BRPI0807204A2

BRPI0807204A2 - Molécula de dsrna, coleção de moléculas de dsrna, planta transgênica, e, método para preparar uma planta transgênica

Info

Publication number: BRPI0807204A2
Application number: BRPI0807204-3A
Authority: BR
Inventors: Robert A Ascenzi
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2008-02-07
Publication date: 2014-06-03
Also published as: US20100017910A1; WO2008095970A1; CN101631867A; ES2373614T3; EP2115148A1; MX2009007766A; ATE524553T1; AR065284A1; CA2677630A1; EP2115148B1

Description

“MOLÉCULA DE dsRNA, COLEÇÃO DE MOLÉCULAS DE dsRNA, PLANTA TRANSGÊNICA, E, MÉTODO PARA PREPARAR UMA PLANTA TRANSGÊNICA”

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de pedido de patente internacional U.S. de número de série 60/900.466 depositado aos 09 de Fevereiro de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO

O campo desta invenção é o controle de nematódeos, em particular o controle de nematódeos de cisto de feijão-soja. A invenção também se refere à introdução de material genético dentro de plantas que são suscetíveis aos nematódeos com o propósito de aumentar a resistência aos nematódeos.

BACKGROUND OF THE INVENTION

Nematódeos são vermes arredondados microscópicos que se alimentam nas raízes, folhas, e caules de mais do que 2.000 plantações de escala, verduras/hortaliças, frutas, e plantas ornamentais, causando uma perda de plantação mundial estimada de 100 bilhões. Uma variedade de espécies de nematódeo parasita infecta plantas de colheita, incluindo nematódeo das galhas (RKN), nematódeos formadores de cisto e de lesão. Nematódeos das galhas, que são caracterizados por causarem formação de galha de raiz em sítios de alimentação, têm uma variedade de hospedeiros relativamente ampla e são portanto patogênicos em um número grande de espécies de plantas de colheita. As espécies de nematódeos formadores de cisto e de lesão têm uma variedade de hospedeiros mais limitada, mas ainda causam perdas consideráveis em plantações suscetíveis.

Nematódeos patogênicos estão presentes em todos os Estados Unidos, com as concentrações maiores ocorrendo nas regiões quentes, úmidas do Sul e do Oeste e em solos arenosos. Nematódeo de cisto de feijão-soja (Heterodera glycines), a peste mais séria das plantas de feijão-soja, foi primeiro descoberto nos Estados Unidos na Carolina do Norte em 1954. Algumas áreas estão tão intensamente infestadas por nematódeo de cisto de feijão-soja (SCN) que a produção de feijão-soja não é mais economicamente 5 possível sem medidas de controle. Embora feijão-soja seja a plantação econômica principal atacada por SCN, parasitas SCN somam no total cinqüenta hospedeiros, incluindo plantações de campo, verduras/hortaliças, plantas ornamentais, e ervas daninhas.

Sinais de dano de nematódeo incluem atrofiamento e 10 amarelecimento de folhas, e murchamento das plantas durante períodos quentes. Contudo, infestação de nematódeos pode causar perdas de rendimento significativas sem quaisquer sintomas óbvios de doença acima do solo. As causas primárias de redução de rendimento são devido ao dano de raiz abaixo do solo. Raízes infectadas por SCN são ananicadas ou atrofiadas. 15 Infestação de nematódeo também pode diminuir o número de nódulos fixadores de nitrogênio sobre as raízes, e podem tomar as raízes mais suscetíveis aos ataques por outros patógenos de planta provenientes do solo.

O ciclo de vida de nematódeo tem três estágios maiores: ovo, juvenil, e adulto. O ciclo de vida varia entre espécies de nematódeos. Por exemplo, o ciclo de vida de SCN pode costumeiramente ser completado em

24 a 30 dias sob condições ótimas enquanto que outras espécies podem demorar tão longamente quanto um ano, ou mais longo, para completar o ciclo de vida. Quando os níveis de temperatura e de umidade tomam-se favoráveis no verão, nematódeos juvenis vermiformes eclodem de ovos no 25 solo. Apenas nematódeos no estágio desenvolvente juvenil são capazes de infectar raízes de feijão-soja.

O ciclo de vida de SCN tem sido submetido a muitos estudos, e como tal é um exemplo útil para entender um ciclo de vida de nematódeo. Após penetrarem nas raízes de feijão-soja, nematódeos juvenis SCN movem- se através da raiz até contatarem tecido vascular, em cujo momento param de migrar e começam a se alimentar. Com um estilete, o nematódeo injeta secreções que modificam certas células da raiz e as transformam em sítios de alimentação especializados. As células de raiz são morfologicamente 5 transformadas em sincícios multinucleados grandes (ou células gigantes no caso de RKN), que são usadas como uma fonte de nutrientes para os nematódeos. Os nematódeos ativamente se alimentando assim roubam nutrientes essenciais da planta resultando em perda de rendimento. A medida que os nematódeos fêmeas se alimentam, se incham e eventualmente se 10 tomam tão grandes que seus corpos rompem o tecido da raiz e são expostos sobre a superfície da raiz.

Após um período de alimentação, nematódeos SCN machos, que não estão inchados como adultos, migram para fora da raiz para dentro do solo e fertilizam as fêmeas adultas aumentadas. Os machos então morrem, enquanto que as fêmeas permanecem fixadas no sistema de raiz e continuam a se alimentar. Os ovos nas fêmeas inchadas começam a se desenvolver, inicialmente em uma massa ou saco de ovos fora do corpo, então mais tarde dentro da cavidade corporal do nematódeo. Eventualmente a cavidade corporal inteira da fêmea adulta está cheia de ovos, e o nematódeo fêmea morre. IE o corpo cheio de ovos da fêmea morta que é chamado de cisto. Cistos eventualmente se desalojam e são encontrados livres no solo. As paredes do cisto tomam-se muito resistentes, proporcionam excelente proteção para os aproximadamente 200 a 400 ovos contidos dentro das mesmas. Ovos de SCN sobrevivem dentro do cisto até ocorrerem condições apropriadas de eclosão. Embora muitos dos ovos possam eclodir dentro do primeiro ano, muitos também sobreviverão dentro dos cistos por vários anos.

Um nematódeo pode se mover por si mesmo através do solo apenas umas poucas polegadas por ano. Contudo, infestação de nematódeo pode ser espalhada por distâncias substanciais em uma variedade de maneiras. Qualquer coisa que possa mover solo infestado é capaz de espalhar a infestação, incluindo maquinário, veículos e ferramentas de fazenda, vento, água, animais, e trabalhadores de fazenda. Partículas de solo do tamanho de semente freqüentemente contaminam semente colhida. Conseqüentemente, 5 infestação de nematódeo pode ser espalhada quando semente contaminada de campos infestados é plantada em campos não-infestados. Há até mesmo evidência de que certas espécies de nematódeos podem ser espalhadas por aves. Apenas algumas das causas podem ser prevenidas.

Práticas tradicionais para manejar infestação de nematódeo incluem: manutenção de níveis de pH de solo e de nutrientes de solo apropriados em terra infestada com nematódeo; controle de outras doenças de planta, bem como de pestes de ervas daninhas e de insetos; usando práticas de sanitização tais com aração, plantio, e cultivo de campos infestados com nematódeos apenas após trabalhar campos não-infestados; limpeza cuidadosa de equipamento com vapor de água ou água de pressão alta após trabalho em campos infestados; não uso de semente crescida em terra infestada para plantio de campos não-infestados a não ser que a semente tenha sido apropriadamente limpa; rotação de campos infestados e altemação de plantações hospedeiras com plantações não-hospedeiras; usando nematicidas; e plantio de variedades de planta resistentes.

Têm sido propostos métodos para a transformação genética de plantas com o objetivo de conceder resistência aumentada aos nematódeos parasitas de plantas. Patentes U.S. Nos. 5.589.622 e 5.824.876 são direcionadas para a identificação de genes de planta expressados 25 especificamente em ou adjacentemente aos sítio de alimentação da planta após fixação pelo nematódeo. Os promotores destes genes alvos de planta podem ser então usados para dirigir a expressão específica de enzimas ou proteínas prejudiciais, ou a expressão de RNA de anti-senso para o gene alvo ou para genes celulares gerais. Os promotores de planta também podem ser usados para conceder resistência a nematódeo especificamente no sítio de alimentação por transformação da planta com um construto compreendendo o promotor do gene alvo de planta ligado em um gene cujo produto induz letalidade no nematódeo após ingestão.

Recentemente, interferência de RNA (RNAi), também

chamada de silenciamento de gene, tem sido proposta como um método para controlar nematódeos. Quando RNA de fita dupla (dsRNA) correspondendo essencialmente à seqüência de um gene alvo ou mRNA é introduzido em uma célula, expressão do gene alvo é inibida (Veja e.g., Patente U.S. No. 10 6.506.559). Patente U.S. No. 6.506.559 demonstra a efetividade de RNAi contra genes conhecidos em Caenorhabditis elegans, mas não demonstra a utilidade de RNAi para controlar nematódeos parasitas de planta.

Uso de RNAi para selecionar genes de nematódeo essenciais alvo tem sido proposto, por exemplo, em Publicação PCT de No. WO 01/96584, WO 01/17654, US 2004/0098761, US 2005/0091713, US 2005/0188438, US 2006/0037101, US 2006/0080749, US 2007/0199100, e US 2007/0250947.

