelas pessoas experientes na arte reconhecerão, ou serão

capazes de averiguar usando experimentação não mais do que rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes são intencionados para serem incluídos pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Molécula de dsRNA, caracterizada pelo fato de compreender a) uma primeira fita compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 e b) uma segunda fita compreendendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita.

2. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a porção do gene 50657480, gene semelhante a50657480 ou um homólogo de 50657480 é uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; b) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com SEQ ID NO.l, nucleotídeos7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; c) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8, d) um polinucleotídeo sendo obtenível com iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQID NO: 4, 5, 14, ou 15, e) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21,23, 25, 27 ou 29. f) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 40% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

3. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a porção do gene alvo é de cerca de 19 a 500 nucleotídeos.

4. Coleção de moléculas de dsRNA, caracterizada pelo fato de compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de19 a24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo sendo substancialmente idêntico a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480.

5. Coleção de moléculas de dsRNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: l,SEQIDNO:7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; b) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com SEQ ID NO. 1, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; c) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8 d) um polinucleotídeo sendo obtenível com iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 4, 5, 14, ou 15, e) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21,23, 25, 27 ou 29. f) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 40% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

6. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser capaz de expressar um dsRNA que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480.

7. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o gene 50657480, gene semelhante a 50657480 ou homólogo de 50657480 compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; b) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com SEQ ID NO.l, nucleotídeos7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; c) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8, d) um polinucleotídeo sendo obtenível com iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 4, 5, 14, ou 15, e) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21,23, 25, 27 ou 29. f) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 40% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

8. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA, em que cada uma das moléculas da coleção de moléculas de RNA compreende uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19-24 nucleotídeos, sendo que as moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo substancialmente idêntico a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480.

9. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQID NO:7orSEQ ID NO:8; b) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com SEQ ID NO. 1, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; c) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ IDNO:7 ou SEQID NO:8 d) um polinucleotídeo sendo obtenível com iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 4, 5, 14, ou 15, e) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21,23, 25, 27 ou 29. f) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 40% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

10. Método para preparar uma planta transgênica capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 em uma planta, dito método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) preparar uma seqüência de ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 uma vez expressado na planta; b) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a progênie para expressão de dito transcrito.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene alvo compreende uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; b) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com SEQ ID NO.l, nucleotídeos7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQ ID NO:7 ou SEQ ID NO:8; c) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, nucleotídeos 7 a 483 de SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 1 a 1096 de SEQID NO:7 ou SEQ ID NO:8 d) um polinucleotídeo sendo obtenível com iniciadores tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 4, 5, 14, ou 15, e) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de nucleotídeos como mostrada em SEQ ID NO: 9, 17, 19, 21,23, 25, 27 ou 29. f) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência tendo pelo menos 40% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo codificador de uma seqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO: 10, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a porção do gene 50657480, gene semelhante a 50657480 ou homólogo de 50657480 é de cerca de 19 a cerca de 500 nucleotídeos.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de: feijão-soja, batateira, tomateiro, amendoim, algodoeiro, mandioca, cafeeiro, coqueiro, ananás, árvores cítricas, bananeira, milho, colza, beterraba, girassol, sorgo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, feijão verde, feijão lima, ervilha, e tabaco.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de feijão-soja.

15. Método para conceder resistência a nematódeo a uma planta, dito método caracterizado pelo fato de que as etapas de: a) preparar uma seqüência de ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de 50657480 uma vez expressado na planta; b) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a progênie para resistência a nematódeo.

16. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene 50657480, um gene semelhante a 50657480 ou um homólogo de50657480.

17. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender uma segunda seqüência substancialmente complementar à primeira fita, capaz de formar um dsRNA, quando ambas as seqüências são transcritas.

18. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de compreender um promotor preferível para raiz.