BRPI0807018A2 - Mólecula de dsrna, coleção de moléculas de dsrna, planta transgênica, e, método de preparar uma planta transgênica - Google Patents

Description

“MOLÉCULA DE dsRNA, COLEÇÃO DE MOLÉCULAS DE dsRNA, PLANTA TRANS GÊNICA, E, MÉTODO DE PREPARAR UMA PLANTA TRANSGÊNICA”

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de pedido de patente internacional US de número de série 60/900.145 depositado aos 08 de Fevereiro de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO

O campo desta invenção é o controle de nematódeos, em particular o controle de nematódeos de cisto de feijão-soja. A invenção também se refere à introdução de material genético dentro de plantas que são suscetíveis aos nematódeos com o propósito de aumentar a resistência aos nematódeos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nematódeos são animais vermiformes microscópicos que se alimentam de raízes, folhas, e caules de mais de 2.000 plantações de escala, verduras/hortaliças, frutas, e plantas ornamentais, causando uma perda de plantação mundial estimada de 100 bilhões. Um tipo comum de nematódeo é o nematódeo das galhas (RKN), cuja alimentação causa as galhas características sobre raízes. Outros nematódeos alimentadores de raiz são os dos tipos de cisto e de lesão, que são de hospedeiros mais específico.

Nematódeos estão presentes em todos os Estados Unidos, mas são principalmente um problema em áreas quentes, úmidas do Sul e do Oeste e em solos arenosos. Nematódeo de cisto de feijão-soja (SCN), Heterodera glycines, foi primeiro descoberto nos Estados Unidos na Carolina do Norte em 1954. É a peste mais séria de plantas de feijão-soja. Algumas áreas estão tão intensamente infestadas por SCN que a produção de feijão-soja não é mais economicamente possível sem medidas de controle. Embora feijão-soja seja a plantação econômica principal atacada por SCN, parasitas SCN somam no total cinqüenta hospedeiros, incluindo plantações de campo, verduras/hortaliças, plantas ornamentais, e ervas daninhas.

Sinais de dano de nematódeo incluem atrofiamento e amarelecimento de folhas, e murchamento das plantas durante períodos quentes. Contudo, nematódeos, incluindo SCN, podem causar perda de 5 rendimento significativa sem os sintomas óbvios acima do solo. Em adição, raízes infectadas com SCN são ananicadas ou atrofiadas. Infestação de nematódeo pode diminuir o número de nódulos fixadores de nitrogênio sobre as raízes, e podem tomar as raízes mais suscetíveis aos ataques por outros patógenos de planta provenientes do solo.

O ciclo de vida de nematódeo tem três estágios maiores: ovo,

juvenil, e adulto. O ciclo de vida varia entre espécies de nematódeos. Por exemplo, o ciclo de vida de SCN pode costumeiramente ser completado em

24 a 30 dias sob condições ótimas enquanto que outras espécies podem demorar tão longamente quanto um ano, ou mais longo, para completar o 15 ciclo de vida. Quando os níveis de temperatura e de umidade tomam-se adequados no verão, nematódeos juvenis vermiformes eclodem de ovos no solo. Apenas nematódeos no estágio desenvolvente juvenil são capazes de infectar raízes de feijão-soja. Estes nematódeos juvenis são o único estágio de vida do nematódeo que pode infectar raízes de feijão-soja.

O ciclo de vida de SCN tem sido submetido a muitos estudos e

portanto pode ser usado como um exemplo para entender um ciclo de vida de nematódeo. Após penetrar nas raízes de feijão-soja, nematódeos juvenis SCN movem-se através da raiz até contatarem tecido vascular, onde param e começam a se alimentar. O nematódeo injeta secreções que modificam certas 25 células de raiz e as transformam em sítios de alimentação especializados. As células de raiz são morfologicamente transformadas em sincícios multinucleados grandes (ou células gigantes no caso de RKN), que são usadas como uma fonte de nutrientes para os nematódeos. Os nematódeos ativamente se alimentando assim roubam nutrientes essenciais da planta resultando em perda de rendimento. À medida que os nematódeos se alimentam, eles se incham e eventualmente os nematódeos fêmeas tomam-se tão grandes que rompem o tecido da raiz e são expostos sobre a superfície da raiz.

Após um período de alimentação, nematódeos SCN machos, que não são inchados como adultos, migram para fora da raiz e para dentro do solo e fertilizam as fêmeas adultas de forma de limão. Os machos então morrem, enquanto que as fêmeas permanecem fixadas no sistema de raiz e continuam a se alimentar. Os ovos nas fêmeas inchadas começam a se desenvolver, inicialmente em uma massa ou saco de ovos fora do corpo, então mais tarde dentro da cavidade do corpo. Eventualmente a cavidade corporal inteira da fêmea adulta está cheia de ovos, e o nematódeo fêmea morre. E o corpo cheio de ovos da fêmea morta que é chamado de cisto. Cistos eventualmente se desalojam e são encontrados livres no solo. As paredes do cisto tomam-se muito resistentes, proporcionam excelente proteção para os aproximadamente 200 a 400 ovos contidos dentro das mesmas. Ovos de SCN sobrevivem dentro do cisto até ocorrerem condições apropriadas de eclosão. Embora muitos destes ovos possam eclodir dentro do primeiro ano, muitos também sobreviverão dentro dos cistos por vários anos.

Um nematódeo pode se mover por si mesmo através do solo apenas umas poucas polegadas por ano. Contudo, infestação de nematódeo pode ser espalhada por distâncias substanciais em uma variedade de maneiras. Qualquer coisa que possa mover solo infestado é capaz de espalhar a infestação, incluindo maquinário, veículos e ferramentas de fazenda, vento, água, animais, e trabalhadores de fazenda. Partículas de solo do tamanho de semente freqüentemente contaminam semente colhida. Conseqüentemente, infestação de nematódeo pode ser espalhada quando semente contaminada de campos infestados é plantada em campos não-infestados. Há até mesmo evidência de que certas espécies de nematódeos podem ser espalhadas por aves. Apenas algumas das causas podem ser prevenidas. Práticas tradicionais para manejar infestação de nematódeo incluem: manutenção de níveis de pH de solo e de nutrientes de solo apropriados em terra infestada com nematódeo; controle de outras doenças de planta, bem como de pestes de ervas daninhas e de insetos; usando práticas de 5 sanitização tais com aração, plantio, e cultivo de campos infestados com nematódeos apenas após trabalhar campos não-infestados; limpeza cuidadosa de equipamento com vapor de água ou água de pressão alta após trabalho em campos infestados; não uso de semente crescida em terra infestada para plantio de campos não-infestados a não ser que a semente tenha sido 10 apropriadamente limpa; rotação de campos infestados e altemação de plantações hospedeiras com plantações não-hospedeiras; usando nematicidas; e plantio de variedades de planta resistentes.

Têm sido propostos métodos para a transformação genética de plantas com o objetivo de conceder resistência aumentada aos nematódeos parasitas de plantas. Patentes US Nos. 5.589.622 e 5.824.876 são direcionadas para a identificação de genes de planta expressados especificamente em ou adjacentemente aos sítio de alimentação da planta após fixação pelo nematódeo. Os promotores destes genes alvos de planta podem ser então usados para dirigir a expressão específica de enzimas ou proteínas prejudiciais, ou a expressão de RNA de anti-senso para o gene alvo ou para genes celulares gerais. Os promotores de planta também podem ser usados para conceder resistência a nematódeo especificamente no sítio de alimentação por transformação da planta com um construto compreendendo o promotor do gene alvo de planta ligado em um gene cujo produto induz letalidade no nematódeo após ingestão.

Recentemente, interferência de RNA (RNAi), também chamada de silenciamento de gene, tem sido proposta como um método para controlar nematódeos. Quando RNA de fita dupla (dsRNA) correspondendo essencialmente à seqüência de um gene alvo ou mRNA é introduzido em uma célula, expressão do gene alvo é inibida (Veja e.g., Patente US No. 6.506.559). Patente US No. 6.506.559 demonstra a efetividade de RNAi contra genes conhecidos em Caenorhabditis elegans, mas não demonstra a utilidade de RNAi para controlar nematódeos parasitas de planta.

5 Uso de RNAi para selecionar genes de nematódeo essenciais

alvo tem sido proposto, por exemplo, em WO 01/96584,, WO 01/17654, US 2004/0098761, US 2005/0091713, US 2005/0188438, US 2006/0037101, US 2006/0080749, US 2007/0199100, e US 2007/0250947.

Numerosos modelos têm sido propostos para a ação de RNAi. Em sistemas de mamífero, dsRNAs maior do que 30 nucleotídeos aciona a indução de síntese de interferon e uma parada global de síntese de proteína, em uma maneira não específica para seqüência. Contudo, Patente US No. 6.506.559 revela que em nematódeos, o comprimento do dsRNA correspondendo à seqüência de gene alvo pode ser pelo menos 25, 50, 100, 200, 300, ou 400 bases, e que dsRNAs até mesmo maiores também foram eficazes na indução de RNAi em C. elegans. É sabido que quando construtos de RNA grampo-de-cabelo compreendendo regiões de fita dupla variando de 98 a 854 nucleotídeos foram transformado em numerosas espécies de planta, os genes de planta alvo foram eficazmente silenciados. Há uma concordância geral que em muitos organismos, incluindo nematódeos e plantas, pedaços grandes de dsRNA são clivados em fragmentos de cerca de 19-24 nucleotídeos (siRNA) dentro de células, e que estes siRNAs são os mediadores reais do fenômeno de RNAi.