A Numerosos modelos têm sido propostos para a ação de RNAi. Em sistemas de mamífero, dsRNAs maior do que 30 nucleotídeos 20 aciona a indução de síntese de interferon e uma parada global de síntese de proteína, em uma maneira não específica para seqüência. Contudo, Patente U.S. No. 6.506.559 revela que em nematódeos, o comprimento do dsRNA correspondendo à seqüência de gene alvo pode ser pelo menos 25, 50, 100, 200, 300, ou 400 bases, e que dsRNAs até mesmo maiores também foram 25 eficazes na indução de RNAi em C. elegans. É sabido que quando construtos de RNA grampo-de-cabelo compreendendo regiões de fita dupla variando de 98 a 854 nucleotídeos foram transformado em numerosas espécies de planta, os genes de planta alvo foram eficazmente silenciados. Há uma concordância geral que em muitos organismos, incluindo nematódeos e plantas, pedaços grandes de dsRNA são clivados em fragmentos de cerca de 19-24 nucleotídeos (siRNA) dentro de células, e que estes siRNAs são os mediadores reais do fenômeno de RNAi.

As várias proteína-quinases dependentes de cálcio (CDPKs) em plantas medeiam uma variedade de respostas ao ambiente. Foi demonstrado que uma CDPK específica em Medicago truncatula (CDPKl) é necessária para a transformação de interações simbióticas entre plantas e fungos mycorrhizal e Rhizobia (veja Ivashuta et al., (2005) Plant Cell 17: 2911-2921). Ivashuta et al. sugerem que CDPKl está envolvida na síntese e/ou expansão de parede celular.

Embora tenha havido numerosos esforços para usar RNAi para controlar nematódeos parasitas de planta, até o momento nenhuma planta transgênica resistente a nematódeo tem sido desregulada em qualquer país. Conformemente, continua a haver uma necessidade para identificar métodos e composições eficazes e seguras para o controle de nematódeos de planta usando RNAi, e para a produção de plantas tendo resistência aumentada aos nematódeos parasitas de planta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores têm descoberto que a infra-regulação de proteína-quinases dependentes de cálcio (genes semelhantes a CDPL ou CDPKs), exemplificadas por cDNA de G. max designado por 49806575, concede à planta resistência a nematódeos. Esta infra-regulação pode ser realizada usando RNAi que seleciona tais genes semelhantes a CDPK.

Em uma modalidade, a invenção fornece uma molécula de dsRNA compreendendo (a) uma primeira fita compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK e (b) uma segunda fita compreendendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita.

A invenção é adicionalmente representada como modalidade em uma coleção de moléculas de dsRNA compreendendo uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo sendo 5 substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CDPK.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica resistente a nematódeo capaz de expressar um dsRNA que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CDPK.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta 10 transgênica capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA, sendo que cada molécula de dsRNA compreende uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19-24 nucleotídeos e sendo que as moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CDPK.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método de

preparar uma planta transgênica capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA cada uma das quais é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK em uma planta, dito método compreendendo as etapas de: a) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é 20 substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de um gene semelhante a CDPK uma vez expressado na planta; b) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a 25 progênie para expressão de dito transcrito.

A invenção adicionalmente fornece um método de conceder resistência a nematódeo de uma planta, dito método compreendendo as etapas de: a) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de a gene semelhante a CDPK uma vez expressado na planta; b) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a progênie para resistência a nematódeo. A invenção adicionalmente fornece um cassete de expressão e um vetor de expressão compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK.Em outra modalidade, a invenção fornece um método para controlar a infecção de uma planta por um nematódeo parasita, compreendendo as etapas de transformar a planta com uma molécula de dsRNA operacionalmente ligada em um promotor preferido em raiz, induzível por nematódeo ou preferido em sítio de alimentação, com o qual o dsRNA compreendendo uma fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um ácido nucleico alvo essencial para a formação, o desenvolvimento ou o suporte do sítio de alimentação, em particular a formação, o desenvolvimento ou o suporte de uma célula gigante ou sincicial, controlando deste modo a infecção da planta pelo nematódeo pela remoção ou incapacitação funcional do sítio de alimentação, dos sincícios ou da célula gigante, sendo que o ácido nucleico alvo é um gene semelhante a CDPK.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

Figura 1 mostra a tabela de SEQ ID NOs atribuídas às seqüências correspondentes. SEQ ID NO: 1 é a seqüência de cDNA parcial de clone 49806575 de Glycine max, incluindo o códon de terminação e a região 3' não-traduzida. SEQ ID NO: 2 é a seqüência de senso do fragmento de 49806575 (SEQ ID NO: 1) usada no ensaio de explante enraizado de Exemplo 2. SEQ ID NO; 3 é a seqüência de aminoácidos codificada por 49806575 (SEQ ID NO: I). SEQ ID NO: 4 é a seqüência de cDNA de Medicago Genbank acesso AY821654, incluindo seqüências codificadoras e não-codificadoras. A primeira base da região codificadora corresponde ao nucleotídeo 147, e a última base do códon de terminação corresponde ao nucleotídeo 1829. SEQ ID NO: 5 é a seqüência sintetizada descrita em Exemplo I, e SEQ ID NO: 6 é a seqüência do promotor semelhante a TPP (SEQ ID NO:6) descrita em copendente USSN 60/874,375 e aqui incorporada 5 como referência.

Figuras 2a-2c mostram alinhamento de aminoácido de proteínas semelhantes a CDPK: o clone 49806575 de cDNA de Glycine parcial (SEQ ID NO:3), a proteína codificada por AY821654 de Medicago (SEQ ID NO: 7), a proteína codificada por AY823957 de Medicago (SEQ ID 10 NO: 9), a proteína codificada por AF435451 de Nicotiana (SEQ ID NO: 11), a proteína codificada por AY971376 de Nicotiana (SEQ ID NO: 13), a proteína codificada por AF030879 de Solanum (SEQ ID NO: 15), a proteína

17), a proteína 19), a proteína 21), a proteína

codificada por At2gl7890 de Arabidopsis (SEQ ID NO codificada por At4g36070 de Arabidopsis (SEQ ID NO codificada por At5g66210 de Arabidopsis (SEQ ID NO:

codificada por NM OO1052286 de Oryza (SEQ ID NO: 23), a proteína codificada por NM OO1065979 de Oryza (SEQ ID NO: 25) e o produto amplificado de CDPK 5' RACE PCR, RKF195-3, de Glycine (SEQ ID NO:27). o alinhamento é realizado em conjunto de programas de computador 20 Vector NTI (penalidade de abertura de lacuna =10, penalidade de extensão de lacuna = 0,05, penalidade de separação de lacuna = 8).

Figura 3 mostra a identidade de aminoácido global de genes semelhantes a CDPK exemplares: a proteína codificada pelo clone 49806575 parcial de Glycine (SEQ ID NO:3), a proteína codificada por RKF195-3' de 25 Glycine (SEQ ID NO: 27), a proteína codificada por AY821654 de Medicago (SEQ ID NO: 7), a proteína codificada por AY823957 de Medicago (SEQ ID NO: 9), a proteína codificada por AF435451 de Nicotiana (SEQ ID NO: 11), a proteína codificada por AY971376 de Nicotiana (SEQ ID NO: 13), a proteína codificada por AF030879 de Solanum (SEQ ID NO: 15), a proteína codificada por At2gl7890 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 17), a proteína codificada por At4g36070 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 19), a proteína codificada por At5g66210 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 21), a proteína codificada por NM OO1052286 de Oryza (SEQ ID NO: 23) e a proteína 5 codificada por NM OO1065979 de Oryza (SEQ ID NO: 25). Apenas a região de recobrimento com o clone 49806575 de cDNA parcial foi incluída na análise. Alinhamentos em pares e identidades percentuais foram calculadas usando Needle of EMBOSS-4.0.0 (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453).

Figura 4 mostra a identidade percentual de nucleotídeo global

de genes semelhantes a CDPK exemplares: o clone 49806575 parcial de Glycine (SEQ ID NO: I), RKF195-3' de Glycine (SEQ ID NO:26), AY821654 de Medicago (SEQ ID NO:4), AY823957 de Medicago (SEQ ID NO: 8), AF435451 de Nicotiana (SEQ ID NO: 10), AY971376 de Nicotiana 15 (SEQ ID NO: 12), AF030879 de Solanum (SEQ ID NO: 14), At2gl7890 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 16), At4g36070 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 18), At5g66210 de Arabidopsis (SEQ ID NO: 20), NM_001052286 de Oryza (SEQ ID NO: 22), e NMJXH065979 de Oryza (SEQ ID NO: 24). Apenas a região de recobrimento com o clone 49806575 de cDNA parcial foi incluída 20 na análise. Alinhamentos em pares e identidades percentuais foram calculadas usando Needle of EMBOSS-4.0.0 (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453).

Figuras 5a-5g mostram vários 21 mers possíveis para genes semelhantes a CDPK exemplares de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26 ou uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de um homólogo de semelhante a CDPK por posição de nucleotídeo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção pode ser entendida mais prontamente com referência à seguinte descrição detalhada das modalidade preferidas da invenção e dos exemplos aqui incluídos. A não ser que indicado de outro modo, os termos aqui usados são para serem entendidos de acordo com o uso convencional por aquelas pessoas experientes na arte relevante. Em adição às definições de termos fornecidas abaixo, as definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer- Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement). É para ser entendido que como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, "um" ou "uma" pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado. Assim, por exemplo, referência a "uma célula" pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada. É para ser entendido que a terminologia aqui usada é para o propósito apenas de descrever modalidades específicas e não é intencionada para ser limitante.

Em todo este pedido, são feitas referências a várias publicações de patente e de literatura. As revelações de todas estas publicações e daquelas referências citadas dentro daquelas publicações em suas totalidades são por meio deste incorporadas como referências neste pedido com o propósito de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual este invenção pertence.

