MX2010011716A

MX2010011716A - Composiciones y metodos para utilizar rna de interferencia para el control de nematodos.

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Publication number: MX2010011716A
Application number: MX2010011716A
Authority: MX
Inventors: Shawn Motyka; Ren Peifeng; Talton Lawrence Winfield; John Mc Millan; Bonnie Mc Caig
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2009-04-29
Publication date: 2011-04-04

Abstract

La presente invención proporciona composiciones de RNA bicatenario y plantas transgénicas que pueden inhibir la expresión de genes esenciales en nemátodos parásitos, y los métodos asociados con estas. Específicamente, la invención se refiere al uso de RNA de interferencia para inhibir la expresión de un gen esencial diana de nemátodos, el cual es un gen tipo innexin, pas-1, tcp-1, tipo snurportin-1, pol delta S, prs-4, rtp-1 o rpn-5 de nemátodos, y se refiere a la producción de plantas que tienen resistencia aumentada a nemátodos parásitos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA UTILIZAR RNA DE INTERFERENCIA PARA EL CONTROL DE NEMATODOS El campo de esta invención es el control de nemátodos, en particular el control de nemátodos del quiste de la soya. La invención también se refiere a la introducción de material genético en plantas que sean susceptibles a nemátodos para aumentar la resistencia a los nemátodos.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Los nemátodos son gusanos redondos microscópicos que se alimentan de las raices, hojas y tallos de más de 2,000 cultivos en surco, vegetales, frutos y plantas ornamentales, ocasionando una pérdida estimada de 100,000,000 millones de dólares de cultivos en todo el mundo. Una variedad de especies de nemátodos parásitos infectan las plantas de cultivo, incluidos los nemátodos del nudo de raíz (RKN) , nemátodos formadores de quiste y lesión. Los nemátodos del nudo de raíz, los cuales se caracterizan por provocar formación de agallas de la raíz en los sitios de alimentación, tienen una gama de huéspedes relativamente amplia y por tanto son patógenos en una gran cantidad de especies de cultivo. Las especies de nemátodos formadoras de quistes y lesiones tienen una ama de huéspedes más limitada, pero todavía provocan érdidas considerables en cultivos susceptibles.

Los nemátodos patógenos están presentes a todo lo largo de Estados Unidos, y las concentraciones más grandes se presentan en las zonas cálidas, húmedas del sur y oeste y en. suelos arenosos. El nemátodo del quiste de la soya (Heterodera glycines) , la plaga más seria de las plantas de soya, fue descubierta en Estados Unidos en Carolina del norte en 1954. Algunas áreas están tan densamente infestadas por nemátodos del quiste de la soya (SCN) de modo que la producción de soya ya no es posible desde el punto de vista económico sin medidas de control. Aunque la soya es el principal cultivo económico atacado por SCN, los SCN parasitan unos cincuenta huéspedes en total, en los que se incluyen los cultivos de campo, vegetales, plantas ornamentales y maleza.

Los signos de daño por nemátodos pueden ser achaparramiento y amarillamiento de las hojas, y el marchitamiento de las plantas durante el tiempo de calor. Sin embargo, la infestación por nemátodos puede ocasionar pérdidas significativas en el rendimiento sin síntomas de enfermedad superficial aparente. Las causas principales de reducción del rendimiento se deben al daño de las raices subterráneas. Las raices infectadas por SCN son enanas o achaparradas. La infestación por nemátodos también puede disminuir la cantidad de nodulos fijadores de nitrógeno sobre las raices, y pueden hacer las raices más susceptibles a ataques por otros patógenos de plantas que habiten en el suelo.

El ciclo de vida de los nemátodos tiene tres etapas importantes: huevo, juvenil y adulto. El ciclo de vida varia entre las especies de nemátodos. Por ejemplo, el ciclo de vida de los SCN normalmente puede ser completado en 24 a 30 días en condiciones óptimas, mientras que otras especies pueden tardar tanto tiempo como un año o más, para completar el ciclo de vida. Cuando los niveles de temperatura y humedad se vuelven favorables en la primavera, los nemátodos en la etapa juvenil en forma de gusano salen de los huevos de la tierra. Solo los nemátodos en la etapa de desarrollo juvenil son capaces de infectar las raices de la soya.

El ciclo de vida de los SCN ha sido el objeto de múltiples estudios, y como tales son un ejemplo útil para comprender el ciclo de vida de los nemátodos. Después de penetrar las raices de la soya, los SCN juveniles se mueven a través de la raíz hasta que hacen contacto con el tejido vascular, en cuyo momento estos dejan de migrar y comienzan a alimentarse. Con un estilete, el nemátodo inyecta las secreciones que modifican ciertas células de la raíz y las transforman en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz se transforman morfológicamente en sincitios multinucleados grandes (o células gigantes en el caso del RKN) , los cuales son utilizados como una fuente de nutrientes para los nemátodos . Los nemátodos que se alimentan activamente de este modo roban nutrientes esenciales de la planta ocasionando pérdida en el rendimiento. A medida que los nemátodos hembra se alimentan, estos se hinchan y finalmente se hacen tan grandes que sus cuerpos se rompen a través del tejido de la raíz y son expuestos sobre la superficie de la raíz.

Después de un periodo de alimentación, los nemátodos SCN machos, los cuales no están hinchados como los adultos, salen de la raíz hacia el suelo y fertilizan a las hembras adultas agrandadas. Los machos entonces mueren, mientras que las hembras permanecen unidas al sistema de la raíz y continúan alimentándose. Los huevos en las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, primero en una masa o saco vitelino fuera del cuerpo, y posteriormente dentro de la cavidad corporal del nematodo. Finalmente toda la cavidad corporal de las hembras adultas está llena de huevos, y el nemátodo muere. Es el cuerpo lleno de huevos de la hembra muerta a la que se hace referencia como el quiste. El quiste finalmente se desprende y se encuentra libre en el suelo. Las paredes del quiste se vuelven muy resistentes, proporcionando excelente protección para los aproximadamente 200 a 400 huevos contenidos. Los huevos de los SCN sobreviven dentro del quiste hasta que se presentan las condiciones apropiadas para salir del huevo. Aunque muchos de los huevos pueden romperse dentro del primer año, muchos también sobrevivirán dentro de los quistes protectores durante varios años.

Un nemátodo puede moverse a través del suelo solo algunas pulgadas por año por si mismos. Sin embargo, la infestación por nemátodos puede propagarse a distancias considerables en diversas formas. Cualquier cosa que pueda mover el suelo infestado es capaz de propagar la infestación, como puede ser la maquinaria agrícola, vehículos y herramientas, el viento, agua, los animales y los agricultores. Las partículas del suelo del tamaño de las semillas muchas veces contaminan las semillas cosechadas. En consecuencia, la infestación por nemátodos puede propagarse cuando la semilla contaminada de los campos infestados se planta en campos no infestados. Incluso hay evidencia que algunas especies de nemátodos pueden ser propagadas por las aves. Solo algunas de estas causas pueden ser evitadas.

La práctica tradicional para manejar la infestación por nemátodos incluye: el mantenimiento apropiado de los nutrientes del suelo y los niveles de pH del suelo en la tierra infestada por nemátodos; el control de otras enfermedades de las plantas asi como las plagas de insectos y maleza; el uso de prácticas de higienización como puede ser el arado, plantación y cultivo de campos infestados por nemátodos solo después de trabajar campos no infestados; la limpieza del equipo perfectamente con agua a alta presión o vapor después de trabajar en campos infestados; no utilizar semillas que hayan crecido en suelos infestados para plantar campos no infestados a menos que la semilla haya sido limpiada adecuadamente; hacer la rotación de los campos infestados y alternar cultivos huéspedes con cultivos no huéspedes; el uso de nematicidas; y la plantación de variedades de plantas resistentes .

Se han propuesto métodos para la transformación genética de plantas con el fin de conferir aumentada resistencia a los nemátodos parásitos de las plantas. Las Patentes U.S. Nos. 5,589,622 y 5,824,876 se dirigen a la identificación de genes de plantas que se expresan específicamente en o junto al sitio de alimentación de la planta después de que se ha adherido el nemátodo. Los promotores de estos genes diana de las plantas pueden entonces utilizarse para dirigir la expresión especifica de proteínas o enzimas perjudiciales, o la expresión de RNA antisentido para el gen diana o para genes celulares generales. Los promotores de las plantas también pueden utilizarse para conferir resistencia a los nemátodos específicamente -en el lugar de alimentación transformando la planta con un constructo que contenga el promotor del gen diana de la planta ligado a un gen cuyo producto induzca letalidad en el nemátodo después de que lo ingiera .

En fechas recientes, el RNA de interferencia (RNAi), también conocido como silenciador de genes, ha sido propuesto como un método para regular los nemátodos. Cuando el RNA bicatenario (dsRNA) que corresponde principalmente a la secuencia de un gen diana o mRNA es introducido en una célula, se inhibe la expresión del gen diana (véase, p. ej . , la Patente U.S. No. 6,506,559). La Patente U.S. No. 6,506,559 demuestra la eficacia del RNAi contra genes conocidos de Caenorhabdítis elegans, pero no demuestra la utilidad del RNAi para regular los nemátodos parásitos de las plantas.

Se han propuesto diversos modelos para la acción de los RNAi. En sistemas de mamífero, los dsRNA más grandes de 30 nucleótidos disparan la inducción de la síntesis del interferón y un paro global de las síntesis de proteínas, en una forma no específica de la secuencia. Sin embargo, la Patente U.S. No. 6,506,559 describe que en los nemátodos, la longitud del dsRNA correspondiente a la secuencia del gen diana puede ser de al menos 25, 50, 100, 200, 300 o 400 bases, y que incluso dsRNA más grandes también fueron eficaces para inducir RNAi en C. elegans. Se sabe que cuando los constructos de RNA de horquilla que contienen regiones bicatenarias que abarcan desde 98 hasta 854 nucleótidos fueron transformados en un número de especies de plantas, los genes diana de las plantas fueron silenciados eficientemente. Existe un convenio general que en muchos organismos, incluidos los nemátodos y las plantas, piezas grandes de dsRNA se desdoblan en fragmentos de 19-24 nucleótido (los siRNA) dentro de las células, y que estos siRNA son los mediadores reales del fenómeno RNAi.

En las plantas, el dsRNA largo es procesado en dúplex de siRNA de 21 nucleótidos mediante una RNAsa III denominada como "Dicer". El dúplex de siRNA de 21 nucleótidos en las plantas puede contener una porción bicatenaria de 19 nucleótidos y una porción de 2 nucleótidos en la posición del extremo 3' no apareados de cada hebra de RNA. Se ha demostrado que las porciones de 2 nucleótidos no apareados no contribuyen al silenciamiento de genes específicos de la secuencia, y que la porción bicatenaria de 19 nucleótidos realmente interviene en el silenciamiento génico especifico de la secuencia. (Elbashir (2001) Na ture 411 : 494-4 8 ) .

El uso de RNAi para los genes esenciales diana de nematodo ha sido propuesto, por ejemplo, en la Publicación del PCT O 01/96584, WO 01/17654, US 2004/0098761, US 2005/0091713, US 2005/0188438, US 2006/0037101, US 2006/0080749, US 2007/0199100, y US 2007/0250947. Aunque se han hecho numerosos esfuerzos para utilizar el RNAi para regular los nemátodos parásitos de las plantas, a la fecha ninguna planta transgénica resistente a nemátodos ha sido desregulada en algún país. Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad de identificar composiciones seguras y eficaces y métodos para regular los nemátodos parásitos de plantas utilizando RNAi, y para la producción de plantas que tengan resistencia aumentada a los nemátodos parásitos de las plantas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los ácidos nucleicos, plantas transgénicas y los métodos para solucionar o aliviar infestaciones de nemátodos de cultivos agrícolas valiosos como los de soya. Los ácidos nucleicos de la invención son capaces de disminuir la expresión de genes diana de nemátodos parásitos a través del RNAi. De acuerdo con la invención, el gen diana de nemátodos parásitos se selecciona de un grupo que consiste en un gen tipo innexin (innexin-like) de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen pas-1 de C. elegans, un gen snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad 4 reguladora de proteasoma de 26S (prs-4), y un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpn-5 de C. elegans.

Los ácidos nucleicos de la invención codifican RNA bicatenario que contiene (a) una primera hebra que tiene una secuencia prácticamente idéntica a desde 19 hasta aproximadamente 400 o 500 nucleótidos consecutivos de un gen diana que tiene una secuencia seleccionada del grupo de ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 5, ID SEC NO: 11; ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 104, ID SEC NO: 39 e ID SEC NO: 57; y (b) una segunda hebra que tiene una secuencia prácticamente complementaria a la primera hebra.

La invención además está incorporada como un pool de moléculas de RNA bicatenario que contiene una multiplicidad de moléculas de RNA interferente cortas cada una contiene una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde las moléculas de RNA se obtienen de un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 1; (b) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 5; (c) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 11; (d) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 19; (e) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 23; (f) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 104; (g) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 39; (h) un polinucleótido que contiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 57.

En otra modalidad, la invención propone una planta transgénica resistente a infección por némátodos parásitos, la planta contiene un constructo de ácido nucleico que codifica un dsRNA o siRNA con capacidad para disminuir específicamente un gen diana de nemátodo parásito seleccionado del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad 4 reguladora de proteasoma de 26S (prs-4), y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans.

En otra modalidad, la invención proporciona una planta transgénica con capacidad para expresar un pool de moléculas de dsRNA, en donde cada molécula de dsRNA contiene una región bicatenaria que tiene una longitud de 19-24 nucleótidos, y en donde las molécula de RNA se obtienen de polinucleótidos considerablemente idénticos a una porción de un gen diana de nemátodo parásito seleccionado del grupo que consiste en el gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad 4 reguladora de proteasoma de 26S (prs-4) y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans.

La invención además comprende un método para elaborar una planta transgénica con capacidad para expresar dsRNA o siRNA que sea considerablemente idéntica a una porción de un gen diana de un nemátodo parásito, el método comprende los pasos de: (a) seleccionar un gen diana del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tc'p-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad 4 reguladora de proteasoma de 26S (prs-4) y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans; (b) preparar una secuencia de ácido nucleico que contenga una región que sea considerablemente idéntica a una porción del gen diana seleccionado, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcrito bicatenario una vez expresado en la planta; (c) transformar una planta recipiendaria con el ácido nucleico; (d) producir uno o más retoños transgénicos de la planta recipiendaria; y (e) seleccionar los retoños para determinar si son resistentes a los nemátodos.

La invención además propone un método para conferir resistencia a los nemátodos a una planta, el método comprende los pasos de: (a) seleccionar un gen diana del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifique una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad 4 reguladora de proteasoma de 26S (prs-4) y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans; (b) preparar una secuencia de ácido nucleico que contenga una región que sea considerablemente idéntica a una porción del gen diana seleccionado, en donde el ácido nucleico pueda formar un RNA Joicatenario una vez expresado en la planta; (c) transformar una planta recipiendaria con el ácido nucleico; (d) producir uno o más retoños transgénicos de la planta recipiendaria; y (e) seleccionar los retoños para determinar su resistencia a los nemátodos.