Embora tenha havido numerosos esforços para usar RNAi para 25 controlar nematódeos parasitas de planta, até o momento nenhuma planta transgênica resistente a nematódeo tem sido desregulada em qualquer país. Conformemente, continua a haver uma necessidade para identificar métodos e composições eficazes e seguras para o controle de nematódeos de planta usando RNAi, e para a produção de plantas tendo resistência aumentada aos nematódeos parasitas de planta. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores têm descoberto que um novo gene alvo de planta, cinamil-álcool-desidrogenase-like ("CAD-like"), também representado pela designação 49676534, é sobre-expressado em sincícios induzidos por infecção de raízes de feijão-soja por SCN. Os inventores têm adicionalmente descoberto que quando expressão do gene 49676534 é suprimida em um sistema modelo de raiz de feijão-soja, a capacidade dos nematódeos para infectar tal raízes é diminuída.

Em uma primeira modalidade, portanto, a invenção fornece uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA) compreendendo a) uma primeira fita compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD e b) uma segunda fita compreendendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita.

A invenção é adicionalmente representada como modalidade em uma coleção de moléculas de dsRNA compreendendo uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CAD.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica resistente a nematódeo capaz de expressar um dsRNA que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CAD.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA, sendo que cada molécula de dsRNA compreende uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19-24 nucleotídeos e sendo que as moléculas de dsRNA são derivadas de um polinucleotídeo substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CAD. Em outra modalidade, a invenção fornece um método de preparar uma planta transgênica capaz de expressar uma coleção de moléculas de dsRNA cada uma das quais é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD em uma planta, dito método compreendendo as 5 etapas de: a) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de um gene semelhante a CAD uma vez expressado na planta; b) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma 10 ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a progênie para expressão de dito transcrito.

A invenção adicionalmente fornece um método de conceder resistência a nematódeo de uma planta, dito método compreendendo as etapas de: a) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente 15 idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla de uma porção de um gene semelhante a CAD uma vez expressado na planta; b) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; c) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e d) selecionar a progênie para 20 resistência a nematódeo.

A invenção adicionalmente proporciona um cassete de expressão e um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CAD.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método para 25 controlar a infecção de uma planta por um nematódeo parasita, compreendendo as etapas de transformar a planta com uma molécula de dsRNA operacionalmente ligada em um promotor preferido em raiz, induzível por nematódeo ou preferido em sítio de alimentação, por meio do qual o dsRNA compreende uma fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um ácido nucleico alvo semelhante a CAD que é essencial para a formação, o desenvolvimento ou o suporte do sítio de alimentação, em particular a formação, o desenvolvimento ou o suporte de uma célula gigante ou sincicial, controlando deste modo a infecção da planta pelo nematódeo 5 pela remoção ou incapacitação funcional do sítio de alimentação, dos sincícios ou da célula gigante.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

Figura 1 mostra a tabela de SEQ ID NOs designadas para Genes semelhantes a CAD, o promotor usado em RCB5 84, e fragmentos 5' RACE.

Figura 2 mostra a seqüência de cDNA de gene 49676534, (SEQIDNO.l)

Figuras 3a a 3b mostram o alinhamento de DNA de gene 49676534 (SEQ ID N0:1) com o fragmento 5' RACE descrito por SEQ ID NO:5.

Figuras 4a a 4b mostram um alinhamento de aminoácido de proteínas CAD-Iike exemplares de uma variedade de espécies de planta incluindo a seqüência de proteína de comprimento total do gene semelhante a CAD descrita por SEQ ID N0:7 correspondendo ao gene 49676534. O 20 alinhamento é realizado no conjunto de programas de computador Vector NTI (penalidade de abertura de lacuna =10, penalidade de extensão de lacuna = 0,05, penalidade de separação de lacuna = 8).

Figura 5 mostra um tabela de matriz de identidade percentual de aminoácido global de genes CAD-Iike exemplares descritos por SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, e 25.

Figura 6 mostra a tabela de matriz de identidade percentual de ácido nucleico global de genes CAD-Iike exemplares descritos por SEQ ID NO: 26, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e 24.

Figuras 7a-7j mostram vários 2 Imers possíveis em genes CAD-Iike exemplares de SEQ ID NO. 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, e 24 por posição de nucleotídeo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS DA INVENÇÃO 5 A presente invenção pode ser entendida mais prontamente com

referência à seguinte descrição detalhada das modalidade preferidas da invenção e dos exemplos aqui incluídos. A não ser que indicado de outro modo, os termos aqui usados são para serem entendidos de acordo com o uso convencional por aquelas pessoas experientes na arte relevante. Em adição às 10 definições de termos fornecidas abaixo, as definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., 1991 Glossary de genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer- Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene 15 Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement). É para ser entendido que como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, "um" ou "uma" pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é usado. Assim, por exemplo, referência a "uma célula" pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada. É para ser entendido 20 que a terminologia aqui usada é para o propósito apenas de descrever modalidades específicas e não é intencionada para ser limitante.

Em todo este pedido, são feitas referências a várias publicações de patente e de literatura. As revelações de todas estas publicações e daquelas referências citadas dentro daquelas publicações em 25 suas totalidades são por meio deste incorporadas como referências neste pedido com o propósito de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual este invenção pertence.

Um "gene semelhante a CAD" de planta é aqui definido como um gene tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de gene 49676534 mostradas em SEQ ID NO:l. De acordo com a invenção, genes CAD-Iike include genes tendo seqüências tais como aquelas mostradas em SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26, que são homólogos do gene semelhante a CAD 5 de SEQ ID NO:l. Os genes CAD-Iike aqui definidos codificam polipeptídeos tendo pelo menos 45% de identidade de seqüência com o polipeptídeo 49676534 tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:7. Tais polipeptídeos incluem polipeptídeos CAD-Iike tendo seqüências como mostradas em SEQ ID NOs:4, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, e 25. Genes alvo semelhante a CAD 10 adequados são pelo menos cerca de 50-60%, pelo menos cerca de 60-70%, ou pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95%, e também podem ser pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idênticos a um polinucleotídeo compreendendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26. Alternativamente, 15 genes alvo semelhante a CAD adequados compreendem um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26.

Genes semelhantes a CAD adicionais (homólogos de gene 20 semelhante a CAD) podem ser isolados de plantas diferentes de feijão soja usando a informação aqui fornecida e as técnicas conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte de biotecnologia. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de uma planta que hibridiza sob condições estringentes com o ácido nucleico de SEQ ID NO:l pode ser isolada de bibliotecas de cDNA de 25 tecido de planta. Alternativamente, mRNA pode ser isolado de células de planta (e.g., pelo procedimento de extração em tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299), e cDNA pode ser preparado usando transcriptase reversa (e.g., transcriptase reversa de Moloney MLV, disponível na Gibco/BRL, Bethesda, MD; ou Transcriptase reversa de AMV, disponível na Seika-gaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para amplificação por reação em cadeia da polimerase podem ser projetados baseado na seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:l. Podem ser projetados iniciadores de 5 oligonucleotídeo adicionais que são baseados nas seqüências dos genes CAD- Iike tendo as seqüências como mostradas em SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26. Moléculas de ácido nucleico correspondendo aos genes alvo semelhante a CAD aqui definidos podem ser amplificadas usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um modelo e iniciadores 10 de oligonucleotídeo apropriados de acordo com técnicas de amplificação por PCR padrão. As moléculas de ácido nucleico assim amplificadas podem ser clonadas em vetores apropriados e caracterizadas por análise de seqüência de DNA.

Como aqui usado, "RNAi" ou "interferência de RNA" refere- 15 se a um processo de silenciamento de gene pós-transcricional específico de seqüência em plantas, mediado por RNA de fita dupla (dsRNA). Como aqui usado, "dsRNA" refere-se a RNA que é de fita parcial ou completamente dupla. RNA de fita dupla também é chamado de um RNA interferente curto ou pequeno (siRNA), ácido nucleico interferente curto (siRNA), RNA 20 interferente curto, micro-RNA (miRNA), e semelhantes. No processo de RNAi, dsRNA compreendendo uma primeira fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene alvo e.g. um gene semelhante a CAD e uma segunda fita que é complementar à primeira fita é introduzido em uma planta. Após introdução na planta, o dsRNA específico de gene alvo é 25 processado em fragmentos relativamente pequenos (siRNAs) e pode ser subseqüentemente tomado distribuído em toda a planta, causando uma mutação de perda-de-função tendo um fenótipo que, durante um período de regeneração, pode se tomar muito proximamente parecido com o fenótipo decorrente de uma deleção parcial ou completa do gene alvo. Alternativamente, o dsRNA específico de gene alvo está operacionalmente associado em um elemento regulatório ou promotor que resulta em expressão do dsRNA em um tecido, maneira temporal, espacial ou induzível e pode ser adicionalmente processado em fragmentos relativamente pequenos por uma 5 célula de planta contendo o maquinário de processamento de RNAi, e é obtido o fenótipo de perda-de-função. Também, o elemento regulatório ou promotor pode dirigir a expressão quer constitutivamente naqueles tecidos quer sob indução pela alimentação do nematódeo ou nematódeo juvenil, tal como nematódeos J2.

A como aqui usado, tomando-se em consideração a

substituição de timina por uracila quando se comparam seqüências de RNA e DNA, o termo "substancialmente idêntico" como aplicado a dsRNA significa que a seqüência de nucleotídeos de uma fita do dsRNA é pelo menos cerca de 80%-90% idêntica a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, mais 15 preferivelmente, pelo menos cerca de 90-95%, idêntico a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%), 98% ou 99% idêntica ou absolutamente idêntica a 20 ou mas nucleotídeos contíguos do gene alvo ou CAD-like. 20 ou mais nucleotídeos contíguos significa uma porção, sendo pelo menos cerca de 20, 20 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 bases consecutivas ou até o comprimento total do gene alvo.