Um "gene semelhante a CDPK" de planta é aqui definido como um gene tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo 49806575 tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, que é o gene semelhante a CDPK de G. max. De acordo com a invenção, genes semelhantes a CDPK incluem genes tendo seqüências tais como aquelas mostradas em SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e 26, que são homólogos do gene semelhante a CDPK de G. max de SEQ ID NO:l. Os genes semelhantes a CDPK aqui definidos codificam polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polipeptídeo semelhante a CDPK de G. max tendo a seqüência como mostrada em SEQ ID NO:3. Tais polipeptídeos incluem polipeptídeos semelhantes a CDPK tendo seqüências como mostradas em SEQ ID NOs: 7, 5 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25 e 27.

Genes semelhantes a CDPK adicionais (homólogos de gene semelhante a CDPK) podem ser isolados de plantas diferentes de feijão soja usando a informação aqui fornecida e as técnicas conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte de biotecnologia. Por exemplo, uma molécula de 10 ácido nucleico de uma planta que hibridiza sob condições estringentes com o ácido nucleico de SEQ ID NO:l pode ser isolada de bibliotecas de cDNA de tecido de planta. Alternativamente, mRNA pode ser isolado de células de planta (e.g., pelo procedimento de extração em tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299), e cDNA pode ser 15 preparado usando transcriptase reversa (e.g., transcriptase reversa de Moloney MLV, disponível na Gibco/BRL, Bethesda, MD; ou Transcriptase reversa de AMV, disponível na Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para amplificação por reação em cadeia da polimerase podem ser projetados baseado na seqüência de nucleotídeos 20 mostrada em SEQ ID NO:l. Podem ser projetados iniciadores de oligonucleotídeos adicionais que são baseados nas seqüências dos genes semelhantes a CDPK tendo as seqüências como mostradas em SEQ ID NOs:

2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, e 26. Moléculas de ácido nucleico correspondendo aos genes alvo semelhantes a CDPK aqui definidos podem 25 ser amplificadas usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um modelo e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com técnicas de amplificação por PCR padrão. As moléculas de ácido nucleico assim amplificadas podem ser clonadas em vetores apropriados e caracterizadas por análise de seqüência de DNA. Como aqui usado, "RNAi" ou "interferência de RNA" refere- se a um processo de silenciamento de gene pós-transcricional específico de seqüência em plantas, mediado por RNA de fita dupla (dsRNA). Como aqui usado, "dsRNA" refere-se a RNA que é de fita parcial ou completamente dupla. RNA de fita dupla também é chamado de um RNA interferente curto ou pequeno (siRNA), ácido nucleico interferente curto (siRNA), RNA interferente curto, micro-RNA (miRNA), e semelhantes. No processo de RNAi, dsRNA compreendendo uma primeira fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene alvo e.g. um gene semelhante a CDPK e uma segunda fita que é complementar à primeira fita é introduzido em uma planta. Após introdução na planta, o dsRNA específico de gene alvo é processado em fragmentos relativamente pequenos (siRNAs) e pode ser subseqüentemente tomado distribuído em toda a planta, causando uma mutação de perda-de-função tendo um fenótipo que, durante um período de regeneração, pode se tomar muito proximamente parecido com o fenótipo decorrente de uma deleção parcial ou completa do gene alvo. Alternativamente, o dsRNA específico de gene alvo está operacionalmente associado em um elemento regulatório ou promotor que resulta em expressão do dsRNA em um tecido, maneira temporal, espacial ou induzível e pode ser adicionalmente processado em fragmentos relativamente pequenos por uma célula de planta contendo o maquinário de processamento de RNAi, e é obtido o fenótipo de perda-de-função. Também, o elemento regulatório ou promotor pode dirigir a expressão quer constitutivamente naqueles tecidos quer sob indução pela alimentação do nematódeo ou nematódeo juvenil, tal como nematódeos J2.

Como aqui usado, tomando-se em consideração a substituição de timina por uracila quando se comparam seqüências de RNA e DNA, o termo "substancialmente idêntico" como aplicado a dsRNA significa que a seqüência de nucleotídeos de uma fita do dsRNA é pelo menos cerca de 80%- 90% idêntica a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90-95%, idêntico a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ou absolutamente idêntica a ou mas nucleotídeos contíguos do gene alvo. 20 ou mais nucleotídeos contíguos significa uma porção, sendo pelo menos cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, bases consecutivas ou até o comprimento total do gene alvo.

Como aqui usado, polinucleotídeos "complementares" são aqueles que são capazes de parear bases de acordo com as regras de complementaridade padrão de Watson-Crick. Especificamente, purinas parearão com pirimidinas para formar uma combinação de guanina pareada com citosina (G:C) e quer adenina pareada com timina (A:T) no caso de

r

DNA, quer adenina pareada com uracila (A:U) no caso de RNA. E entendido que dois polinucleotídeos podem hibridizar um com o outro até mesmo se não forem complementares entre si, desde que cada um tenha pelo menos uma região que é substancialmente complementar a do outro.. Como aqui usado, o termo "substancialmente complementar" significa que duas seqüências de ácido nucleico são complementares em mais de pelo menos a 80% de seus nucleotídeos. Preferivelmente, as duas seqüências de ácido nucleico são complementares em mais de pelo menos a 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou todos de seus nucleotídeos. Alternativamente, "substancialmente complementar" significa que duas seqüências de ácido nucleico podem hibridizar sob condições de estringência. Como aqui usado, o termo "substancialmente idêntico" ou "correspondendo a" significa que duas seqüências de ácido nucleico têm pelo menos 80% de identidade de seqüência. Preferivelmente, as duas seqüências de ácido nucleico têm pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência. Também como aqui usados, os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" referem-se a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um seu híbrido. O termo também inclui híbridos de RNA/DNA. Quando dsRNA é produzido sinteticamente, bases menos comuns, tais como inosina, 5-metil-citosina, 6-metil-adenina, hipoxantina e outras também podem ser usadas para pareamento de anti-senso, dsRNA, e ribozima. Por exemplo, tem sido mostrado que polinucleotídeos que contêm análogos de C-5 propino de uridina e citidina se ligam em RNA com afinidade alta e são inibidores de anti-senso potentes da expressão de gene. Outras modificações, tais como modificações na estrutura principal de fosfodiéster, ou na 2'-hidroxila no grupo açúcar ribose do RNA também podem ser feitas.

Como aqui usado, o termo "controle", quando usado no contexto de uma infecção, refere-se à redução ou prevenção de uma infecção. Redução ou prevenção de uma infecção por um nematódeo fará com que uma planta tenha resistência aumentada ao nematódeo, contudo, tal resistência aumentada não implica que a planta necessariamente tenha resistência de 100% à infecção. Em modalidades preferidas, a resistência à infecção por um nematódeo em uma planta resistente é maior do que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% em comparação com uma planta de tipo selvagem que não é resistente a nematódeos. Preferivelmente a planta de tipo selvagem é uma planta de um genótipo similar, mais preferivelmente idêntico ao da planta tendo resistência aumentada ao nematódeo, mas não compreende um dsRNA direcionado para o gene alvo. A resistência da planta à infecção pelo nematódeo pode ser devido à morte, esterilidade, parada no desenvolvimento, ou mobilidade prejudicada do nematódeo sob exposição à planta compreendendo dsRNA específico para um gene essencial para o desenvolvimento ou a manutenção de um sítio de alimentação funcional, sincícios, ou célula gigante. O termo "resistente à infecção por nematódeo" ou "uma planta tendo resistência ao nematódeo" como aqui usado refere-se à capacidade de uma planta, em comparação com uma planta de tipo selvagem, para evitar infecção por nematódeos, para matar nematódeos ou para impedir, reduzir ou parar o desenvolvimento, o crescimento ou a multiplicação de nematódeos. Isto pode ser conseguido por um processo ativo, e.g. pela produção de uma substância prejudicial para o nematódeo, ou por um processo passivo, como ter um valor nutricional reduzido para o nematódeo ou não desenvolver estruturas induzidas pelo sítio de alimentação de nematódeo como sincícios ou células gigantes. O nível de resistência de nematódeo de uma planta pode ser determinado em várias maneiras, e.g. pela contagem dos nematódeos que são capazes de estabelecer parasitismo sobre aquela planta, ou pela medição dos tempos de desenvolvimento de nematódeos, pela proporção de nematódeos machos e fêmeas ou, para nematódeos de cisto, pela contagem do número de cistos ou ovos de nematódeo produzidos sobre raízes de uma planta infectada ou um sistema de ensaio de planta.

O termo "planta" é intencionado para incluir plantas em qualquer estágio de maturidade ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de planta) obtidos de ou derivados de qualquer tal planta a não ser que seja indicado diferentemente pelo contexto. Partes de planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, flores, óvulos, estames, sementes, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos, culturas de raiz peluda, culturas de explante enraizado e semelhantes. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas da presente invenção. Em uma modalidade, as sementes são geração verdadeira para uma resistência aumentada à infestação por nematódeo em comparação com uma variedade de tipo selvagem da semente de planta. Como aqui usada, uma "célula de planta" inclui, mas não é limitada a, um protoplasto, célula produtora de gametas, e uma célula que regenera em uma planta inteira. Cultura de tecido de vários tecidos de plantas e regeneração de plantas a partir dos mesmos são bem conhecidas na arte e estão amplamente publicadas.

5 Como aqui usado, o termo "transgênico" refere-se a qualquer

planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante está estavelmente integrado(a) em um cromossomo ou elemento extra-cromossômico estável, de 10 modo que é passado para as gerações sucessivas. Para os propósitos da invenção, o termo "polinucleotídeo recombinante" refere-se a um polinucleotídeo que tem sido alterado, rearranjado, ou modificado por engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, ou polinucleotídeos, que estão ligados ou unidos em seqüências heterólogas. O 15 termo "recombinante" não se refere às alterações de polinucleotídeos que resultam de eventos naturalmente ocorrentes, tais como mutações espontâneas, ou de mutagênese não-espontânea seguida por geração seletiva.