La invención además proporciona un cásete de expresión y un vector de expresión que contiene una secuencia considerablemente idéntica a una porción de un gen diana de nemátodo parásito de las plantas seleccionado de un grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifique una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S), un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad 4 reguladora de proteasoma de 26S (prs-4) y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras la-lc muestran la tabla de las ID SEC NO asignada a las secuencias de nucleótidos y aminoácido correspondientes de H. glycines y otras especies de nemátodos. Las ID SEC NOS: 1, 5, 11, 19, 23, 104, 39 y 57 corresponden a las secuencias de nucleótidos de H. glycines de longitud completa para los genes tipo innexin (inx, ID SEC NO: 1), pas-1 (ID SEC NO: 5), de la T-complex protein 1 (tcp-1, ID SEC NO: 11), de snurportinl (ID SEC NO: 19), de la subunidad pequeña de polimerasa delta (Pol DeltaS, ID SEC NO: 23), de la subunidad 4 reguladora de proteasoma (prs-4, ID SEC NO: 104), partícula reguladora de proteasoma, tipo ATPase {rpt-1, ID SEC NO: 39) y de la subunidad 5 reguladora de proteasoma no-ATPase (rpn-5, ID SEC NO: 57) . Los fragmentos de nucleótido sentido sintetizados en constructos de expresión tipo horquilla, como está descrito en el Ejemplo 2, están indicados por la ID SEC NO: 3 (tipo innexin) , ID SEC NO: (pas-1), ID SEC NO: 13 (tcp-1) , ID SEC NO: 21 (snurportinl) , ID SEC NO: 25 (Pol DeltaS), ID SEC NO: 29 (subunidad 4 reguladora de proteasoma, prs-4) , ID SEC NO: 41 (rpt-1) e ID SEC NO: 59 (rpn-5) . Las secuencias promotoras inducidas por sincitios se dan en la ID SEC NO: 69 (el promotor tipo TPP de Arabidopsis thaliana) , la ID SEC NO: 70 (el promotor tipo MtN3 de Glycine max) y la ID SEC NO: 71 (promotor del locus At5gl2170 de A. thaliana) . Los motivos de los nucleótidos conservados están enlistados para pas-1 (ID SEC NOS: 72-78), rpn-5 (ID SEC NOS: 79-85), tcp-I (ID SEC NOS: 86-91), prs-4 (ID SEC NOS: 92, 93, 106 y 107), y rpt-1 (ID SEC NOS: 94-103).

La Figura 2 muestra la alineación de los aminoácidos de las secuencias de tipo pas-1: pas-1 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 6); el fragmento pas-1 de H. glycines (ID SEC NO: 8) dirigido por el vector binario RTP 1095; y una etiqueta de la secuencia expresada de longitud parcial (EST) de Globodera rostochiensis del número de acceso Genbank BM355389 (ID SEC NO: 10) utilizando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalización de abertura de hueco = 10, penalización de extensión de hueco = 0.05, penalización de separación de hueco = 8) .

La Figura 3 muestra el alineamiento de aminoácidos de las secuencias tipo tcp-1 de C. elegans acceso Genbank AAA93233 (ID SEC NO: 18); el tcp-1 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 12); el fragmento tcp-1 de H. glycines dirigido por el vector binario RSA131 (ID SEC NO: 14); una etiqueta de la secuencia expresada de longitud parcial de Heterodera schachtii (EST) de número de acceso Genbank CF 100567 (ID SEC NO: 16), empleando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalización de abertura de hueco = 10, penalización de extensión de hueco = 0.05, penalización de separación de hueco = 8) .

La Figura 4 muestra el alineamiento de aminoácidos de las secuencias tipo prs-4 de C. elegans número de acceso Genbank 016368 (ID SEC NO: 34); número de acceso EMBL de C. briggsae CAE64528 (ID SEC NO: 32) el prs-4 de H. glycines de longitud completa generado a través de RACE PCR (reacción en cadena de la polimerasa con amplificación rápida de los extremos del cDNA) (ID SEC NO: 105) ; el fragmento prs-4 de H. glycines sintetizado dirigido por el vector binario RTP1169 (ID SEC NO: 30) ; el Contig526 parcial ensamblado a partir de las EST de Meloidogyne hapla (ID SEC NO: 36) : y el Contig2153 parcial ensamblado a partir de las EST de Meloidogyne incógnita (ID SEC NO: 38), empleando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penali zación de abertura de hueco = 10, penalización de extensión de hueco = 0.05, penalización de separación de hueco = 8) .

Las Figuras 5a-5b muestran el alineamiento de aminoácidos de las secuencias rpt-1 de C. elegans número de acceso EMBL CAB01414 (ID SEC NO: 54); C. briggsae número de acceso EMBL CAE75362 (ID SEC NO: 56); rpt-1 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 40); la secuencia EST de H. glycines de número de acceso Genbank CB376265 (ID SEC NO: 44); el fragmento rpt-1 de H. glycines dirigido por el vector binario RSA012 (ID SEC NO: 42); la EST de H. schachtii con número de acceso Genbank CD750393 (ID SEC NO: 46); una EST de G. rostochiensis de número de acceso Genbank EE269079 (ID SEC NO: 50) ; una EST de G. rostochiensis de número de acceso Genbank EE269080 (ID SEC NO: 48); y el Contigll70 parcial de la EST de Meloidogyne hapla (ID SEC NO: 52), empleando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalización de abertura de hueco = 10, penalización de extensión de hueco = 0.05, penalización de separación de hueco = 8) Las Figuras 6a-6b muestran el alineamiento de aminoácidos de las proteínas tipo rpn-5 de C. elegans número de acceso Genbank AAA81126 (ID SEC NO: 66); C. briggsae número de acceso EMBL CAE60648 (ID SEC NO: 68); rpn-5 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 58); la EST de H. glycines de número de acceso Genbank CA940612 (ID SEC NO: 62); la EST de H. glycines parcial de número de acceso Genbank CA940612 (ID SEC NO: 62); el fragmento rpn-5 de H. glycines dirigido por el vector binario RTP1269 (ID SEC NO: 60) y una EST de G. rostochiensis de número de acceso Genbank EE266903 (ID SEC NO: 64), empleando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalización de abertura de hueco = 10, penalización de extensión de hueco = 0.05, penalización de separación de hueco = 8) .

Las Figuras 7a-7b muestran el alineamiento de nucleótidos de la región codificadora pas-1 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 5), el fragmento pas-1 de ' H. glycines sintetizado (ID SEC NO: 7) utilizado en el vector binario RTP 1095-1 y la EST BM355389 de G. rostochiensis parcial (ID SEC NO: 9) . Los motivos conservados están indicados por texto en negritas y están enlistados en la Figura 12. El alineamiento se hizo utilizando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalizacion de abertura de hueco = 15, penalizacion de extensión de hueco = 6.66, penalizacion de separación de hueco = 8) .

Las Figuras 8a-8c muestran el alineamiento de nucleótidos de la región codificadora tcp-1 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 11) y la EST CF100567 de H. schachtii parcial (ID SEC NO: 15). Los motivos conservados están indicados por texto en negritas y están enlistados en la Figura 12. El alineamiento se hizo utilizando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalizacion de abertura de hueco = 15, penalizacion de extensión de hueco = 6.66, penalizacion de separación de hueco = 8) .

Las Figuras 9a-9b muestran el alineamiento de nucleótidos de la región codificadora prs-4 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 104), el ensamble EST parcial del Contig526 de M. hapla (ID SEC NO: 35) y el ensamble de EST de longitud completa para el Contig2153 de M. incógnita (ID SEC NO: 37). Los motivos conservados están indicados en texto en negritas y están enlistados en la Figura 12. El alineamiento se hizo utilizando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalización de abertura de hueco = 15, penalización de extensión de hueco = 6.66, penalización de separación de hueco = 8) .

Las Figuras 10a-10e muestran el alineamiento de nucleótidos de la región codificadora rpt-1 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 39), la EST CB376265 de H. glycines parcial (ID SEC NO: 43), la EST CD750393 de H. schachtii parcial (ID SEC NO: 45), la EST EE269079 de G. rostochiensis parcial (ID SEC NO: 49) , la EST parcial de EE269080 de G. rostochiensis (ID SEC NO: 47) y el ensamble de EST parcial para el Contigll70 de . hapla (ID SEC NO: 51) . Los motivos conservados están indicados por texto en negritas y están enlistados en la Figura 12. El alineamiento se hizo utilizando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalización de abertura de hueco = 15, penalización de extensión de hueco = 6.66, penalización de separación de hueco = 8) .

Las Figuras lla-llb muestran el alineamiento de nucleótidos de la región codificadora rpn-5 de H. glycines de longitud completa (ID SEC NO: 57) y la EST parcial EE266903 de G. rostochiensis (ID SEC NO: 63) . Los motivos conservados están indicados con texto en negritas y están enlistados en la Figura 12. El alineamiento se hizo utilizando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0 (penalización de abertura de hueco = 15, penalización de extensión de hueco = 6.66, penalización de separación de hueco = 8) .

La Figura 12 muestra una tabla de motivos de nucleótidos conservados identificados a partir de los genes pas-1, rpn-5, tcp-1, prs-4 y rpt-1 como está descrito en las Figuras 7 - 11.

Las Figuras 13a-13j muestran el porcentaje de identidad global de las secuencias pas-1 ejemplares (Figura 13a, aminoácido; Figura 13b, nucleótido) , las secuencias de tipo tcp-1 (Figura 13c, aminoácido; Figura 13d, nucleótido) , las secuencias tipo prs-4 (Figura 13e, aminoácido; Figura 13f, nucleótido), las secuencias tipo rpt-1 (Figura 13g, aminoácido; Figura 13h, nucleótido) y las secuencias tipo rpn-5 (Figura 13i, aminoácido; Figura 13 , nucleótido) . El porcentaje de identidad se calculó a partir de múltiples alineamientos empleando el programa informático Vector NTI versión vlO.3.0.

Las Figuras 14a-141 muestran algunos 21 meros posibles en las ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67 o 104 por la posición de los nucleotidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención puede entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los ejemplos que se incluyen en la presente. A menos que se indique de otro modo, los términos utilizados en la presente han de ser entendidos de acuerdo con el uso tradicional por parte de los expertos en la técnica pertinente. Además de las definiciones de los términos que se proporcionan más adelante, las definiciones de los términos comunes en la biología molecular también pueden encontrarse en Rieger et al, 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5a Ed., Berlín: Springer-Verlag; y en Current Protocols in Molecular Biology, F. . Ausubel et al., Eds . , Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1998). Debe entenderse que cuando se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones, "un" o "uno" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se usa. Así pues, por ejemplo, la referencia a "una célula" que puede utilizarse al menos una célula. Debe entenderse que la terminología que se utiliza en la presente es con el propósito de describir modalidades específicas solamente y no se pretende ser limitativos.

A lo largo de esta solicitud se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y aquellas referencias citadas dentro de estas publicaciones en su totalidad se incorporan por este medio para referencia en esta solicitud para describir más completamente el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención. Las técnicas normalizadas para clonación, aislamiento del DNA, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas que involucran DNA ligasa, DNA polimerasa, endonucleasas de restricción y similares, y las diferentes técnicas de separación son las conocidas y comúnmente empleadas por los expertos en la técnica. Múltiples técnicas normalizadas están descritas en Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y.; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y.; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed. ) 1979 Meth Enzymol. 68; u et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed. ) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.; Old and Primrose, 1981 Principies of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol . I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principies and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York. Las abreviaturas y nomenclatura, donde se empleen son consideradas normales en el campo y las comúnmente utilizadas en las revistas profesionales como las citadas en la presente.

Cuando se utiliza en la presente, "RNAi" o "RNA de interferencia" se refiere al proceso de silenciamiento de genes post-transcripcional , especifico de la secuencia para nemátodos, en los que interviene RNA bicatenario (dsRNA) . Cuando se utiliza en la presente, "dsRNA" se refiere al RNA que es parcial o completamente bicatenario. El RNA bicatenario también es conocido como un RNA interferente corto (siRNA) , el ácido nucleico interferente corto (siNA) , micro-RNA (miRNA) , y similares. Durante el proceso de RNAi, el dsRNA que contiene una primera hebra que es considerablemente idéntica a una porción de un gen diana, y una segunda hebra que es complementaria a la primera hebra, se introduce en un nemátodo, preferentemente por remojo, y más preferentemente por alimentación. Después de introducirlo en el nemátodo, el dsRNA especifico del gen diana es procesado en fragmentos relativamente pequeños (los siRNA) y posteriormente puede distribuirse desde el intestino a otras partes del nemátodo, dando origen a una mutación de pérdida de función que tiene un fenotipo que, durante el periodo de una generación, puede semejarse estrechamente al fenotipo que surge de una deleción completa o parcial del gen diana. De otro modo, el dsRNA especifico del gen diana es procesado en fragmentos relativamente pequeños por una célula vegetal que contenga la maquinaria de procesamiento del RNAi; y^ cuando el dsRNA pequeño procesado por la planta es ingerido por un nemátodo parásito, se obtiene el fenotipo de pérdida de función.

Cuando se utiliza en la presente, tomando en cuenta la sustitución de uracilo por timina cuando se comparan las secuencias de RNA y DNA, el término "considerablemente idéntico" cuando se aplica al dsRNA significa que la secuencia de nucleótidos de una hebra del dsRNA es al menos aproximadamente 80%-90% idéntico a 19 o más nucleótidos contiguos del gen diana, más preferentemente, al menos aproximadamente 90-95% idéntico a 19 o más nucleótidos contiguos del gen diana, y más preferentemente al menos alrededor de 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico o absolutamente idéntico a 19 o más nucleótidos contiguos del gen diana. El término "19 o más nucleótidos contiguos del gen diana" corresponde a la parte de doble hebra del dsRNA que es complementaria al gen diana, siendo al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 bases consecutivas o hasta la longitud completa del gen diana.

Cuando se utiliza en la presente, polinucleótidos "complementarios" son aquellos que son capaces del apareamiento de bases de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson-Crick normalizadas. Específicamente, las bases purinas se aparearán con las pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y la adenina se apareará con timina (A: T) en el caso del DNA, o la adenina se apareará con uracilo (A:U) en el caso del RNA. Se entenderá que dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí incluso si estos no son completamente complementarios entre sí, a condición de que cada uno tenga al menos una región que sea considerablemente complementaria a la otra. Cuando se utiliza en la presente, el término "considerablemente complementario" significa que dos secuencias de ácido nucleico son complementarias aproximadamente al menos 80% de sus nucleótidos. Preferentemente, las dos secuencias de ácido nucleico son complementarias en al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más o todos sus nucleótidos. De otro modo, "considerablemente complementario" significa que dos secuencias de ácido nucleico pueden hibridar en condiciones altamente restrictivas. Cuando se utiliza en la presente, el término "considerablemente idéntico" o "correspondiente a" significa que dos secuencias de ácido nucleico tienen al menos 80% de identidad de las secuencias. Preferentemente, las dos secuencias de ácido nucleico tienen al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de las secuencias.

