ES2373614T3 - Composiciones y métodos que utilizan interferencia de arn de tipo cdpk para el control de nemátodos. - Google Patents

Abstract

Un método para conferir resistencia a los nematodos a una planta, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar un ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que tiene una región que es absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario de una porción de un gen como el CDPK una vez expresado en la planta; b) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; c) producir uno o más descendientes transgénicos de dicha planta receptora; y d) seleccionar la descendencia para resistencia a los nemátodos; en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de: a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.

Description

Composiciones y métodos que utilizan interferencia de ARN de tipo CDPK para el control de nematodos.

El campo de esta invención es el control de nemátodos, en particular con el control de nematodos formadores de quistes de la soja. La invención también se relaciona con la introducción de material genético dentro de plantas que son susceptibles a nemátodos con el propósito de incrementar la resistencia a los nemátodos.

Los nemátodos son lombrices microscópicas que se alimentan sobre las raíces, hojas y tallos de más de 2.000 cultivos en hilera, vegetales, frutas, y plantas ornamentales, provocando una pérdida de cultivos estimada en $100 mil millones en todo el mundo. Una variedad de especies de nemátodos parásitos, incluidos nemátodos de los nudos de la raíz (RKN), nematodos formadores de quistes y de lesiones. Los nematodos de los nudos de la raíz, que se caracterizan por causar la formación de agallas en la raíz en los sitios de alimentación, tienen una gama de huéspedes relativamente amplia y son por lo tanto patógenos sobre un gran número de especies de cultivo. Las especies de nemátodos formadoras de quistes y de lesiones tienen una gama de huéspedes más limitada, pero aún provocan pérdidas considerables en cultivos susceptibles.

Los nematodos patógenos están presentes a todo lo largo de los Estados Unidos, presentándose las mayores concentraciones en las regiones húmedas y cálidas del Sur y del Oeste y en suelos arenosos. Los nematodos formadores de quistes de la soja (Heterodera glycines), la plaga más seria de las plantas de la soja, fue descubierta primero en los Estados Unidos en Carolina del Norte en 1954. Algunas áreas están tan fuertemente infestadas por el nematodo formador de quistes de la soja (SCN) que la producción de soja no es económicamente factible sin medidas de control. Aunque la soja es el principal cultivo económico atacado por el SCN, el SCN parasita algunos cincuenta huéspedes en total, incluidos cultivos de campo, vegetales, ornamentales, y malas hierbas.

Los signos de daño por nemátodos incluyen retraso en el crecimiento y amarillamiento de hoja, y marchitamiento de las plantas durante períodos cálidos. Sin embargo, la infestación por nemátodos puede provocar pérdidas significativas en productividad sin síntomas de enfermedad obvios por encima del suelo. Las causas primarias de reducción en productividad son debidas a daño de las raíces por debajo del suelo. Las raíces infectadas por SCN son enanas o con retraso en el crecimiento. La infestación por nemátodos infestación también puede disminuir el número de nódulos que fijan nitrógeno sobre las raíces, y pueden volver a las raíces más susceptibles a los ataques por otros patógenos de la planta transmitidos por el suelo.

El ciclo de vida de los nemátodos tiene tres etapas principales: embrionaria, juvenil, y adulta. El ciclo de vida varía entre las especies de nemátodos. Por ejemplo, el ciclo de vida del SCN usualmente se puede completar en 24 a 30 días bajo condiciones óptimas mientras que en otras especies puede tomar tanto como un año, o más, para completar el ciclo de vida. Cuando los niveles de temperatura y de humedad se tornan favorables en la primavera, eclosionan gusanos juveniles de los embriones en el suelo. Únicamente nemátodos en etapa de desarrollo juvenil son capaces de infectar raíces de soja.

El ciclo de vida de los SCN ha sido sometido a muchos estudios, y como tales son un ejemplo útil para comprender el ciclo de vida del nemátodo. Después de penetrar las raíces de soja, los SCN juveniles se mueven a través de la raíz hasta que hacen contacto con el tejido vascular, en cuyo momento dejan de migrar y empiezan alimentarse. Con un estilete, el nemátodo inyecta secreciones que modifican ciertas células de la raíz y las transforma en sitios de alimentación especializados. Las células de la raíz son morfológicamente transformadas en grandes sincitios multinucleados (o células gigantes en el caso de RKN), que son utilizados como una fuente de nutrientes para los nemátodos. Los nemátodos que se alimentan activamente roban por lo tanto nutrientes esenciales de la planta lo que resulta en pérdida de productividad. A medida que los nemátodos hembra se alimentan, se hinchan y eventualmente se hacen tan grandes que sus cuerpos atraviesan el tejido de la raíz y quedan expuestos sobre la superficie de la misma.

Después de un período de alimentación, los nematodos SCN, que no están hinchados como los adultos, migran fuera de la raíz hacia el suelo y fertilizan a las hembras adultas agrandadas. Los machos mueren luego, mientras que las hembras permanecen unidas al sistema de la raíz y continúan alimentándose. Los embriones en las hembras hinchadas comienzan a desarrollarse, inicialmente en una masa o saco embrionario por fuera del cuerpo, y posteriormente dentro de la cavidad corporal del nemátodo. Eventualmente la cavidad entera del cuerpo de la hembra adulta se llena con embriones, y el nemátodo muere. Es al cuerpo lleno de embriones de la hembra muerta al que se denomina como el quiste. Los quistes eventualmente son desalojados y se encuentran libres en el suelo. Las paredes del quiste se hacen muy duras, proporcionan una excelente protección para los aproximadamente 200 a 400 embriones contenidos dentro. Los embriones del SCN sobreviven dentro del quiste hasta que se presenten condicione apropiadas para eclosionar. Aunque muchos de los embriones pueden eclosionar dentro del primer año, muchos sobrevivirán también dentro de los quistes protectores durante varios años.

Un nemátodo puede moverse a través del suelo únicamente unas pocas pulgadas por año por sus propios medios. Sin embargo, la infestación por nemátodos puede recorrer grandes distancias en una variedad de formas. Cualquier cosa que pueda mover el suelo infestado es capaz de esparcir la infestación, incluida la maquinaria agrícola, vehículos y herramientas, viento, agua, animales, y los trabajadores agrícolas. Las partículas del suelo del tamaño de las semillas a menudo contaminan las semillas cosechadas. En consecuencia, se puede esparcir la infestación con nemátodos cuando se planta semilla contaminada de campos infestados en campos no infestados. Existe incluso evidencia de que ciertas especies de nemátodos pueden ser esparcidas por los pájaros. Solamente algunas de estas causas pueden ser impedidas.

Las prácticas tradicionales para manejar la infestación por nemátodos incluyen: el mantenimiento apropiado de los nutrientes del suelo y los niveles de pH del suelo en una tierra infestada de nemátodos; el control de otras enfermedades de las plantas, así como plagas de insectos y de mala hierba; el uso de prácticas sanitarias tales como el arado, la plantación, y el cultivo de campos infestados por nemátodos únicamente después de trabajar los campos no infestados; la limpieza completa del equipo con agua o vapor a alta presión después de trabajar en campos infestados; no utilizar semilla que se desarrolló sobre tierra infestada para la plantación de campos no infestados a menos que la semilla haya sido limpiada adecuadamente; la rotación de campos infestados y la alternación de cultivos huéspedes con cultivos no huéspedes; el uso de nematicidas; y la plantación de variedades de plantas resistentes.

Se han propuesto métodos para la transformación genética de plantas con el propósito de conferir mayor resistencia a los nematodos que parasitan las plantas. Las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.589.622 y 5.824.876 están dirigidas a la identificación de genes de plantas expresados específicamente en o en forma adyacente al sitio de alimentación de la planta después de fijación por el nemátodo. Los promotores de estos genes objetivo de la planta pueden ser luego utilizados para dirigir la expresión específica de proteínas o enzimas perjudiciales, o la expresión de ARN antisentido al gen objetivo o a los genes celulares en general. Los promotores de la planta pueden ser utilizados también para conferir resistencia a los nemátodos específicamente en el sitio de alimentación transformando la planta con una construcción que contiene al promotor del gen objetivo de la planta enlazado a un gen cuyo producto induce letalidad en el nemátodo después de ingestión.

Recientemente, la interferencia de RNA (ARNi), también denominada como silenciamiento génico, ha sido propuesta como un método para controlar nemátodos. Cuando se introduce ARN bicatenario (ARNds) que corresponde esencialmente a la secuencia de un gen objetivo o ARNm en una célula, se inhibe la expresión del gen objetivo (Ver por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.506.559). La patente de los estados Unidos No. 6.506.559 demuestra la efectividad del ARNi contra genes conocidos en Caenorhabditis elegans, pero no demuestra la utilidad del ARNi para controlar los nematodos que parasitan la planta.

Se ha propuesto el uso de ARNi para apuntar a los genes esenciales del nemátodo, por ejemplo, en la Publicación PCT WO 01/96584, WO 01/17654, US 2004/0098761, US 2005/0091713, US 2005/0188438, US 2006/0037101, US 2006/0080749, US 2007/0199100, y US 2007/0250947.

Se han propuesto una cantidad de modelos para la acción del ARNi. En sistemas de mamíferos, los ARNds mayores a 30 nucleótidos activan la inducción de la síntesis de interferón y una suspensión global de la síntesis de proteína, en una forma no específica de la secuencia. Sin embargo, la patente de los Estados Unidos No. 6.506.559 divulga que en los nemátodos, la longitud del ARNds correspondiente a la secuencia del gen objetivo puede tener al menos 25, 50, 100, 200, 300, ó 400 bases, e inclusive que los ARNds mayores fueron también efectivos en la inducción de ARNi en C. elegans. Se sabe que cuando las construcciones de horquillas de ARN que contienen regiones bicatenarias en el rango de 98 a 854 nucleótidos fueron transformadas en una cantidad de especies de plantas, se silenciaron eficientemente los genes de la planta objetivo. Existe un acuerdo general de que en muchos organismos, incluidos nemátodos y plantas, se escinden grandes pedazos de ARNds en fragmentos de aproximadamente 19 - 24 nucleótidos (ARNsi) dentro de las células, y que estos ARNsi son los mediadores reales del fenómeno del ARNi.

Las diferentes proteína quinasas que dependen del calcio (CDPK) en las plantas median una variedad de respuestas al medio ambiente. Se demostró que una CDPK específica en Medicago truncatula (CDPK1) era necesaria para la formación de interacciones simbióticas entre plantas y Rhizobia y hongos micorrícicos (ver Ivashuta et al., (2005) Plant Cell 17: 2911 - 2921). Ivashuta et al. sugiere que la CDPK1 está involucrada en la expansión y/o la síntesis de la pared celular.