Como aqui usado, polinucleotídeos "complementares" são aqueles que são capazes de parear bases de acordo com as regras de complementaridade padrão de Watson-Crick. Especificamente, purinas 25 parearão com pirimidinas para formar uma combinação de guanina pareada com citosina (G:C) e quer adenina pareada com timina (A:T) no caso de DNA, quer adenina pareada com uracila (A:U) no caso de RNA. E entendido que dois polinucleotídeos podem hibridizar um com o outro até mesmo se não forem complementares entre si, desde que cada um tenha pelo menos uma região que é substancialmente complementar a do outro.. Como aqui usado, o termo "substancialmente complementar" significa que duas seqüências de ácido nucleico são complementares em mais de pelo menos 80% de seus nucleotídeos. Preferivelmente, as duas seqüências de ácido nucleico são 5 complementares em mais de pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou todos de seus nucleotídeos. Alternativamente, "substancialmente complementar" significa que duas seqüências de ácido nucleico podem hibridizar sob condições de estringência. Como aqui usado, o termo "substancialmente idêntico" ou "correspondendo a" significa que duas 10 seqüências de ácido nucleico têm pelo menos 80%) de identidade de seqüência. Preferivelmente, as duas seqüências de ácido nucleico têm pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência.

Também como aqui usados, os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" referem-se a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um seu híbrido. O termo também inclui híbridos de RNA/DNA. Quando dsRNA é produzido sinteticamente, bases menos comuns, tais como inosina, 5-metil-citosina, 6-metil-adenina, hipoxantina e outras também podem ser usadas para pareamento de anti-senso, dsRNA, e ribozima. Por exemplo, tem sido mostrado que polinucleotídeos que contêm análogos de C-5 propino de uridina e citidina se ligam em RNA com afinidade alta e são inibidores de anti-senso potentes da expressão de gene. Outras modificações, tais como modificações na estrutura principal de fosfodiéster, ou na 2!-hidroxila no grupo açúcar ribose do RNA também podem ser feitas.

Como aqui usado, o termo "controle", quando usado no contexto de uma infecção, refere-se à redução ou prevenção de uma infecção. Redução ou prevenção de uma infecção por um nematódeo fará com que uma planta tenha resistência aumentada ao nematódeo, contudo, tal resistência aumentada não implica que a planta necessariamente tenha resistência de 100% à infecção. Em modalidades preferidas, a resistência à infecção por um nematódeo em uma planta resistente é maior do que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%), 60%), 70%), 80%, 90%, ou 95% em comparação com uma planta de tipo 5 selvagem que não é resistente a nematódeos. Preferivelmente a planta de tipo selvagem é uma planta de um genótipo similar, mais preferivelmente idêntico ao da planta tendo resistência aumentada ao nematódeo, mas não compreende um dsRNA direcionado para o gene alvo. A resistência da planta à infecção pelo nematódeo pode ser devido à morte, esterilidade, parada no 10 desenvolvimento, ou mobilidade prejudicada do nematódeo sob exposição à planta compreendendo dsRNA específico para um gene essencial para o desenvolvimento ou a manutenção de um sítio de alimentação funcional, sincícios, ou célula gigante. O termo "resistente à infecção por nematódeo" ou "uma planta tendo resistência ao nematódeo" como aqui usado refere-se à 15 capacidade de uma planta, em comparação com uma planta de tipo selvagem, para evitar infecção por nematódeos, para matar nematódeos ou para impedir, reduzir ou parar o desenvolvimento, o crescimento ou a multiplicação de nematódeos. Isto pode ser conseguido por um processo ativo, e.g. pela produção de uma substância prejudicial para o nematódeo, ou por um 20 processo passivo, como ter um valor nutricional reduzido para o nematódeo ou não desenvolver estruturas induzidas pelo sítio de alimentação de nematódeo como sincícios ou células gigantes. O nível de resistência de nematódeo de uma planta pode ser determinado em várias maneiras, e.g. pela contagem dos nematódeos que são capazes de estabelecer parasitismo sobre 25 aquela planta, ou pela medição dos tempos de desenvolvimento de nematódeos, pela proporção de nematódeos machos e fêmeas ou, para nematódeos de cisto, pela contagem do número de cistos ou ovos de nematódeo produzidos sobre raízes de uma planta infectada ou um sistema de ensaio de planta. O termo "planta" é intencionado para incluir plantas em qualquer estágio de maturidade ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de planta) obtidos de ou derivados de qualquer tal planta a não ser que seja indicado diferentemente pelo contexto. Partes de 5 planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, flores, óvulos, estames, sementes, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos, culturas de raiz peluda, e semelhantes. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas da presente invenção. Em 10 uma modalidade, as sementes são geração verdadeira para uma resistência aumentada à infestação por nematódeo em comparação com uma variedade de tipo selvagem da semente de planta. Como aqui usada, uma "célula de planta" inclui, mas não é limitada a, um protoplasto, célula produtora de gametas, e uma célula que regenera em uma planta inteira. Cultura de tecido de vários 15 tecidos de plantas e regeneração de plantas a partir dos mesmos são bem conhecidas na arte e estão amplamente publicadas.

Como aqui usado, o termo "transgênico" refere-se a qualquer planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos 20 casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante está estavelmente integrado(a) em um cromossomo ou elemento extra-cromossômico estável, de modo que é passado para as gerações sucessivas. Para os propósitos da invenção, o termo "polinucleotídeo recombinante" refere-se a um polinucleotídeo que tem sido alterado, rearranjado, ou modificado por 25 engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, ou polinucleotídeos, que estão ligados ou unidos em seqüências heterólogas. O termo "recombinante" não se refere às alterações de polinucleotídeos que resultam de eventos naturalmente ocorrentes, tais como mutações espontâneas, ou de mutagênese não-espontânea seguida por geração seletiva. Como aqui usado, o termo "quantidade suficiente para inibir expressão" refere-se a uma concentração ou quantidade do dsRNA que é suficiente para reduzir níveis ou estabilidade de niRNA ou proteína produzido(a) a partir de um gene alvo em uma planta. Como aqui usado, 5 "inibir expressão" refere-se à ausência ou decréscimo observável no nível de proteína e/ou produto de mRNA a partir de um gene alvo. Inibição de expressão de gene alvo pode ser letal para o nematódeo parasita quer direta quer indiretamente através de modificação ou erradicação do sítio de alimentação, sincícios, ou célula gigante, ou tal inibição pode retardar ou 10 prevenir a entrada em uma etapa desenvolvente particular (e.g., metamorfose), se acesso a um sítio de alimentação totalmente funcional, sincícios, ou célula gigante estiver associado com um estágio particular do ciclo de vida de nematódeo parasita. As conseqüências de inibição podem ser confirmadas pelo exame da raiz da planta para redução ou eliminação de 15 cistos ou outras propriedades do nematódeo ou da infestação por nematódeo (como apresentado abaixo no Exemplo 3).

De acordo com a invenção, a planta é transformada com um ácido nucleico codificador de um dsRNA, que especificamente inibe expressão de um gene semelhante a CAD na planta que é essencial para o 20 desenvolvimento ou a manutenção de um sítio de alimentação, sincícios, ou célula gigante; em fim afetando a sobrevivência, a metamorfose, ou a reprodução do nematódeo. Em uma modalidade, o dsRNA é codificado por um vetor que tem sido transformado em um progenitor da planta infectada. Preferivelmente, o ácido nucleico expressando dito dsRNA que seleciona o 25 gene semelhante a CAD está sob o controle transcricional de um promotor específico para raiz ou um promotor específico para célula de alimentação de nematódeo parasita ou um promotor induzível por nematódeo.

Conformemente, o dsRNA da invenção compreende uma primeira fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD tal como gene alvo 49676534 de feijão-soja gene de um genoma de planta, e uma segunda fita que é substancialmente complementar à primeira fita. Em modalidades preferidas, o gene alvo é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; (b) um polinucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e (c) um polinucleotídeo de uma planta que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 O comprimento das seqüências de nucleotídeos de fita dupla substancialmente idênticas pode ser pelo menos cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500, bases consecutivas ou até o comprimento total do semelhante a CAD. Em uma modalidade preferida, o comprimento da seqüência de nucleotídeos de fita dupla é de aproximadamente de cerca de 19 a cerca de 200-500 nucleotídeos consecutivos em comprimento. Em outra modalidade preferida, o dsRNA da invenção é substancialmente idêntico ou é idêntico às bases 1 to 170 de SEQ ID NO: 5.

Como discutido acima, fragmentos de dsRNA maiores do que cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento são clivados intracelularmente por nematódeos e plantas em siRNAs de cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento, e estes siRNAs são os mediadores reais do fenômeno de RNAi. A tabela mostrada em Figuras 7a-7j apresenta 21-mers exemplares de genes CAD-Iike aqui definidos. Esta tabela também pode ser usada para calcular os 19, 20, 22, 23 ou 24-mers pela adição ou subtração do número apropriado de nucleotídeos de cada 21mer. Assim o dsRNA da presente invenção pode variar em comprimento de cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 500 nucleotídeos consecutivos ou até o comprimento total de um gene semelhante a CAD. Preferivelmente, o dsRNA da invenção tem um comprimento de cerca de 21 nucleotídeos a cerca de 600 nucleotídeos consecutivos. Mais preferivelmente, o dsRNA da invenção tem um comprimento de cerca de 21 nucleotídeos a cerca de 500 nucleotídeos consecutivos, ou de cerca de 21 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotídeos consecutivos.

5 Como aqui revelado, 100% de identidade de seqüência entre o

RNA e o gene alvo não é exigido para praticar a presente invenção. Embora um dsRNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos idêntica a uma porção do gene semelhante a CAD seja preferida para inibição, a invenção pode tolerar variações de seqüência que podem ser esperadas devido à síntese 10 ou manipulação de gene, mutação genética, polimorfismo de cepa, ou divergência evolucionária. Assim os dsRNAs da invenção também incluem dsRNAs compreendendo uma combinação má com o gene alvo de pelo menos 1, 2, ou mais nucleotídeos. Por exemplo, é contemplado na presente invenção que as seqüências de 2 Imer dsRNA exemplificadas em Figuras 7 a- 15 7j pode conter uma adição, deleção ou substituição de 1, 2, ou mais nucleotídeos, com a condição de que a seqüência resultante ainda interfira com a função do gene semelhante a CAD.