Asimismo, cuando se utiliza en la presente, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren al RNA o DNA que sea lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario o un híbrido de éstos. El término también comprende híbrido de RNA/DNA. Cuando se produce en forma sintética el dsRNA, también es posible utilizar bases menos comunes, como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras para el antisentido, dsRNA, y el apareamiento de ribozimas. Por ejemplo, los polinucleótidos que contienen análogos C-5 propino de uridina y citidina han demostrado unirse al RNA con alta afinidad y han demostrado ser inhibidores antisentido potentes de la expresión génica. Otras modificaciones, como puede ser la modificación al esqueleto fosfodiéster, o también puede hacerse el 2'-hidroxi en el grupo azúcar ribosa del RNA.

Cuando se utiliza en la presente, los términos "poner en contacto" y "administrar" se utiliza de manera indistinta, y se refiere a un proceso mediante el cual el dsRNA de la presente invención se suministra a una célula de un nemátodo parásito, para inhibir la expresión de un gen diana esencial en el nemátodo. El dsRNA puede ser administrado en diversas formas, como puede ser, más no se limita a, la introducción directa en una célula (es decir, de manera intracelular ) ; o introducción extracelular en una cavidad, espacio intersticial o en la circulación del nemátodo, introducción oral, el dsRNA puede ser introducido preparando el baño del nemátodo en una solución que contenga dsRNA, o el dsRNA puede estar presente en la fuente alimenticia. Los métodos de introducción oral consisten en el mezclado directo del dsRNA con alimento del nemátodo, asi como métodos de ingeniería en los cuales una especie que se utilice como alimento es manipulada para expresar un dsRNA, luego se alimenta al organismo que va a ser afectado. Por ejemplo, el dsRNA puede ser rociado sobre una planta, o el dsRNA puede ser aplicado al suelo en las cercanías de las raíces. Puede ser captado por la planta y/o el nemátodo parásito, o una planta puede ser genéticamente manipulada para expresar el dsRNA en una cantidad suficiente para matar o afectar de manera adversa algunos o todos los nemátodos parásitos a los cuales está expuesta la planta.

Cuando se utiliza en la presente, el término "control, " cuando se utiliza en el contexto de una infección, se refiere a la reducción o prevención de una infección. La reducción o prevención de una infección por parte de un nemátodo ocasionará que una planta tenga resistencia aumentada al nemátodo; no obstante, tal resistencia aumentada no implica que la planta necesariamente tenga resistencia al 100% a la infección. En las modalidades preferidas, la resistencia a la infección causada por un nemátodo en una planta resistente es mayor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con una planta tipo nativa que no sea resistente a los nemátodos. Preferentemente, la planta tipo nativa es una planta de un genotipo semejante, más preferentemente idéntico al de la planta que tiene resistencia aumentada al nemátodo, pero no contiene un dsRNA dirigido al gen diana. La resistencia de la planta a la infección causada por nemátodos puede deberse a la muerte, esterilidad, el paro del desarrollo o movilidad deteriorada del nemátodo tras la exposición al dsRNA especifico para un gen esencial. El término "resistente a la infección de nemátodos" o "una planta que tiene una resistencia a los nemátodos", cuando se utiliza en la presente se refiere a la capacidad de una planta, en comparación con una planta tipo silvestre, para evitar infección de nemátodos, para matar nemátodos o para obstaculizar, reducir o detener el desarrollo, crecimiento o multiplicación de los nemátodos. Esto podría obtenerse mediante un proceso activo, p. ej . , produciendo una sustancia que sea perjudicial para el nemátodo, o por un proceso pasivo, como puede ser tener un valor nutricional reducido para el nemátodo o no desarrollar estructuras inducidas por el sitio de alimentación del nemátodo como sincitios o células gigantes. El nivel de resistencia de una planta al nemátodo puede determinarse en diversas formas, por ejemplo, mediante el recuento de los nemátodos que pueden establecer parasitismo en esa planta, o midiendo los tiempos de desarrollo de los nemátodos, la proporción de nemátodos hebras y macho o, para nemátodos de quistes, el recuento del número de quistes o huevos de nemátodos producidos en las raices de una planta infectada o sistema de ensayo de la planta.

El término "planta" está destinado a comprender plantas en cualquier etapa de madurez o desarrollo, asi como tejidos u órganos (partes de las plantas) tomados u obtenidos de cualquiera de las plantas a menos que se indique claramente de otro modo de acuerdo con el contexto. Las partes de las plantas pueden ser, más no se limitan a, tallos, raices, flores, óvulos, estambres, semillas, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, cultivos de anteras, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas, protoplastos, cultivos de raices pilosas y similares. La presente invención también incluye semillas producidas por las plantas de la presente invención. En una modalidad, las semillas son de plantas de linea genéticamente pura para una resistencia aumentada a la infección por nemátodos cuando se comparan con una variedad tipo nativa de la semilla de la planta. Cuando se utiliza en la presente, una "célula vegetal" incluye, más no se limita, un protoplasto, célula productora de gametos y una célula que se regenera en una planta completa. El cultivo de tejido de diferentes tejidos de plantas y la regeneración de las plantas a partir de estos es bien conocido en la técnica y se publica extensamente.

Cuando se utiliza en la presente, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula vegetal, tejido calloso, tejido vegetal o parte de planta que contiene todo o parte de al menos un polinucleótido recombinante . En muchos casos, todo o partes del polinucleótido recombinante se integra de manera estable en un cromosoma o elemento extra-cromosómico estable, de modo que es pasado a generaciones sucesivas. Para el propósito de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reordenado o modificado por ingeniería genética. Los ejemplos pueden ser cualquier polinucleótido clonado, o polinucleótidos , que estén ligados o nidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a las alteraciones de los polinucleótidos que resultan de sucesos naturales, como puede ser mutaciones espontáneas, o de mutagénesis no espontánea seguido por reproducción selectiva.

Cuando se utiliza en la presente, el término "cantidad suficiente para inhibir la expresión" se refiere a una concentración o cantidad del dsRNA que sea suficiente para reducir los niveles o la estabilidad del mRNA o la proteina producida a partir de un gen diana en un nemátodo parásito. Cuando se utiliza en la presente, "inhibir la expresión" se refiere a la ausencia o disminución observable en el nivel de la proteina y/o el producto del mRNA a partir de un gen diana. La inhibición de la expresión del gen diana puede ser letal para el nemátodo parásito, o tal inhibición puede retardar o prevenir la entrada en una etapa de desarrollo particular (p. ej . , metamorfosis), si la enfermedad de la planta es asociada con una etapa especifica del ciclo de vida del nemátodo parásito. Las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse examinando las propiedades externas del nemátodo (tal y como se presenta más adelante en los ej emplos ) .

De acuerdo con la invención, un nemátodo parásito hace contacto con un dsRNA, el cual inhibe específicamente la expresión de un gen diana que sea esencial para la supervivencia, metamorfosis o reproducción del nemátodo. Preferentemente, el nemátodo parásito entra en contacto con el dsRNA después de entrar en una planta que exprese el dsRNA. En una modalidad, el dsRNA es codificado por un vector que ha sido transformado en un ancestro de la planta infectada. Preferentemente, la secuencia del ácido que expresa el dsRNA está bajo el control transcripcional de un promotor especifico de raíz, un promotor especifico de la célula que alimenta el nemátodo parásito o un promotor constitutivo .

En una modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un gen tipo innexin. Se considera que las innexinas consisten en una gran familia de genes que codifican a las proteínas formadoras de canales que utilizan la unión tipo gap o uniones comunicantes en los invertebrados. Estas proteínas formadoras de canales permiten el transporte de iones y otras moléculas pequeñas entre células contiguas. En C. elegans, el RNAi que se dirige a las innexinas da como resultado letalidad embriónica y larvaria en d elegans. Preferentemente, el gen diana es un homólogo de la familia de genes innexina de C. elegans y se obtiene de un nemátodo parásito de las plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen diana tipo innexin de nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) las secuencias establecidas en las ID SEC NO: 1 o 3, y (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con las ID SEC NO: 1 o 3. Como se muestra en el Ejemplo 1, el gen tipo innexin de H. glycines de longitud completa fue separado y está representado en la ID SEC NO: 1.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un gen que codifica una subunidad pequeña de la polimerasa delta (pol delta S) . La polimerasa delta está implicada en la replicación, reparación y recombinación del DNA. La subunidad pequeña es no catalítica. Se necesita la subunidad pequeña para la interacción funcional de la subunidad catalítica con el antígeno nuclear de las células proliferantes y la síntesis procesiva del DNA. En C. elegans, el RNAi que se dirige a la subunidad pequeña de la polimerasa delta (F12F6.7) da como resultado letalidad embriónica. Preferentemente, el gen diana es un homólogo del gen de la subunidad pequeña de polimerasa delta de C. elegans y se obtiene a partir de un nemátodo parásito de plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen diana de la subunidad pequeña de la polimerasa delta de nemátodos parásitos consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) las secuencias establecidas en la ID SEC NO: 23 o 25, y (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 23 o 25. Como se muestra en el Ejemplo 1, el gen de la subunidad pequeña de la polimerasa delta de H. glycínes de longitud completa fue aislado y se representa en la ID SEC NO: 23.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un homólogo del gen tcp-1 de C. elegans T21B10.7 (No. de acceso Genbank AAA93233) el cual codifica una subunidad alfa putativa de la chaperonina citosólica eucariótica (? complejo T" ) . Esta proteina complejo T es necesaria para la rotación normal del complejo pronuclear-centrosoma, posicionando el uso mitótico, la meiosis, y la migración de las células de la punta distal; también es necesario para la fertilidad y viabilidad en la C. elegans. Preferentemente, el gen diana es un homólogo del gen tcp-1 de C. elegans y se obtiene a partir de un nemátodo parásito de las plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen diana tcp-1 del nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) las secuencias establecidas en la ID SEC NO: 11 o 13, y (b) un polinucleótido que tenga al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 11 o 13. Como se muestra en el Ejemplo 1, el gen tipo tcp-1 de H. glycines, de longitud completa fue aislado y se representa en la ID SEC NO: 11.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un homólogo del gen tcp-1 de C. elegans, T21B10.7 (No. de acceso Genbank AAA93233) o un motivo del fragmento de la secuencia obtenido utilizando la secuencia de DNA correspondiente a la secuencia de aminoácidos del homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans . Como se describe en el Ejemplo 1, el transcrito de longitud completa del gen tipo tcp-1 de H. glycines fue aislado y se representa en la ID SEC NO: 11. La secuencia descrita por la ID SEC NO: 11 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos que se describe como ID SEC NO: 12. Como está descrito en el Ejemplo 4, la secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 12 fue utilizada para identificar las secuencias de aminoácidos del gen homólogo. La secuencia de DNA homologa correspondiente está descrita por la ID SEC NO: 15. El alineamiento de la secuencia de DNA del homólogo identificado descrito por la ID SEC NO: 15 a ID SEC NO: 11 se muestra en la Figura 8a-c. Las regiones de alta homología de secuencias sobre 21 nucleótidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo F en la Figura 8a-c. Las secuencias motivo correspondientes a Motivo A hasta Motivo F están descritas por las ID SEC NOS: 86-91. En esta modalidad de la presente invención, la secuencia homologa o el motivo fragmento de la secuencia del gen diana tcp-1 del nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia establecida en la ID SEC NO: 15, (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencias con la ID SEC NO: 15, y (c) las secuencias establecidas en las ID SEC NO: 86, 87, 88, 89, 90, o 91.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un homólogo del gen pas-1 de C. elegans que codifica una subunidad alfa del proteasoma. Las subunidades alfa del proteasoma son parte de la partícula central proteasa 20S [sic] del proteasoma 26S. Estas actúan como una compuerta a través de las cuales las proteínas etiquetadas entran en el proteasoma para la degradación. Preferentemente, el gen diana es un homólogo del gen pas-1 de C. elegans y se obtiene a partir de un nemátodo parásito de plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen diana pas-1 del nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) las secuencias establecidas en las ID SEC NO: 5 o 7, y (b) un polinucleótido que tenga al menos 80% de identidad de secuencia con las ID SEC NO: 5 o 7. Como se muestra en el Ejemplo 1, el pas-1 de H. glycines de longitud completa fue aislado y está representado en la ID SEC NO: 5.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un homólogo del gen pas-1 de C. elegans o un motivo fragmento de secuencia obtenido utilizando la secuencia de DNA correspondiente a la secuencia de aminoácidos homologa para el gen pas-1 de C. elegans. Como se describe en el Ejemplo 1, el transcrito de longitud completa del gen tipo pas-1 de H. glycines fue aislado y está representado en la ID SEC NO: 5. La secuencia descrita por la ID SEC NO: 5 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como ID SEC NO: 6. Como se describe en el Ejemplo 4, la secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 6 se utilizó para identificar secuencias de aminoácidos de genes homólogos. La secuencia de DNA homologa correspondiente está descrita por la ID SEC NO: 9. El alineamiento de la secuencia de DNA del homólogo identificado descrito por la ID SEC NO: 9 a ID SEC NO: 5 se muestra en la Figura 7a-b. Las regiones que tienen alta homología de secuencias sobre 21 nucleótidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo G en la Figura 7a-b. Las secuencias motivo correspondientes a Motivo A hasta Motivo G están descritas por las ID SEC NOS: 72-78. En esta modalidad de la presente invención, la secuencia homologa o el motivo fragmento de la secuencia del gen diana pas-1 del nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia establecida en la ID SEC NO: 9, (b) un polinucleótido que tenga al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 9, y (c) las secuencias establecidas en las ID SEC NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, o 78.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito. Las snurportinas son receptores nucleares importantes implicados en importar las snRNP ( ribonucleoproteina nuclear pequeña), U con terminaciones m3G, utilizadas para el corte y empalme, en el núcleo. En C. elegans, el RNAi que se dirige a snurportin-1 (F23F1.5) da como resultado letalidad embriónica. Preferentemente, el gen diana es un homólogo del gen snurportin-1 de C. elegans, F23G1.5 (No. de aceso Genbank AAB70323) y se obtiene de un nemátodo parásito de plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen diana snurportin-1 de nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) las secuencias establecidas en la ID SEC NO: 19 o 21, y (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% identidad de secuencia con ID SEC NO: 19 o 21. Como se muestra en el Ejemplo 1, el gen snurportin-1 de H. glycines de longitud completa fue aislado y está representado en la ID SEC NO: 19.