Aunque se han hecho numerosos esfuerzos para utilizar ARNi para controlar los nemátodos que parasitan las plantas, hasta la fecha no se ha desregulado en ningún país las plantas transgénicas resistentes a los nemátodos. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar composiciones y métodos efectivos y seguros para el control de los nematodos que parasitan las plantas utilizando ARNi, y para la producción de plantas que tengan mayor resistencia a los nematodos que parasitan las plantas.

Los presentes inventores han descubierto que la reducción de la expresión de las proteína quinasas que dependen del calcio (las CDPK o los genes tipo CDPL), ejemplificadas por el ADNc de G. max denominado como 49806575, confiere resistencia a los nemátodos que parasitan las plantas. Esta reducción de la expresión se puede lograr utilizando ARNi que apunta a genes tales como CDPK.

La invención provee las modalidades caracterizadas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

La presente invención puede ser entendida más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los ejemplos incluidos allí. A menos que se determine otra cosa, los términos utilizados aquí deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por parte de aquellos ordinariamente capacitados en la técnica pertinente. Además de las definiciones de términos suministradas más adelante, se pueden encontrar definiciones de términos comunes en biología molecular en Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer-Verlag; y en Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, una colaboración empresarial entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (1998 Suplemento). Debe entenderse que como se lo utiliza en la especificación y en las reivindicaciones, "uno" o "una" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el cual se lo utilice. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar al menos una célula. Debe entenderse que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de describir modalidades específicas únicamente y no pretende constituirse en limitante.

A través de esta solicitud, se hace referencia a diferentes publicaciones de patente de la literatura. Las divulgaciones de todas estas publicaciones y de aquellas referencias citadas dentro de esas publicaciones son incorporadas aquí en su totalidad como referencia en esta solicitud con el propósito de describir más completamente el estado del arte al cual pertenece esta invención.

Un "gen como el CDPK" de una planta es definido aquí como un gen que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polinucleótido 49806575 que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, que es el gen como el CDPK de G. max. De acuerdo con la invención, los genes tipo CDPK incluyen a los genes que tienen secuencias tales como aquella expuesta en la SEQ ID NO: 2 que son homólogas del gen como el CDPK de G. max. Los genes tipo CDPK definidos aquí codifican polipéptidos que tienen al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido parcial tipo CDKP de G. max que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3. Tales polipéptidos incluyen a los polipéptidos tipo CDPK que tienen las secuencias expuestas en la SEQ ID Nos: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27.

Se pueden aislar genes adicionales tipo CDPK (homólogos del gen como el CDPK) de plantas diferentes a la soja utilizando la información suministrada aquí y las técnicas conocidas por aquellos capacitados en el arte de la biotecnología. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de una planta que hibrida bajo condiciones rigurosas al ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 puede ser aislada de bibliotecas de ADNc de tejido vegetal. Alternativamente, se puede aislar ARNm de células vegetales (por ejemplo, por medio del procedimiento de extracción de tiocianato de guanidina de Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294 - 5299), y se puede preparar ADNc utilizando transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa del MLV de Moloney, que puede ser adquirida de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa del AMV, que puede ser adquirida de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los iniciadores de oligonucleótidos sintéticos para amplificación por reacción en cadena de la polimerasa pueden ser diseñados con base en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Se pueden diseñar iniciadores adicionales de oligonucleótido que se basen en las secuencias de los genes tipo CDPK que tienen secuencias como las expuestas en la SEQ ID NO: 2. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a los genes objetivo tipo CDPK definidos aquí pueden ser amplificados utilizando ADNc o, alternativamente, ADN genómico, como molde e iniciadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR. Las moléculas de ácido nucleico así amplificadas pueden ser clonadas en vectores apropiados y caracterizadas por medio de análisis de secuencia de ADN.

Como se lo utiliza aquí, "ARNi" o "interferencia de ARN" se refiere al proceso de silenciamiento génico posttranscripcional específico de la secuencia en plantas, mediado por ARN bicatenario (ARNds). Como se lo utiliza aquí, "ARNds" se refiere a RNA que es parcial o completamente bicatenario. El ARN bicatenario es también denominado como ARN de interferencia corta o pequeña (ARNsi), ácido nucleico de interferencia corta (NAsi), ARN de interferencia corta, micro-ARN (ARNmi), y similares. En el proceso del ARNi, se introducen el ARNds que contiene una primera cadena que es sustancialmente idéntica a una porción de un gen objetivo por ejemplo un gen como el CDPK y una segunda cadena que es complementaria a la primera cadena en una planta. Después de la introducción en la planta, se procesa el ARNds específico del gen objetivo en fragmentos relativamente pequeños (los ARNsi) y pueden posteriormente llegar a ser distribuidos a través de la planta, lo que conduce a una mutación con pérdida de la función que tiene un fenotipo que, durante el período de una generación, puede llegar a asemejarse al fenotipo que surge de una supresión parcial o completa del gen objetivo. Alternativamente, el ARNds específico del gen objetivo está operativamente asociado con un elemento regulador o promotor que resulta en la expresión del ARNds en un tejido, de manera temporal, espacial o inducible y puede además ser procesado en fragmentos relativamente pequeños por una célula de una planta que contiene la maquinaria de procesamiento del ARNi, y se obtiene el fenotipo de pérdida de la función. También, el elemento regulador o promotor puede dirigir preferencialmente la expresión a las raíces o sincitios o a células gigantes donde los ARNds pueden ser expresados ya sea constitutivamente en esos tejidos o después de inducción por medio de la alimentación del nemátodo o nemátodo juvenil, por ejemplo los nemátodos J2.

Como se lo utiliza aquí, teniendo en cuenta la sustitución de uracilo por timina cuando se comparan las secuencias de ARN y ADN, el término "sustancialmente idéntico" como se lo aplica al ARNds significa que la secuencia de nucleótidos de una cadena de los ARNds es aproximadamente al menos del 80% - 90% idéntica a 20 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo, más preferiblemente, aproximadamente al menos 90 - 95% idéntica a 20 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo, y lo más preferiblemente aproximadamente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica o absolutamente idéntica a 20 o más nucleótidos contiguos del gen objetivo. 20 o más nucleótidos significa una porción, que tiene aproximadamente al menos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, bases consecutivas o hasta la longitud completa del gen objetivo.

Como se lo utiliza aquí, polinucleótidos "complementarios" son aquellos que son capaces de apareamiento de bases de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Específicamente, las purinas se aparearán con pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada ya sea con timina (A:T) en el caso del ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso del ARN. Se entiende que dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí incluso si no son completamente complementaros entre sí, siempre y cuando cada uno tenga al menos una región que sea sustancialmente complementaria a la otra. Como se lo utiliza aquí, el término "sustancialmente complementaria" significa que dos secuencias de ácido nucleico son complementarias al menos en un 80% de sus nucleótidos. Preferiblemente, las dos secuencias de ácido nucleico son complementarias en al menos un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más o en todos sus nucleótidos. Alternativamente, "sustancialmente complementaria" significa que dos secuencias de ácido nucleico pueden hibridar bajo condiciones altamente restrictivas. Como se lo utiliza aquí, el término "sustancialmente idéntica" o "correspondiente a" significa que dos secuencias de ácido nucleico tienen al menos 80% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las dos secuencias de ácido nucleico tienen al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia.

También como se los utiliza aquí, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren a ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Cuando se produce ARNds en forma sintética, las bases menos comunes, tales como inosina, 5metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras pueden también ser utilizadas para el apareamiento de ribozima y de ARNds antisentido. Por ejemplo, polinucleótidos que contienen análogos de propino C-5 de uridina y de citidina han demostrado que enlazan ARN con alta afinidad y que son potentes inhibidores antisentido de expresión génica. También pueden hacerse otras modificaciones, tales como la modificación a la columna vertebral fosfodiéster, o al 2’-hidroxi en el grupo de azúcar de la ribosa del ARN.

Como se lo utiliza aquí, el término "control," cuando se lo utiliza en el contexto de una infección, se refiere a la reducción o prevención de una infección. La reducción o prevención de una infección por parte de un nemátodo provocará que una planta tenga mayor resistencia al nemátodo, Sin embargo, tal mayor resistencia no implica que la planta necesariamente tenga 100% de resistencia a la infección. En modalidades preferidas, la resistencia a la infección por parte de un nemátodo en una planta resistente es mayor al 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% en comparación con una planta de tipo silvestre que no sea resistente a los nemátodos. Preferiblemente la planta de tipo silvestre es una planta de un genotipo similar, más preferiblemente idéntico al de la planta que tiene mayor resistencia al nemátodo, pero no contiene un ARNds dirigido al gen objetivo. La resistencia de la planta a la infección por el nemátodo puede ser debida a la muerte, esterilidad, detención del desarrollo, o movilidad reducida del nemátodo después de exposición a la planta que contiene ARNds específicos para un gen esencial para el desarrollo o mantenimiento de un sitio funcional de alimentación, sincitios, o células gigantes. El término "resistente a infección por nemátodo" o "una planta que tiene resistencia a los nemátodos" como se los utiliza aquí se refieren a la capacidad de una planta, comparada con una planta de tipo silvestre, para evitar una infección por nemátodos, para matar nemátodos o para obstaculizar, reducir o detener el desarrollo, crecimiento o multiplicación de nemátodos. Esto se puede lograr por medio de un proceso activo, por ejemplo por medio de la producción de una sustancia perjudicial para el nemátodo, o por medio de un proceso pasivo, como el que tiene un valor nutricional reducido para el nemátodo o estructuras que no se desarrollan inducidas por el sitio de alimentación del nemátodo como sincitios o células gigantes. El nivel de resistencia al nemátodo resistencia de una planta se puede determinar en diferentes formas, por ejemplo por medio del recuento de los nemátodos que son capaces de establecer parasitismo sobre esa planta, o la medición de los tiempos de desarrollo de los nemátodos, la proporción de nemátodos macho y hembra o, por nemátodos formadores de quistes, el recuento del número de quistes o de embriones de nemátodos producidos sobre las raíces de una planta infectada o sistema de ensayo de la planta.