Como aqui usado, o termo "quantidade suficiente para inibir expressão" refere-se a uma concentração ou quantidade do dsRNA que é 20 suficiente para reduzir níveis ou estabilidade de mRNA ou proteína produzido(a) a partir de um gene alvo em uma planta. Como aqui usado, "inibir expressão" refere-se à ausência ou decréscimo observável no nível de proteína e/ou produto de mRNA a partir de um gene alvo. Inibição de expressão de gene alvo pode ser letal para o nematódeo parasita quer direta 25 quer indiretamente através de modificação ou erradicação do sítio de alimentação, sincícios, ou célula gigante, ou tal inibição pode retardar ou prevenir a entrada em uma etapa desenvolvente particular (e.g., metamorfose), se acesso a um sítio de alimentação totalmente funcional, sincícios, ou célula gigante estiver associado com um estágio particular do ciclo de vida de nematódeo parasita. As conseqüências de inibição podem ser confirmadas pelo exame da raiz da planta para redução ou eliminação de cistos ou outras propriedades do nematódeo ou da infestação por nematódeo (como apresentado abaixo no Exemplo 2).

De acordo com a invenção, a planta é transformada com um ácido nucleico ou um dsRNA, que especificamente inibe expressão de um gene alvo (gene semelhante a CDPK) na planta que é essencial para o desenvolvimento ou a manutenção de um sítio de alimentação, sincícios, ou célula gigante; em fim afetando a sobrevivência, a metamorfose, ou a reprodução do nematódeo. Em uma modalidade, o dsRNA é codificado por um vetor que tem sido transformado em um progenitor da planta infectada. Preferivelmente, a seqüência de ácido nucleico expressando dito dsRNA está sob o controle transcricional de um promotor específico para raiz ou um promotor específico para célula de alimentação de nematódeo parasita ou um promotor induzível por nematódeo.

Conformemente, o dsRNA da invenção compreende uma primeira fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK tal como o cDNA 49806575 de feijão-soja, e uma segunda fita que é substancialmente complementar à primeira fita. Em modalidades preferidas, o gene alvo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5,

8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; (b) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12,

14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e (c) um polinucleotídeo de uma planta que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,

24 ou 26. O comprimento das seqüências de nucleotídeos de fita dupla substancialmente idênticas pode ser pelo menos cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, bases consecutivas ou até o comprimento total do gene semelhante a CDPK. Em uma modalidade preferida, o comprimento da seqüência de nucleotídeos de fita dupla é de cerca de 19 a cerca de 200-500 nucleotídeos consecutivos em comprimento. Em outra modalidade preferida, o dsRNA da invenção é substancialmente idêntico ou é idêntico às bases 1 a 320 de SEQ ID NO: 2.

Como discutido acima, fragmentos de dsRNA maiores do que cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento são clivados intracelularmente por nematódeos e plantas em siRNAs de cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento, e estes siRNAs são os mediadores reais do fenômeno de RNAi. A tabela em Figuras 51-5g indica 21-mers exemplares dos genes semelhantes a CDPK aqui definidos. Esta tabela também pode ser usada para calcular os 19, 20, 22, 23 ou 24-mers pela adição ou subtração do número apropriado de nucleotídeos de cada 21mer. Assim o dsRNA da presente invenção pode variar em comprimento de cerca de 19 nucleotídeos a 320 nucleotídeos. Preferivelmente, o dsRNA da invenção tem um comprimento de cerca de 21 nucleotídeos a 500 nucleotídeos. Mais preferivelmente, o dsRNA da invenção tem um comprimento de cerca de 21 nucleotídeos a 500 nucleotídeos, ou de cerca de 21 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos.

Como aqui revelado, 100% de identidade de seqüência entre o RNA e o gene alvo não é exigido para praticar a presente invenção. Embora um dsRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos idêntica a uma porção do gene semelhante a CDPK seja preferida para inibição, a invenção pode tolerar variações de seqüência que podem ser esperadas devido à síntese ou manipulação de gene, mutação genética, polimorfismo de cepa, ou divergência evolucionária. Assim os dsRNAs da invenção também incluem dsRNAs compreendendo uma combinação má com o gene alvo de pelo menos 1, 2, ou mais nucleotídeos. Por exemplo, é contemplado na presente invenção que as seqüências de 2 Imer dsRNA exemplificadas em Figuras 5a- 5g pode conter uma adição, deleção ou substituição de 1, 2, ou mais nucleotídeos, com a condição de que a seqüência resultante ainda interfira com a função de gene semelhante a CDPK.

Identidade de seqüência entre os dsRNAs da invenção os genes alvo semelhante a CDPK pode ser otimizada por algoritmos de alinhamento e comparação de seqüências conhecidos na arte (veja Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, e referências citadas no mesmo) e cálculo da diferença percentual entre as seqüências de nucleotídeos por, por exemplo, o algoritmo de Smith-Waterman como implementado no programa de computador BESTFIT usando parâmetros padrão (e.g., University of Wisconsin Genetic Computing Group). Mais do que 80 % de identidade de seqüência, 90% de identidade de seqüência, ou até mesmo 100% de identidade de seqüência, entre o RNA inibitório e a porção do gene alvo é preferida. Alternativamente, a região duplex do RNA pode ser definida funcionalmente como uma seqüência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar com uma porção transcrito de gene alvo sob condições estringentes (e.g., NaCl 400 mM, PIPES 400 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, hibridização 60°C por 12-16 horas; seguida por lavagem a 65°C com SDS 0,1% e SSC

0,1% por cerca de 15-60 minutos).

Quando dsRNA da invenção tem um comprimento mais longo do que cerca de 21 nucleotídeos, por exemplo de cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos, ele será clivado aleatoriamente em dsRNAs de cerca de 21 nucleotídeos dentro de célula de nematódeo parasita ou de planta, os siRNAs. A clivagem de um dsRNA mais curto da invenção dará uma coleção de cerca de 2 Imer dsRNAs (variando de cerca de 19mers a cerca de 24mers), derivado do dsRNA mais longo. Esta coleção de cerca de 2 Imer dsRNAs também está incluída dentro do escopo da presente invenção, quer gerada intracelularmente dentro da planta ou do nematódeo quer sinteticamente usando métodos conhecidos de síntese de oligonucleotídeo.

Os siRNAs da invenção têm seqüências correspondendo aos fragmentos de cerca de 19-24 nucleotídeos contíguos através da seqüência inteira de um gene alvo semelhante a CDPK. Por exemplo, uma coleção de siRNA da invenção derivada do gene semelhante a CDPK como mostrado em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 podem 5 compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA que são selecionadas do grupo consistindo de oligonucleotídeos substancialmente idênticos aos 2Imer nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 encontrados em Figuras 5a-5g. Uma coleção de siRNA da invenção derivada de gene alvo semelhante a CDPK de SEQ ID NO: 1 também pode 10 compreender qualquer combinação das moléculas de RNA específicas tendo qualquer uma das 21 seqüências de nucleotídeos contíguas derivadas de SEQ ID NO: 1 mostrada em Figuras 5a-5g. Ademais, como notado acima, múltiplos Dicers especializados em plantas geram siRNAs tipicamente variando em tamanho de 19nt a 24nt (Veja Henderson et al., 2006. Nature Ge- 15 netics 38:721-725). Os siRNAs da presente invenção podem variar de cerca de 19 seqüências de nucleotídeos contíguos a cerca de 24 seqüências de nucleotídeos contíguos. Similarmente, uma coleção de siRNA da invenção podem compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA tendo qualquer uma de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 seqüências de nucleotídeos 20 contíguos derivadas de SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26. Alternativamente, a coleção de siRNA da invenção pode compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA tendo uma combinação de qualquer uma de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, e/ou 24 seqüências de nucleotídeos contíguos derivadas de SEQ ID NO: 1.

O dsRNA da invenção pode opcionalmente compreender uma

projeção de fita única em qualquer uma ou em ambas as extremidades. A estrutura de fita dupla pode ser formada por uma fita de RNA auto- complementar única (i.e. formando uma alça de grampo-de-cabelo) ou duas fitas de RNA complementares. Formação de duplex de RNA pode ser iniciada quer dentro quer fora da célula. Quando o dsRNA da invenção forma uma alça de grampo-de-cabelo, ele pode opcionalmente compreender um íntron, como mostrado em US 2003/0180945Al ou um espaçador de nucleotídeo, que é um segmento de seqüência entre as fitas de RNA complementares para 5 estabilizar o transgene de grampo-de-cabelo em células. Métodos para preparar várias moléculas de dsRNA são mostrados, por exemplo, em WO 99/53050 e em Pat. U.S. No. 6.506.559. O RNA pode ser introduzido em uma quantidade que permite liberação de pelo menos uma cópia por célula. Doses mais altas de material de fita dupla podem dar inibição mais eficaz.

Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor de

expressão recombinante isolado compreendendo um ácido nucleico codificador de uma molécula de dsRNA como descrita acima, sendo que a expressão do vetor em uma célula hospedeira de planta resulta em resistência aumentada a um nematódeo parasita em comparação com uma variedade de 15 tipo selvagem da célula hospedeira de planta. Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico no qual tem estado ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, no 20 qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira de planta na qual estão introduzidos. Outros vetores são integrados no genoma de uma célula hospedeira de planta sob introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, 25 certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes nos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores são aqui chamados de "vetores de expressão". Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" pode ser usado intercambiavelmente porque o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada. Contudo, a invenção é intencionada para incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (e.g., vírus X da batateira, vírus das manchas cloróticas amarelas do tabaco, e Geminivírus), que servem com funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira de planta, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais seqüências regulatórias,e.g. promotores, selecionadas baseando-se nas células hospedeiras de planta a serem usadas para expressão, que está operacionalmente ligado na seqüência de ácido nucleico a ser expressada. Com respeito a um vetor de expressão recombinante, os termos "operacionalmente ligado" e "em associação operativa" são intercambiáveis e são intencionados para significar que a seqüência de ácido nucleico de interesse está ligada na(s) seqüência(s) regulatória(s) em uma maneira que permite a expressão da seqüência de nucleotídeos (e.g., em uma célula hospedeira de planta quando o vetor é introduzido na célula hospedeira de planta). O termo "seqüência regulatória" é intencionado para incluir promotores, intensificadores, e outros elementos de controle de expressão (e.g., sinais de poliadenilação). Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick e Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluindo as referências dos mesmos. Seqüências regulatórias incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão da seqüência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Será reconhecido por aquelas pessoas experientes na arte que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de dsRNA desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células 5 hospedeiras de planta para deste modo produzirem moléculas de dsRNA da invenção codificadas por ácido nucleicos como aqui descrito.