En otra modalidad, el gen diana de nemátodo parásito es un homólogo del gen rpt-1 de C. elegans el cual codifica una subunidad de ATPasa pronosticada del complejo regulador 19S del proteasoma que afecta la fertilidad y la viabilidad embriónica. Preferentemente, el gen diana es un homólogo del gen rpt-1 de C. elegans, C52E4.4 (No. de acceso EMBL CAB01414) y se obtiene de un nemátodo parásito de plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen diana rpt-1 de nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) las secuencias establecidas en las ID SEC NO: 39, 41 o 43, y (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con las ID SEC NO: 39, 41 o 43. Como se muestra en el Ejemplo 1, el gen tipo rpt-1 de H. glycines de longitud completa fue aislado y está representado en la ID SEC NO: 39.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un homólogo del gen rpt-1 de C. elegans, C52E4.4 (No. de acceso EMBL CAB01414) o un motivo fragmento de secuencia obtenido utilizando la secuencia de DNA correspondiente a la secuencia de aminoácidos homologa para el gen rpt-1 de C. elegans. Como se describe en el Ejemplo 1, el transcrito de longitud completa del gen tipo rpt-1 de H. glycines fue aislado y está representado en la ID SEC NO: 39. La secuencia descrita por la ID SEC NO: 39 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como ID SEC NO: 40. Como está descrito en el Ejemplo 4, la secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 40 se utilizó para identificar las secuencias de aminoácidos del gen homólogo. Las secuencias de DNA homologas correspondientes están descritas por las ID SEC NOS: 45, 47, 49, 51, 53 y 55. El alineamiento de la secuencia de DNA de los homólogos de nemátodos parásitos de plantas identificados descritos por las ID SEC NOS: 45, 47, 49, y 51 con la ID SEC NO: 39 se muestra en la Figura lOa-e.

Las regiones de alta homología de secuencias sobre 21 nucleótidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo J en la Figura lOa-e. Las secuencias motivo correspondientes al Motivo A hasta Motivo J están descritas por ID SEC NOS: 94-103. En esta modalidad de la presente invención, las secuencias homologas o motivos fragmentos de secuencias del gen diana rpt-1 de nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia establecida en las ID SEC NO: 45, 47, 49 o 51, (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con las ID SEC NO: 45, 47, 49 o 51, y (c) las secuencias establecidas en las ID SEC NOS: 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 o 103.

En otra modalidad, la diana es un gen que codifica una subunidad reguladora del proteasoma 26S 4 (prs-4). La proteina subunidad 4 es parte del complejo regulador 19S del proteasoma 26S y contiene un dominio ATPasa. La ruptura de este gen en los nemátodos parásitos con el RNAi originaria defectos potenciales en el proteasoma y la muerte. Preferentemente, el gen diana es un homólogo del gen de la subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 de C. elegans, el gen F29G9.5, Swiss-Prot entry 016368, y se obtiene de un nemátodo parásito de plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen diana de la subunidad reguladora del proteasoma 26S 4 de nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia establecida en la ID SEC NO: 27, 29 o 104, (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 27, 29 o 104, y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que híbrida en condiciones restrictivas a la secuencia establecida en las ID SEC NOS: 27, 29 o 104. Como se muestra en el Ejemplo 1, una secuencia del gen de la subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 de H. glycines, de longitud completa, fue aislada y se representa en la ID SEC NO: 104.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es una subunidad reguladora del proteasoma 26S 4 de nemátodo parásito (prs-4) o un motivo fragmento de secuencia obtenido utilizando la secuencia de DNA correspondiente a la secuencia de aminoácidos homologa para la secuencia de la subunidad reguladora de proteasoma 25S 4 de nemátodo parásito (prs-4) . Como se describe en el Ejemplo 1, una secuencia del gen de la subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 de H. glycines, de longitud completa, fue aislada y está representada en la ID SEC NO: 104. La secuencia descrita por la ID SEC NO: 104 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como ID SEC NO: 105. Como está descrito en el Ejemplo 4, la secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 105 se utilizó para identificar las secuencias de aminoácidos de genes homólogos. Las secuencias de DNA homologas correspondientes están descritas por las ID SEC NOS: 31, 33, 35 y 37. El alineamiento de la secuencia de DNA de los homólogos identificados descritos por las ID SEC NO: 35 y la ID SEC NO: 37 a ID SEC NO: 104 se muestran en la Figura 9a-b. Las regiones de alta homología de secuencias sobre 21 nucleótidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo D en la Figura 9a-b. Las secuencias motivo correspondientes a Motivo A hasta Motivo D están descritas en las ID SEC NOS: 92, 93, 106 y 107. En esta modalidad de la presente invención, la secuencia homologa o motivo fragmento de secuencia del gen diana prs-4 del nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia establecida en la ID SEC NO: 35 o 37, (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 35 o 37, y (c) las secuencias establecidas en las ID SEC NOS: 92, 93, 106 o 107.

En otra modalidad, el gen diana del nemátodo parásito es un homólogo del gen rpn-5 de C. elegans el cual codifica una partícula reguladora de proteasoma. La proteína es parte del complejo regulador del proteasoma 26S y contiene un dominio no ATPasa. Los estudios con RNAi en ensayos de alimentación de C. elegans han demostrado fenotipos de letalidad embriónica .

Preferentemente, el gen diana es un homólogo del gen rpn-5 de C. elegans, F10G7.8 (No. de acceso Genbank AAA81126) y se obtiene de un nemátodo parásito de plantas. En esta modalidad de la presente invención, el gen rpn-5 de nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) las secuencias establecidas en las ID SEC NO: 57, 59 o 61, (b) un polinucleótido que tenga al menos 80% de identidad de secuencia con ID SEC NO: 57, 59 o 61, y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a la secuencia establecida en la ID SEC NO: 57, 59 o 61. Como se muestra en el Ejemplo 1, el gen rpn-5 de H. glycines de longitud completa fue aislado y está representado en la ID. SEC NO: 57.

En otra modalidad, el gen diana de nemátodo parásito es un gen rpn-5 de nemátodo parásito o un motivo fragmento de secuencia obtenido utilizando la secuencia de DNA correspondiente a la secuencia de aminoácidos homologa para el gen rpn-5 de nemátodo parásito. Como se describe en el Ejemplo 1, un gen rpn-5 de H. glycines de longitud completa fue aislado y está representado en la ID SEC NO: 57. La secuencia descrita por la ID SEC NO: 57 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como ID SEC NO: 58. Como se describe en el Ejemplo 4, la secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 58 se utilizó para identificar las secuencias de aminoácidos de genes homólogos. La secuencia de DNA homologa correspondiente está descrita por la ID SEC NO: 63. El aislamiento de la secuencia de DNA del homólogo identificado descrito por la ID SEC NO: 63 a la ID SEC NO: 57 se muestra en la Figura lla-b. Las regiones de alta homología de secuencias sobre 21 nucleótidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo G en la Figura lla-b. Las secuencias Motivo correspondientes a Motivo A hasta Motivo G están descritas por las ID SEC NOS: 79-85. En esta modalidad de la presente invención, la secuencia homologa o motivo fragmento de secuencia del gen diana rpn-5 de nemátodo parásito consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia establecida en la ID SEC NO: 63, (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 63, y (c) las secuencias establecidas en las ID SEC NO: 79, 80, 81, 82, 83, 84 u 85.

Los cDNA completos correspondientes a los genes diana de nemátodos parásitos de la invención pueden ser aislados a partir de los nemátodos parásitos que no sean H. glycines empleando la información que se proporciona en la presente y las técnicas conocidas para los expertos en la materia de biotecnología. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a una secuencia de nucleótidos de las ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61 puede ser aislado a partir de bibliotecas de cDNA de nemátodos parásitos. Cuando se utiliza en la presente con respecto a la hibridación para DNA a un DNA problema, el término "condiciones restrictivas" se refiere a la hibridación durante la noche a 60°C en solución de Denhart 10X, SSC 6X, SDS al 0.5% y 100 pg/mL de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Los DNA ensayados se lavan en secuencia a 62°C durante 30 minutos cada vez en SSC 3X/SDS al 0.1%, seguido por SSC IX/SDS al 0.1% y por último SSC 0.1X/SDS al 0.1%. Como también se utiliza en la presente, en una modalidad preferida, la frase "condiciones restrictivas" se refiere a la hibridación en una solución de SSC 6X a 65°C. En otra modalidad, "condiciones altamente restrictivas" se refiere a la hibridación durante la noche a 65°C en solución de Denhart 10X, SSC 6X, SDS al 0.5% y 100 µg/mL de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Las muestras se lavan en secuencia a 65°C durante 30 minutos cada vez en SSC 3X/SDS al 0.1%, seguido por SSC IX/SDS al 0.1%, y por último SSC 0.1X/SDS al 0.1%. Los métodos para hibridaciones de ácidos nucleicos están descritos en Meinkoth y Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; bien conocidos en la técnica. De otro modo, el mRNA puede ser aislado de células de nemátodos parásitos, y el cDNA puede ser preparado utilizando transcriptasa inversa. Los cebadores oligonucleótidos sintéticos para la amplificación con reacción en cadena de las polimerasas pueden ser diseñados con base en la secuencia de nucleótidos que se muestra en las ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61. Las moléculas ácidos nucleicos correspondientes a los genes diana de nemátodos parásitos de la invención pueden ser amplificadas utilizando cDNA, o de otro modo, DNA genómico, como un modelo y los cebadores oligonucleótidos apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación por PCR normalizadas. Las moléculas de ácido nucleico asi amplificadas pueden ser clonadas en vectores apropiados y caracterizadas por análisis de secuencias del DNA.

Por consiguiente, en una modalidad, el dsRNA de la invención consiste en una primera cadena que es considerablemente idéntica a una parte del gen diana tipo innexin de un genoma de nemátodo parásito de plantas, y una segunda cadena que sea considerablemente complementaria a la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleotido que tenga la secuencia establecida en la ID SEC NO: 1 o 3; (b) un polinucleotido que tenga al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 1 o 3; y (c) un polinucleotido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleotido que tenga la secuencia establecida en la ID SEC NO: 1 o 3.

En otra modalidad, el dsRNA de la invención contiene una primera cadena que es considerablemente idéntica a una parte del gen diana pas-1 de un genoma de nemátodo parásito de plantas, y una segunda cadena que sea considerablemente complementaria a la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleotido que tenga la secuencia establecida en las ID SEC NOS: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 o 78; (b) un polinucleotido que tenga al menos 80% de identidad de la secuencia con las ID SEC NOS: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 o 78; y (c) un polinucleotido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleotido que tenga la secuencia establecida en las ID SEC NOS: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 o 78.

En otra modalidad, los dsRNA de la invención contienen una primera cadena que es considerablemente idéntica a una parte del gen diana de tcp-1 del genoma de un nemátodo parásito de plantas y una segunda cadena que sea considerablemente complementaria a la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en las ID SEC NOS: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90, o 91; (b) un polinucleótido que tenga al menos 80% de identidad de secuencias con la ID SEC NO: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 o 91; y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en las ID SEC NOS: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 o 91.

En otra modalidad, el dsRNA de la invención contiene una primera cadena que es considerablemente idéntica a una parte del gen diana tipo snurportin-1 del genoma de un nemátodo parásito de plantas, y una segunda cadena que sea considerablemente complementaria a la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en la ID SEC NO: 19 o 21; (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia para la ID SEC NO: 19 o 21; y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en la ID SEC NO: 19 o 21.

En otra modalidad, el dsRNA de la invención contiene una primera cadena que es considerablemente idéntica a una parte del gen diana de la subunidad pequeña de polimerasa delta del genoma de un nemátodo parásito de plantas, y una segunda cadena que es considerablemente complementaria a la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en las ID SEC NO: 23 o 25; (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la ID SEC NO: 23 o 25; y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en la ID SEC NO: 23 o 25.

En otra modalidad, el dsRNA de la invención consiste en una primera cadena que es considerablemente idéntica a una parte del gen diana prs-4 del genoma de un nemátodo parásito de plantas y una segunda cadena que es considerablemente complementaria a la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en las ID SEC NOS: 27, 104, 29, 92, 93, 106 o 107; (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencias con la ID SEC NO: 27, 104, 29, 92, 93, 106 o 107; y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en ID SEC NO: 27, 104, 29, 92, 93, 106 o 107.

En otra modalidad, el dsRNA de la invención contiene una primera hebra que es considerablemente idéntica a una parte del gen diana rpt-1 del genoma de un nemátodo parásito de plantas y una segunda cadena que es considerablemente complementaria a la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en ID SEC NO: 39, 41, 43, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 o 103; (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencias a la ID SEC NO: 39,41, 43, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 o 103; y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en la ID SEC NO: 39, 41, 43, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 o 103.

En otra modalidad, el dsRNA de la invención contiene una primera cadena que es considerablemente idéntica a una porción del gen diana rpn-5 del genoma de un nemátodo parásito de plantas y una segunda cadena que es considerablemente complementaria a' la primera cadena. En las modalidades preferidas, el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en las ID SEC NO: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o 85; (b) un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad de secuencias con las ID SEC NOS: 57, 59, 61 , 63, 79, 80, 81 , 82, 83, 84 o 85; y (c) un polinucleótido de un nemátodo parásito que hibride en condiciones restrictivas a un polinucleótido que tenga la secuencia establecida en las ID SEC NOS: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o 85.

Como se describe en lo anterior, los fragmentos de dsRNA más grandes de 19-24 nucleótidos de longitud son desdoblados dentro de la célula por los nemátodos de las plantas a siRNA de 19-24 nucleótidos de longitud, y estos siRNA son los mediadores reales del fenómeno del RNAi . La tabla de las Figuras 14a-141 establece los 21-meros ejemplares del gen tipo innexin de los SCN. La ID SEC NO: 1, gen pas-1, ID SEC NO: 5, gen tcp-1, ID SEC NO: 11, gen tipo snurportin-1, ID SEC NO: 19, gen pol delta S, ID SEC NO: 23, gen prs-4, ID SEC NO: 104, gen rpt-1, ID SEC NO: 39, y gen rpn-5, ID SEC NO: 57, y los fragmentos y homólogos respectivos de estos, como se indica por las ID SEC NOS establecidas en la tabla. Esta tabla también puede utilizarse para calcular los 19, 20, 22, 23 o 24-meros sumando o restando el número apropiado de nucleótidos desde cada 21-mero. Asi pues, el dsRNA de la presente invención puede abarcar en longitud desde 19 nucleótidos hasta aproximadamente 500 nucleótidos consecutivos o hasta la longitud completa del gen diana. El dsRNA de la invención puede ser incorporado como un miRNA que se dirige a un solo sitio dentro del gen diana de un nemátodo parásito. De otro modo, el dsRNA de la invención tiene una longitud desde aproximadamente 19 nucleótidos hasta aproximadamente 600 nucleótidos consecutivos. En otra modalidad, el dsRNA de la invención tiene una longitud desde aproximadamente 20 nucleótidos hasta aproximadamente 400 nucleótidos consecutivos, o desde aproximadamente 21 nucleótidos hasta aproximadamente 300 nucleótidos consecutivos.