El término "planta" tiene por objeto abarcar plantas en cualquier etapa de maduración o desarrollo, así como cualquier tejido u órgano (partes de la planta) tomado o derivado de cualquiera de tales plantas a menos que se especifique otra cosa claramente indicada por el contexto. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, tallos, raíces, flores, óvulos, estambres, semillas, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, cultivos de antera, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas, protoplastos, cultivos de raíces vellosas, cultivos de explantes con raíces y similares. La presente invención también incluye semillas producidas por las plantas de la presente invención. En una modalidad, las semillas son líneas genéticamente puras para una mayor resistencia a la infección por nemátodos comparadas con una variedad de tipo silvestre de la semilla de la planta. Como se lo utiliza aquí, una "célula de una planta" incluye, pero no se limita a, un protoplasto, célula productora de gametos, y una célula que se regenera en una planta completa. El cultivo de tejido de diferentes tejidos de plantas y la regeneración de plantas a partir de los mismos es bien conocido en el arte y está ampliamente publicado.

Como se lo utiliza aquí, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula de la planta, callo, tejido de la planta, o parte de la planta que contiene todo o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante integrado en forma estable dentro de un cromosoma o elemento extracromosómico estable, de modo que sea pasado a sucesivas generaciones. Para los propósitos de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reordenado, o modificado por medio de ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, o polinucleótidos, que estén enlazados o unidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que resulten de eventos de origen natural, tales como mutaciones espontáneas, o de mutagénesis no espontanea seguida por fitomejoramiento selectivo.

Como se lo utiliza aquí, el término "cantidad suficiente para inhibir la expresión" se refiere a una concentración o cantidad del ARNds que sea suficiente para reducir los niveles o la estabilidad del ARNm o proteína producida a partir de un gen objetivo en una planta. Como se lo utiliza aquí, "inhibición de la expresión" se refiere a la ausencia o disminución observable en el nivel de proteína y/o producto de ARNm de un gen objetivo. La inhibición de la expresión de un gen objetivo puede ser letal para el nematodo parásito ya sea directa o indirectamente a través de la modificación o erradicación del sitio de alimentación, sincitios, o célula gigante, o tal inhibición puede retrasar o evitar la entrada en una etapa particular de desarrollo (por ejemplo, metamorfosis), si el acceso a un sitio de alimentación completamente funcional, sincitios, o célula gigante está asociado con una etapa particular del ciclo de vida del nematodo parásito. Las consecuencias de la inhibición pueden ser confirmadas por medio del examen de la raíz de la planta para la reducción o eliminación de quistes u otras propiedades del nemátodo o infestación por nemátodos (como se presenta más adelante en el Ejemplo 2).

De acuerdo con la invención, una planta se transforma con un ácido nucleico o un ARNds, que específicamente inhibe la expresión de un gen objetivo (gen como el CDPK) en la planta que es esencial para el desarrollo o mantenimiento de un sitio de alimentación, sincitios, o células gigante; afectando finalmente la supervivencia, metamorfosis, o reproducción del nemátodo. En una modalidad, el ARNds es codificado por un vector que ha sido transformado en un ancestro de la planta infectada. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que expresa dicho ARNds está bajo el control transcripcional de un promotor específico de la raíz o un promotor específico de la célula para alimentación del nemátodo parásito o un promotor inducible por el nemátodo.

Por lo tanto, el ARNds referido de acuerdo con la invención comprende una primera cadena que es sustancialmente idéntica a una porción de un gen como el CDPK tal como el ADNc 49806575 de soja, y una segunda cadena que es sustancialmente complementaria a la primera cadena. El gen objetivo se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; (b) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, ó 2. La longitud de las secuencias de nucleótidos bicatenarios sustancialmente idénticos pueden ser aproximadamente al menos 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, bases consecutivas o hasta la longitud completa del gen como el CDPK. En una modalidad preferida, la longitud de la secuencia bicatenaria de nucleótidos es de aproximadamente 19 hasta aproximadamente 200 - 500 nucleótidos consecutivos de longitud. En otra modalidad preferida, el ARNds es sustancialmente idéntico o es idéntico a las bases 1 a 320 de la SEQ ID NO: 2.

Como se discutió anteriormente, los fragmentos de ARNds aproximadamente superiores a 19 - 24 nucleótidos de longitud son escindidos intracelularmente por nemátodos y plantas a los ARNsi de aproximadamente 19 - 24 nucleótidos de longitud, y estos ARNsi son los reales mediadores del fenómeno del ARNi. La tabla en las Figuras 51

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5g expone ejemplos de 21 mers de los genes como el CDPK definidos aquí. Esta tabla puede ser utilizada también para calcular los 19, 20, 22, 23 o 24 mers por medio de adición o sustracción del número apropiado de nucleótidos de cada 21 mer. De este modo el ARNds puede estar en el rango de longitud de aproximadamente 19 nucleótidos hasta aproximadamente 320 nucleótidos. Preferiblemente, el ARNds de la invención tiene una longitud e aproximadamente 21 nucleótidos hasta aproximadamente 600 nucleótidos. Más preferiblemente, el ARNds tiene una longitud de aproximadamente 21 nucleótidos hasta aproximadamente 500 nucleótidos, o aproximadamente desde 21 nucleótidos hasta aproximadamente 400 nucleótidos.

Como se divulga aquí, no se requiere una identidad de secuencia del 100% entre el ARNds y el gen objetivo para practicar la presente invención. Aunque se prefiere para la inhibición un ARNds que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a una porción del gen como el CDPK, la invención puede tolerar variaciones de secuencia que pueden ser esperadas debido a manipulación génica o síntesis, mutación genética, polimorfismo de cadena, o divergencia evolucionaria. Por lo tanto los ARNds de la invención también abarcan los ARNds que contienen una falta de coincidencia con el gen objetivo de al menos 1, 2, o más nucleótidos. Por ejemplo, se contempla en la presente invención que las secuencias de ARNds de 21 mer ejemplificadas en las Figuras 5a-5g pueden contener una adición, supresión o sustitución de 1, 2, o más nucleótidos, siempre y cuando la secuencia resultante aún interfiera con la función de un gen como el CDPK.

La identidad de secuencia entre los ARNds de la invención y los genes objetivo como el CDPK puede ser optimizada por medio de comparación de secuencias y algoritmos de alineación conocidos en el arte (ver Gribskov y Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, y las referencias citadas allí) y calculando la diferencia en porcentaje entre las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, por medio del algoritmo de Smith-Waterman como el implementado en el programa de software BESTFIT utilizando parámetros predeterminados (por ejemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group). Se prefiere una identidad de secuencia superior al 80%, una identidad de secuencia superior al 90%, o incluso una identidad de secuencia del 100%, entre el ARN inhibitorio y la porción del gen objetivo. Alternativamente, la región dúplex del ARN puede ser definido funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con una porción del transcripto del gen objetivo bajo condiciones rigurosas (por ejemplo, NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, hibridación a 60°C durante 12 - 16 horas; seguido por lavado a 65°C con SDS al 0,1% y SSC al 0,1% aproximadamente durante 15 - 60 minutos).

Cuando el ARNds tiene una longitud aproximadamente mayor a 21 nucleótidos, por ejemplo aproximadamente de 50 nucleótidos hasta aproximadamente 1000 nucleótidos, se escindirá en forma aleatoria hasta los ARNds de aproximadamente 21 nucleótidos dentro de la planta o las células del nemátodo parasitario, los ARNsi. La escisión de un ARNds más largo de la invención producirá una reserva de los ARNds de aproximadamente 21 mer (en el rango aproximadamente desde 19 mers hasta aproximadamente 24 mers), derivada del ARNds más largo. Esta reserva de ARNds de aproximadamente 21 mer está también incluida dentro del alcance de la presente invención, ya sea generada en forma intracelular dentro de la planta o el nemátodo o en forma sintética utilizando métodos conocidos de síntesis de oligonucleótidos.

Los ARNsi aplicados de acuerdo con la invención tienen secuencias correspondientes a fragmentos de aproximadamente 19 - 24 nucleótidos contiguos a través de la secuencia completa de un gen objetivo como el CDPK. Por ejemplo, una reserva de tales ARNsi derivados de un gen como el CDPK como se expone en la SEQ ID NO: 1, ó 2, puede incluir una multiplicidad de moléculas de ARN que se seleccionan del grupo que consiste de oligonucleótidos sustancialmente idénticos a los nucleótidos de 21 mer de la SEQ ID NO: 1, ó 2, encontrados en las Figuras 5a - 5g. Una reserva de ARNsi derivados de un gen objetivo como el CDPK de la SEQ ID NO: 1 puede contener también cualquier combinación de las moléculas específicas de ARN que tienen cualquiera de las 21 secuencias contiguas de nucleótidos derivadas de SEQ ID NO: 1 expuestas en las Figuras 5a - 5g. Además, como se señaló anteriormente, múltiples Dicers especializadas en plantas generan los ARNsi típicamente en un rango de tamaño de 19 nt a 24 nt (Ver Henderson et al., 2006. Nature Genetics 38: 721 - 725.). Los ARNsi pueden estar en el rango aproximadamente desde 19 secuencias contiguas de nucleótidos hasta aproximadamente 24 secuencias contiguas de nucleótidos. En forma similar, una reserva de ARNsi puede incluir una multiplicidad de moléculas de ARN que tienen cualquiera de las aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, ó 24 secuencias contiguas de nucleótidos derivadas de la SEQ ID NO: 1, ó 2. Alternativamente, la reserva de ARNsi puede incluir una multiplicidad de moléculas de ARN que tienen una combinación de cualquiera de las aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23, y/o 24 secuencias contiguas de nucleótidos derivadas de la SEQ ID NO: 1.

El ARNds mencionado anteriormente de acuerdo con la invención puede incluir opcionalmente una proyección monocatenaria en uno cualquiera o en ambos extremos. La estructura bicatenaria puede estar formada por una sola cadena de ARN autocomplementaria (es decir, formando un bucle en horquilla) o dos cadenas complementarias de ARN. La formación del dúplex de ARN se puede iniciar ya sea dentro o fuera de la célula. Cuando el ARNds forma un bucle en horquilla, puede incluir opcionalmente un intrón, como se expone en US 2003/0180945A1 o un espaciador nucleótido, que es un tramo de secuencia entre las cadenas complementarias de ARN para estabilizar al transgén en forma de horquilla en las células. Los métodos para elaborar diferentes moléculas de ARNds están expuestos, por ejemplo, en WO 99/53050 y en la patente de los Estados Unidos No. 6.506,559. El ARN puede ser introducido en una cantidad que permita el suministro de al menos una copia por célula. Dosis mayores de material bicatenario pueden producir una inhibición más efectiva.