De acordo com a invenção, o vetor de expressão recombinante compreende uma seqüência regulatória operacionalmente ligada em uma seqüência de nucleotídeos que é um modelo para uma ou ambas as fitas das 10 moléculas de dsRNA da invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico adicionalmente compreende um promotor flanqueando qualquer extremidade da molécula de ácido nucleico, sendo que os promotores dirigem a expressão de cada fita individual de DNA, gerando deste modo dois RNAs complementares que hibridizam e formam o dsRNA. Em outra modalidade, a 15 molécula de ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos que é transcrita em ambas as fitas do dsRNA em uma unidade de transcrição, sendo que a fita de senso é transcrita da extremidade 5' da unidade de transcrição e a fita de anti-senso é transcrita da extremidade 3', sendo que as duas fitas são separadas por cerca de 3 a cerca de 500 pares de bases, e sendo que após a 20 transcrição, o transcrito de RNA dobra-se sobre si mesmo para formar um grampo-de-cabelo. De acordo com a invenção, a região espaçadora no transcrito de grampo-de-cabelo pode ser qualquer fragmento de DNA.

De acordo com a presente invenção, o polinucleotídeo introduzido pode ser mantido na célula de planta estavelmente se ele é 25 incorporado em um replicon autônomo de não-cromossomo ou integrado nos cromossomos da planta. Alternativamente, o polinucleotídeo introduzido pode estar presente em um vetor não-replicativo extra-cromossômico e ser transientemente expressado ou transientemente ativo. Se presente em um vetor não-replicativo extra-cromossômico ou um vetor que está integrado em um cromossomo, o polinucleotídeo preferivelmente reside em um cassete de expressão em planta. Um cassete de expressão em planta preferivelmente contém seqüências regulatórias capazes de dirigir a expressão de gene em células de planta que estão operacionalmente ligadas de modo que cada seqüência possa realizar sua função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação preferidos são aqueles originários de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tal como o gene 3 conhecido como octopina sintase do plasmídeo-Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou seus equivalentes funcionais, mas também outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados. Como o vetor de expressão de gene de planta é muito freqüentemente não limitado aos níveis transcricionais, um cassete de expressão em planta preferivelmente contém outras seqüências operacionalmente ligadas como intensificadores de tradução tal como seqüência overdrive contendo seqüência líder 5'-não- traduzida do vírus do mosaico do tabaco intensificando a razão de polipeptídeo por RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693- 8711). Exemplos de vetores de expressão em planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D. et al., 1992, "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the Ieft border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; e "Vectors for Gene Transfer in Higher Plants"; em: Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Expressão de gene de planta deve estar operacionalmente ligada em um promotor apropriado que concede expressão de gene em uma maneira temporal-preferida, espacial-preferida, tipo-de-célula-preferida, e/ou tecido-preferida. Promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem qualquer promotor que é capaz de iniciar transcrição em uma célula de planta presente nas raízes de planta. Tais promotores incluem, mas não são limitados àqueles que podem ser obtidos de plantas, vírus de planta e bactérias que contêm genes que são expressados em plantas, tais como Agrobacterium e Rhizobium. Preferivelmente, o cassete de expressão da invenção compreende um promotor específico para raiz, um promotor induzível por patógeno ou um promotor induzível por nematódeo. Mais preferivelmente o promotor induzível por nematódeo é um promotor específico de sítio de alimentação de nematódeo parasita. Um promotor específico de sítio de alimentação de nematódeo parasita pode ser específico para células sinciciais ou células gigantes ou específico para ambos os tipos de células. Um promotor é induzível, se sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzido sob controle do promotor é pelo menos 30%, 40%, 50% preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% mais preferido pelo menos 100%, 200%, 300% maior em seu estado induzido, do que em seu estado não-induzido. Um promotor é específico para célula, tecido ou órgão, se sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzida sob controle do promotor, for pelo menos 30%, 40%, 50% preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% mais preferido pelo menos 100%, 200%, 300% maior em um tipo de célula, tecido ou órgão particular, do que em outros tipos de célula, ou tecidos da mesma planta, preferivelmente os outros tipos de célula ou tecidos são tipos de célula ou tecidos do mesmo órgão de planta, e.g. uma raiz. No caso de promotores específicos para órgão, a atividade de promotor tem que ser comparada com a atividade de promotor em outros órgãos de planta, e.g. folhas, caules, flores ou sementes.

O promotor pode ser constitutivo, induzível, preferido para estágio desenvolvente, preferido para tipo de célula, preferido para tecido ou preferido para órgão. Promotores constitutivos são ativos sob a maioria das condições. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem os promotores 19S e 35S de CaMV (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), o promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), o promotor Sepl, o promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), o promotor de actina de Arabidopsis, o promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), o promotor 35S do vírus do mosaico de escrofulária, o promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), o promotor GRP1-8, o promotor de cinamil-álcool- desidrogenase (Patente U.S. No. 5.683.439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, tais como promotor de manopina sintase, promotor de nopalina sintase, e promotor de octopina sintase, o promotor de subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO), e semelhantes. Promotores que expressam o dsRNA em uma célula que é contatada por nematódeos parasitas são preferidos. Alternativamente, o promotor pode conduzir expressão do dsRNA em um tecido de planta remoto do sítio de contato com o nematódeo, e o dsRNA pode ser então transportado pela planta para uma célula que é contatada pelo nematódeo parasita, em particular células de ou próximas pelos sítio de alimentação, e.g. células sinciciais ou células gigantes.

Promotores induzíveis são ativos sob certas condições, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou metabólito, calor, frio, luz, ataque patogênico, condições anaeróbicas, e semelhantes. Por exemplo, tem sido mostrado que os promotores TobRB7, AtRPE, AtPykl 0, Gemini 19, e AtHMGl são induzidos por nematódeos (para uma revisão de promotores induzíveis por nematódeos, veja Ann. Rev. Phytopathol. (2002) 40:191-219; veja também US 6.593.513). Método para isolar promotores adicionais, que são induzíveis por nematódeos são mostrados em Pat. U.S. Nos. 5.589.622 e 5.824.876. Outros promotores induzíveis incluem o promotor hsp80 de Brassica, sendo induzível por choque térmico; o promotor PPDK é induzido por luz; o promotor PR-1 de tabaco, Arabidopsis, e milho são induzíveis por infecção com um patógeno; e o promotor Adhl é induzido por hipoxia e estresse frio. Expressão de gene de planta também pode ser facilitada via um promotor induzível (para revisão, veja Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Promotores quimicamente induzíveis são especialmente adequados se for desejada expressão de gene tempo-específica.

5 Exemplos não-limitantes de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico (Pedido PCT No. WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2:397-404) e um promotor induzível por etanol (Pedido PCT No. WO 93/21334).

Promotores preferidos para estágio desenvolvente são preferivelmente expressados em certos estágios de desenvolvimento. Promotores específicos de tecido e de órgão incluem, mas não são limitados a, àqueles que são preferencialmente expressados em certos tecidos ou órgãos, tais como, mas não limitados a folhas, raízes, sementes, ou xilema. Exemplos de promotores preferidos para tecido e preferidos para órgão incluem, mas não são limitados a promotores preferidos para fruta, preferidos para óvulo, preferidos para tecido masculino, preferidos para semente, preferidos para tegumento, preferidos para tubérculo, preferidos para pedúnculo, preferidos para pericarpo, preferidos para folha, preferidos para estigma, preferidos para pólen, preferidos para antera, um preferido para pétala, preferidos para sépala, preferidos para pedicelo, preferidos para síliqua, preferidos para caule, preferidos para raiz e semelhantes. Promotores preferidos para semente são preferivelmente expressados durante desenvolvimento e/ou germinação de semente. Por exemplo, promotores preferidos para semente podem ser preferidos para embrião, preferidos para endosperma e preferidos para capa de semente. Veja Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferidos para semente incluem, mas não limitados a celulose sintase (celA), Cim 1, gama-zeína, globulina-1, zeína de 19 kD de milho (cZ19Bl) e semelhantes.

Outros promotores preferidos para tecido ou preferidos para órgão adequados incluem, mas não são limitados a, o promotor de gene de napina de colza (Patente U.S. No. 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (Pedido PCT No. WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente U.S. No. 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (Pedido PCT No. WO 91/13980), ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), bem como promotores que concedem expressão específica em semente em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados para anotar são o promotor de gene Ipt2 ou Iptl de cevada (Pedido PCT No. WO 95/15389 e Pedido PCT No. WO 95/23230) ou aqueles descritos em Pedido PCT No. WO 99/16890 (promotores do gene de hordeína de cevada, gene de glutelina de arroz, gene orizina de arroz, gene prolamina de arroz, gene gliadina de arroz, gene glutelina de trigo, gene de glutelina de aveia, gene casirina de sorgo, e gene de secalina de centeio).