Cuando se describe en la presente, el 100% de identidad de la secuencia entre el dsRNA y el gen diana no es necesario para practicar la presente invención. Preferentemente, el dsRNA de la invención contiene una porción de 19 nucleótidos que es considerablemente idéntica a al menos 19 nucleótidos contiguos del gen diana. Aunque para la invención se prefiere un dsRNA que contenga una secuencia de nucleótidos idéntica a una porción de los genes diana de nemátodos parásitos de la invención, la invención puede tolerar variaciones en las secuencias que puedan esperarse debido a manipulación génica o síntesis, mutación genética, polimorfismo de las cepas o divergencia de la evaluación. Asi pues, los dsRNA de la invención también comprenden los dsRNA que contienen un mal apareamiento con el gen diana de al menos 1, 2 o más nucleótidos. Por ejemplo, se considera en la presente invención que las secuencias de dsRNA de 21 meros ejemplificadas en las Figuras 14a-141 pueden contener una adición, deleción o sustitución de 1, 2 o más nucleótidos, a condición de que la secuencia resultante todavía interfiera con la función del gen diana de nemátodos parásitos.

La identidad de la secuencia entre los dsRNA de la invención y los genes diana de nemátodos parásitos puede optimizarse por comparación de las secuencias y algoritmos de alineamiento conocidos en la técnica (véase Gribskov y Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, y las referencias que se mencionan en ésta) y calculando el porcentaje de diferencia entre las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, mediante el algoritmo de Smith-Waterman como se practica en el programa informático BESTFIT utilizando los parámetros predeterminados (p. ej . , University of isconsin Genetic Computing Group) . Se prefiere más de 80% de identidad de las secuencias, 90% de identidad de las secuencias o incluso 100% de identidad de las secuencias entre el RNA inhibidor y al menos 19 nucleótidos contiguos del gen diana .

Cuando los dsRNA de la invención tienen una longitud mayor de 21 nucleótidos, por ejemplo desde aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 1000 nucleótidos, este se desdoblará aleatoriamente a los dsRNA de aproximadamente 21 nucleótidos dentro de la planta o la célula del nemátodo parásito, los siRNA. El desdoblamiento de un dsRNA más grande de la invención producirá un pool de dsRNA 21-meros, obtenidos del dsRNA más largo. Este pool de dsRNA 21-meros también está comprendido dentro del alcance de la presente invención, bien sea que se produzca dentro de la célula de la planta o el neraátodo o en forma sintética empleando los métodos conocidos de la síntesis de oligonucleotidos.

Los siRNA de la invención tienen secuencias correspondientes a los fragmentos de 19-24 nucleótidos contiguos a lo largo de la secuencia del gen diana del nemátodo parásito. Por ejemplo, un pool de siRNA de la invención obtenido del gen diana de H. glycines como se establece en las ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61 puede contener una multiplicidad de moléculas de RNA que se seleccionan del grupo que consiste en oligonucleotidos considerablemente idénticos a los nucleótidos 21-meros de ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61 que se encuentran en las Figuras 14a-141. Del mismo modo, el pool de los siRNA de la invención también está incorporado en los pool de 21-meros de los fragmentos y homólogos de los genes diana de H. glycines como se establece en la tabla de las Figuras 14a-141. Un experto en la técnica se dará cuenta que el siRNA puede tener un mal apareamiento con el gen diana de al menos 1, 2 o más nucleótidos. Además, estos malos apareamientos están destinados a estar incluidos en la presente invención. Por ejemplo, se considera en la presente invención que las secuencias de dsRNA 21-meros ejemplificadas en las Figuras 14a-141 pueden contener una adición, deleción o sustitución de 1, 2 o más nucleótidos, y la secuencia resultante todavía interfiere con la función del gen del nemátodo. Un pool de siRNA de la invención obtenida del gen diana de H. glycines de ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61 también puede contener cualquier combinación de moléculas de RNA específicas que tengan cualquiera de las secuencias de 21 nucleótido contiguos obtenidas a partir de las ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61 establecidas en las Figuras 14a-141. Además, en vista de que múltiples moléculas Dicer especializadas en las plantas generan los siRNA que normalmente abarcan en tamaño desde 19 nucleótidos hasta 24 nucleótidos (véase Henderson et al, 2006. Nature Genetics 38:721-725), los siRNA de la presente invención también pueden abarcar secuencias desde 19 nucleótidos contiguos hasta secuencias de aproximadamente 24 nucleótidos contiguos. Del mismo modo, un pool de siRNA de la invención puede contener una multiplicidad de moléculas de RNA que tengan cualquiera de las secuencias de 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos contiguos obtenidos a partir de las ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61. De otro modo, el pool de siRNA de la invención puede contener una multiplicidad de moléculas de RNA que tengan una combinación de cualquiera de las secuencias de 19, 20, 21, 22, 23 y/o 24 nucleótidos contiguos obtenidas de las ID SEC NOS: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 39, 41, 43, 57, 59 o 61.

Los dsRNA de la invención, como una opción, pueden contener una sola cadena despareada en cualquiera o ambos extremos. Preferentemente, el extremo saliente monocatenario contiene al menos dos nucleótidos en el extremo 3' de cada cadena de la molécula del dsRNA. Los siRNA sintéticos pueden contener 2 ' -desoxitimidina (TT) o ribo-uridina (UU) en las porciones saliente de dos nucleótidos. La estructura bicatenaria puede formarse por una sola cadena de RNA auto-complementaria (es decir, formando un bucle de horquilla) o dos cadenas de RNA complementarias. La formación del dúplex de RNA puede iniciarse dentro o fuera de la célula. Cuando el dsRNA de la invención forma una horquilla, esta puede opcionalmente contener un intrón, como se establece en US 2003/0180945A1 o un espaciador de nucleótidos, que es un tramo de secuencia entre las cadenas de RNA complementarias para estabilizar el transgen horquilla en las células. Los métodos para preparar las diferentes moléculas de dsRNA se indican, por ejemplo, en O 99/53050 y en la Patente U.S. No. 6,506,559. El RNA puede ser introducido en una cantidad que permita el suministro de al menos una copia por célula. Dosis mayores del material bicatenario pueden producir inhibición más eficaz .

En otra modalidad, la invención proporciona un vector de expresión recombinante , aislado, que contiene un ácido nucleico que codifica una molécula de dsRNA como se describe antes, en donde la expresión del vector en una célula hospedera de planta da como resultado resistencia aumentada a un nemátodo parásito cuando se compara con una variedad tipo silvestre de la célula de la planta hospedera. Cuando se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligada. Un tipo de vector es un "plásmido", lo cual se refiere a un bucle de DNA bicatenario, circular en el que pueden ligarse otros segmentos de DNA. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos adicionales de DNA pueden ser ligados en el genoma viral. Algunos vectores pueden tener replicación autónoma en una célula de planta hospedera en la cual se introducen. Otros vectores se integran en el genoma de una célula de planta hospedera tras la introducción en la célula hospedera, y con ello se replican junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales están ligados de manera operante. Tales vectores se conocen en la presente como "vectores de expresión" . En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas del DNA recombinante muchas veces están en forma de plásmidos. En la especificación presente, "plásmido" y "vector" puede utilizarse de manera indistinta en vista de que el plásmido es la forma de vector que se utiliza con mayor frecuencia. No obstante, la invención está destinada a incluir tales formas de vectores de expresión, como pueden ser los vectores virales (p. ej . , el virus X de la papa, el virus del estriado necrótico del tabaco y el virus Gemini) , los cuales tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención contienen un ácido nucleico de la invención en forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula de planta hospedera, lo cual significa que el vector de expresión recombinante contiene una o más secuencias reguladoras, p. ej . , promotores, seleccionados con base en las células de la planta hospedera que va a utilizarse para la expresión, las cuales están ligadas de manera operante a la secuencia de ácido nucleico que va a ser expresada. Con respecto a un vector de expresión recombinante, los términos "ligado de manera operante" y "en asociación operativa" se utilizan de manera indistinta y están destinadas a significar que la secuencia de nucleótidos que interesa está ligada a la(s) secuencia (s) reguladora (s) en una forma que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej . , en una célula de planta hospedera cuando se introduce el vector en la célula de la planta hospedera) . El término "secuencia reguladora" se propone para incluir promotores, potenciadotes y otros elementos para el control de la expresión (p. ej . , las señales de poliadenilación) . Estas secuencias reguladoras están descritas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds . Glick and Thompson, Capitulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Ratón, Florida, incluidas las referencias que se mencionan en estas. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospederas y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en determinadas células hospederas o en ciertas condiciones. Los expertos en la técnica observarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que va a ser transformada, el nivel de expresión deseado del dsRNA y similares. Los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos en las células de plantas hospederas y con ello producir moléculas de dsRNA de la invención codificadas por los ácidos nucleicos como se describe en la presente.

De acuerdo con la invención, el vector de expresión recombinante contiene una secuencia reguladora ligada de manera operante a una secuencia de nucleótidos que es un modelo para una o ambas cadenas de la molécula de dsRNA de la invención. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico además contiene un promotor que flanquea cualquier extremo de la molécula de ácido nucleico, en donde los promotores impulsan la expresión de cada cadena de DNA individual, generando con ello dos RNA complementarios que hibridan y forman el dsRNA. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que es transcrita en ambas cadenas de la molécula de dsRNA en una unidad de transcripción, en donde la cadena sentido es transcrita desde el extremo 5' de la unidad de transcripción, y la hebra antisentido es transcrita desde el extremo 3 ' , en donde las dos cadenas están separadas por 3 a 500 pares de bases o más, y en donde después de la transcripción, el transcrito de RNA se dobla en si mismo para formar una horquilla. De acuerdo con la invención, la región espadadora del transcrito horquilla puede ser cualquier fragmento de DNA.

De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido introducido puede mantenerse en la célula vegetal de manera estable si se incorpora en un replicón autónomo, no cromosómico o se integra en los cromosomas de la planta. De otro modo, el polinucleótido introducido puede estar presente en un vector no replicante, extra-cromosómico y puede ser expresado de manera transitoria o puede ser activo de manera transitoria. Si está presente en un vector no replicante, extra-cromosómico o un vector que esté integrado en un cromosoma, el polinucleótido preferentemente reside en un cásete de expresión de la planta. Un cásete de expresión de la planta preferentemente contiene secuencias reguladoras que pueden impulsar la expresión génica en las células de las plantas que están ligadas de manera operante de modo que cada secuencia pueda cumplir su función, por ejemplo, la terminación de la transcripción mediante señales de poliadenilación . Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan del t-DNA de Agrobacterium turnefaciens, como puede ser el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti, pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3: 835) o equivalentes funcionales de éste, pero también todos los demás terminadores funcionalmente activos en plantas son adecuados. En vista de que con mucha frecuencia la expresión de los genes de las plantas no se limita a niveles de transcripción, un cásete de expresión de plantas preferentemente contiene otras secuencias ligadas de manera operante tipo potenciadores de la traducción como puede ser la secuencia overdrive que contiene la secuencia guia 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco que potencia la relación polipéptido a RNA (Gallie et al., 1987, Nucí. Acids Research 15: 8693-8711). Los ejemplos de los vectores de expresión de plantas incluyen aquellos que se describen en: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; Bevan, M. W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transíormation, Nucí. Acid. Res. 12: 8711-8721; and Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds . : Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

La expresión génica de plantas debe estar ligada de manera operante a un promotor adecuado que confiera expresión génica en una forma preferida por el tiempo, preferida por el espacio, preferida por el tipo de célula y/o preferida por el tipo de tejido. Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor que pueda iniciar la transcripción en una célula de planta presente en las raices de la planta. Promotores como estos incluyen, más no se limitan a aquellos que pueden obtenerse de las plantas, virus y bacterias de las plantas, que contienen genes que se expresan en plantas, como puede ser Agrobacterium y Rhizobium. Preferentemente, el cásete de expresión de la invención contiene un promotor especifico de la raíz, un promotor inducible por patógenos o un promotor inducible por nemátodos. Más preferentemente, el promotor inducible por nemátodos es de un promotor específico del sitio de alimentación del nemátodo parásito. Un promotor específico del sitio de alimentación del nemátodo parásito puede ser específico para células sincitiales o células gigantes o especifico para ambas clases de células. Un promotor es inducible si su actividad, medida por la cantidad de RNA producido bajo el control del promotor, es al menos 30%, 40%, 50% o preferentemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, más preferentemente al menos 100%, 200%, 300% o mayor en su estado inducido, en comparación con su estado no inducido. Un promotor es especifico de la célula, tejido u órgano, si su actividad, medida en la cantidad de RNA producido bajo control del promotor, es al menos 30%, 40%, 50%, preferentemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, más preferentemente al menos 100%, 200%, 300% o mayor en un tipo de célula particular, tejido u órgano, en comparación con otros tipos de células o tejidos de la misma planta, preferentemente los otros tipos de células o tejidos son tipos de células o tejidos del mismo órgano de la planta, p. ej . , una raíz. En el caso de promotores específicos de órganos, la actividad promotora tiene que ser comparada con la actividad promotora en otros órganos de plantas, por ejemplo, hojas, tallos, flores o semillas .

El promotor puede ser constitutivo, inducible, preferido por la etapa de desarrollo, preferido por el tipo de célula, preferido por el tejido o preferido por el órgano. Los promotores constitutivos son activos en la mayoría de las condiciones. Los ejemplos no limitativos de promotores constitutivos incluyen los promotores 19S y 35S del CaMV (Odell et al, 1985, Nature 313: 810-812), el promotor 35S de CaMV s (Kay et al, 1987, Science 236: 1299-1302) , el promotor Sepl, el promotor de actina de arroz (McElroy et al, 1990, Plant Cell 2:el63-171), el promotor de actina de Arabidopsis, el promotor de ubiquitina (Christensen et al, 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al, 1991, Theor. Appl . Genet. 81: 581-588), el promotor 35S del virus del mosaico de escrofularia, el promotor Smas (Velten et al, 1984, EMBO J. 3: 2723-2730), el promotor GRP1-8, el promotor de la alcohol cinamilico deshidrogenasa (Patente U.S. No. 5,683,439), los promotores del T-DNA de Agrobacterium, como puede ser la manopina sintasa, nopalina sintasa y octopina sintasa, el promotor de la subunidad pequeña de ribulosa bifosfato carboxilasa ( ssuRUBISCO) , y similares. Se prefieren los promotores que expresan el dsRNA en una célula que tiene contacto con los nemátodos parásitos. De otro modo, el promotor puede impulsar la expresión del dsRNA en un tejido de planta alejado del sitio de contacto con el nemátodo, y el dsRNA entonces puede ser transportado por la planta a una célula que esté en contacto con el nemátodo parásito, en particular células de, o cercanas a los sitios de alimentación del nemátodo, p. ej . , las células sincitiales o células gigantes.