También se divulga aquí un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds como se describió anteriormente, en donde la expresión del vector en una célula de una planta huésped da como resultado una mayor resistencia a un nemátodo parásito comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula de la planta huésped. Como se lo utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula de una planta huésped dentro de la cual son introducidos. Otros vectores son integrados dentro del genoma de una célula de una planta huésped por medio de la introducción en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los cuales están operativamente enlazados. Tales vectores son denominados aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente especificación, se pueden utilizar indistintamente "plásmido" y "vector" ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, virus X de la patata, virus cascabel del tabaco, y Geminivirus), que cumple funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante incluyen un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula de la planta huésped, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, por ejemplo promotores, seleccionados con base en las células de la planta huésped que son utilizadas para expresión, que están operativamente enlazados a la secuencia de ácido nucleico que es expresada. Con respecto a un vector de expresión recombinante, los términos "operativamente enlazado" y "en asociación operativa" son intercambiables y pretenden dar a entender que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) en una forma que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en una célula de una planta huésped cuando el vector es introducido en la célula de la planta huésped). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, reforzadores, y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick y Thompson, Capítulo 7, 89 - 108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluidas las referencias citadas allí. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Se apreciará por parte de aquellos capacitados en el arte que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la escogencia de la célula huésped que es transformada, el nivel de expresión deseado de ARNds, etc. Los vectores de expresión pueden ser introducidos en células huésped de plantas para producir así moléculas de ARNds mencionadas de acuerdo con la invención, codificadas por ácidos nucleicos como se describe aquí.

El vector de expresión recombinante incluye una secuencia reguladora operativamente enlazada a una secuencia de nucleótidos que es un molde para una o ambas cadenas de las moléculas de ARNds. La molécula de ácido nucleico puede incluir además un promotor que flanquea cualquier extremo de la molécula de ácido nucleico, en donde los promotores dirigen la expresión de cada cadena individual de ADN, generando así dos ARN complementarios que hibridan y forman el ARNds. La molécula de ácido nucleico puede incluir también una secuencia de nucleótidos que es transcrita dentro de ambas cadenas del ARNds sobre una unidad de transcripción, en donde la cedana sentido es transcrita desde el extremo 5’ de la unidad de transcripción y la cadena antisentido es transcrita desde el extremo 3’, en donde las dos cadenas están separadas por aproximadamente 3 hasta aproximadamente 500 pares de bases o más, y en donde después de la transcripción, el transcripto de ARN se pliega sobre sí mismo para formar una horquilla. La invención, la región espaciadora en el transcripto de la horquilla puede ser cualquier fragmento de ADN.

De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido introducido puede ser mantenido en forma estable en la célula de la planta si es incorporado en un replicón autónomo no cromosómico o integrado dentro de los cromosomas de la planta. Alternativamente, el polinucleótido introducido puede estar presente sobre un vector no replicante extracromosómico y ser expresado en forma transitoria o activo transitoriamente. Ya sea que esté presente en un vector no replicante extracromosómico o en un vector que esté integrado dentro de un cromosoma, el polinucleótido reside preferiblemente en un casete de expresión de la planta. Un casete de expresión de una planta contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en células vegetales que están operativamente enlazadas de modo que cada secuencia pueda cumplir su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por medio de señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan a partir del t-ADN de Agrobacterium tumefaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti, pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3: 835) o equivalentes funcionales del mismo, pero también son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en plantas. Como la expresión del gen de la planta muy a menudo no está limitada sobre los niveles transcripcionales, un casete de expresión de una planta contiene preferiblemente otras secuencias operativamente enlazadas como potenciadores de la traducción tales como la secuencia de sobreexcitación que contiene la secuencia líder no traducida 5’ del virus del mosaico del tabaco que mejora la relación polipéptido por ARN (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693 - 8711). Los ejemplos de vectores de expresión de la planta incluyen a aquellos detallados en: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195 - 1197; Bevan, M. W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711 8721; y Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering y Utilization, eds.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38.

La expresión del gen de la planta debe estar operativamente enlazada a u promotor apropiado que confiera expresión génica en una forma temporal preferida, espacial preferida, preferida por el tipo de célula, y/o preferida por el tejido. Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor que sea capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal presente en las raíces de la planta. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a aquellos que pueden ser obtenidos a partir de plantas, virus de la planta y bacterias que contengan genes que se expresen en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium. Preferiblemente, el casete de expresión de la invención incluye un promotor específico de la raíz, un promotor inducible por un patógeno, o un promotor inducible por un nemátodo. Más preferiblemente el promotor inducible por un nemátodo es un promotor específico de la célula que alimenta al nemátodo parasito. Un promotor específico del sitio de alimentación del nematodo parásito puede ser específico para células sincitiales o células gigantes o específico para ambas clases de células. Un promotor es inducible, si su actividad, medida sobre la cantidad de ARN producida bajo el control del promotor, es al menos 30%, 40%, 50% preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90% más preferible al menos 100%, 200%, 300% superior en su estado inducido, que en su estado no inducido. Un promotor es específico de la célula, tejido u órgano, si su actividad, medida sobre la cantidad de ARN producido bajo el control del promotor, es al menos 30%, 40%, 50% preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90% más preferible al menos 100%, 200%, 300% superior en un tipo particular de célula, tejido u órgano, luego en otros tipos de células o tejidos de la misma planta, preferiblemente los otros tipos de células o tejidos son tipos de células o tejidos del mismo órgano de la planta, por ejemplo una raíz. En el caso de promotores específicos del órgano, la actividad del promotor tiene que ser comparada con la actividad del promotor en otros órganos de la planta, por ejemplo hojas, tallos, flores o semillas.

El promotor puede ser constitutivo, inducible, preferido en etapa de desarrollo, preferido por el tipo de célula, preferido por el tejido o preferido por el órgano. Los promotores constitutivos son activos bajo la mayoría de las condiciones. Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos incluyen a los promotores 19S y 35S del CaMV (Odell et al., 1985, Nature 313: 810 - 812), al promotor 35S del CaMV (Kay et al., 1987, Science 236: 1299 - 1302), al promotor Sep1, al promotor de la actina del arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163 - 171), al promotor de la actina de Arabidopsis, al promotor de la ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18: 675 - 689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581 - 588), al promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, al promotor de Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3: 2723 - 2730), al promotor de GRP1-8, al promotor de la cinamil alcohol deshidrogenasa (patente de los Estados Unidos No. 5.683.439), promotores del T-ADN de Agrobacterium, tales como manopina sintasa, nopalina sintasa, y octopina sintasa, la pequeña subunidad del promotor de ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRUBISCO), y similares. Se prefieren los promotores que expresan al ARNds en una célula que esté en contacto por medio de nemátodos parásitos. Alternativamente, el promotor puede dirigir la expresión del ARNds en un tejido vegetal alejado del sitio de contacto con el nemátodo, y el ARNds puede ser transportado luego por la planta a una célula que sea contactada por el nematodo parásito, en particular células de, o cercanas a los sitios de alimentación del nemátodo, por ejemplo células sincitiales o células gigantes.

Los promotores inducibles son activos bajo ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o la ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque de patógenos, condiciones anaeróbicas, y similares. Por ejemplo, se ha demostrado que los promotores de TobRB7, AtRPE, AtPyk10, Gemini19, y AtHMG1 son inducidos por nemátodos (para una revisión de promotores inducibles por nemátodos, ver Ann. Rev. Phytopathol. (2002) 40: 191 - 219; ver también la patente de los Estados Unidos No. 6.593.513). Los métodos para aislamiento de promotores adicionales, que son inducibles por nemátodos están expuestos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.589.622 y 5.824.876. Otros promotores inducibles incluyen al promotor de hsp80 de Brassica, que es inducible por choque térmico; el promotor de PPDK es inducido por luz; el promotor de PR-1 de tabaco, Arabidopsis, y maíz es inducible por medio de infección con un patógeno; y el promotor de Adh1 es inducido por hipoxia y estrés por frío. La expresión del gen de la planta puede ser facilitado también a través de un promotor inducible (para revisión, ver Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89 - 108). Los promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se desea expresión génica específica del tiempo. Los ejemplos no limitantes de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (Solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2: 397 - 404) y un promotor inducible por etanol (Solicitud PCT No. WO 93/21334).

Los promotores preferidos de la etapa de desarrollo son preferencialmente expresados en ciertas etapas del desarrollo. Los promotores preferidos de órganos y tejidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que son preferencialmente expresados en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas, o xilema. Los ejemplos de promotores preferidos de tejidos y preferidos de órganos incluyen, pero no se limitan a preferidos de las frutas, preferidos de los óvulos, preferidos de tejidos de machos, preferidos de la semilla, preferidos del integumento, preferidos de los tubérculos, preferidos del tallo, preferidos del pericarpio, y preferidos de la hoja, preferidos del estigma, preferidos del polen, preferidos de la antera, preferidos el pétalo, preferidos del sépalo, preferidos del pedicelo, preferidos de la silicua, preferidos el tronco, promotores preferidos de la raíz y similares. Los promotores preferidos de la semilla son preferencialmente expresados durante el desarrollo de la semilla y/o la germinación. Por ejemplo, los promotores preferidos de la semilla pueden ser preferidos de los embriones, preferidos del endospermo y preferidos del recubrimiento de la semilla. Ver Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Los ejemplos de promotores preferidos de la semilla incluyen, pero no se limitan a celulosa sintasa (celA), Cim1, gamma-zeína, globulina-1, zeína de 19 kD del maíz (cZ19B1) y similares.

Otros promotores adecuados preferidos de los tejidos o preferidos de los órganos incluyen al promotor del gen de la napina de semilla de colza (patente de los Estados Unidos No. 5.608.152), al promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3): 459 - 67), al promotor de oleosina de Arabidopsis (Solicitud PCT No. WO 98/45461), al promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente de los Estados Unidos No. 5.504.200), al promotor de Bce4 de Brassica (Solicitud PCT No. WO 91/13980), o al promotor de B4 de legúmina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233 - 9), así como promotores que confieren expresión específica a la semilla en plantas monocotiledóneas como el maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados a tener en cuenta son el promotor del gen Ipt1 o Ipt2 de cebada (Solicitud PCT No. WO 95/15389 y Solicitud PCT No. WO 95/23230) o aquellos descritos en la Solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen de la hordeína de la cebada, del gen de la glutelina del arroz, el gen de la orizina del arroz, el gen de la prolamina del arroz, el gen de la gliadina del trigo, el gen de la glutelina del trigo, el gen de la glutelina de la avena, el gen de la kasirina del sorgo, y el gen de la secalina del centeno).