Outros promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem, mas não são limitados a, o promotor de proteína ligante de clorofila a/b maior, promotores de histona, o promotor Ap3, o promotor de β- conglicina, o promotor de napina, o promotor de lecitina de feijão-soja, o promotor de zeína de 15kD de milho, o promotor de zeína de 22kD, o promotor de zeína de 27kD, o promotor de g-zeína, os promotores ceroso, shrunken 1, shrunken 2, e bronze, o promotor Zml3 (Patente U.S. No. 5.086.169), os promotores de poligalacturonase (PG) de milho (Patentes U.S. Nos. 5.412.085 e 5.545.546), e o promotor SGB6 (Patente U.S. No. 5.470.359), bem como promotores sintéticos e outros promotores naturais.

De acordo com a presente invenção, o cassete de expressão compreende uma seqüência de controle de expressão operacionalmente ligada em uma seqüência de nucleotídeos que é um modelo para uma ou ambas as fitas do dsRNA. O dsRNA modelo compreende (a) uma primeira fita tendo uma seqüência sendo substancialmente idêntica de cerca de 19 a cerca de 500, ou até o comprimento total de, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NOS:l,

2, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e (b) uma segunda fita tendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita. Em outras modalidades, o promotor flanqueia qualquer extremidade da seqüência de nucleotídeo modelo, sendo que o promotor dirige a expressão de cada fita de DNA individual, gerando deste modo dois RNAs complementares que hibridizam e formam o dsRNA. Em modalidades alternativas, a seqüência de nucleotídeos é transcrita em ambas as fitas do dsRNA em uma unidade de transcrição, sendo que a fita de senso é transcrita da extremidade 5' da unidade de transcrição e a fita de anti-senso é transcrita da extremidade 3', sendo que as duas fitas são separadas por cerca de 3 a cerca de 500 pares de bases, e sendo que após transcrição, o transcrito de RNA dobra-se sobre si mesmo para formar um grampo-de-cabelo.

Em outra modalidade, o vetor contém um promotor bidirecional, dirigindo a expressão de duas moléculas de ácido nucleico, por meio do qual a molécula de ácido nucleico codifica a seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK e a outra molécula de ácido nucleico codifica uma segunda seqüencia sendo substancialmente complementar à primeira fita e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as seqüências são transcritas. Um promotor bidirecional é um promotor capaz de mediar expressão em duas direções.

Em outra modalidade, o vetor contém dois promotores um mediando a transcrição da seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK e outro promotor mediando transcrição de uma segunda seqüência sendo substancialmente complementar à primeira fita e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as seqüências são transcritas. O segundo promotor pode ser um promotor diferente. Um promotor diferente significa um promotor tendo uma atividade diferente com relação à especificidade de tecido ou célula, ou mostrando expressão em indutores diferentes por exemplo, patógenos, estresse abiótico ou agentes químicos. Por exemplo, um promotor pode ser específico para tecido ou constitutivo e o outro pode ser específico para tecido ou induzível por patógenos. Em uma modalidade um promotor medeia a transcrição de uma molécula de ácido nucleico adequada para sobre-expressão de um gene semelhante a CDPK, enquanto que o outro medeia transcrição específica para célula ou tecido ou expressão induzível por patógeno do ácido nucleico complementar.

A invenção também é apresentada como modalidade em uma planta transgênica capaz de expressar o dsRNA da invenção e deste modo inibir os genes semelhantes a CDPK nas raízes, sítio de alimentação, sincícios e/ou célula gigante. A planta ou planta transgênica pode ser qualquer planta, tal como, mas não limitada a árvores, flores cortadas, plantas ornamentais, verduras/hortaliças ou plantas de colheita. A planta pode ser escolhida de um gênero selecionado do grupo consistindo de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, So-lanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triti-cale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Het-erocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium, ou a planta pode ser selecionada de um gênero selecionado do grupo consistindo de Arabidopsis, Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, So-lanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Brachipodium, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium. Em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

Preferivelmente a planta é uma planta de colheita. Plantas de colheita são todas as plantas, usadas em agricultura. Conformemente em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea, preferivelmente uma planta da família Poaceae, Musaceae, Liliaceae ou Bromeliaceae, preferivelmente da família Poaceae. Conformemente, em ainda outra modalidade a planta é uma planta Poaceae do gênero Zea, Triticum, Oryza, Hordeum, Secale, Avena, Saccharum, Sorghum, Pennisetum, Setaria, Panieum, Eleusine, Miscanthus, Brachypodium, Festuca ou Lolium. Quando a planta é do gênero Zea, a espécie preferida é Z. mays. Quando a planta é do gênero Triticum, a espécie preferida é T. aestivum, T. speltae ou T. durum. Quando a planta é do gênero Oryza, a espécie preferida é O. sativa. Quando a planta é do gênero Hordeum, a espécie preferida é H. vulgare. Quando a planta é do gênero Secale, a espécie preferida é S. cereale. Quando a planta é do gênero Avena, a espécie preferida é A. sativa. Quando a planta é do gênero Saccarum, a espécie preferida é S. officinarum. Quando a planta é do gênero Sorghum, a espécie preferida é S. vulgare, S. bicolor ou S. sudanense. Quando a planta é do gênero Pennisetum, a espécie preferida é P. glaucum. Quando a planta é do gênero Setaria, a espécie preferida é S. italica. Quando a planta é do gênero Panieum, a espécie preferida é P. miliaceum ou P. virgatum. Quando a planta é do gênero Eleusine, a espécie preferida é E. coracana. Quando a planta é do gênero Miscanthus, a espécie preferida é M. sinensis. Quando a planta é uma planta do gênero Festuca, a espécie preferida é F. arundinaria, F. rubra ou F. pratensis. Quando a planta é do gênero Lolium, a espécie preferida é L. perenne ou L. multiflorum. Alternativamente, a planta pode ser Triticosecale. Alternativamente, em uma modalidade a planta é uma planta dicotiledônea, preferivelmente uma planta da família Fabaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Linacea, Euphorbiaceae, Convolvulaceae Rosaceae, Cucurbitaceae, Theaceae, Rubiaceae, Sterculiaceae ou Citrus. Em uma modalidade a planta é uma planta da família Fabaceae, Solanaceae ou Brassicaceae. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Fabaceae, preferivelmente do gênero Glycine, Pisum, Arachis, Cicer, Vicia, Phaseolus, Lupinus, Medicago ou Lens. Espécies preferidas da família Fabaceae são M. truncatula, M, sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba, P. vulgaris, Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius ou Lens culinaris. Mais preferidas são as espécies G. max A. hypogea e M. sativa. Mais preferida é a espécie G. max. Quando a planta é da família Solanaceae, o gênero preferido é Solanum, Lycopersicon, Nicotiana ou Capsicum. Preferred species da família Solanaceae are S. tuberosum, L. esculentum, N. tabaccum ou C. chinense. Mais preferido é S. tuberosum. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Brassicaceae, preferivelmente do gênero Brassica ou Raphanus. Espécies preferidas da família Brassicaceae são as espécies B. napus, B. oleracea, B. juncea ou B. rapa. Mais preferida é a espécie B. napus. Quando a planta é da família Chenopodiaceae, o gênero preferido é Beta e a espécie preferida é a B. vulgaris. Quando a planta é da família Asteraceae, o gênero preferido é Helianthus e a espécie preferida é H. annuus. Quando a planta é da família Malvaceae, o gênero preferido é Gossypium ou Abelmoschus. Quando o gênero é Gossypium, a espécie preferida é G. hirsutum ou G. barbadense e a espécie mais preferida é G. hirsutum. Uma espécie preferida do gênero Abelmoschus é a espécie A. escuientus. Quando a planta é da família Linacea, o gênero preferido é Linum e a espécie preferida é L. usitatissimum. Quando a planta é da família Euphorbiaceae, o gênero preferido é Manihot, Jatropa ou Rhizinus e a espécie 5 preferida é M. esculenta, J. curcas ou R. comunis. Quando a planta é da família Convolvulaceae, o gênero preferido é Ipomea e a espécie preferida é I. batatas. Quando a planta é da família Rosaceae, o gênero preferido é Rosa, Malus, Pyrus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium ou Fragaria e a espécie preferida é o híbridoFragaria x ananassa. Quando a planta é da família 10 Cucurbitaceae, o gênero preferido é Cucumis, Citrullus ou Cucurbita e a espécie preferida é Cucumis sativus, Citrullus lanatus ou Cucurbita pepo. Quando a planta é da família Theaceae, o gênero preferido é Camellia e a espécie preferida é C. sinensis. Quando a planta é da família Rubiaceae, o gênero preferido é Coffea e a espécie preferida é C. arabica ou C. canephora. 15 Quando a planta é da família Sterculiaceae, o gênero preferido é Theobroma e a espécie preferida é T. cacao. Quando a planta é do gênero Citrus, a espécie preferida é C. sinensis, C. limon, C. reticulata, C. maxima e híbrido de espécie Citrus, ou semelhantes. Em uma modalidade preferida da invenção, a planta é uma planta de feijão-soja, uma batateira, ou uma planta de milho.

Em uma modalidade a planta é uma planta Fabaceae e o gene

alvo é substancialmente similar à SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8 ou 26. Em uma outra modalidade a planta é uma planta Brassicaceae e o gene alvo é substancialmente idêntico à SEQ ID NO: 16, 18 ou 20. Em uma modalidade alternativa a planta é uma planta Solanaceae e o gene alvo é substancialmente 25 idêntico à SEQ ID NO: 10, 12 ou 14. Em uma outra modalidade a planta é uma planta Poaceae e o gene alvo é substancialmente idêntico à SEQ ID NO: 22 ou 24.