Identidade de seqüência entre os dsRNAs da invenção e os genes alvos semelhante a CAD pode ser otimizada por algoritmos de 20 alinhamento e comparação de seqüências conhecidos na arte (veja Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, e referências citadas no mesmo) e cálculo da diferença percentual entre as seqüências de nucleotídeos por, por exemplo, o algoritmo de Smith-Waterman como implementado no programa de computador BESTFIT usando parâmetros 25 padrão (e.g., University of Wisconsin Genetic Computing Group). Mais do que 80 % de identidade de seqüência, 90% de identidade de seqüência, ou até mesmo 100% de identidade de seqüência, entre o RNA inibitório e a porção do gene alvo é preferida. Alternativamente, a região duplex do RNA pode ser definida funcionalmente como uma seqüência de nucleotídeos que é capaz de hibridizar com uma porção transcrito de gene alvo sob condições estringentes (e.g., NaCl 400 mM, PIPES 400 mM pH 6, 4, EDTA 1 mM, hibridização 60°C por 12-16 horas; seguida por lavagem a 65°C com SDS 0, 1% e SSC 0, 1% por cerca de 15-60 minutos).

5 Quando dsRNA da invenção tem um comprimento mais longo

do que cerca de 21 nucleotídeos, por exemplo de cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 1130 nucleotídeos, ele será clivado aleatoriamente em dsRNAs de cerca de 21 nucleotídeos dentro de célula de nematódeo parasita ou de planta, os siRNAs. A clivagem de um dsRNA mais curto da invenção dará uma 10 coleção de cerca de 2 Imer dsRNAs (variando de cerca de 19mers a cerca de 24mers), derivado do dsRNA mais longo. Esta coleção de cerca de 2 Imer dsRNAs também está incluída dentro do escopo da presente invenção, quer gerada intracelularmente dentro da planta ou do nematódeo quer sinteticamente usando métodos conhecidos de síntese de oligonucleotídeo.

Os siRNAs da invenção têm seqüências correspondendo aos

fragmentos de cerca de 19-24 nucleotídeos contíguos através da seqüência inteira de o gene alvo semelhante a CAD. Por exemplo, uma coleção de siRNA da invenção derivada de genes CAD-Iike como mostrado em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 podem compreender uma 20 multiplicidade de moléculas de RNA que são selecionadas do grupo consistindo de oligonucleotídeos compreendendo uma fita que é substancialmente idêntica aos 21 mer nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 encontrados em Figuras 7a-7j. Uma coleção de siRNA da invenção derivada de genes CAD-Iike descritos por 25 SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 também pode compreender qualquer combinação das moléculas de RNA específicas tendo qualquer uma das 21 seqüências de nucleotídeos contíguas derivadas de SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 mostradas em Figuras 7a-7j. Ademais, como notado acima, múltiplos Dicers especializados em plantas geram siRNAs tipicamente variando em tamanho de 19nt a 24nt (Veja Henderson et al., 2006. Nature Genetics 38:721-725.). Os siRNAs da presente invenção podem variar de cerca de 19 seqüências de nucleotídeos contíguos a cerca de 24 seqüências de nucleotídeos contíguos. Similarmente, uma coleção 5 de siRNA da invenção pode compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA tendo qualquer uma de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 seqüências de nucleotídeos contíguos derivadas de SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26. Alternativamente, a coleção de siRNA da invenção pode compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA tendo uma 10 combinação de qualquer uma de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, e/ou 24 seqüências de nucleotídeos contíguos derivadas de SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26.

O dsRNA da invenção podem opcionalmente compreender uma projeção de fita única em qualquer uma ou em ambas as extremidades. A 15 estrutura de fita dupla pode ser formada por uma fita única de RNA auto- complementar (i.e. formando uma alça de grampo-de-cabelo) ou duas fitas de

--------------RNA complementares. Formação de duplex de RNA pode ser iniciada quer

dentro quer fora da célula. Quando o dsRNA da invenção forma uma alça de grampo-de-cabelo, ele pode opcionalmente compreender um íntron, como 20 mostrado em US 2003/0180945Al ou um espaçador de nucleotídeo, que é um segmento de seqüência entre as fitas de RNA complementares para estabilizar o transgene de grampo-de-cabelo em células. Métodos para preparar várias moléculas de dsRNA são mostrados, por exemplo, em WO 99/53050 e em Pat. US No. 6.506.559. O RNA pode ser introduzido em uma quantidade que 25 permite liberação de pelo menos uma cópia por célula. Doses mais altas de material de fita dupla podem dar inibição mais eficaz.

Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor de expressão recombinante isolado compreendendo um ácido nucleico codificador de uma molécula de dsRNA como descrita acima, sendo que a expressão do vetor em uma célula hospedeira de planta resulta em resistência aumentada a um nematódeo parasita em comparação com uma variedade de tipo selvagem da célula hospedeira de planta. Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro 5 ácido nucleico no qual tem estado ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo," que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira 10 de planta na qual estão introduzidos. Outros vetores são integrados no genoma de uma célula hospedeira de planta sob introdução na célula hospedeira, e deste modo são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes nos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores são aqui chamados de "vetores de 15 expressão". Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente

--------relatório----descritivo,----"plasmídeo"---e--'Vetor" pode ser usado

intercambiavelmente porque o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada. Contudo, a invenção é intencionada para incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (e.g., vírus X da batata, vírus das manchas cloróticas amarelas do tabaco, e Geminivírus), que servem com funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucleico da invenção em uma forma adequada para 25 expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira de planta, o que significa que o vetor de expressão recombinante inclui uma ou mais seqüências regulatórias,e.g. promotores, selecionadas baseando-se nas células hospedeiras de planta a serem usadas para expressão, que está operacionalmente ligado na seqüência de ácido nucleico a ser expressada. Com respeito a um vetor de expressão recombinante, os termos "operacionalmente ligado" e "em associação operativa" são intercambiáveis e são intencionados para significar que a seqüência de ácido nucleico de interesse está ligada na(s) seqüência(s) regulatória(s) em uma maneira que 5 permite a expressão da seqüência de nucleotídeos (e.g., em uma célula hospedeira de planta quando o vetor é introduzido na célula hospedeira de planta). O termo "seqüência regulatória" é intencionado para incluir promotores, intensificadores, e outros elementos de controle de expressão (e.g., sinais de poliadenilação). Tais seqüências regulatórias são descritas, por 10 exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluindo as referências dos mesmos. Seqüências regulatórias incluem aquelas que dirigem 15 a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão da seqüência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Será reconhecido por aquelas pessoas experientes na arte que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula 20 hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de dsRNA desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras de planta para deste modo produzirem moléculas de dsRNA da invenção codificadas por ácido nucleicos como aqui descrito.

De acordo com a invenção, o vetor de expressão recombinante 25 compreende uma seqüência regulatória operacionalmente ligada em uma seqüência de nucleotídeos que é um modelo para uma ou ambas as fitas das moléculas de dsRNA da invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico adicionalmente compreende um promotor flanqueando qualquer extremidade da molécula de ácido nucleico, sendo que os promotores dirigem a expressão de cada fita individual de DNA, gerando deste modo dois RNAs complementares que hibridizam e formam o dsRNA. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeos que é transcrita em ambas as fitas do dsRNA em uma unidade de transcrição, sendo 5 que a fita de senso é transcrita da extremidade 5' da unidade de transcrição e a fita de anti-senso é transcrita da extremidade 3', sendo que as duas fitas são separadas por cerca de 3 a cerca de 500 pares de bases, e sendo que após a transcrição, o transcrito de RNA dobra-se sobre si mesmo para formar um grampo-de-cabelo. De acordo com a invenção, a região espaçadora no 10 transcrito de grampo-de-cabelo pode ser qualquer fragmento de DNA.

De acordo com a presente invenção, o polinucleotídeo introduzido pode ser mantido na célula de planta estavelmente se ele é incorporado em um replicon autônomo de não-cromossomo ou integrado nos cromossomos da planta. Alternativamente, o polinucleotídeo introduzido pode 15 estar presente em um vetor não-replicativo extra-cromossômico e ser transientemente expressado ou transientemente ativo. Se presente em um vetor não-replicativo extra-cromossômico ou um vetor que está integrado em um cromossomo, o polinucleotídeo preferivelmente reside em um cassete de expressão em planta. Um cassete de expressão em planta preferivelmente 20 contém seqüências regulatórias capazes de dirigir a expressão de gene em células de planta que estão operacionalmente ligadas de modo que cada seqüência possa realizar sua função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação preferidos são aqueles originários de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tal como o gene 3 25 conhecido como octopina sintase do plasmídeo-Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou seus equivalentes funcionais, mas também outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados. Como o vetor de expressão de gene de planta é muito freqüentemente não limitado aos níveis transcricionais, um cassete de expressão em planta preferivelmente contém outras seqüências operacionalmente ligadas como intensificadores de tradução tal como seqüência overdrive contendo seqüência líder 5’-não- traduzida do vírus do mosaico do tabaco intensificando a razão de polipeptídeo por RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693- 5 8711). Exemplos de vetores de expressão em planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D. et al., 1992, "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the Ieft border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; e "Vectors for Gene 10 Transfer in Higher Plants"; em: Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Expressão de gene de planta deve estar operacionalmente ligada em um promotor apropriado que concede expressão de gene em uma maneira temporal-preferida, espacial-preferida, tipo-de-célula-pre ferida, e/ou 15 tecido-preferida. Promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem qualquer promotor que é capaz de iniciar transcrição em uma célula de planta presente nas raízes de planta. Tais promotores incluem, mas não são limitados àqueles que podem ser obtidos de plantas, vírus de planta e bactérias que contêm genes que são expressados em plantas, tais como 20 Agrobacterium e Rhizobium. Preferivelmente, o cassete de expressão da invenção compreende um promotor específico para raiz, um promotor induzível por patógeno ou um promotor induzível por nematódeo. Mais preferivelmente o promotor induzível por nematódeo é um promotor específico de sítio de alimentação de nematódeo parasita. Um promotor 25 específico de sítio de alimentação de nematódeo parasita pode ser específico para células sinciciais ou células gigantes ou específico para ambos os tipos de células. Um promotor é induzível, se sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzido sob controle do promotor é pelo menos 30%, 40%, 50% preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% mais preferido pelo menos 100%, 200%, 300% maior em seu estado induzido, do que em seu estado não-induzido. Um promotor é específico para célula, tecido ou órgão, se sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzida sob controle do promotor, for pelo menos 30%, 40%, 50% preferivelmente pelo menos 5 60%, 70%>, 80%), 90% mais preferido pelo menos 100%, 200%, 300%) maior em um tipo de célula, tecido ou órgão particular, do que em outros tipos de célula, ou tecidos da mesma planta, preferivelmente os outros tipos de célula ou tecidos são tipos de célula ou tecidos do mesmo órgão de planta, e.g. uma raiz. No caso de promotores específicos para órgão, a atividade de promotor 10 tem que ser comparada com a atividade de promotor em outros órgãos de planta, e.g. folhas, caules, flores ou sementes.