Otros promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen, pero no se limitan al, promotor principal de la proteína de enlazamiento de clorofila a/b, promotores de histona, al promotor de Ap3, al promotor de l-conglicina, al promotor de napina, al promotor de lecitina de soja, al promotor de zeína de 15 kD de maíz, al promotor de zeína de 22 kD, al promotor de zeína de 27 kD, al promotor de zeína g, a los promotores de cera, a los promotores de apergaminado 1, apergaminado 2, y bronceado, al promotor de Zm13 (patente de los Estados Unidos No. 5.086.169), a los promotores de poligalacturonasa de maíz (PG) (patente de los Estados Unidos Nos. 5.412.085 y 5.545.546), y al promotor de SGB6 (patente de los Estados Unidos No. 5.470.359), así como promotores sintéticos u otros naturales.

De acuerdo con la presente invención, el casete de expresión comprende una secuencia de control de la expresión operativamente enlazada a una secuencia de nucleótidos que es un molde para una o ambas cadenas del ARNds. El molde del ARNds incluye (a) una primera cadena que tiene una secuencia sustancialmente idéntica a partir de aproximadamente 19 hasta aproximadamente 500, o hasta la longitud completa, nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, ó 2; y (b) una segunda cadena que tiene una secuencia sustancialmente complementaria a la primera cadena. En modalidades adicionales, un promotor flanquea cualquiera de los extremos de la secuencia de nucleótidos del molde, en donde los promotores dirigen la expresión de cada cadena individual de ADN, generando así dos ARN complementarios que hibridan y forman el ARNds. En modalidades alternativas, la secuencia de nucleótidos es transcrita dentro de ambas cadenas del ARNds sobre una unidad de transcripción, en donde la cadena sentido es transcrita desde el extremo 5’ de la unidad de transcripción y la cadena antisentido es transcrita desde el extremo 3’, en donde ls dos cadenas están separas por aproximadamente 3 hasta aproximadamente 500 pares de bases, y en donde después de la transcripción, el transcripto de ARN se pliega sobre sí mismo para formar una horquilla.

En otra modalidad, el vector contiene un promotor bidireccional, que dirige la expresión de dos moléculas de ácido nucleico, mediante lo cual una molécula de ácido nucleico codifica para la secuencia sustancialmente idéntica a una porción de un gen como el CDPK y la otra molécula de ácido nucleico codifica para una segunda secuencia que es sustancialmente complementaria a la primera cadena y capaz de formar un ARNds, cuando ambas secuencias son transcritas. Un promotor bidireccional es un promotor capaz de mediar la expresión en dos direcciones.

En otra modalidad, el vector contiene dos promotores, uno que media la transcripción de la secuencia sustancialmente idéntica a una porción de un gen como el CDPK y otro promotor que media la transcripción de una segunda secuencia siendo sustancialmente complementaria a la primera cadena y capaz de formar un ARNds, cuando se transcriben ambas secuencias. El segundo promotor puede ser un promotor diferente. Un promotor diferente significa un promotor que tiene una actividad diferente en relación con la especificidad de la célula o el tejido, o que muestra expresión sobre diferentes inductores por ejemplo, patógenos, estrés abiótico o compuestos químicos. Por ejemplo, un promotor puede ser constitutivo o específico del tejido y otro puede ser específico del tejido o inducible por patógenos. En una modalidad un promotor media la transcripción de una molécula de ácido nucleico adecuada para sobreexpresión de un gen como el CDPK, mientras que otro promotor media la transcripción específica de la célula o del tejido o la expresión inducible por el patógeno del ácido nucleico complementario.

La invención está también incorporada en una planta transgénica capaz de expresar el ARNds de la invención y por lo tanto de inhibir los genes como el CDPK en las raíces, el sitio de alimentación, las células sincitiales y/o gigantes. La planta o la planta transgénica pueden ser cualquier planta, tal como, pero sin limitarse a árboles, flores cortadas, plantas ornamentales, hortalizas o plantas de cultivo. La planta puede ser de un género seleccionado del grupo que consiste de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, y Allium, o la planta puede ser seleccinada de un género seleccionado de entre el grupo que consiste de Arabidopsis, Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Brachipodium, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, y Allium. En una modalidad la planta es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.

Preferiblemente la planta es una planta de cultivo. Las plantas de cultivo son todas plantas, utilizadas en agricultura. Por lo tanto en una modalidad la planta es una planta monocotiledónea, preferiblemente una planta de la familia Poaceae, Musaceae, Liliaceae o Bromeliaceae, preferiblemente de la familia Poaceae. En consecuencia, en aún otra modalidad la planta es una planta Poaceae del género Zea, Triticum, Oryza, Hordeum, Secale, A vena, Saccharum, Sorghum, Pennisetum, Setaria, Panicum, Eleusine, Miscanthus, Brachypodium, Festuca o Lolium. Cuando la planta es del género Zea, la especie preferida es Z. mays. Cuando la planta es del género Triticum, la especie preferida es T. aestivum, T. speltae o T. durum. Cuando la planta es del género Oryza, la especie preferida es O. sativa. Cuando la planta es del género Hordeum, la especie preferida es H. vulgare. Cuando la planta es del género Secale, la especie preferida es S. cereale. Cuando la planta es del género Avena, la especie preferida es A. sativa. Cuando la planta es del género Saccarum, la especie preferida es S. officinarum. Cuando la planta es del género Sorghum, la especie preferida es S. vulgare, S. Bicoloror, S. sudanense. Cuando la planta es del género Pennisetum, la especie preferida es P. glaucum. Cuando la planta es del género Setaria, la especie preferida es S. italica. Cuando la planta es del género Panicum, la especie preferida es P. miliaceum o P. virgatum. Cuando la planta es del género Eleusine, la especie preferida es E. coracana. Cuando la planta es del género Miscanthus, la especie preferida es M. sinensis. Cuando la planta es una planta del género Festuca, la especie preferida es F. arundinaria, F. rubra o F. pratensis. Cuando la planta es del género Lolium, la especie preferida es L. perenne o L. multiflorum. Alternativamente, la planta puede ser Triticosecale. Alternativamente, en una modalidad la planta es una planta dicotiledonea, preferiblemente una planta de la familia Fabaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Linacea, Euphorbiaceae, Convolvulaceae Rosaceae, Cucurbitaceae, Theaceae, Rubiaceae, Sterculiaceae o Citrus. En una modalidad la planta es una planta de la familia Fabaceae, Solanaceae o Brassicaceae. En consecuencia, en una modalidad la planta es de la familia Fabaceae, preferiblemente del género Glycine, Pisum, Arachis, Cicer, Vicia, Phaseolus, Lupinus, Medicago o Lens. Las species preferidas de la familia Fabaceae son M. truncatula, M, sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba,

P. vulgaris, Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius o Lens culinaris. Más preferidas son las especies G. max A. hypogea y M. sativa. La más preferida es la especie G. max. Cuando la planta es de la familia Solanaceae, el género preferido es Solanum, Lycopersicon, Nicotiana o Capsicum. Las especies preferidas de la familia Solanaceae son S. tuberosum, L. esculentum, N. tabaccum o C. chinense. La más preferida es S. tuberosum. En consecuencia, en una modalidad la planta es de la familia Brassicaceae, preferiblemente del género Brassica o Raphanus. Las especies preferidas de la familia Brassicaceae son las especies B. napus, B. oleracea, B. juncea o B. rapa. La más preferida es la especie B. napus. Cuando la planta es de la familia Chenopodiaceae, el género preferido es Beta y la especie preferida es la B. vulgaris. Cuando la planta es de la familia Asteraceae, el género preferido es Helianthus y la especie preferida es H. annuus. Cuando la planta es de la familia Malvaceae, el género preferido es Gossypium o Abelmoschus. Cuando el género es Gossypium, la especie preferida es G. hirsutum o G. barbadense y la especie más preferida es G. hirsutum. Una especie preferida del género Abelmoschus es la especie A. esculentus. Cuando la planta es de la familia Linacea, el género preferido es Linum y la especie preferida es L. usitatissimum. Cuando la planta es de la familia Euphorbiaceae, el género preferido es Manihot, Jatropa o Rhizinus y las especies preferidas son M. esculenta, J. curcas o R. comunis. Cuando la planta es de la familia Convolvulaceae, el género preferido es Ipomea y la especie preferida es I. batatas. Cuando la planta es de la familia Rosaceae, el género preferido es Rosa, Malus, Pyrus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium o Fragaria y la especie preferida es el híbrido Fragaria xananassa. Cuando la planta es de la familia Cucurbitaceae, el género preferido es Cucumis, Citrullus o Cucurbita y la especie preferida es Cucumis sativus, Citrullus lanatus o Cucurbita pepo. Cuando la planta es de la familia Theaceae, el género preferido es Camellia y la especie preferida es C. sinensis. Cuando la planta es de la familia Rubiaceae, el género preferido es Coffea y la especie preferida es C. arabica o C. canephora. Cuando la planta es de la familia Sterculiaceae, el género preferido es Theobroma y la especie preferida es T. cacao. Cuando la planta es del género Citrus, la especie preferida es C. sinensis, C. limon, C. reticulata, C. maxima e híbridos de la especie Citrus, o similares. En una modalidad preferida de la invención, la planta es una planta de soja, una de patata o una de maíz.

En una modalidad la planta es una planta Fabaceae y el gen objetivo es sustancialmente similar a la SEQ ID NO: 1, ó 2.

Los métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped incluidas células de plantas son bien conocidos en el arte de la biotecnología de las plantas. Cualquier método puede ser utilizado para transformar al vector de expresión recombinante en células de plantas para producir las plantas transgénicas de la invención. Los métodos generales para transformar plantas dicotiledóneas son divulgados, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.940.838; 5.464.763, y similares. Los métodos para transformar plantas dicotiledóneas específicas, por ejemplo, algodón, son expuestos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.004.863; 5.159.135; y 5.846.797. Los métodos de transformación de soja son expuestos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.992.375; 5.416.011; 5.569.834; 5.824.877; 6.384.301 y pueden ser utilizados en EP 0301749B1. Los métodos de transformación pueden incluir métodos directos e indirectos de transformación. Los métodos directos adecuados incluyen la aceptación de ADN inducida por polietilén glicol, transformación mediada por liposomas (patente de los Estados Unidos No. 4.536.475), métodos biolísticos utilizando la pistola de genes (Fromm M. E. et al., Bio/Technology. 8(9): 833 - 9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2: 603, 1990), electroporación, incubación de embriones secos de plantas en una solución que contiene ADN, y microinyección. En el caso de estos métodos directos de transformación, los plásmidos utilizados no necesitan reunir ningún requerimiento particular. Se pueden utilizar plásmidos simples, tales como aquellos de la serie pUC, pBR322, de la serie M13mp, pACYC184 y similares. Si se van a regenerar plantas intactas a partir de células transformadas, se localiza preferiblemente un gen marcador seleccionable adicional sobre el plásmido. Las técnicas de transformación directa son igualmente adecuadas para plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.