Los promotores inducible son activos en ciertas condiciones ambientales, como puede ser en la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas y similares. Por ejemplo, los promotores TobRB7 , AtRPE, AtPyklO, Geminil9 y AtHMGl han demostrado ser inducidos por nemátodos (para una revisión de los promotores inducibles por nemátodos, véase Ann. Rev. Phytopathol. (2002) 40:191-219; véase también la Patente U. S. No. 6,593,513) . Los promotores inducibles por nemátodos, preferidos, están descritos en las solicitudes copendientes cedidas con la presente PCT/EP2007/ , PCT/EP2007/ , PCT/EP2007/ , y PCT/EP2008/ . Más preferentemente, los promotores inducibles por nemátodos que tienen las ID SEC NOS: 69, 70 y 71 se emplean en el vector de expresión de la invención.

Los métodos para aislar otros promotores, que sean inducibles por nemátodos se establecen en las Patentes U. S. Nos. 5,589,622 y 5,824,876. Otros promotores inducibles incluyen el promotor hsp80 de Brassica , siendo inducible por choque térmico; el promotor PPDK es inducido por la luz; el promotor PR-1 del tabaco, Arabidopsis, y maíz son inducibles por infección con un patógeno; y el promotor Adhl es inducido por hipoxia y estrés por frió. La expresión génica de las plantas también puede facilitarse a través de un promotor inducible (para una revisión, véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Los promotores que pueden ser inducidos por métodos químicos son especialmente adecuados si se desea expresión génica específica del tiempo. Los ejemplos no limitativos de estos promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (Solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al, 1992, Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible por etanol (Solicitud PCT No. WO 93/21334) .

Los promotores preferidos por la etapa de desarrollo preferentemente se expresan en ciertas etapas del desarrollo. Los promotores preferidos por el tejido y órgano incluyen aquellos que preferentemente se expresan en ciertos tejidos u órganos, como las hojas, raíces, semillas o el xilema. Los ejemplos de promotores preferidos por el tejido y preferidos por el órgano pueden ser, más no se limitan a, promotores preferidos por la fruta, preferidos por el óvulo, preferidos por el tejido macho, preferidos por la semilla, preferidos por el integumento, preferidos por el tubérculo, preferidos por el pedúnculo, preferidos por el pericarpio y preferidos por las hojas, preferidos por el estigma, preferidos por el polen, preferidos por las anteras, preferidos por los pétalos, preferidos por los sépalos, preferidos por los pedículos, preferidos por la silicua, preferidos por el tallo, preferidos por la raíz y similares. Los promotores preferidos por las semillas preferencialmente se expresan durante el desarrollo y/o germinación de las semillas. Por ejemplo, los promotores preferidos por las semillas pueden ser preferidos por el embrión, preferidos por el endospermo y preferidos por el recubrimiento de la semilla. Véase Thompson et al, 1989, BioEssays 10:108. Los ejemplos de los promotores preferidos por las semillas pueden ser, más no se limitan a celulosa sintasa (celA) , Ciml, gamma-zeina, globulin-1, maize 19 kD zein (cZ19Bl) y similares.

Otros promotores preferidos por tejido o preferidos por órgano adecuados pueden ser, más no se limitan a, el promotor del gen de napina de la semilla de colza (Patente U.S. No. 5,608,152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al, 1991, Mol. Gen Genet. 225(3) :459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (Solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente U.S. No. 5,504,200), el promotor de Bce4 de Brassica (Solicitud PCT No. WO 91/13980), o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al, 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), asi como promotores que confieran expresión especifica de la semilla en plantas monocotiledóneas tipo maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados que se pueden señalar son el promotor del gen de lpt2 o lptl de cebada (Solicitud PCT No. WO 95/15389 y Solicitud PCT No. WO 95/23230) o los descritos en la Solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores provenientes del gen de hordeina de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de origina de arroz, 'el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo y el gen de secalina de centeno) .

Otros promotores útiles en los casetes de expresión de la invención pueden ser, más no se limitan a, el promotor mayor de la proteina de unión a clorofila a/b, los promotores de histona, el promotor Ap3, el promotor de ß-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lecitina de soya, el promotor de zeina 15kD de maiz, el promotor de zeina de 22kD, el promotor de zeina de 27kD, el promotor de zeina g, los promotores ceroso, de shrunken 1, shrunken 2, y bronce, el promotor Zml3 (Patente U.S. No. 5,086,169), los promotores de poligalacturonasa de maíz (PG) (Patentes U.S. Nos. 5,412,085 y 5,545,546), y el promotor SGB6 (Patente U.S. No. 5,470,359), asi como promotores sintéticos u otros naturales .

De acuerdo con la presente invención, el cásete de expresión contiene una secuencia control de expresión ligada de manera operante a una secuencia de nucleótidos que es un modelo para una o ambas cadenas del dsRNA. El modelo de dsRNA contiene: (a) una primera cadena que tiene una secuencia considerablemente idéntica a desde 19 hasta aproximadamente 400-500, o hasta la longitud completa de nucleótidos consecutivos de la ID SEC NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 57, 59, 61, 63, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 106 o 107 y (b) una segunda cadena que tiene una secuencia considerablemente complementaria a la primera cadena. En otras modalidades, un promotor flanquea cualquier extremo de la secuencia de nucleótidos modelo, en donde los promotores impulsan la expresión de cada cadena de DNA individual, generando con ello dos RNA complementarios que hibridan y forman el dsRNA. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos es transcrita en ambas cadenas del dsRNA sobre una unidad de transcripción, en donde la hebra sentido es transcrita desde el extremo 5' de la unidad de transcripción y la cadena antisentido es transcrita desde el extremo 3', en donde las dos cadenas están separadas por aproximadamente 3 a aproximadamente 500 pares de bases, y en donde después de la transcripción, el transcrito de RNA se pliega sobre si mismo para formar una horquilla.

En otra modalidad, el vector contiene un promotor bidireccional que impulsa la expresión de dos moléculas de ácido nucleico, con ello una molécula de ácido nucleico codifica para la secuencia considerablemente idéntica a una porción de un gen diana tipo innexin, pas-1, tcp-1, tipo snurportin-1 , pol delta S, prs-4 , rtp-1 o rpn-5 de nemátodo parásito y la otra molécula de ácido nucleico codifica para una segunda secuencia que sea considerablemente complementaria a la primera cadena y con la posibilidad de formar un dsRNA, cuando se transcriben ambas secuencias. Un promotor bidireccional es un promotor que puede intervenir en la expresión en dos direcciones.

En otra modalidad, el vector contiene dos promotores, uno participa en la transcripción de la secuencia considerablemente idéntica a una porción de un gen diana tipo innexin, pas-1, tcp-1, tipo snurportin-1 , pol delta S, prs-4, rtp-1 o rpn-5 de nemátodo parásito y otro promotor participa en la transcripción de una segunda secuencia que sea considerablemente complementaria a la primera cadena y que puede formar un dsRNA, cuando ambas secuencias son transcritas. El segundo promotor podría se un promotor diferente.

Un promotor diferente significa un promotor que tenga una actividad diferente con respecto a la especificidad celular o tisular, o que muestre expresión en diferentes inductores, por ejemplo, patógenos, estrés abiótico o sustancias químicas. Por ejemplo, un promotor podría ser constitutivo o específico de tejido y otro podría ser específico de tejido o inducible por patógenos. En una modalidad, un promotor participa en la transcripción de una molécula de ácido nucleico adecuada para sobreexpresion de un gen tipo innexin, pas-1, tcp-1, tipo snurportin-1 , pol delta S, prs-4, rtp-1 o rpn-5, mientras que otro promotor interviene en la transcripción específica de tejido o de célula o expresión inducible por patógeno del ácido nucleico complementario.

La invención también está incorporada en una planta transgénica que puede expresar el dsRNA de la invención y con ello inhibir los genes tipo innexin , pas-1, tcp-1, tipo snurportin-1 , pol delta S, prs-4, rtp-1 y rpn-5 en nemátodos parásitos. La planta o la plana transgénica puede ser cualquier planta, como puede ser, más o se limita a, árboles, flores cortadas, plantas ornamentales, vegetales o plantas de cultivo. La planta puede ser de un género seleccionado del grupo que consiste en Medicago, Lycopersicon , Brassica , Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis , Picea, Capsicum , Chenopodium, Dendranthema , Pharbitis , Pinus , Pisum, Oryza, Zea, Triticu , Triticale, Sécale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga , Kalanchoe, Beta, Helianthus , Nicotiana , Cucúrbita , Rosa, Fragaria , Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella , Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus , Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana , Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus , Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium , Panieum, Pennisetum, Ranunculus , Senecio, Salpiglossis, Browaalia , Phaseolus , Avena, y Allium, o la planta puede ser de un género seleccionado del grupo que consiste en Arabidopsis , Medicago, Lycopersicon, Brassica , Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum , Brachipodium , Populus, Fragaria , Arabidopsis , Picea, Capsicum , Chenopodium, Dendranthema , Pharbitis , Pinus , Pisum, Oryza, Zea, Triticum , Triticale, Sécale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga , Kalanchoe, Beta, Helianthus , Nicotiana , Cucúrbita , Rosa, Fragaria , Lotus, Medicago, Onobrychis , trifolium, Trigonella , Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis , Majorana , Ciahorium , Lactuca, Bromus, Asparagus , Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus , Senecio, Salpiglossis , Browaalia , Phaseolus , Avena, y Allium. En una modalidad, la planta es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.

Preferentemente, la planta es una planta de cultivo. Las plantas de cultivo son todas las plantas que se utilizan en la agricultura. Por consiguiente, en una modalidad, la planta es una planta monocotiledónea, preferentemente una planta de la familia Poaceae, Musaceae, Liliaceae o Bromeliaceae, preferentemente de la familia Poaceae. Por consiguiente, y todavía otra modalidad, la planta es una planta Poaceae del género Zea, Triticum, Oryza, Hordeum. Sécale, Avena, Saccharum, Sorghum, Pennisetum, Setaria, Panicum, Eleusine, Míscanthus , Brachypodium , Festuca o Lolium. Cuando la planta es del género Zea, la especie preferida es Z. mays. Cuando la planta es del género Triticum, la especies preferida es T. aestivu , T speltae o T. durum. Cuando la planta es del género Oryza, la especie preferida es O. sativa. Cuando la planta es del género Hordeum, la especie preferida es H. vulgare. Cuando la planta es del género Sécale, la especie preferida es S. cereale. Cuando la planta es del género Avena, la especie preferida es A. sativa. Cuando la planta es del género Saccarum, la especie preferida es S. officinarum. Cuando la planta es del género Sorghum, la especie preferida es S. vulgare, S. bicolor o S. sudanense. Cuando la planta es del género Pennisetum, la especie preferida es P. glaucum. Cuando la planta es del género Setaria, la especie preferida es S. itálica. Cuando la planta es del género Panicum, la especie preferida es P. miliaceum o P. virgatum. Cuando la planta es del género Eleusine, la especie preferida es E. coracana . Cuando la planta es del género Miscanthus, la especie preferida es M. sinensis . Cuando la planta es del género Festuca, la especie preferida es F. arundinaria, F. rubra o F. pratensis . Cuando la planta es del género Lolium, la especie preferida es L. perenne o L. multiflorum. De otro modo, la planta puede ser Triticosecale.

De otro modo, en una modalidad, la planta es una planta dicotiledónea, preferentemente una planta de la familia Fajbaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Linacea, Euphorbiaceae, Convolvulaceae Rosaceae, Cucurbitaceae, Theaceae, Rubiaceae , Sterculiaceae o Citrus. En una modalidad, la planta es una planta de la familia a¿>aceae, Solanaceae o Brassicaceae . Por consiguiente, en una modalidad, la planta es de la familia Fabaceae, preferentemente del género Glycine, Pisum, Arachis, Cicer, Vicia, Phaseolus, Lupinus, Medicago o Lens. Las especies preferidas de la familia Fabaceae son M. truncatula, M, sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea , C. arietinum, V. faba, P. vulgaris , Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustífolius o Lens culinaris . Son más preferidas las especies G. max, A. hypogea y M. sativa. Más preferida es la especie G. max. Cuando la planta es de la familia Solanaceae, el género preferido es Solanum, Lycopersicon , Nicotiana o Capsicum. Las especies preferidas de la familia Solanaceae son S. tuberosum, L. esculentum (también conocida como Solanum lycopersicon) , N. tabaccum o C. chínense . Más preferida es S. tuberosum. Por consiguiente, en una modalidad, la planta de la familia Brassicaceae, preferentemente del género Brassica o Raphanus . Las especies preferidas de la familia Brassicaceae son las especies B. napus , B. olerácea, B. júncea o B. rapa. Más preferida es la especie B. napus. Cuando la planta es de la familia Chenopodiaceae, el género preferido es Beta y la especie preferida es B. vulgaris . Cuando la planta es de la familia Asteraceae, el género preferido es Helianthus y la especie preferida es H. annuus. Cuando la planta es de la familia Malvaceae, el género preferido es Gossypium o Abelmoschus . Cuando el género es Gossypium, la especie preferida es G. hirsutum o G. barbadense y la especie más preferida es G. hirsutum. Una especie preferida del género Abelmoschus es la especie A. esculentus . Cuando la planta es de la familia Linacea, el género preferido es Linum y la especie preferida es L. usitatissimum. Cuando la planta es de la familia Euphorbiaceae, el género preferido es Manihot, Jatropa o Rhizinus y la especie preferida es M. esculenta , J. curcas o R. comunis. Cuando la planta es de la familia Convolvulaceae, el género preferido es Ipomea y la especie preferida es I. batatas. Cuando la planta es de la familia Rosaceae, el género preferido es Rosa, Malus,' Pyrus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium o Fragaria y la especie preferida es híbrido Fragaria x ananassa. Cuando la planta es de la familia Cucurbitaceae, el género preferido es Cucumis, Citrullus o Cucúrbita y la especie preferida es Cucumis sativus, Citrullus lanatus o Cucúrbita pepo. Cuando la planta es de la familia Theaceae, el género preferido es Camellia y la especie preferida es C. sinensis . Cuando la planta es de la familia Rubiaceae, el género preferido es Coffea y la especie preferida es C. arábica o C. canephora. Cuando la planta es de la familia Sterculiaceae, el género preferido es Theobroma y la especie preferida es T. cacao. Cuando la planta es del género Citrus, la especie preferida es C. sinensis , C limón, C reticulata , C máxima e híbridos de la especie Citrus, o similares. En una modalidad preferida de la invención, la planta es una planta de soya, una planta de papa o de maíz.