O promotor pode ser constitutivo, induzível, preferido para estágio desenvolvente, preferido para tipo de célula, preferido para tecido ou preferido para órgão. Promotores constitutivos são ativos sob a maioria das 15 condições. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem os promotores 19S e 35S de CaMV (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), o promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302), o promotor Sep 1, o promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), o promotor de actina de Arabidopsis, o promotor de 20 ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), o promotor 35S do vírus do mosaico de escrofulária, o promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), o promotor GRP1-8, o promotor de cinamil álcool desidrogenase (Patente US No. 5.683.439), promotores do T-DNA de 25 Agrobacterium, tais como promotor de manopina sintase, promotor de nopalina sintase, e promotor de octopina sintase, o promotor de subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO), e semelhantes. Promotores que expressam o dsRNA em uma célula que é contatada por nematódeos parasitas são preferidos. Alternativamente, o promotor pode conduzir expressão do dsRNA em um tecido de planta remoto do sítio de contato com o nematódeo, e o dsRNA pode ser então transportado pela planta para uma célula que é contatada pelo nematódeo parasita, em particular células de ou próximas pelos sítio de alimentação, e.g. células sinciciais ou 5 células gigantes.

Promotores induzíveis são ativos sob certas condições, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou metabólito, calor, frio, luz, ataque patogênico, condições anaeróbicas, e semelhantes. Por exemplo, tem sido mostrado que os promotores TobRB7, AtRPE, AtPykl 0, Gemini 19, e AtHMGI são induzidos por nematódeos (para uma revisão de promotores induzíveis por nematódeos, veja Ann. Rev. Phytopathol. (2002) 40:191-219; veja também Pat. US No. 6.593.513). Método para isolar promotores adicionais, que são induzíveis por nematódeos são mostrados em Pat. US Nos. 5.589.622 e 5.824.876. Outros promotores induzíveis incluem o promotor hsp80 de Brassica, sendo induzível por choque térmico; o promotor PPDK é induzido por luz; o promotor PR-I de tabaco, Arabidopsis, e milho são induzíveis por infecção com um patógeno; e o promotor Adhl é induzido por hipoxia e estresse frio. Expressão de gene de planta também pode ser facilitada via um promotor induzível (para revisão, veja Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Promotores quimicamente induzíveis são especialmente adequados se for desejada expressão de gene tempo-específica. Exemplos não-limitantes de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico (Pedido PCT No. WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2:397-404) e um promotor induzível por etanol (Pedido PCT No. WO 93/21334).

Promotores preferidos para estágio desenvolvente são preferivelmente expressados em certos estágios de desenvolvimento. Promotores específicos de tecido e de órgão incluem aqueles que são preferencialmente expressados em certos tecidos ou órgãos, tais como, mas não limitados a folhas, raízes, sementes, ou xilema. Exemplos de promotores preferidos para tecido e preferidos para órgão incluem, mas não são limitados a promotores preferidos para fruta, preferidos para óvulo, preferidos para tecido masculino, preferidos para semente, preferidos para tegumento, 5 preferidos para tubérculo, preferidos para pedúnculo, preferidos para pericarpo, preferidos para folha, preferidos para estigma, preferidos para pólen, preferidos para antera, um preferido para pétala, preferidos para sépala, preferidos para pedicelo, preferidos para síliqua, preferidos para caule, preferidos para raiz e semelhantes. Promotores preferidos para semente são 10 preferivelmente expressados durante desenvolvimento e/ou germinação de semente. Por exemplo, promotores preferidos para semente podem ser preferidos para embrião, preferidos para endosperma e preferidos para capa de semente. Veja Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferidos para semente incluem, mas não limitados a celulose 15 sintase (celA), Cim 1, gama-zeína, globulina-1, zeína de 19 kD de milho (cZ19Bl) e semelhantes.

Outros promotores preferidos para tecido ou preferidos para órgão adequados incluem, mas não são limitados a, o promotor de gene de napina de colza (Patente US No. 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba 20 (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3):459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (Pedido PCT No. WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente US No. 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (Pedido PCT No. WO 91/13980), ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), bem como 25 promotores que concedem expressão específica em semente em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados para anotar são o promotor de gene Ipt2 ou Iptl de cevada (Pedido PCT No. WO 95/15389 e Pedido PCT No. WO 95/23230) ou aqueles descritos em Pedido PCT No. WO 99/16890 (promotores do gene de hordeína de cevada, gene de glutelina de arroz, gene orizina de arroz, gene prolamina de arroz, gene gliadina de arroz, gene glutelina de trigo, gene de glutelina de aveia, gene casirina de sorgo, e gene de secalina de centeio).

Outros promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção 5 incluem, mas não são limitados a, o promotor de proteína ligante de clorofila a/b maior, promotores de histona, o promotor Ap3, o promotor de β- conglicina, o promotor de napina, o promotor de lecitina de feijão-soja, o promotor de zeína de 15kD de milho, o promotor de zeína de 22kD, o promotor de zeína de 27kD, o promotor de g-zeína, os promotores ceroso, 10 shrunken 1, shrunken 2, e bronze, o promotor Zml3 (Patente US No. 5.086.169), os promotores de poligalacturonase (PG) de milho (Patentes US Nos. 5.412.085 e 5.545.546), e o promotor SGB6 (Patente US No. 5.470.359), bem como promotores sintéticos e outros promotores naturais.

De acordo com a presente invenção, o cassete de expressão 15 compreende uma seqüência de controle de expressão operacionalmente ligada em uma seqüência de nucleotídeos que é um modelo para uma ou ambas as fitas do dsRNA. O dsRNA modelo compreende (a) uma primeira fita tendo uma seqüência sendo substancialmente idêntica de cerca de 19 a cerca de 500, ou até o comprimento total, nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1, 2, 5, 20 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e (b) uma segunda fita tendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita. Em outras modalidades, o promotor flanqueia qualquer extremidade da seqüência de nucleotídeo modelo, sendo que o promotor dirige a expressão de cada fita de DNA individual, gerando deste modo dois RNAs complementares que 25 hibridizam e formam o dsRNA. Em modalidades alternativas, a seqüência de nucleotídeos é transcrita em ambas as fitas do dsRNA em uma unidade de transcrição, sendo que a fita de senso é transcrita da extremidade 5' da unidade de transcrição e a fita de anti-senso é transcrita da extremidade 3', sendo que as duas fitas estão separadas por cerca de 3 a cerca de 500 pares de base, e sendo que após transcrição, o transcrito de RNA dobra-se sobre si mesmo para formar um grampo-de-cabelo.

Em outra modalidade, o vetor contém um promotor bidirecional, dirigindo a expressão de duas moléculas de ácido nucleico, por 5 meio do qual a molécula de ácido nucleico codifica a seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD e a outra molécula de ácido nucleico codifica uma segunda seqüencia sendo substancialmente complementar à primeira fita e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as seqüências são transcritas.. Um promotor bidirecional é um 10 promotor capaz de mediar expressão em duas direções.

Em outra modalidade, o vetor contém dois promotores um mediando a transcrição da seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD e outro promotor mediando transcrição de uma segunda seqüência sendo substancialmente complementar à primeira fita 15 e capaz de formar um dsRNA, quando ambas as seqüências são transcritas. O segundo promotor pode ser um promotor diferente.

Um promotor diferente significa um promotor tendo uma atividade diferente com relação à especificidade de tecido ou célula, ou mostrando expressão em indutores diferentes por exemplo, patógenos, 20 estresse abiótico ou agentes químicos. Por exemplo, um promotor pode ser constitutivo ou específico para tecido e o outro pode ser específico para tecido ou induzível por patógenos. Em uma modalidade um promotor medeia a transcrição de uma molécula de ácido nucleico adequada para sobre- expressão de um gene semelhante a CAD, enquanto que o outro medeia 25 transcrição específica para célula ou tecido ou expressão induzível por patógeno do ácido nucleico complementar.