Métodos adequados para transformar ou transfectar células hospedeiras incluindo células de planta são bem conhecidos na arte de biotecnologia de planta. Qualquer método pode ser usado para transformar o vetor de expressão recombinante em células de planta para dar as plantas transgênicas da invenção. Métodos gerais para transformar plantas dicotiledôneas são revelados, por exemplo, em Pat. U.S. Nos. 4.940.838; 5.464.763, e semelhantes. Métodos para transformar plantas dicotiledôneas específicas, por exemplo, algodoeiro, são mostrados em Pat. U.S. Nos. 5.004.863; 5.159.135; e 5.846.797. Métodos de transformação de feijão-soja que são mostrados em Pat. U.S. Nos. 4.992.375; 5.416.011; 5.569.834; 5.824.877; 6.384.301 e em EP 0301749B1 podem ser usados. Métodos de transformação podem incluir métodos diretos e indiretos de transformação. Métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por poli(etileno-glicol), transformação mediada por lipossomo (US 4.536.475), métodos biolísticos usando pistola de gene (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 1990), eletroporação, incubação de embriões secos em solução compreendendo DNA, e microinjeção. No caso destes métodos diretos de transformação, os plasmídeos usados não necessitam atender às exigências particulares. Plasmídeos simples, tais como aqueles da série pUC, pBR322, da série M13mp, pACYC184 e semelhantes podem ser usados. Se plantas intactas são para serem regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável é preferivelmente localizado no plasmídeo. As técnicas de transformação diretas são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Transformação também pode ser realizada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo EP 0.116.718), infecção viral por intermédio de vetores virais (EP 0.067.553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0.270.356; WO 85/01856; US 4.684.611). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na arte. A cepa de Agrobacterium (e.g., Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula de planta. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeo- Ri ou -Ti ou está separadamente compreendido em um denominado vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229. A transformação mediada por Agrobacterium é melhor adequada para plantas dicotiledôneas mas também tem sido adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita em, por exemplo, White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225. Transformação pode resultar em transformação e expressão transientes ou estáveis. Embora uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção possa ser inserida em qualquer planta e célula de planta caindo dentro destas classes amplas, ela é particularmente útil em células de planta de colheita.

As plantas transgênicas da invenção podem ser cruzadas com plantas transgênicas similares ou com plantas transgênicas faltantes de ácidos nucleicos da invenção ou com plantas não-transgênicas, usando métodos conhecidos de geração de planta, para preparar sementes. Ademais, a planta transgênica da presente invenção pode compreender, e/ou ser cruzada com outra planta transgênica que compreende um ou mais ácidos nucleicos, criando assim uma "pilha" de transgenes na planta e/ou sua progênie. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica fértil cruzada compreendendo o ácido nucleico da invenção. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o cassete de expressão particular herdado através de uma planta parental fêmea ou através de uma planta parental macho. A segunda planta pode ser uma planta endogâmica. A planta transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também estão incluídas dentro da presente invenção as sementes de qualquer uma destas plantas transgênicas férteis. As sementes desta invenção podem ser colhidas de plantas transgênicas férteis e usadas para crescer gerações de progênie de plantas transformadas desta invenção incluindo linhagens de planta híbrida compreendendo o construto de DNA.

"Empilhamento de gene" também pode ser realizado por transferência de dois ou mais genes para dentro do núcleo de célula por transformação de planta. Múltiplos genes podem ser introduzidos no núcleo da célula durante transformação quer seqüencialmente quer simultaneamente. Múltiplos genes em planta ou espécie de patógeno alvo podem ser infra- regulados por mecanismos de silenciamento de gene, especialmente RNAi, pelo uso de um transgene único selecionador de múltiplas seqüências parciais ligadas de interesse. Genes múltiplos, empilhados sob o controle de promotores individuais também podem ser sobre-expressados para alcançar um fenótipo único ou múltiplo desejado. Construtos contendo pilhas de gene de ambos os genes sobre-expressados e alvos silenciados também podem ser introduzidos em plantas dando fenótipos únicos ou múltiplos agronomicamente importantes. Em certas modalidades as seqüências de ácido nucleico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeo de interesse para criar fenótipos desejados. As combinações podem produzir plantas com uma variedade de combinações de feições incluindo mas não limitadas a resistência à doença, tolerância a herbicida, intensificação de rendimento, tolerância ao frio e à estiagem. Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo mas não limitado a geração cruzada de plantas por métodos convencionais ou por transformação genética. Se as feições são empilhadas por transformação genética, as seqüências de polinucleotídeo de interesse podem ser seqüencial ou simultaneamente combinadas em qualquer ordem. Por exemplo se dois genes são para serem introduzidos, as duas seqüências 5 podem estar contidas em cassetes de transformação separados ou no mesmo cassete de transformação. A expressão das seqüências pode ser conduzida por promotores iguais ou diferentes.

De acordo com esta modalidade, a planta transgênica da invenção é produzida por um método compreendendo as etapas de fornecer 10 um gene alvo semelhante a CDPK, preparar um cassete de expressão tendo uma primeira região que é substancialmente idêntica a uma porção do gene semelhante a CDPK selecionado e uma segunda região que é complementar à primeira região, transformar o cassete de expressão em uma planta, e selecionar a progênie da planta transformada que expressa o construto de 15 dsRNA da invenção.

Resistência aumentada à infecção de nematódeo é uma feição geral desejada para ser herdada em uma ampla variedade de plantas. Resistência aumentada à infecção de nematódeo é uma feição geral desejada para ser herdada em uma ampla variedade de plantas. A presente invenção 20 pode ser usada para reduzir a destruição de plantação por qualquer nematódeo parasita de planta. Preferivelmente, os nematódeos parasitas pertencem às famílias de nematódeo incluindo células sinciciais ou gigantes. Nematódeos indutores de células sinciciais ou gigantes são encontrados nas famílias Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae 25 ou Tylenchulidae. Em particular nas famílias Heterodidae e Meloidogynidae.

Conformemente, nematódeos parasitas selecionados pela presente invenção pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Het-erodera, Punctodera, Longidorus ou Meloidogyne. Em uma modalidade preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera ou Meloidogyne. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Globodera, 5 Heterodera, ou Meloidogyne. Em uma modalidade ainda mais preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou ambos os gêneros selecionados do grupo de Globodera ou Heterodera. Em outra modalidade os nematódeos parasitas pertencem ao gênero Meloidogyne.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Globodera, as 10 espécies são preferivelmente do grupo consistindo de G. achilleae, G. artemisiae, G. hypolysi, G. mexicana, G. mille-folii, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis, G. tabacum, e G. virginiae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Globodera incluem pelo menos um da espécie G. pallida, G. tabacum, ou G. rostochiensis. Quando os nematódeos parasitas são 15 do gênero Heterodera, as espécies podem ser preferivelmente do grupo consistindo de H. avenae, H. carotae, H. ciceri, H. cruciferae, H. delvii, H. elachista, H. filipjevi, H. gambiensis, H. glycines, H. goettingiana, H. graduni,

H. humuli, H. hordecalis, H. latipons, H. major, H. medicaginis, H. oryzicola,

H. pakistanensis, H. rosii, H. sacchari, H. schachtii, H. sorghi, H. trifolii, H. 20 urticae, H. vigni e H. zeae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Heterodera incluem pelo menos um da espécie H. glycines, H. avenae, H. cajani, H. gottingiana, H. trifolii, H. zeae ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos um da espécie H. glycines ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida o 25 nematódeo parasita é a espécie H. glycines.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Meloidogyne, os nematódeos parasitas podem ser selecionados do grupo consistindo de M. acronea, M. arabica, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. chitwoodi, M. cofeicola, M. esigua, M. graminicola, M. hapla, M. incógnita, M. indica, M. inomata, M. javanica, M. lini, M. mali, Μ. microcephala, M. microtyla, M. naasi, M. salasi e M. thamesi. Em uma modalidade preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos um da espécie M. javanica, M. incógnita, M. hapla, M. arenaria ou M. chitwoodi.

Os seguintes exemplos não são intencionados para limitarem o

escopo das reivindicações da invenção, mas mais propriamente são intencionados para serem exemplares de certas modalidades. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorrem para o técnico experiente são intencionadas para caírem dentro do escopo da presente invenção.

EXEMPLO 1: Construção de vetor binário para transformação de feijão-soja

Este método exemplificado utiliza um vetor binário contendo o gene alvo correspondendo ao clone 49806575 de cDNA de feijão-soja. Clone 49806575 foi identificado por pesquisa de um banco de dados patenteado de 15 seqüências de cDNA usando a seqüência AY821654 de Medicago truncatula. O vetor de expressão consiste do fragmento sintetizado (SEQ ID NO:5), que por sua vez é composto de uma porção de anti-senso de 320 pb de gene 49806575, um espaçador, um fragmento de senso do gene alvo (SEQ ID NO:2) correspondendo aos nucleotídeos 50-372 de SEQ ID NO:l, e uma 20 estrutura principal de vetor. Neste vetor, RCB562, dsRNA para o gene alvo 49806575 foi expressado sob um promotor preferido para sincícios ou raiz, promotor, semelhante a TPP (SEQ ID NO: 6, veja Pedido de Patente U.S. copendente 60/874.375, aqui incorporado como referência). O promotor semelhante a TPP dirige a expressão de transgene preferivelmente em raízes 25 e/ou sincícios ou células gigantes. O marcador de seleção para transformação neste vetor foi um gene AHAS mutado de Arabidopsis thaliana que concedeu resistência ao herbicida Arsenal (Imazapir, BASF Corporation, Mount Olive, NJ). A expressão de AHAS mutado foi conduzida pelo promotor de ubiquitina de salsa (veja Plesch, G. e Ebneth, M., "Method for the stable expression of nucleic acids in transgenic plants, controlled by a parsley ubiquitin promoter", WO 03/102198, aqui incorporada como referência). EXEMPLO 2: Uso de sistema de ensaio de planta de feijão-soja para detectar resistência à infecção de SCN

5 O ensaio de explante enraizado foi utilizado para demonstrar

expressão de dsRNA e a resistência a nematódeo resultante. Este ensaio pode ser encontrado em pedido co-pendente USSN 12/001.234, cujo conteúdo é aqui incorporado como referência.