Los métodos preferidos para transformar o transfectar células hospederas incluidas las células vegetales son bien conocidos en la técnica de la biotecnología vegetal. Es posible utilizar cualquier método para transformar el vector de expresión recombinante en células vegetales para producir las plantas transgénicas de la invención. Los métodos generales para transformar planta dicotiledóneas están descritos, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 4,940,838; 5,464,763, y similares. Los métodos para transformar plantas dicotiledóneas específicas, por ejemplo, algodón, están mencionados en las Patentes U.S. Nos. 5,004,863; 5,159,135; y 5,846,797. Los métodos para la transformación de soya están establecidos en las Patentes U.S. Nos. 4,992,375; 5,416,011; 5,569,834; 5, 824, 877 ; 6,384, 301 y en EP-0301749B1. Los métodos de transformación pueden incluir métodos de transformación directa e indirecta. Los métodos directos adecuados incluyen captación de DNA inducida por polietilen glicol, la transformación en la que intervienen liposomas (US 4,536,475), métodos biolisticos que utilizan la pistola génica (Fromm ME et al., Bio/Technology . 8(9): 833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), electroporación, incubación de embriones secos en solución que contenga DNA, y microinyección . En el caso de estos métodos de transformación directa no es necesario que los plásmidos utilizados cumplan algún requisito particular. Es posible utilizar plásmidos sencillos como los de la serie pUC, pBR322, de la serie M13mp, pACYC18¾ y similares. Si se van a regenerar plantas intactas a partir de células transformadas, preferentemente se localiza en el plásmido un gen marcador seleccionable adicional. Las técnicas de transformación directa son igualmente apropiadas para plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.

La transformación también puede llevarse a cabo por infección bacteriana por medio de Agrobacterium (por ejemplo EP 0 116 718), infección viral por medio de vectores virales (EP 0 067 553; US 4, 407,956; O 95/34668; WO 93/03161) o por medio de polen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4,684,611). Las técnicas de transformación basadas en Agrobacterium (especialmente para las plantas dicotiledóneas) son bien conocidas. La cepa Agrobacterium (p. e . , Agrobacterium tumeíaciens o Agrobacterium rhizogenes) contiene un plásmido (el plásmido Ti o Ri) y un elemento T-DNA que es transferido a la planta luego de la infección con Agrobacterium. El T-DNA (DNA transferido) se integra en el genoma de la célula vegetal. El T-DNA puede ser ubicado en el plásmido Ri o Ti o puede estar contenido por separado en un denominado vector binario. Los métodos para la transformación en las que interviene Agrobacterium están descritos, por ejemplo, en Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229. La transformación en la que participa Agrobacterium es muy adecuada para plantas dicotiledóneas, pero también ha sido adaptada para plantas monocotiledóneas . La transformación de plantas por Agrobacterias está descrita en, por ejemplo, White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec. Biol 42: 205-225. La transformación puede dar como resultado transformación y expresión transitoria o estable. Aunque una secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser insertada en cualquier planta o célula de planta que entre dentro de estas clases amplias, es particularmente útil en células de plantas de cultivo.

Las plantas transgénicas de la invención pueden ser cruzadas con plantas transgénicas semejantes o con plantas transgénicas carentes de los ácidos nucleicos de la invención o con plantas no transgénicas, empleando los métodos conocidos de reproducción de plantas, para preparar semillas. Además, la planta transgénica de la presente invención puede contener, y/o ser cruzada a otra planta transgénica que contenga uno o más ácidos nucleicos, creando asi una "pila" de transgenes en la planta y/o su descendencia. La semilla se planta entonces para obtener una planta transgénica fértil cruzada que contiene el ácido nucleico de la invención. La planta transgénica fértil, cruzada, puede tener el cásete de expresión especifico heredado a través de un padre hembra o un padre macho. La segunda planta puede ser una planta endogámica. El transgénico fértil cruzado puede ser un híbrido. También se incluyen dentro de la presente invención las semillas de cualquiera de las plantas transgénicas fértiles, cruzadas. Las semillas de esta invención pueden ser cosechadas a partir de plantas transgénicas fértiles y pueden ser utilizadas para hacer crecer generaciones de progenie de plantas transformadas de esta invención que incluyen las líneas de plantas híbridas que contienen el constructo DNA.

El "Gene stacking" o apilamiento génico también se puede lograr transfiriendo dos o más genes en el núcleo celular por transformación de la planta. Múltiples genes pueden ser introducidos en el núcleo celular durante la transformación en forma sucesiva o al unísono. Múltiples genes de plantas o especies patógenas diana pueden tener disminución regulada por mecanismos de silenciamiento génico, específicamente RNAi, mediante el uso de un solo transgen que se dirija a las secuencias parciales ligadas múltiples que interesen. Los múltiples genes apilados bajo el control de promotores individuales también pueden ser sobreexpresados para lograr un solo fenotipo o múltiples fenotipos deseados. Los constructos que contienen pilas de genes de genes sobreexpresados y dianas silenciadas también pueden ser introducidos en plantas que produzcan fenotipos sencillos o múltiples importantes para la agricultura. En ciertas modalidades, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser apiladas con cualquier combinación de secuencias de polinucleótido que interese para crear los fenotipos deseados. Las combinaciones pueden producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos que pueden ser, más no se limitan a resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, mejoramiento del rendimiento, tolerancia al frió y la sequía. Estas combinaciones apiladas puede ser creadas por cualquier método como puede ser, más no se limita a, plantas de reproducción cruzada por métodos tradicionales o por transformación genética. Si los rasgos son apilados por transformación genética, las secuencias de polinucleótidos que interesan pueden combinarse en forma secuencial o al mismo tiempo en cualquier orden. Por ejemplo, si dos genes van a ser introducidos, las dos secuencias pueden estar contenidas en diferentes casetes de transformación o en el mismo cásete de transformación. La expresión de las secuencias puede ser impulsada por promotores iguales o diferentes.

De acuerdo con esta modalidad, la planta transgénica de la invención se produce por un método que comprende los pasos de disponer de un gen diana tipo innexin, pas-1, tcp-1, tipo snurportin-1 , pol delta S, prs-4, rtp-1 o rpn-5 de nemátodos parásitos, preparar un cásete de expresión que tenga una primera región que sea considerablemente idéntica a una porción del gen tipo innexin, pas-1, tcp-1, tipo snurportin-1 , pol delta S, prs-4, rtp-1 o rpn-5 seleccionado y una segunda región que sea complementaria a la primera región, transformar el cásete de expresión en una planta y seleccionar la progenie o descendencia de la planta transformada que exprese el dsRNA de la invención .

Una resistencia aumentada a infección por nemátodos es un rasgo general que se desea que sea heredado a una amplia variedad de plantas. La presente invención puede utilizarse para reducir la destrucción de los cultivos por cualquier nemátodo parásito de las plantas. Preferentemente, los nemátodos parásitos pertenecen a las familias de nemátodo que inducen células gigantes y sincitiales. Los nemátodos que inducen células gigantes o sincitiales se encuentran en las familias Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae o Tylenchulidae . En particular, en las familias Heterodidae y Meloidogynidae.

Por consiguiente, los nemátodos parásitos consignados por la presente invención pertenecen a uno o más géneros seleccionados del grupo de Naccobus, Cactodera , Dolichodera , Globodera, Heterodera , Punctodera , Longidorus o Meloidogyne. En una modalidad preferida, los nemátodos parásitos pertenecen a uno o más géneros seleccionados del grupo de Naccobus , Cactodera , Dolichodera , Globodera , Heterodera , Punctodera o Meloidogyne . En una modalidad preferida, los nemátodos parásitos pertenecen a uno o más géneros seleccionados del grupo de Globodera , Heterodera o Meloidogyne . En una modalidad más preferida, los nemátodos parásitos pertenecen a uno o ambos géneros seleccionados del grupo de Globodera o Heterodera. En otra modalidad, los nemátodos parásitos pertenecen al género Meloidogyne.

Cuando los nemátodos parásitos son del género Globodera , las especies preferentemente son del grupo que consiste en G. achilleae , G. artemisiae , G. hypolysi, G. mexicana, G. millefolii, G. malí, G. pallida, G. rostochiensis , G. tabacum y G. virginiae.

En otra modalidad preferida, los nemátodos Globodera parásitos incluyen al menos una de las especies G. pallida, G. tabacum o G. rostochiensis. Cuando los nemátodos parásitos son del género Heterodera , las especies pueden preferentemente ser del grupo que consiste en H. avenae, H carotae, H ciceri, H cruciferas, H delvii, H elachista, H.filipjevi, H. gambiensis , H. glycines , H. goettingiana , H. graduni , H. humuli, H hordecalis , H latipons , H major, H medicaginis, H oryzicola , H pakistanensis, H. rosii, H. sacchari, H. schachtií, H. sorghi, H. trifoiii, H. urticae , H. vigni y H. zeae. En otra modalidad preferida, los nemátodos Heterodera parásitos incluyen al menos una de las especies H. glycines , H. avenae, H. cajani, H. gottingiana , H. trifoiii , H. zeae o H. schachtii . En una modalidad más preferida, los nemátodos parásitos incluyen al menos una de las especies H. glycines o H. schachtii. En una modalidad más preferida, el nemátodo parásito es la especies H. glycines . Cuando los nemátodos parásitos son del género Meloidogyne, el nemátodo parásito puede seleccionarse del grupo que consiste en M. acronea, M. arábica, M. arenaria , M. artiellia , M. brevicauda , M. camelliae, M. chitwoodi , M. cofeicola, M. esigua, M. graminicola, M. hapla, M. incógnita , M. indica, M. inornata , M. javanica , M. lini, M. mali, M. microcephala , M. microtyla, M. naasi, M. salasi y M. thamesi. En una modalidad preferida, los nemátodos parásitos incluyen al menos una de las especies M. javanica, M. incógnita, M. hapla, M. arenaria o M. chitwoodi.

Los siguientes ejemplos no están propuestos para limitar el alcance de las reivindicaciones de la invención, sino más bien están destinados para que sean ejemplares de ciertas modalidades. Algunas variaciones en los métodos ejemplificados que encuentren los expertos en la técnica están destinadas a entrar dentro del alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1: IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE LOS GENES DIANA RNAi DE H. GLYCINES .

Utilizando RNA total separado de la etapa J2 de SCN, se utilizó RT-PCR para aislar fragmentos de cDNA de aproximadamente 400-500 pb de longitud que se utilizaron para construir los vectores binarios que se describen en el Ejemplo 2. Los productos de la PCR fueron clonados en un vector pCR2.1 de TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los insertos fueron confirmados por secuenciación . Con este método se aislaron los fragmentos génicos de los ocho genes diana.

Para obtener cDNA de longitud completa para los genes diana de H. glycines, se utilizó un método RT-PCR basado en la secuencia guia (SL1) cortada y empalmada, altamente conservada presente en múltiples especies de nemátodos. Las reacciones se hicieron utilizando el kit Superscript One-Step (Invitrogen, Carlsbad, Calif, no. catálogo 10928-034) y una serie de cebadores. El cebador de avance consistió en una secuencia SL1 22-mero y cebadores inversos fueron específicos del gen y estuvieron ubicados en la región del cDNA previamente clonada. Los productos de la PCR fueron clonados en un vector pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y se secuenciaron .

Los extremos 3' del cDNA fueron amplificados utilizando el kit GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad, CA, No. catálogo L1500-01) . Los cDNA de la primera cadena (sic) fueron generados por transcripción inversa utilizando RNA total y el cebador GeneRacer Oligo dT Primer. Se hizo la reacción 3' RACE PCR con el cebador 3' GeneRacer y un cebador de avance específico del gen. Las reacciones PCR anidadas fueron realizadas posteriormente utilizando el cebador anidado GeneRacer 3' Nested Primer y un cebador de avance específico del gen. Los productos de la PCR fueron clonados en un pCR4-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se secuenciaron.

Las secuencias de longitud completa para cada uno de los ocho genes diana de los SCN fueron ensambladas en los cDNA correspondientes a las ocho dianas génicas, denominadas como ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 5, ID SEC NO: 11, ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 39, ID SEC NO: 57 e ID SEC NO: 104.

EJEMPLO 2: CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR BINARIO PARA LA TRANSFORMACIÓN DEL FRIJOL DE SOYA Para evaluar si las dianas de los SCN son eficaces in vivo, fragmentos de cDNA de ocho genes diana de SCN se utilizaron para preparar vectores binarios. Los vectores consisten en un fragmento antisentido de la diana (p. ej . , tcp-1 de H. glycines) , un fragmento espaciador, un fragmento sentido de la diana (p. ej . , tcp-1 de H. glycines) y un esqueleto vector. En este vector, el dsRNA para el gen diana fue expresado bajo un Super Promoter constitutivo (véase la Patente US 5955,646, incorporada en la presente para referencia) . El marcador de selección para la transformación fue un gen de acetohidroxiácido sintasa (AHAS) mutado de Arabídopsis taliana que confiere resistencia al herbicida ARSENAL (Imazapyr, BASF Corporation, Florham Park, NJ) . La expresión del AHAS mutado fue impulsada por un promotor de ubiquitina.

Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 3 se utilizó para construir el vector primario RTP1030.

Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 7 se utilizó para construir el vector binario RTP 1095. Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 13 se utilizó para construir el vector binario RSA131. Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 21 se utilizó para construir el vector binario RSA123. Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 25 se utilizó para construir el vector binario RCB987. Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 29 se utilizó para construir el vector binario RTP1169. Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 41 se utilizó para construir el vector binario RSA012. Un fragmento génico correspondiente a la ID SEC NO: 59 se utilizó para construir el vector binario RTP1269.

EJEMPLO 3 BIOENSAYO DE DSRNA DIRIGIDO A LOS GENES DIANA DE H. GLYCINES Para demostrar la expresión del dsRNA y la resistencia a los nemátodos resultantes se empleó un ensayo de explantes de raíz. Los detalles de este ensayo pueden encontrarse en la solicitud copendiente USSN 12/001, 234, el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia. Los vectores binarios RTP1030, RCB987, RSA131, RTP1095, RSA123, RSA012, RTP1169, RTP1269 descritos en el Ejemplo 2 fueron transfectados en la cepa K599 de A. rhizogenes "desarmada", y cotiledones de soya que contienen el extremo proximal de su conexión con las plántulas se utilizaron como el explante para la transformación. De dos a tres semanas después de la inoculación y la inducción de la raíz de acuerdo con el método de USSN 12/001,234, las raices transformadas fueron formadas sobre los extremos cortados de los explantes.

Las raices de soya fueron escindidas de los explantes de raíz, fueron subcultivadas y uno a cinco días después del subcultivo las raíces fueron inoculadas con organismos juveniles J2 de SCN esterilizados, superficiales en placas de múltiples pozos para el ensayo del constructo del gen que interesa. Como testigos se utilizó el vector testigo cultivar Williams 82 de soya y las raices del vector testigo Jack. Cuatro semanas después de la inoculación de los nemátodos, se contaron los quistes de cada pozo. Los resultados del bioensayo para los constructos RTP1030, RCB987, RSA131, RTP1095, RSA123, RSA012, RTP1169 y RTP1269 dieron como resultado múltiples líneas con cuenta reducida de quistes mostrando una tendencia general de cuenta reducida de los quistes sobre muchas de las líneas probadas.