A invenção também é apresentada como modalidade em uma planta transgênica capaz de expressar o dsRNA da invenção e deste modo inibir os genes semelhantes a CAD e.g. nas raízes, sítio de alimentação, sincícios e/ou célula gigante. A planta ou planta transgênica pode ser qualquer planta, tal como, mas não limitada a árvores, flores cortadas, plantas ornamentais, verduras/hortaliças ou plantas de colheita. A planta pode ser escolhida de um gênero selecionado do grupo consistindo de Medicago, 5 Lycopersicon, Brassica, Cucumis, So-lanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triti-cale, Secale, Lolium, Flordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, 10 Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Het-erocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium, ou a planta 15 pode ser selecionada de um gênero selecionado do grupo consistindo de Arabidopsis, Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, So-lanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Brachipodium, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, 20 Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helian-thus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, FIyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, 25 Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium. Em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

Preferivelmente a planta é uma planta de colheita. Plantas de colheita são todas as plantas, usadas em agricultura. Conformemente em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea, preferivelmente uma planta da família Poaceae, Musaceae, Liliaceae ou Bromeliaceae, preferivelmente da família Poaceae. Conformerncnte, em ainda outra modalidade a planta é uma planta Poaceae do gênero Zea, Triticum, Oryza, 5 Hordeum, Secale, Avena, Saccharum, Sorgo, Pennisetum, Setaria, Panieum, Eleusine, Miscanthus, Brachypodium, Festuca ou Lolium. Quando a planta é do gênero Zea, a espécie preferida é Z. mays. Quando a planta é do gênero Triticum, a espécie preferida é T. aestivum, T. speltae ou T. durum. Quando a planta é do gênero Oryza, a espécie preferida é O. sativa. Quando a planta é 10 do gênero Hordeum, a espécie preferida é H. vulgare. Quando a planta é do gênero Secale, a espécie preferida é S. cereale. Quando a planta é do gênero Avena, a espécie preferida é A. sativa. Quando a planta é do gênero Saccarum, a espécie preferida é S. officinarum. Quando a planta é do gênero Sorgo, a espécie preferida é S. vulgare, S. bicolor ou S. sudanense. Quando a 15 planta é do gênero Pennisetum, a espécie preferida é P. glaucum. Quando a planta é do gênero Setaria, a espécie preferida é S. italica. Quando a planta é do gênero Panieum, a espécie preferida é P. miliaceum ou P. virgatum. Quando a planta é do gênero Eleusine, a espécie preferida é E. coracana. Quando a planta é do gênero Miscanthus, a espécie preferida é M. sinensis. 20 Quando a planta é uma planta do gênero Festuca, a espécie preferida é F. arundinaria, F. rubra ou F. pratensis. Quando a planta é do gênero Lolium, a espécie preferida é L. perenne ou L. multiflorum. Alternativamente, a planta pode ser Triticosecale.

Alternativamente, em uma modalidade a planta é uma planta 25 dicotiledônea, preferivelmente uma planta da família Fabaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Linacea, Euphorbiaceae, Convolvulaceae Rosaceae, Cucurbitaceae, Theaceae, Rubiaceae, Sterculiaceae ou Citrus. Em uma modalidade a planta é uma planta da família Fabaceae, Solanaceae ou Brassicaceae. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Fabaceae, preferivelmente do gênero Glycine, Pisum, Arachis, Cicer, Vicia, Phaseolus, Lupinus, Medicago ou Lens. Espécies preferidas da família Fabaceae são M. truncatula, M, sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba, P. vulgaris, Lupinus 5 albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius ou Lens culinaris. Mais preferidas são as espécies G. max A. hypogea e M. sativa. Mais preferida é a espécie G. max. Quando a planta é da família Solanaceae, o gênero preferido é Solanum, Lycopersicon, Nicotiana ou Capsicum. Espécies preferidas da família Solanaceae são S. tuberosum, L. esculentum, N. tabaccum ou C. 10 chinense. Mais preferido é S. tuberosum. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Brassicaceae, preferivelmente do gênero Brassica ou Raphanus. Espécies preferidas da família Brassicaceae são as espécies B. napus, B. oleracea, B. juncea ou B. rapa. Mais preferida é a espécie B. napus. Quando a planta é da família Chenopodiaceae, o gênero 15 preferido é Beta e a espécie preferida é a B. vulgaris. Quando a planta é da família Asteraceae, o gênero preferido é Helianthus e a espécie preferida é H. annuus. Quando a planta é da família Malvaceae, o gênero preferido é Gossypium ou Abelmoschus. Quando o gênero é Gossypium, a espécie preferida é G. hirsutum ou G. barbadense e a espécie mais preferida é G. 20 hirsutum. Uma espécie preferida do gênero Abelmoschus é a espécie A. esculentus. Quando a planta é da família Linacea, o gênero preferido é Linum e a espécie preferida é L. usitatis-simum. Quando a planta é da família Euphorbiaceae, o gênero preferido é Manihot, Jatropa ou Rhizinus e a espécie preferida é M. esculenta, J. curcas ou R. comunis. Quando a planta é da 25 família Convolvulaceae, o gênero preferido é Ipomea e a espécie preferida é I. batatas. Quando a planta é da família Rosaceae, o gênero preferido é Rosa, Malus, Py-rus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium ou Fragaria e a espécie preferida é o híbridoFra-garia x ananassa. Quando a planta é da família Cucurbitaceae, o gênero preferido é Cucu-mis, Citmllus ou Cucurbita e a espécie preferida é Cucumis sativus, Citrullus lanatus ou Cucurbita pepo. Quando a planta é da família Theaceae, o gênero preferido é Camellia e a espécie preferida é C. sinensis. Quando a planta é da família Rubiaceae, o gênero preferido é Coffea e a espécie preferida é C. arabica ou C. canephora.

5 Quando a planta é da família Sterculiaceae, o gênero preferido é Theobroma e a espécie preferida é T. cacao. Quando a planta é do gênero Citrus, a espécie preferida é C. sinensis, C. limon, C. reticulata, C. maxima e híbrido de espécie Citrus, ou semelhantes. Em uma modalidade preferida da invenção, a planta é uma planta de feijão-soja, uma batateira, ou uma planta de milho.

Métodos de transformação podem incluir métodos diretos e

indiretos de transformação. Métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por poli(etileno-glicol), transformação mediada por lipossomo (US 4.536.475), métodos biolísticos usando pistola de gene (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9):833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2:603, 15 1990), eletroporação, incubação de embriões secos em solução compreendendo DNA, e microinjeção. No caso destes métodos diretos de transformação, os plasmídeos usados não necessitam atender às exigências particulares. Plasmídeos simples, tais como aqueles da série pUC, pBR322, da série M13mp, pACYC184 e semelhantes podem ser usados. Se plantas 20 intactas são para serem regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável é preferivelmente localizado no plasmídeo. As técnicas de transformação diretas são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Transformação também pode ser realizada por infecção 25 bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo EP 0.116.718), infecção viral por intermédio de vetores virais (EP 0.067.553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0.270.356; WO 85/01856; US 4.684.611). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na arte. A cepa de Agrobacterium (e.g., Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado 5 no genoma da célula de planta. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeo- Ri ou -Ti ou está separadamente compreendido em um denominado vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229. A transformação mediada por Agrobacterium é melhor adequada para plantas IO dicotiledôneas mas também tem sido adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita em, por exemplo, White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for 15 Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Aeademic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225. Vários tecidos são adequados como material inicial (explante) para o processo de transformação mediada por Agrobacterium incluindo mas não limitados a 20 calo (US 5, 591, 616; EP-Al 604.662), embriões imaturos (EP-A1 672.752), pólen (US 54.929.300), ápice de raiz (US 5.164.310), ou em transformação de planta (US 5, 994, 624). O método e o material aqui descritos podem ser combinados com virtualmente todos os métodos de transformação mediada por Agrobacterium conhecidos na arte. As plantas transgênicas da invenção 25 podem ser cruzadas com plantas transgênicas similares ou com plantas transgênicas faltantes de ácidos nucleicos da invenção ou com plantas não- transgênicas, usando métodos conhecidos de geração de planta, para preparar sementes. Ademais, a planta transgênica da presente invenção pode compreender, e/ou ser cruzada com outra planta transgênica que compreende um ou mais ácidos nucleicos, criando assim uma "pilha" de transgenes na planta e/ou sua progênie. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica fértil cruzada compreendendo o ácido nucleico da invenção. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o cassete de expressão particular 5 herdado através de uma planta parental fêmea ou através de uma planta parental macho. A segunda planta pode ser uma planta endogâmica. A planta transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também estão incluídas dentro da presente invenção as sementes de qualquer uma destas plantas transgênicas férteis. As sementes desta invenção podem ser colhidas de 10 plantas transgênicas férteis e usadas para crescer gerações de progênie de plantas transformadas desta invenção incluindo linhagens de planta híbrida compreendendo o construto de DNA.

"Empilhamento de gene" também pode ser realizado por transferência de dois ou mais genes para dentro do núcleo de célula por 15 transformação de planta. Múltiplos genes podem ser introduzidos no núcleo da célula durante transformação quer seqüencialmente quer simultaneamente. Múltiplos genes em planta ou espécie de patógeno alvo podem ser infra- regulados por mecanismos de silenciamento de gene, especialmente RNAi, pelo uso de um transgene único selecionador de múltiplas seqüências parciais 20 ligadas de interesse, genes múltiplos, empilhados sob o controle de promotores individuais também podem ser sobre-expressados para alcançar um fenótipo único ou múltiplo desejado. Construtos contendo pilhas de gene de ambos os genes sobre-expressados e alvos silenciados também podem ser introduzidos em plantas dando fenótipos únicos ou múltiplos 25 agronomicamente importantes. Em certas modalidades as seqüências de ácido nucleico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeo de interesse para criar fenótipos desejados. As combinações podem produzir plantas com uma variedade de combinações de feições incluindo mas não limitadas a resistência à doença, tolerância a herbicida, intensificação de rendimento, tolerância ao frio e à estiagem. Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo mas não limitado a geração cruzada de plantas por métodos convencionais ou por transformação genética. Se as feições são empilhadas 5 por transformação genética, as seqüências de polinucleotídeo de interesse podem ser seqüencial ou simultaneamente combinadas em qualquer ordem. Por exemplo se dois genes são para serem introduzidos, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados ou no mesmo cassete de transformação. A expressão das seqüências pode ser conduzida por 10 promotores iguais ou diferentes.

De acordo com esta modalidade, a planta transgênica da invenção é produzida por um método compreendendo as etapas de preparar um cassete de expressão tendo uma primeira região que é substancialmente idêntica a uma porção de gene semelhante a CAD selecionado e uma segunda 15 região que é complementar à primeira região, transformar o cassete de expressão em uma planta, e selecionar a progênie da planta transformada que expressa o construto de dsRNA da invenção.