La trasformación puede ser llevada cabo también por infección bacteriana por medio de Agrobacterium (por ejemplo EP 0 116 718), infección viral por medio de vectores virales (EP 0 067 553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) o por medio de polen (EP 0 270 356; WO 85/01856; US 4.684.611). Las técnicas de transformación basadas en Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledóneas) son bien conocidas en el arte. La cepa de Agrobacterium (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes) incluyen un plásmido (plásmido Ti o Ri) y un elemento de T-ADN que es transferido a la planta después de infección con Agrobacterium. El T-ADN (ADN transferido) se integra dentro del genoma de la célula de la planta. El T-ADN puede estar localizado sobre el plásmido Ri o Ti o estar separadamente incluido en el así llamado vector binario. Los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium están descritos, por ejemplo, en Horsch R. B. et al. (1985) Science 225: 1229. La transformación mediada por Agrobacterium es más adecuada para plantas dicotiledóneas pero también ha sido adaptada a plantas monocotiledóneas. La transformación de plantas por medio de Agrobacterias es descrita, por ejemplo, en White F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering y Utilization, editada por S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editada por S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 128 - 143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205 - 225. La transformación puede dar como resultado una transformación y expresión transitoria o estable. Aunque se puede insertar una secuencia de nucleótidos de la presente invención en cualquier planta y célula de planta que caiga dentro de estas amplias clases, es particularmente útil en células de plantas de cultivos.

Las plantas transgénicas de la invención pueden ser cruzadas con plantas transgénicas similares o con plantas transgénicas que carecen de los ácidos nucleicos de la invención o con plantas no transgénicas, utilizando métodos conocidos de fitomejoramiento de planta, para preparar semillas. Además, la planta transgénica de la presente invención puede incluir, y/o ser cruzada con otra planta transgénica que contiene uno o más ácidos nucleicos, creando así un "apilamiento" de transgenes en la planta y/o en su progenie. La semilla es luego plantada para obtener una planta transgénica fértil cruzada que contiene al ácido nucleico de la invención. La planta transgénica fértil cruzada puede tener al casete de expresión particular heredado a través de un progenitor hembra o a través de un progenitor macho. La segunda planta puede ser una planta endogámica. La planta transgénica fértil cruzada puede ser un híbrido. También están incluidas dentro de la presente invención semillas de cualquiera de estas plantas transgénicas fértiles cruzadas. Las semillas de esta invención pueden ser cosechadas a partir de plantas transgénicas fértiles y ser utilizadas para el cultivo de generaciones de la progenie de plantas transformadas de esta invención incluidas líneas de plantas híbridas que contienen al constructo de ADN.

El "apilamiento de genes" puede también ser logrado por transferencia de dos o más genes dentro del núcleo de la célula por medio de transformación de la planta. Se pueden introducir múltiples genes en el núcleo de la célula durante la transformación ya sea en forma secuencial o al unísono. Se puede reducir la expresión en genes múltiples en plantas o especies patógenas objetivo por medio de mecanismos de silenciamiento de genes, específicamente ARNi, utilizando un solo transgén dirigido a secuencias parciales enlazadas en forma múltiple de interés. Los genes múltiples apilados bajo el control de promotores individuales pueden también ser sobreexpresados para lograr un fenotipo único o múltiple deseado. Las construcciones que contienen apilamiento de genes tanto de genes sobreexpresados como objetivos silenciados pueden también ser introducidas en plantas que producen fenotipos agronómicamente importantes individuales o múltiples. En ciertas modalidades las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser apiladas con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés para crear fenotipos deseados. Las combinaciones pueden producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos que incluyen pero no se limitan a resistencia a las enfermedades, tolerancia a los herbicidas, mayor productividad, tolerancia al frío y a la sequía. Estas combinaciones amontonadas pueden ser creadas por cualquier método incluyendo pero sin limitarse al cruzamiento de plantas para fitomejoramiento por medio de métodos convencionales o por medio de transformación genética. Si los rasgos se amontonan por medio de transformación genética, las secuencias de polinucleótidos de interés se pueden combinar en forma secuencial o en forma simultánea en cualquier orden. Por ejemplo si se van a introducir dos genes, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación separados o sobre el mismo casete de transformación. La expresión de las secuencias puede ser dirigida por el mismo o por diferentes promotores.

De acuerdo con esta modalidad, se produce la planta transgénica de la invención por medio de un método que comprede las etapas de proveer un gen objetivo como el CDPK, preparar un casete de expresión que tiene un primera región que es sustancialmente idéntica a una porción del gen seleccionado como el CDPK y una segunda región que es complementaria a la primera región, transformando el casete de expresión en una planta, y seleccionando la progenie de la planta transformada que expresa el constructo de ARNds de la invención.

Una mayor resistencia a la infección por nemátodos es un rasgo general que se desea que sea heredado en una amplia variedad de plantas. La presente invención puede ser utilizada para reducir la destrucción de cultivos por parte de cualquier nematodo parásito de la planta. Preferiblemente, los nemátodos parásitos pertenecen a familias de nemátodos que inducen células gigantes o sincitiales. Los nemátodos que inducen células gigantes o sincitiales se encuentran en las familias Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae o Tylenchulidae. En particular en las familias Heterodidae y Meloidogynidae.

En consecuencia, los nemátodos parásitos objetivo de la presente invención pertenecen a uno o más géneros seleccionados de entre el grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera, Longidorus o Meloidogyne. En una modalidad preferida los nemátodos parásitos pertenecen a uno o más géneros seleccionados de entre el grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera o Meloidogyne. En una modalidad más preferida los nemátodos parásitos pertenecen a uno o más géneros seleccionados de entre el grupo de Globodera, Heterodera, o Meloidogyne. En aún una modalidad más preferida los nemátodos parásitos pertenecen a uno o ambos géneros seleccionados de entre el grupo de Globodera o Heterodera. En otra modalidad los nemátodos parásitos pertenecen al género Meloidogyne.

Cuando los nemátodos parásitos son del género Globodera, las especies son preferiblemente del grupo que consiste de G. achilleae, G. artemisiae, G. hypolysi, G. mexicana, G. millefolii, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis,

G. tabacum, y G. virginiae. En otra modalidad preferida los nemátodos parásitos del género Globodera incluyen al menos a uno de la especie G. pallida, G. tabacum, o G. rostochiensis. Cuando los nemátodos parásitos son del género Heterodera, la especie puede ser preferiblemente del grupo que consiste de entre H. avenae, H. carotae, H. ciceri, H cruciferae, H delvii, H. elachista, H. filipjevi, H. gambiensis, H. glycines, H. goettingiana, H graduni, H humuli, H. hordecalis, H. latipons, H major, H. medicaginis, H. oryzicola, H. pakistanensis, H. rosii, H. sacchari, H. schachtii, H. sorghi, H. trifolii, H. urticae, H. vigni y H. zeae. En otra modalidad preferida los nemátodos parásitos del género Heterodera incluyen al menos a uno de la especie H. glycines, H. avenae, H. cajani, H. gottingiana, H. trifolii,

H. zeae o H. schachtii. En una modalidad más preferida los nemátodos parásitos incluyen al menos uno de entre las especies H. glycines o H. schachtii. En una modalidad aún más preferida el nematodo parásito es de la especie H. glycines.

Cuando los nemátodos parásitos son del género Meloidogyne, el nematodo parásito puede ser seleccionado de entre el grupo que consiste de M. acronea, M. arabica, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. chitwoodi, M. cofeicola, M. esigua, M. graminicola, M. hapla, M. incognita, M. indica, M. inomata, M. javanica, M. lini,

M. mali, M. microcephala, M. microtyla, M. naasi, M. salasi y M. thamesi. En una modalidad preferida los nemátodos parásitos incluyen al menos una de las especies M. javanica, M. incognita, M. hapla, M. arenaria o M. chitwoodi.

Los siguientes ejemplos no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones de la invención, sino más bien servir como ejemplos de ciertas modalidades. Cualquier variación en los métodos que sirven como ejemplo que se le presentan a la persona capacitada en el arte está destinada a caer dentro del alcance de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la tabla de las SEQ ID Nos asignadas a las correspondientes secuencias. La SEQ ID NO: 1 es la secuencia parcial de ADNc del clon Hygene 49806575 de Glycine max, incluido el codón de detención y la región no traducida 3’. La SEQ ID NO: 2 es la secuencia sentido del fragmento de 49806575 (SEQ ID NO: 1) utilizada en el ensayo del explante con raíces del Ejemplo 2. La SEQ ID NO; 3 es la secuencia de aminoácidos codificada por 49806575 (SEQ ID NO: 1). La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ADNc de Medicago con el número de acceso del Gen-bank AY821654, que incluye secuencias de codificadoras y no codificadoras. La primera base de la región de codificación corresponde al nucleótido 147, y la última base del codón de detención corresponde al nucleótido 1829. La SEQ ID NO: 5 es la secuencia sintetizada descrita en el Ejemplo 1., y la SEQ ID NO: 6 es la secuencia de un promotor como el TPP (SEQ ID NO: 6) descrito en la USSN 60/874.375 en trámite junto con la presente y que se incorpora aquí como referencia.

Las Figuras 2a - 2c muestran la alineación de aminoácidos de proteínas como la CDPK: el clon parcial 49806575 de ADNc de Glycine (SEQ ID NO: 3), la proteína codificada por AY821654 de Medicago (SEQ ID NO: 7), la proteína codificada por AY823957 de Medicago (SEQ ID NO: 9), la proteína codificada por AF435451 de Nicotiana (SEQ ID NO: 11), la proteína codificada por AY971376 de Nicotiana (SEQ ID NO: 13), la proteína codificada por AF030879 de Solanum (SEQ ID NO: 15), la proteína codificada por At2g17890 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 17), la proteína codificada por At4g36070 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 19), la proteína codificada por At5g66210 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 21), la proteína codificada por NM_001052286 de Oryza (SEQ ID NO: 23), la proteína codificada por NM_001065979 de Oryza (SEQ ID NO: 25) y el producto amplificado de la PCR RACE de CDPK 5’, RKF195-3, de Glycine (SEQ ID NO: 27). La alineación se lleva a cabo en la suite del software Vector NTI (penalización por apertura de un intervalo = 10, penalización por extensión del intervalo = 0,05, penalización por separación del intervalo = 8).