EJEMPLO 4 DESCRIPCIÓN DE HOMÓLOGOS Y MOTIVOS DE LA SECUENCIA DEL DNA Como se describe en el Ejemplo 3, el constructo RTP1095 dio origen a la expresión de una molécula de RNA bicatenaria que se dirige a la ID SEC NO: 5 y da como resultado una cuenta reducida de quistes cuando se liga de manera operante a un promotor constitutivo y se expresa en raices de soya. Como se describe en el Ejemplo 1, la secuencia del transcrito putativo de longitud completa del gen que se describe por la ID SEC NO: 5 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos que se describe como ID SEC NO: 6. La secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 6 se utilizó para identificar genes homólogos. Un gen muestra con DNA y secuencias de aminoácidos homologas a la ID SEC NO: 5 e ID SEC NO: 6, respectivamente, fueron identificados y están descritos por ID SEC NO: 9 e ID SEC NO: 10. El alineamiento de aminoácidos del homólogo identificado para ID SEC NO: 6 se muestra en la Figura 2. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de los aminoácidos del homólogo identificado y la ID SEC NO: 6 se muestran en la Figura 13a. El alineamiento de la secuencia del DNA de la ID SEC NO: 9 homologa identificada para ID SEC NO: 5 se muestra en la Figura 7a-b. Las regiones de alineamiento con alta homología sobre 21 nucleótidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo G en la Figura 7a-b. Las secuencias motivo correspondientes a Motivo A hasta Motivo G están descritas por las ID SEC NOS: 72-78. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de las secuencias del DNA de ID SEC NO: 5 y la ID SEC NO: 9 del homólogo identificado entre si se muestra en la Figura 13b.

Como se describe en el Ejemplo 3, el constructo RSA131 da como resultado la expresión de una molécula de RNA bicatenaria que se dirige a la ID SEC NO: 11 y da como resultado una cuenta reducida de quistes cuando se liga de manera operante a un promotor constitutivo y se expresa en raices de soya. Como está descrito en el Ejemplo 1, la secuencia del transcrito putativo de longitud completa del gen que se describe por la ID SEC NO: 11 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como la ID SEC NO: 12. La secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 12 se utilizó para identificar genes homólogos. Los genes de nemátodos parásitos de plantas con las secuencias de DNA y aminoácidos homologas para la ID SEC NO: 11 e ID SEC NO: 12, respectivamente, fueron identificados y están descritos por las ID SEC NOS: 15-18. El alineamiento de los aminoácidos del homólogo identificado para la ID SEC NO: 12 se muestra en la Figura 3. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de los aminoácidos del homólogo identificado y la ID SEC NO: 6 se muestra en la Figura 13c. El alineamiento de la secuencia del DNA del homólogo identificado descrito por la ID SEC NO: 15 a la ID SEC NO: 11 se muestra en las Figuras 8a-c. Las regiones de alineamiento de alta homología sobre 21 nucleótidos o más -están marcadas como Motivo A hasta Motivo G en las Figuras 8a-c. Las secuencias del motivo correspondiente a Motivo A hasta Motivo F están descritas por las ID SEC NOS: 86-91. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de la secuencia del DNA de ID SEC NO: 11 y los homólogos identificados entre sí se muestra en la Figura 13d.

Como está descrito en el Ejemplo 3, el constructo RTP1 169 da como resultado la expresión de una molécula de RNA bicatenaria que se dirige a las ID SEC NO: 27 e ID SEC NO: 104 y da origen a una cuenta reducida de quistes cuando se liga de manera operante a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de soya. La secuencia descrita por la ID SEC NO: 27 es una secuencia parcial de DNA y no representa la secuencia codificadora de longitud completa del gen asociado. La secuencia de aminoácidos de esta secuencia parcial de DNA está representada por la ID SEC NO: 28. La secuencia putativa de longitud completa del gen asociado descrito por la ID SEC NO: 27 fue derivada utilizando RACE 5' y 3' y está descrito por la ID SEC NO: 104. La secuencia de aminoácidos de la secuencia putativa de longitud completa está descrita por la ID SEC NO: 105. La secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 105 se utilizó para identificar genes homólogos. Los genes de nemátodos parásitos de plantas con las secuencias de DNA y de aminoácidos homologas para ID SEC NO: 104 e ID SEC NO: 105, respectivamente, fueron identificados y están descritos por las ID SEC NOS: 31-38. El alineamiento de los aminoácidos de los homólogos identificados para ID SEC NO: 105 se muestra en la Figura 4. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de los aminoácidos del homólogo identificado y la ID SEC NO: 105 entre si se muestra en la Figura 13e. El alineamiento de la secuencia del DNA de los homólogos identificados a la ID SEC NO: 104 se muestra en la Figura 9a-b. Las regiones del alineamiento de alta homología sobre 21 nucleótidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo D en la Figura 9a-b. Las secuencias motivo correspondientes a Motivo A y Motivo B están descritas por las ID SEC NOS: 92, 93, 106 y 107. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de la secuencia del DNA de ID SEC NO: 104 y los homólogos identificados entre si se muestra en la Figura 13f.

Como está descrito en el Ejemplo 3, el constructo RSA012 da como resultado la expresión de una molécula de RNA bicatenaria que se dirige a la ID SEC NO: 39 y da como resultado una cuenta reducida de quistes cuando se liga de manera operante a un promotor constitutivo y se expresa en raices de soya. Como se describe en el Ejemplo 1, la secuencia del transcrito putativo de longitud completa del gen descrito por la ID SEC NO: 39 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como ID SEC NO: 40. La secuencia de aminoácidos descrita por ID SEC NO: 40 se utilizó para identificar genes homólogos. Los genes de nemátodos parásitos de plantas con secuencias de DNA y de aminoácido homologas para la ID SEC NO: 39 e ID SEC NO: 40, respectivamente, fueron identificados y están descritos por las ID SEC NOS: 43-56. El alineamiento de los aminoácidos de los homólogos identificados para ID SEC NO: 40 se muestra en la Figura 5a-b. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de los aminoácidos del homólogo identificado y la ID SEC NO: 40 entre si se muestra en la Figura 13g. El alineamiento de la secuencia del DNA de los homólogos identificados de ID SEC NO: 39 se muestra en la Figura lOa-e. Las regiones con alineamiento de alta homología sobre 21 nucleotidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo J en la Figura lOa-e. Las secuencias motivo correspondientes al Motivo A hasta Motivo J están descritas por las ID SEC NOS: 94-103. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de la secuencia del DNA de ID SEC NO: 39 y los homólogos identificados entre sí se muestra en la Figura 13h.

Como se describe en el Ejemplo 3, el constructo RTP1269 da como resultado la expresión de una molécula de RNA bicatenaria que se dirige a la ID SEC NO: 57 y da como resultado una cuenta reducida de quistes cuando se liga de manera operante a un promotor constitutivo y se expresa en raíces de soya. Como se describe en el Ejemplo 1, la secuencia del transcrito putativo de longitud completa del gen descrito por la ID SEC NO: 57 contiene un marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos descrita como ID SEC NO: 58. La secuencia de aminoácidos descrita por la ID SEC NO: 58 fue utilizada para identificar genes homólogos. Los genes de nemátodos parásitos de plantas con secuencias de DNA y de aminoácidos homologas para ID SEC NO: 57 e ID SEC NO: 58, respectivamente, fueron identificados y están descritos por las ID SEC NOS: 61-68. El alineamiento de los aminoácidos del homólogo identificado para ID SEC NO: 58 se muestra en la Figura 6a-b. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de los aminoácidos de los homólogos identificados y la ID SEC NO: 58 entre sí se muestra en la Figura 13i. El alineamiento de la secuencia del DNA de los homólogos identificados para ID SEC NO: 57 se muestra en la Figura 11 a-b. Las regiones de alineamiento con alta homología sobre 21 nucleotidos o más están marcadas como Motivo A hasta Motivo G en la Figura lla-b. Las secuencias motivo correspondientes al Motivo A hasta Motivo G están descritas por las ID SEC NOS: 79-85. Una tabla matriz que muestra el porcentaje de identidad de la secuencia del DNA de ID SEC NO: 57 y los homólogos identificados entre sí se muestra en la Figura

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de RNA bicatenaria que contiene: (a) una primera cadena que tiene una secuencia considerablemente idéntica a desde 19 hasta aproximadamente 400 o 500 nucleótidos consecutivos de un gen diana de nemátodo parásito de plantas seleccionado de un grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad reguladora del proteasoma 26S 4 [prs-4) , y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans.

2. El RNA bicatenario de la reivindicación 1, caracterizado porque la primera cadena tiene una secuencia considerablemente idéntica a desde 19 hasta aproximadamente 400 o 500 nucleótidos consecutivos de un gen diana que tiene una secuencia seleccionada del grupo de ID SEC NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 104, 29, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 57, 59, 61, 63, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 106 o 107, y (b) una segunda cadena que tiene una secuencia considerablemente complementaria a la primera cadena.

3. Un pool de moléculas de RNA bicatenario que contiene una multiplicidad de moléculas de RNA interferente cortas cada una conteniendo una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde las moléculas de RNA se derivan de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 (prs-4) , y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans.

4. El pool de moléculas de RNA bicatenario de la reivindicación 3, caracterizado porque las moléculas de RNA se obtienen del polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 1 y 3; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 y 91; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 19 y 21; (e) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 23 y 25; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 104, 27, 29, 35, 37, 92, 93, 106 y 107; (g) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 y 103; (h) un polinucleótido que comrende una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 y 85.

5. Una planta transgénica resistente a la infección por nemátodos parásitos, la planta contiene un constructo de ácido nucleico que codifica un dsRNA con capacidad para disminuir específicamente la expresión de un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta [pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 {prs-4) , o un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans .

6. La planta transgénica de la reivindicación 5, caracterizada porque el dsRNA se dirige a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 1 y 3; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 y 91; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NO: 19 y 21; (e) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 23 y 25; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 104, 27, 29, 35, 37, 92, 93, 106 y 107; (g) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en las ID SEC NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 y 103; (h) un polinucleótido que comprende una secuencia como se establece en las ID SEC NOS: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 y 85.

7. Una planta transgénica que puede expresar un pool de moléculas de dsRNA, caracterizada porque cada molécula de dsRNA contiene una región bicatenaria que tiene una longitud de 19-24 nucleótidos, y en donde las moléculas de RNA se obtienen de polinucleótidos considerablemente idénticos a una porción de un gen diana de un nemátodo parásito seleccionado del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 (prs-4) , o un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans.

8. La planta transgénica de la reivindicación 7, caracterizada porque el pool de dsRNA se dirige a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 1 y 3; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 y 91; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 19 y 21; (e) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 23 y 25; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 104, 27, 29, 35, 37, 92, 93, 106 y 107; (g) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 y 103; (h) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 y 85.

9. Un método para preparar una planta transgénica con capacidad de expresar un dsRNA que sea considerablemente idéntico a un gen diana de un nemátodo parásito, el método comprende los pasos de: (a) seleccionar un gen diana del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta (pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 [prs-4) , y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans; (b) preparar una secuencia de ácido nucleico que contenga una región que sea considerablemente idéntica a una parte del gen diana seleccionado, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcrito bicatenario una vez expresado en la planta; (c) transformar una planta recipiendaria con el ácido nucleico; (d) producir uno o más retoños transgénicos de la planta recipiendaria; y (e) seleccionar los retoños para resistencia a nemátodos.

10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el dsRNA se dirige a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 1 y 3; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 y 91; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 19 y 21; (e) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 23 y 25; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 104, 27, 29, 35, 37, 92, 93, 106 y 107; (g) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 y 103; (h) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 y 85.

11. Un método para conferir resistencia a los nemátodos a una planta, el método comprende los pasos de: (a) seleccionar un gen diana del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta {pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 {prs-4) , y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans; (b) preparar una secuencia de ácido nucleico que contenga una región que sea considerablemente idéntica a una parte del gen diana seleccionado, en donde el ácido nucleico pueda formar un transcrito bicatenario una vez expresado en la planta; (c) transformar una planta recipiendaria con el ácido nucleico; (d) producir uno o más retoños transgénicos de la planta recipiendaria; y (e) seleccionar el retoño para resistencia a nemátodos.

12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el gen diana es un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 1 y 3; (b) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78; (c) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 y 91; (d) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 19 y 21; (e) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 23 y 25; (f) un polinucleotido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 104, 27, 29, 35, 37, 92, 93, 106 y 107; (g) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 y 103; (h) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 y 85.

13. Un cásete de expresión que contiene una secuencia considerablemente idéntica a una porción de un gen diana de nemátodo parásito de plantas seleccionado del grupo que consiste en un gen tipo innexin de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad pequeña de polimerasa delta {pol delta S) , un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen tcp-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen pas-1 de C. elegans, un gen tipo snurportin-1 de nemátodo parásito, un gen de nemátodo parásito homólogo para el gen rpt-1 de C. elegans, un gen de nemátodo parásito que codifica una subunidad reguladora de proteasoma 26S 4 (prs-4) , y un gen de nemátodo parásito homólogo para un gen rpn-5 de C. elegans; (b) preparar una secuencia de ácido nucleico que contenga una región que sea considerablemente idéntica a una parte del gen diana seleccionado, en donde el ácido nucleico pueda formar un transcrito bicatenario una vez expresado en la planta; (c) transformar una planta recipiendaria con el ácido nucleico; (d) producir uno o más retoños transgénicos de la planta recipiendaria; y (e) seleccionar el retoño para resistencia a nemátodos.

14. El cásete de expresión de la reivindicación 13, caracterizado porque el gen diana es un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 1 y 3; (b) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 5, 7, 9, 72, 73, 74, 75, 76, 77 y 78; (c) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 11, 13, 15, 86, 87, 88, 89, 90 y 91; (d) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 19 y 21; (e) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 23 y 25; (f) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 104, 27, 29, 35, 37, 92, 93, 106 y 107; (g) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 y 103; (h) un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en la ID SEC NO: 57, 59, 61, 63, 79, 80, 81, 82, 83, 84 y 85. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones de RNA bicatenario y plantas transgénicas que pueden inhibir la expresión de genes esenciales en nemátodos parásitos, y los métodos asociados con estas. Específicamente, la invención se refiere al uso de RNA de interferencia para inhibir la expresión de un gen esencial diana de nemátodos, el cual es un gen tipo innexin, pas-1, tcp-1, tipo snurportin-i , pol delta S, prs-4, rtp-1 o rpn-5 de nemátodos, y se refiere a la producción de plantas que tienen resistencia aumentada a nemátodos parásitos.