Resistência aumentada à infecção de nematódeo é uma feição geral desejada para ser herdada em uma ampla variedade de plantas A 20 presente invenção pode ser usada para reduzir a destruição de plantação por qualquer nematódeo parasita de planta. Preferivelmente, os nematódeos parasitas pertencem às famílias de nematódeo incluindo células sinciciais ou gigantes. Nematódeos indutores de células sinciciais ou gigantes são encontrados nas famílias Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, 25 Meloidogynidae, Pratylenchidae ou Tylenchulidae. Em particular nas famílias Heterodidae e Meloidogynidae.

Conformemente, nematódeos parasitas selecionados pela presente invenção pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Het-erodera, Punctodera, Longidorus ou Meloidogyne. Em uma modalidade preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera ou Meloidogyne. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas 5 pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Globodera, Heterodera, ou Meloidogyne. Em uma modalidade ainda mais preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou ambos os gêneros selecionados do grupo de Globodera ou Heterodera. Em outra modalidade os nematódeos parasitas pertencem ao gênero Meloidogyne.

IO Quando os nematódeos parasitas são do gênero Globodera, as

espécies são preferivelmente do grupo consistindo de G. achilleae, G. artemisiae, G. hypolysi, G. mexicana, G. millefolii, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis, G. tabacum, e G. virginiae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Globodera incluem pelo menos um da espécie G. 15 pallida, G. tabacum, ou G. rostochiensis. Quando os nematódeos parasitas são do gênero Heterodera, as espécies podem ser preferivelmente do grupo consistindo de H. avenae, H. carotae, H. ciceri, H. cruciferae, H. delvii, H. elachista, H. filipjevi, H. gambiensis, H. glycines, H. goettingiana, H. graduni, H. humuli, H. hordecalis, H. latipons, H. major, H. medicaginis, H. oryzicola, 20 H. pakistanensis, H. rosii, H. sacchari, H. schachtii, H. sorghi, H. trifolii, H. urticae, H. vigni e H. zeae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Heterodera incluem pelo menos um da espécie H. glycines, H. avenae, H. cajani, H. gottingiana, H. trifolii, H. zeae ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos um

da espécie H. glycines ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida o nematódeo parasita é a espécie H. glycines.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Meloidogyne, os nematódeos parasitas podem ser selecionados do grupo consistindo de M. acronea, M. arabica, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. chitwoodi, Μ. cofeicola, Μ. esigua, Μ. graminicola, Μ. hapla, Μ. incógnita, Μ. indica, Μ. inomata, Μ. javanica, Μ. lini, Μ. mali, Μ. microcephala, Μ. microtyla, Μ. naasi, Μ. salasi e M. thamesi. Em uma modalidade preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos um da espécie M. javanica, M. incógnita, M. hapla, M. arenaria ou M. chitwoodi.

Os seguintes exemplos não são intencionados para limitarem o escopo das reivindicações da invenção, mas mais propriamente são intencionados para serem exemplares de certas modalidades. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorrem para o técnico experiente são intencionadas para caírem dentro do escopo da presente invenção.

EXEMPLO 1: CLONAGEM DE GENE 49676534 DE

FEIJÃO-SOJA

Glycine max cv. Williams 82 foi germinada sobre placas de ágar por três dias e então transferida para bolsas de germinação. Um dia mais tarde, cada planta jovem foi inoculada com nematódeos juvenis de segundo estágio (J2) de H. glycines race 3. Seis dias após inoculação, tecido de raiz novo foi fatiado em pedaços de 1 cm de comprimento, fixado, embebido em um criomolde, e seccionado usando métodos conhecidos. Células sinciciais foram identificadas por sua morfologia singular de tamanho de célula aumentado, parede celular espessada, e citoplasma denso e dissecadas em tampão de extração de RNA usando um microscópio PALM (P.A.L.M. Microlaser Technologies GmbH, Bemried, Alemanha). RNA celular total foi extraído, amplificado, e fluorescentemente marcado usando métodos conhecidos. Como controles, RNA total foi isolado de ambos "não-sincícios" e raízes de controle não tratadas submetidos ao mesmo processo de amplificação de RNA. O RNA amplificado foi hibridizado em arranjos de cDNA de feijão-soja patenteados.

Clone 49676534 de cDNA de feijão-soja foi identificado como estando supra-regulado em sincícios de raízes de feijão-soja infectadas com SCN como indicado em Tabela I. A seqüência de aminoácidos de clone 49676534 de cDNA de feijão-soja (SEQ ID NO:l) é descrita por SEQ ID NO:4. A seqüência de 49676534 cDNA (SEQ ID NO:l) foi determinada em não ser de comprimento total baseado no alinhamento de SEQ ID NO:4 com 5 seqüências de proteína homólogas de comprimento total.

Tabela 1

Nome do Gene Sincícios Sincícios #2 (N) Não-Sincícios Raízes de #l(N)if Controle 49676534§ 52±16(4) 133±94(5) não detectado não detectado EXEMPLO 2: CONSTRUÇÃO DE VETOR BINÁRIO PARA TRANSFORMAÇÃO DE FEIJÃO-SOJA.

Este método exemplificado emprega vetores binários contendo o gene alvo 49676534 (SEQ ID NO. 26). O vetor consiste de um fragmento de anti-senso (SEQ ID NO:2) do gene alvo 49676534, um espaçador, um fragmento de senso do gene alvo e uma estrutura principal do vetor. O fragmento de gene alvo (SEQ ID NO:2) correspondendo ao nucleotídeos 677 a 876 de SEQ ID NO:l foi usado para construir o vetor binário RCB584. Neste vetor, dsRNA para o gene alvo 49676534 foi expressado sob um promotor semelhante a MtN3 preferido em sincícios ou raiz promotor descrito por SEQ ID NO:3 em RCB584. O promotor dirige a expressão de transgene preferencialmente em raízes e/ou sincícios ou célula gigantes. O marcador de seleção para transformação foi um gene de aceto-hidróxi-ácido sintase (AHAS) mutado de A. thaliana que concedeu resistência ao herbicida ARSENAL (imazepir, BASF Corporation, Mount Olive, NJ). A expressão de AHAS mutado foi dirigida por um promotor de ubiquitina de salsa (WO 03/102198).

EXEMPLO 3: ENSAIOS DE EXPLANTE ENRAIZADO O ensaio de explante enraizado foi utilizado para demonstrar

expressão de dsRNA e a resistência a nematódeo resultante. Este ensaio pode ser encontrado em pedido co-pendente USSN 12/001, 234, cujo conteúdo é aqui incorporado como referência. Sementes de feijão-soja limpas de cultivar de feijão-soja foram esterilizadas na superfície e germinadas.

Três dias antes da inoculação, uma cultura líquida noturna de cultura de Agrobacterium desarmada, por exemplo, a cepa K599 de A. rhizogenes desarmada contendo o vetor binário RCB584, foi iniciada. No dia seguinte a cultura foi espalhada sobre uma placa de ágar LB contendo canamicina como um agente de seleção. As placas foram incubadas a 280C por dois dias. Uma placa foi preparada para cada um dos 50 explantes a serem inoculados. Cotilédones contendo a extremidade proximal de sua conexão com as planta jovens foram usados como o explante para transformação. Após remoção dos cotilédones a superfície foi raspada com um escalpelo ao redor do sítio de corte. O cotilédone cortado e raspado foi o alvo para inoculação com Agrobacterium. os explantes preparados foram imersos em colônias de A. rhizogenes espessas desarmadas preparadas acima de modo que as colônias ficassem visíveis sobre a superfície cortada e raspada. Os explantes foram então posicionados sobre ágar 1% em placas de Petri para co-cultura sob luz por 6-8 dias. Após a transformação e a co-cultura explantes de feijão- soja foram transferidos para meio de indução de enraizamento com um agente de seleção, por exemplo S-B5-708 para o gene de aceto-hidróxi-ácido-sintase (AHAS) mutado (Sathasivan et al., Plant Phys. 97:1044-50, 1991). Culturas foram mantidas na mesma condição como na etapa de co-cultura. O meio S- B5-708 compreende: 0,5X sais B5, MES 3 mM, sacarose 2%, IX vitaminas B5, 400Timentina 400 μg/ml, ágar Noble 0, 8%, e Imazapirl μΜ (agente de seleção para gene AHAS) (BASF Corporation, Florham Park, NJ) em pH 5,8. duas ou três semanas após a seleção e a indução de raízes, raízes transformadas foram formadas sobre as extremidades cortadas dos explantes. Explantes foram transferidos para o mesmo meio de seleção (Meio S-B5-708) para seleção adicional. Raízes transgênicas proliferaram bem dentro de uma semana no meio e estavam prontas para serem subcultivadas. Raízes de feijão-soja brancas e fortes foram excisadas dos explantes enraizados e cultivadas em meio de crescimento de raiz suplementado com Timentina 200 mg/l (meio S-MS-606) em placas de seis cavidades. Culturas foram mantidas 5 na temperatura ambiente sob a condição escura. O meio S-MS-606 compreende: 0, 2X sais MS e vitaminas b5, sacarose 2%, e Timentina 200 mg/l em pH 5, 8.

Um a cinco dias após sub-cultivo, as raízes foram inoculadas com nematódeos juvenis esterilizados em superfície em placas de multicavidades para ensaio quer de construto de promotor quer de gene de interesse. Como um controle, foram usadas raízes de vetor de controle Jack e vetor de controle de feijão-soja cultivar Williams 82. Culturas de raiz de cada linhagem que ocupou pelo menos metade da cavidade foram inoculadas com race 3 de superfície descontaminada de nematódeos de cisto de feijão-soja (SCN) juvenis de segundo estágio (J2) no nível de 500 J2\cavidade. As placas foram então seladas e postas de volta na incubadora a 25°C no escuro. Várias linhagens de raiz independentes foram geradas de cada transformação de vetor binário e as linhagens foram usadas para bioensaio. Quatro semanas após inoculação de nematódeo, os cistos em cada cavidade foram contados. Dados de bioensaio para construto RCB5 84 resultaram em linhagens múltiplas com contagem de cisto reduzida mostrando uma tendência geral de contagem de cisto reduzida sobre muitas das linhagens testadas.