La Figura 3 muestra el porcentaje de identidad global de aminoácidos de ejemplos de genes como el CDPK: la proteína codificada por el clon parcial 49806575 de Glycine (SEQ ID NO: 3), la proteína codificada por RKF195-3, de Glycine (SEQ ID NO: 27), la proteína codificada por AY821654 de Medicago (SEQ ID NO: 7), la proteína codificada por AY823957 de Medicago (SEQ ID NO: 9), la proteína codificada por AF435451 de Nicotiana (SEQ ID NO: 11), la proteína codificada por AY971376 de Nicotiana (SEQ ID NO: 13), la proteína codificada por AF030879 de Solanum (SEQ ID NO: 15), la proteína codificada por At2g17890 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 17), la proteína codificada por At4g36070 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 19), la proteína codificada por At5g66210 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 21), la proteína codificada por NM_001052286 de Oryza (SEQ ID NO: 23) y la proteína codificada por NM_001065979 de Oryza (SEQ ID NO: 25). Únicamente la región que se superpone con el clon parcial 49806575 de ADNc fue incluida en el análisis. Las alineaciones por parejas y las identidades en porcentaje fueron calculadas utilizando Needle de EMBOSS-4.0.0 (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443 - 453).

La Figura 4 muestra el porcentaje de identidad global de nucleótidos de ejemplos de genes como el CDPK: el clon parcial 49806575 de Glycine (SEQ ID NO: 1), RKF195-3, de Glycine (SEQ ID NO: 26), AY821654 de Medicago (SEQ ID NO: 4), AY823957 de Medicago (SEQ ID NO: 8), AF435451 de Nicotiana (SEQ ID NO: 10), AY971376 de Nicotiana (SEQ ID NO: 12), AF030879 de Solanum (SEQ ID NO: 14), At2g17890 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 16), At4g36070 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 18), At5g66210 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 20), NM_001052286 de Oryza (SEQ ID NO: 22), y NM_001065979 de Oryza (SEQ ID NO: 24). Únicamente la región que se superpone con el clon parcial 49806575 de ADNc fue incluida en el análisis. Las alineaciones por parejas y las identidades en porcentaje fueron calculadas utilizando Needle de EMBOSS-4.0.0 (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443 - 453).

Las Figuras 5a - 5g muestran diferentes 21 mers posibles para ejemplos de genes como el CDPK de las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ó 26 o una polisecuencia de nucleótidos que codifica una homología como la de CDPK por medio de la posición de los nucleótidos.

Ejemplo 1: Construcción del vector binario para transformación de soja

Este método ejemplificado emplea un vector binario que contiene al gen objetivo correspondiente al clon 49806575 del ADNc de soja. El clon 49806575 fue identificado por medio de la búsqueda de una base de datos propietaria de secuencias de ADNc utilizando la secuencia pública AY821654 de Medicago truncatula. El vector de expresión consiste del fragmento sintetizado (SEQ ID NO: 5), que a su vez consta de una porción antisentido de 320 pb del gen 49806575, un espaciador, un fragmento sentido del gen objetivo (SEQ ID NO: 2) correspondiente a los nucleótidos 50 - 372 de la SEQ ID NO: 1, y una columna vertebral del vector. En este vector, RCB562, se expresó un ARNds para el gen objetivo 49806575 bajo un promotor preferido de la raíz o de sincitios, un promotor como el TPP (SEQ ID NO: 6, ver la solicitud de patente en trámite junto con la presente 60/874.375, incorporada aquí como referencia). Un promotor como el TPP dirige la expresión del transgén preferencialmente en raíces y/o sincitios o células gigantes. El marcador de selección para transformación en este vector era un gen AHAS mutado de Arabidopsis thaliana que confiere resistencia al herbicida Arsenal (Imazapyr, BASF Corporation, Mount Olive, NJ). La expresión de AHAS mutado fue dirigida por el promotor de ubiquitina de perejil (Ver Plesch, G. y Ebneth, M., "Method for the stable expression of nucleic acids in transgenic plants, controlled by a parsley ubiquitin promotor", WO 03/102198, incorporado aquí como referencia).

Ejemplo 2: Uso de un sistema de ensayo de la planta de soja para detectar la resistencia a la infección por SCN

Se empleó un ensayo de un explante con raíces para demostrar la expresión de ARNds y la resistencia del nemátodo resultante. Este ensayo puede ser encontrado en la solicitud de patente en trámite junto con la presente USSN 12/001.234, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia.

Las semillas de soja limpias de una variedad cultivada de soja fueron esterilizadas en su superficie y germinadas. Tres días antes de la inoculación, se inició un cultivo líquido durante la noche del cultivo desarmado de Agrobacterium, por ejemplo, la cepa K599 desarmada de A. Rhizogenes que contiene el vector binario RCB562. Al siguiente día se esparció el cultivo sobre una placa de agar LB que contenía kanamicina como agente de selección. Las placas fueron incubadas a 28°C durante dos días. Se preparó una placa por cada 50 explantes para ser inoculados. Se utilizaron cotiledones que contenían el extremo proximal de su conexión con las plántulas como el explante para transformación. Después de remover los cotiledones se raspó la superficie con un escalpelo alrededor del sitio de corte. El cotiledón cortado y raspado fue el objetivo para inoculación con Agrobacterium. Los explantes preparados fueron sumergidos en las colonias densas desarmadas de A. rhizogenes preparadas anteriormente de modo que las colonias fueran visibles sobre la superficie cortada y raspada. Se colocaron luego los explantes sobre agar al 1% en cajas de Petri para cocultivo bajo la luz durante 6 - 8 días.

Después de la transformación y cocultivo se transfirieron los explantes de soja a un medio para inducción de las raíces con un agente de selección, por ejemplo S-B5-708 para el gen mutado de la aceto-hidroxi ácido sintasa (AHAS) (Sathasivan et al., Plant Phys. 97: 1044 - 50, 1991). Se mantuvieron los cultivos en la misma condición que en la etapa de cocultivo. El medio SB5-708 contiene: sales B5 0,5X, MES 3 mM, sacarosa al 2%, vitaminas B5 1X, 400 !g/ml de Timentin, agar Noble al 0,8%, y 1 !M de Imazapir (agente de selección para el gen de la AHAS) (BASF Corporation, Florham Park, NJ) a pH 5,8.

Dos a tres semanas después de la selección e inducción de la raíz se formaron las raíces transformadas sobre los extremos cortados de los explantes. Se transfirieron los explantes al mismo medio de selección (medio S-B5-708) para una selección adicional. Las raíces transgénicas proliferaron bien en el lapso de una semana en el medio y estaban listas para ser subcultivadas.

Se cortaron raíces de soja blancas y fuertes de los explantes con raíces y se las cultivó en medio de crecimiento para raíces complementado con 200 mg/l de Timentin (medio S-MS-606) en placas de seis pozos. Se mantuvieron los cultivos a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. El medio S-MS-606 contiene: sales MS 0,2X y vitaminas B5, sacarosa al 2%, y 200 mg/l de Timentin a pH 5,8. De uno a cinco días después del subcultivo, se inocularon las raíces con nemátodos juveniles esterilizados en la superficie en placas de múltiples pozos ya sea para el ensayo el gen de interés o del constructo del promotor. Como control, se utilizaron las raíces con el vector de control 82 de Williams de la variedad cultivada de soja y con el vector de control de Jack. Los cultivos de raíz de cada línea que ocuparon al menos la mitad del pozo fueron inoculados con la estirpe 3 descontaminada en la superficie de nemátodos formadores de quistes de soja (SCN) juveniles de segunda etapa (J2) en un nivel de 500 J2/pozo. Se sellaron luego las placas y se las colocó nuevamente en la incubadora a 25°C en la oscuridad. Se generaron diferentes líneas independientes de raíces de cada transformación de vector binario y se utilizaron las líneas para un bioensayo. Cuatro semanas después de la inoculación del nemátodo, se contabilizaron los quistes en cada pozo.

Para cada línea transformada, el número promedio de quistes por línea, el índice de hembras en porcentaje y los valores estándar de error fueron determinados a través de diferentes pozos por duplicado (Índice de hembras = número promedio de quistes de SCN que se desarrollan sobre las raíces transgénicas expresadas como porcentaje del número promedio de quistes que se desarrollan sobre las raíces de control susceptibles de tipo silvestre W82). Se llevaron a cabo múltiples experimentos biológicamente replicados independientes para comparar el número de quistes entre los transformantes RCB562 y las líneas susceptibles de Williams 82. Los resultados muestran que las raíces transformadas RCB562 tenían reducciones estadísticamente significativas (valor p 0,05) en el recuento de quistes sobre múltiples líneas transgénicas y una tendencia general de recuento reducido de quistes en la mayoría de líneas transgénica ensayadas.

Ejemplo 3: RACE para determinar la secuencia transcrita completa

Se aisló una secuencia de longitud completa del transcripto con alta homología con el clon parcial de ADNc 49806575 (SEQ ID NO: 1) utilizando el kit GeneRacer (L1502-01) de Invitrogen siguiendo las instrucciones del fabricante. Se preparó el ARN total de las raíces de soja cosechadas 6 días después de la infección con SCN de acuerdo con el protocolo del kit GeneRacer de Invitrogen para generar ARN descubierto y desfosforilado ligado al Oligo de ARN de GeneRacer descrito por la SEQ ID NO: 28. Se transcribió en forma inversa el ARN preparado de acuerdo con el protocolo del kit GeneRacer y utilizó como el molde de la biblioteca de RACE para la PCR para aislar los extremos 5’ del ADNc utilizando reacciones PCR primarias y secundarias (anidadas) de acuerdo con el protocolo del kit GeneRacer. Los iniciadores utilizados para la reacción PCR primaria son descritos por las SEQ ID Nos. 29 y

31. Los iniciadores secundarios de la reacción PCR anidada son descritos por las SEQ ID Nos. 30 y 32.

Los productos de la reacción PCR secundaria fueron separados por medio de electroforesis en gel. Los productos específicos fueron purificados del gel de agarosa y clonados dentro de vectores pCR4-TOPO (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las colonias resultantes fueron minipreparadas y secuenciadas. Uno de los fragmentos de longitud completa descritos como la SEQ ID NO: 26 (RKF195-3_2) tenía un alto porcentaje de identidad con la SEQ ID NO: 1 (secuencia de ADNc 49806575). La alineación entre proteínas codificadas por la secuencia parcial 49806575 de Glycine max, la RKF195-3_2 de longitud completa de Glycine max y genes como el CDPK de otras especies de plantas es mostrada en las Figuras 2a - 2d.