Sementes de feijão-soja limpas de de cultivar de feijão-soja 10 foram esterilizadas na superfície e germinadas. Três dias antes da inoculação, uma cultura líquida noturna da cultura de Agrobacterium desarmada, por exemplo, a cepa K599 de A. rhizogenes desarmada contendo o vetor binário RCB562, foi iniciada. No dia seguinte a cultura foi espalhada sobre uma placa de ágar LB contendo canamicina como um agente de seleção. As placas 15 foram incubadas a 28°C por dois dias. Uma placa foi preparada para cada um dos 50 explantes a serem inoculados. Cotilédones contendo a extremidade proximal de sua conexão com as planta jovens foram usados como o explante para transformação. Após remoção dos cotilédones a superfície foi raspada com um escalpelo ao redor do sítio de corte. O cotilédone cortado e raspado 20 foi o alvo para inoculação com Agrobacterium. os explantes preparados foram imersos em colônias de A. rhizogenes espessas desarmadas preparadas acima de modo que as colônias ficassem visíveis sobre a superfície cortada e raspada. Os explantes foram então posicionados sobre ágar 1% em placas de Petri para co-cultura sob luz por 6-8 dias.

Após a transformação e a co-cultura, explantes de feijão-soja

foram transferidos para meio de indução de enraizamento com um agente de seleção, por exemplo S-B5-708 para o gene de aceto-hidróxi-ácido-sintase (AHAS) mutado (Sathasivan et al., Plant Phys. 97:1044-50, 1991). Culturas foram mantidas na mesma condição como na etapa de co-cultura. O meio S- Β5-708 compreende: 0,5X sais B5, MES 3 mM, sacarose 2%, IX vitaminas B5, 4 Timentina 00 μg/ml, ágar Noble 0,8%, e Imazapir 1 μΜ (agente de seleção para gene AHAS) (BASF Corporation, Florham Park, NJ) em pH 5,8.

Duas ou três semanas após a seleção e a indução de raízes, raízes transformadas foram formadas sobre as extremidades cortadas dos explantes. explantes foram transferidos para o mesmo meio de seleção (Meio S-B5-708) para seleção adicional. Raízes transgênicas proliferaram bem dentro de uma semana no meio e estavam prontas para serem subcultivadas.

Raízes de feijão-soja brancas e fortes foram excisadas dos 10 explantes enraizados e cultivadas em meio de crescimento de raiz suplementado com Timentina 200 mg/l (meio S-MS-606) em placas de seis cavidades. Culturas foram mantidas na temperatura ambiente sob a condição escura. O meio S-MS-606 compreende: 0,2X sais MS e vitaminas b5, sacarose 2%, e Timentina 200 mg/l em pH 5,8.

Um a cinco dias após sub-cultivo, as raízes foram inoculadas

com nematódeos juvenis esterilizados em superfície em placas de multicavidades para o ensaio de construto de gene de interesse. Como um controle, foram usadas raízes de vetor de controle Jack e vetor de controle de feijão-soja cultivar Williams 82. Culturas de raiz de cada linhagem que 20 ocupou pelo menos metade da cavidade foram inoculadas com race 3 de superfície descontaminada de nematódeos de cisto de feijão-soja (SCN) juvenis de segundo estágio (J2) no nível de 500 J2\cavidade. As placas foram então seladas e postas de volta na incubadora a 25°C no escuro. Várias linhagens de raiz independentes foram geradas de cada transformação de 25 vetor binário e as linhagens foram usadas para bioensaio. Quatro semanas após inoculação de nematódeo, os cistos em cada cavidade foram contados.

Para cada linhagem transformada, o número médio de cistos por linhagem, os valores de índice de fêmeas percentual e de erro padrão foram determinados através de várias cavidades replicadas (índice de fêmeas = número médio de cistos de SCN se desenvolvendo sobre as raízes transgênicas expressado como a percentagem do número médio de cistos desenvolvendo sobre as raízes de controle suscetíveis de tipo selvagem W82). Múltiplos experimentos independentes, biologicamente replicados foram realizados para comparar números de cistos entre transformantes RCB562 e linhagens Williams82 suscetíveis. Os resultados mostrasm que raízes transformadas com RCB562 tiveram reduções estatisticamente significativas (valor-p <0,05) em contagem de cistos sobre múltiplas linhagens transgênicas e uma tendência egral de contagem de cistos reduzida na maioria das linhagens transgênicas ensaiadas.

Exemplo 3 RACE para determinar seqüência transcrita total

Uma seqüência de transcrito de comprimento total com homologia alta com o clone 49806575 de cDNA parcial (SEQ ID NO: 1) foi isolada usando o GeneRacer Kit (LI502-01) de Invitrogen seguindo as instruções do fabricante. RNA total de raízes de feijão-soja colhidas 6 dias após infecção com SCN foi preparado de acordo com o protocolo de GeneRacer Kit para gerar RNA desfosforilado e de terminal de cadeia desbloqueado ligado no GeneRacer RNA Oligo descrito por SEQ ID NO:28. O RNA preparado foi reversamente transcrito de acordo com o protocolo de GeneRacer Kit e usado como o modelo de biblioteca RACE para PCR para isolar as extremidades 5' cDNA usando as reações PCR primária e secundária (aninhadas) de acordo com o protocolo de GeneRacer Kit. Os iniciadores usados para a reação PCR primária são descritos por SEQ ID NOs 29 e 31. Os iniciadores de reação PCR secundária aninhada são descritos por SEQ ID NOs 30 e 32.

Produtos de reação PCR secundária foram separados por eletroforese em gel. Produtos específicos foram purificados do gel de agarose e clonados em vetores pCR4-TOPO (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Colônias resultantes foram minipreparadas e seqüenciadas. Um dos fragmentos de comprimento total descrito como SEQ ID NO:26 (RKF195-3_2) teve identidade percentual alta com SEQ ID NO:l (seqüência 49806575 cDNA). O alinhamento entre proteínas codificadas pela seqüência parcial de 49806575 de Glycine, os genes semelhantes a CDPK e RKF195- 5 3_2 de Glycine max de comprimento total de outras espécies de planta é mostrado em Figuras 2a-2d.

Aquelas pessoas experientes na arte reconhecerão, ou serão capazes de averiguar usando experimentação não mais do que rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas.

Tais equivalentes são intencionados para serem incluídos pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Molécula de dsRNA, caracterizada pelo fato de compreender i) uma primeira fita compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CDPK, e ii) uma segunda fita compreendendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita, sendo que a porção do gene semelhante a CDPK é de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l,2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ,23, 25, ou 27; c) um polinucleotídeo tendo 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tend70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, ou 27; e) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou26; f) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19, 21,23, 25, ou 27; g) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; e h) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, ou 27.

2. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1,2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26.

3. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26.

4. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25, ou 27.

5. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, ou 27.

6. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26.

7. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, ou 27.

8. Coleção de moléculas de dsRNA, caracterizada pelo fato de compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de19 a24 nucleotídeos, sendo que as ditas moléculas de dsRNA são derivadas de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, ou 27; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, ou 27; c) um polinucleotídeo tendo 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; e d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, ou 27.

9. Coleção de moléculas de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14 , 16,18, 20, 22, 24, ou 26.

10. Coleção de moléculas de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26.

11. Coleção de moléculas de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9,11 , 13, 15, 17, 19,21,23,25, ou 27.

12. Coleção de moléculas de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:2, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

13. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser capaz de expressar um dsRNA que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CDPK, sendo que a porção do gene semelhante a CDPK é de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, ou 27; c) um polinucleotídeo tendo 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:l, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, ou 27; e) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou26; f) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3,1,9, 11, 13, 15, 17, 19 , 21,23, 25, ou 27; g) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:1,2 , 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; e h) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, ou 27.

14. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o dsRNA compreende uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3,7,9, 11, 13, 15, 17, 19 , 21,23, 25, ou 27; c) um polinucleotídeo tendo 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; e d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, ou 27.

15. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de feijão-soja, batateira, tomateiro, amendoim, algodoeiro, mandioca, cafeeiro, coqueiro, ananás, árvores cítricas, bananeira, milho, colza, beterraba, girassol, sorgo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, feijão verde, feijão lima, ervilha, e tabaco.

16. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é feijão-soja.

17. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1,2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou26.

18. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26.

19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15 , 17,19,21,23,25, ou 27.

20. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,25, ou 27.

21. Método para preparar uma planta transgênica capaz de expressar um dsRNA que inibe a expressão de um gene semelhante a CDPK na planta, dito método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de i) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção do gene semelhante a CDPK, sendo que dito ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla uma vez expressado na planta; ii) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; iii) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e iv) selecionar a progênie para expressão de dito transcrito, sendo que a porção do gene semelhante a CDPK é de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ,23, 25, ou 27; c) um polinucleotídeo tendo 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, ou 27; e) um polipeptídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos . 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou26; f) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, ou 27; g) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1 ,2,4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22,24, ou 26; e h) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, ou 27.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dsRNA compreende uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, .23, 25, ou 27; c) um polinucleotídeo tendo 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, ou 26; e d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, ou 27.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de feijão-soja, batateira, tomateiro, amendoim, algodoeiro, mandioca, cafeeiro, coqueiro, ananás, árvores cítricas, bananeira, milho, colza, beterraba, girassol, sorgo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, feijão verde, feijão lima, ervilha, e tabaco.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a planta é feijão-soja.

25. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é expressado em sincícios ou raízes de planta.