Aquellos capacitados en el arte reconocerán, o serán capaces de comprobar utilizando únicamente experimentación de rutina, muchos equivalentes para las modalidades específicas de la invención descrita aquí. Se pretende que 5 tales equivalentes sean abarcados por las siguientes reivindicaciones.

LISTADOS DE SECUENCIAS

<110> BASF Plant Science GmbH Ascenzi, Robert

<120> Composiciones y métodos que utilizan interferencia de ARN de tipo CDPK para el control de nemátodos 10 <130> PF 58856-PCT

<160> 32

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

<211> 1045 15 <212> ADN

<213> Glycine max

<220>

<221> 3’UTR

<222> (663)..(1045) 20 <223> Residuos predichos de nucleótidos de la cola de poli-A 1031 a 1045

<400> 1

<210> 2

<211> 320

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2

<210> 3

<211> 219

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 3

<210> 4

<211> 2211

5 <212> ADN

<213> Medicago truncatula

<220>

<221> 5’UTR

<222> (1)..(146)

10 <220>

<221> 3’UTR

<222> (1830)..(2211)

<400> 4

<210> 5

<211> 740

<212> ADN

<213> Desconocido <220>

<223> Secuencia objetivo sintetizada de horquilla de 49806575

<400> 5

<210> 6

<211> 1999

<212> ADN 10 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

<210> 7

<211> 560

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 7

<210> 8 <211> 1683

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 8

<210> 9

<211> 560

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 9

<210> 10

<211> 1719

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 10

<210> 11

<211> 572

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 11

<210> 12

<211> 1704

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 12

<210> 13

<211> 567

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 13

<210> 14

<211> 1695

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<400> 14

<210> 15

<211> 564

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 15

<210> 16

<211> 1716

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 16

<210> 17

<211> 571

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 17

<210> 18

<211> 1605

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 18

<210> 19 <211> 534

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 19

<210> 20

<211> 1572

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 20

<210> 21

<211> 523

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 21

<210> 22

<211> 1569

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 22

<210> 23

<211> 522

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 23

<210> 24

<211> 1539

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 24

<210> 25

<211> 512

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 25

<210> 26

<211> 1689

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 26

<210> 27

<211> 562

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 27

<210> 28

<211> 44

5

<212> ARN

<213> Desconocido

<220>

<223> Iniciador

<400> 28

10

cgacuggagc acgaggacac ugacauggac ugaaggagua gaaa 44

<210> 29

<211> 23

<212> ADN

<213> Desconocido

15

<220>

<223> Iniciador

<400> 29

cgactggagc acgaggacac tga

23

<210> 30

20

<211> 26

<212> ADN

74

<213> Desconocido

<220>

<223> Iniciador

<400> 30

5

ggacactgac atggactgaa ggagta 26

<210> 31

<211> 28

<212> ADN

<213> Desconocido

10

<220>

<223> Iniciador

<400> 31

tagcaagagc ctgtctcatc tcctcaag

28

<210> 32

15

<211> 28

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Iniciador

20

<400> 32

tgctagccaa tgcccttagt gcaaattg

28

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para conferir resistencia a los nematodos a una planta, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar un ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que tiene una región que es absolutamente

   idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario de una porción de un gen como el CDPK una vez expresado en la planta; b) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; c) producir uno o más descendientes transgénicos de dicha planta receptora; y d) seleccionar la descendencia para resistencia a los nemátodos; en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste

   de: a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la

   expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3; e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido

   que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.
2. 2. El uso de una molécula de ARNds que comprende i) una primera cadena que contiene una secuencia absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, y ii) una segunda cadena que contiene una secuencia complementaria sobre todos sus nucleótidos con la primera cadena, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

   a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2

   para conferir resistencia a los nemátodos parásitos de la planta.
3. 3. El uso de un reservorio de moléculas de ARNds que comprende una multiplicidad de moléculas de ARN cada una conteniendo una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde dichas moléculas de ARNds se derivan de un polinucleótido seleccionado el grupo que consiste de:

   a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   c) un polinucleótido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; y d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   para conferir resistencia a los nemátodos parásitos de la planta.
4. 4. Una planta transgénica resistente a nemátodos parásitos capaz de expresar una ARNds que sea absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

   a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   b) un polinucleótido que tiene 95% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   c) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.
5. 5. La planta de la reivindicación 4, en donde la ARNds comprende una multiplicidad de moléculas de ARN cada una conteniendo una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde dichas moléculas de ARN se derivan de una porción de un polinucleótido seleccionado el grupo que consiste de:

   a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   b) un polinucleótido que tiene 95% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.
6. 6. Un método para elaborar una planta transgénica resistente a los nemátodos capaz de expresar un ARNds que inhibe la expresión de un gen como el CDPK en la planta, dicho método comprendiendo las etapas de i) preparar un ácido nucleico que tiene una región que es absolutamente idéntica a una porción de un gen como el CDPK, en donde el ácido nucleico es capaz de formar un transcripto bicatenario una vez expresado en la planta; ii) transformar una planta receptora con dicho ácido nucleico; iii) producir uno o más descendientes transgénicos de dicha planta receptora, y iv) seleccionar la descendencia para expresión de dicho transcripto, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

   a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   e) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 200 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2.
7. 7. El método de la reivindicación 6, en donde el ARNds comprende una multiplicidad de moléculas de ARN cada una conteniendo una región bicatenaria que tiene una longitud de 19 a 24 nucleótidos, en donde dichas moléculas de ARN se derivan de un polinucleótido seleccionado el grupo que consiste de:

   a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   c) un polinucleótido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2; y

   d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 90% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3.
8. 8. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde la planta se selecciona d entre el grupo que consiste de soja, patata, tomate, cacahuete, algodón, mandioca, café, coco, piña, árboles de cítricos, plátano, maíz, colza, remolacha, girasol, sorgo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, judías verdes, habas, guisantes y tabaco.

   5 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde el ARNds se expresa en las raíces o sincitios de la planta.
9. 10. Un método para controlar la infección de una planta por un nemátodo parásito, que comprende las etapas de transformar la planta con un ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds operativamente enlazada a un promotor preferido del sitio de alimentación del nemátodo o inducible por nemátodo, preferido de la raíz, mediante el 10 cual al ARNds que contiene una cadena que es absolutamente idéntica a una porción de un ácido nucleico objetivo esencial para la formación, desarrollo o soporte del sitio de alimentación, en particular la formación, desarrollo o soporte de sincitios o células gigantes, controlando así la infección de la planta por el nemátodo por medio de la remoción o incapacitando funcionalmente el sitio de alimentación, los sincitios o células gigantes, en donde el ácido nucleico objetivo es un gen como el CDPK, en donde la porción de un gen como el CDPK es de un polinucleótido

   15 seleccionado del grupo que consiste de:

   a) un polinucleótido que comprende una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3;

   c) un polinucleótido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 1, ó 2;

   20 d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene 70% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3.

   Figura 1

   Nombre del gen

   Especie SEQ ID NO:

   Secuencia parcial de ADNc 49806575

   Glycine max

   Secuencia sentido del fragmento 49806575

   Glycine max

   Traducción del EST parcial 49806575

   Glycine max

   ADN para AY821654

   Medicago truncatula

   Secuencia sintetizada descrita en el Ejemplo 1

   Glycine max

   Promotor de TPP

   Arabidopsis thaliana

   Proteína AY821654

   Medicago truncatula

   ADN para AY823957

   Medicago truncatula

   Proteína AY823957

   Medicago truncatula

   ADN para AF435451

   Nicotiana tabacum

   Proteína AF435451

   Nicotiana tabacum

   ADN para AY971376

   Nicotiana tabacum

   Proteína AY971376

   Nicotiana tabacum

   ADN para AF030879

   Solanum tuberosum

   Proteína AF030879

   Solanum tuberosum

   ADN para At2g17890

   Arabidopsis thaliana

   Proteína At2g17890

   Arabidopsis thaliana

   ADN para At4g36070

   Arabidopsis thaliana

   Proteína At4g36070

   Arabidopsis thaliana

   ADN para At5g66210

   Arabidopsis thaliana

   Proteína At5g66210

   Arabidopsis thaliana

   ADN para NM_001052286

   Oryza sativa

   Proteína NM_001052286

   Oryza sativa

   ADN para NM_001065979

   Oryza sativa

   Proteína NM_001065979

   Oryza sativa

   ADN para RKF 195-3

   Glycine max

   Figura 1 (continuación)

   Nombre del gen

   Especie SEQ ID NO:

   Proteína RKF 195-3

   Glycine max 27

   Oligo de ARN GeneRacer

   desconocida 28

   Iniciador 5’ GeneRacer

   desconocida 29

   Iniciador Anidado 5’ GeneRacer

   desconocida 30

   Iniciador RACE 5’ 49806575

   desconocida 31

   Iniciador Anidado RACE 5’ 49806575

   desconocida 32

   FIGURA 2a FIGURA 2b FIGURA 2c

   FIGURA 3

   Porcentaje de identidad (aminoácidos)

   FIGURA 4

   Porcentaje de identidad (ácido nucleótido)

   Figura 5g

   n = número total de nucleótidos de longitud completa de un polinucleótido que codifica como el CDPK – 20

   Por ejemplo: n = 1025 (= 1045 - 20) para la SEQ ID NO: 1; n = 300 (= 320 - 20) para la SEQ ID NO: 2; n = 1991 (= 2211 - 20) para la SEQ ID NO: 4; 10 n = 720 (= 740 - 20) para la SEQ ID NO: 5; n = 1663 (= 1683 - 20) para la SEQ ID NO: 8; n = 1699 (= 1719 - 20) para la SEQ ID NO: 10; n = 1684 (= 1704 - 20) para la SEQ ID NO: 12; n = 1675 (= 1695 - 20) para la SEQ ID NO: 14; 15 n = 1696 (= 1716 - 20) para la SEQ ID NO: 16; n = 1585 (= 1605 - 20) para la SEQ ID NO: 18; n = 1552 (= 1572 - 20) para la SEQ ID NO: 20; n = 1549 (= 1569 - 20) para la SEQ ID NO: 22; n = 1519 (= 1539 - 20) para la SEQ ID NO: 24; 20 n = 1669 (= 1689 - 20) para la SEQ ID NO: 26;