Exemplo 4 RACE para determinar seqüência transcrita total para 49676534 (SEQ ID NO:l)

Amplificação de seqüência de transcrito de comprimento total

correspondendo à seqüência de cDNA descrita por 49676534 (SEQ ID NO:l) foi realizada usando o GeneRacer Kit (LI502-01) de Invitrogen seguindo as instruções do fabricante. RNA total de raízes de feijão-soja colhidas 6 dias após infecção com SCN foi preparado de acordo com o protocolo de GeneRacer Kit de Invitrogen para gerar RNA desfosforilado e de terminal de cadeia desbloqueado ligado no GeneRacer RNA Oligo de acordo com as instruções do fabricante. O RNA preparado foi reversamente transcrito de acordo com o protocolo de GeneRacer Kit e usado como o modelo de 5 biblioteca RACE para PCR para isolar extremidades 5' de cDNA usando reações PCR primária e secundária (aninhadas) de acordo com o protocolo de GeneRacer Kit.

Produtos de reação PCR secundária foram separados por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio. Produtos 10 específicos foram visíveis como bandas distintas e foram excisados do gel. Fragmentos foram purificados do gel de agarose e clonados em vetores pCR4- TOPO (Invitrogen) seguindo instruções do fabricante, e então transformados em células TOPlO One Shot (Invitrogen) seguindo instruções do fabricante. Colônias resultantes foram minipreparadas e seqüenciadas. Um dos 15 fragmentos seqüenciados descrito como SEQ ID NO:5 foi alinhado com SEQ ID NO:l seqüência de 49676534 cDNA. O alinhamento entre SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:l é mostrado em Figura 3. Baseado neste alinhamento uma seqüência de contig de comprimento total putativa foi isolada e é descrita por SEQ ID NO:6. Há uma matriz de leitura aberta em seqüência de contig SEQ 20 ID N0:6 que abarca as bases 34 a 1107. A seqüência de matriz de leitura aberta é descrita por SEQ ID NO:26. A seqüência de aminoácidos da matriz de leitura aberta descrita por bases 34 a 1107 de SEQ ID NO:6 é mostrada como SEQ ID NO:7.

Exemplo 5 Descrição de homólogos Como revelado em Exemplo 3, o construto RCB5 84 resulta na

expressão de uma molécula de RNA de fita dupla que seleciona SEQ ID NO:l e resulta em contagem de cisto reduzida quanto operacionalmente ligado em um promotor induzível por nematódeo e expressado em raízes de feijão-soja. Como revelado em Exemplo 4, a seqüência de transcrito de comprimento total putativa do gene correspondendo à SEQ ID NO:l contém uma matriz de leitura aberta com a seqüência de aminoácidos revelada como SEQ ID NO:7. A identificação de homólogos de gene à seqüência de aminoácidos descrita por SEQ ID NO:7 identifica seqüências adicionais que 5 podem ser capazes de modular transcrito de SEQ ID NO:l resultando em contagem de nematódeo reduzida. Para explorar esta possibilidade, a seqüência de aminoácidos descrita por SEQ ID NO:7 foi usada para identificar genes homólogos. É possível que expressão de RNA de fita dupla específico para o DNA de genes homólogos também possa resultar em 10 contagem de cisto reduzida quando expressado em raízes por seleção dos transcritos descritos por SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:6. Uma amostra de genes com as seqüências de aminoácido e de DNA homólogas às SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:26, respectivamente, foi identificada e é descrita por SEQ ID NOs 8-25 e mostrada em Figura I. Os homólogos descritos representam 15 uma variedade de homologia para o gene descrito por SEQ ID NO:7. O alinhamento de aminoácido dos homólogos truncados identificados à SEQ ID NO:7 é mostrado em Figura 4. Uma tabela de matriz mostrando a identidade percentual de aminoácido dos homólogos identificados e SEQ ID NO:7 é mostrada em Figura 5. Uma tabela de matriz mostrando a identidade 20 percentual da seqüência de DNA dos homólogos identificados e SEQ ID NO:26 é mostrada em Figura 6.

Aquelas pessoas experientes na arte reconhecerão, ou serão capazes de averiguar usando experimentação não mais do que rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes são intencionados para serem incluídos pelas seguintes reivindicações. I LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASF Plant Science GmbH Wiig, Aaron

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS USANDO INTERFERÊNCIA DE RNA DE GENES semelhantes a CAD PARA CONTROLE DE NEMATÓDEOS

<130> PF 58860

<160> 26

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1130

<212> DNA

<213> Glycine max

<4 00> 1

tgcttcgctg atgtagtttg gacaaggaat aaacatggtg actcaaagta tcctgtcgtg 60 cctggtcatg agattgctgg gattgtgaca aaggttggcg ccaatgtcca ccattttaag 120 gttggcgacc atgttggagt ggggacttat ataaactcat gtagggattg tgagtattgt 180 aatgatggac aagaagttca ttgtaccaag ggatctgtat acacttttaa tggtgttgat 240 tttgatggta caattacaaa aggaggatac tccagttaca tagtagtcca tgagaggtac 300 tgcttcatga taccaaaaag ctatccattg gcttccgcag ctcctttgct ttgtgctgga 360 attactgttt attcaccgat ggtccgccac aagatgaatc aacctggtaa atctctagga 420 gtgattggtc ttggtggcct cggtcatatg gcggtgaaat ttggaaaggc atttggtttg 480 agtgtaacgg tttttagcac tagtatatcc aagaaagagg aggcactgag cctgcttggc 540 gcagacaaat ttgttgtttc atctaatcaa gaggaaatga cggcgttggc taaatcgttg 600 gactttataa tcgacacagc atctggtgat cactcgtttg atccttacat gtcactgctg 660 aagacatatg gtgtttttgt cctagttggt ttccctagtc aagtcaaatt tatccctgca 720 agccttaata taggatcaaa gactgttgcc ggaagtgtta caggtggtac aaaagatata 780 caggagatga ttggcttctg tgctgcaaac gagattcacc caaatataga ggtgattcca 840 atcgagtatg ccaatgaagc tcttgagagg ctcataaata gggacgtcaa gtaccggttt 900 gtaatagatg ttgagaattc cctgaaagaa aaatgagttg ttgcctccca aattggacat 960 tattggactt caccttgttc gataaataat gatggtcgga gttcgtaatt tacttacata 1020 gagttgattt gaattttctt taattatttt gtgaactaat attatgtgat tataagaata 1080 ttttggattt ttaaataata ataattatgg aaatcaaaaa aaaaaaaaaa 1130 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Glycine max

<400> 2 tggtttccct agtcaagtca aatttatccc tgcaagcctt aatataggat 60 ttgtcctagt caaagactgt tgccggaagt gttacaggtg gtacaaaaga tatacaggag atgattggct 120 tctgtgctgc aaacgagatt cacccaaata tagaggtgat tccaatcgag tatgccaatg 180 aagctcttga gaggctcata 200 <210> 3 <211> 609 <212> DNA <213> Glycine max <400> 3 catgaagagt atatcatttc agtaatgttt tgagacgcct ctataatgct 60 gaagccacgt ttaccaacaa aacaaaacaa aaaaaagaac atttgaaacc atttgtatta aaaaaaaaaa 120 ggtatattag gccataatat tataggtaac atgaaatatc aaatgacacg caagagtttt 180 gtcaaaaatg aaaccatcac acatcagaga ttatggcaaa taatgttttg tgtgtctctt 240 gcttcaccca taacataagc ctctataact ggagagaaga S3.3âSâ3.âcÍCJ tggaggggct 300 agggtgggaa tttggaagaa tacagttata ttgagcattg agcaagttga tagaaagctt 360 ctcaatttgt acaaaatttg catccacatg attattaaag acgtagacag cacttcttcc 420 ttcttttttt ctataagttt cttatatatt gttcttcatg ttttaatatt attactttat 480 gtacgcgtct aacagtagtc ctcccaaact gctataaata gagcctcttc aacgcacctc 540 ttggcagtac aaaaattatt catctcttct aagttctaat tttctaagca ttcagtaaaa 600 gaactaacc 609 <210> 4 <211> 311 <212> PRT <213> Glycine max <400> 4 Cys Phe Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys His Gly Asp Ser Lys 1 5 10 15 Tyr Pro Val Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Ile Val Thr Lys Val 20 25 30 Gly Ala Asn Val His His Phe Lys Val Gly Asp His Val Gly Val Gly 35 40 45 Thr Tyr Ile Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Gln 50 55 60 Glu Val His Cys Thr Lys Gly Ser Val Tyr Thr Phe Asn Gly Val Asp 65 70 75 80

Phe Asp Gly Thr Ile Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser Tyr Ile Val Val 85 90 95

His Glu Arg Tyr Cys Phe Met Ile Pro Lys Ser Tyr Pro Leu Ala Ser 100 105 110

Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Val 115 120 125

Arg His Lys Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu 130 135 140

Gly Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu 145 150 155 160

Ser Val Thr Val Phe Ser Thr Ser Ile Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu 165 170 175

Ser Leu Leu Gly Ala Asp Lys Phe Val Val Ser Ser Asn Gln Glu Glu 180 185 190

Met Thr Ala Leu Ala Lys Ser Leu Asp Phe Ile Ile Asp Thr Ala Ser 195 200 205

Gly Asp His Ser Phe Asp Pro Tyr Met Ser Leu Leu Lys Thr Tyr Gly 210 215 220

Val Phe Val Leu Val Gly Phe Pro Ser Gln Val Lys Phe Ile Pro Ala 225 230 235 240

Ser Leu Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val Ala Gly Ser Val Thr Gly Gly 245 250 255

Thr Lys Asp Ile Gln Glu Met Ile Gly Phe Cys Ala Ala Asn Glu Ile 260 265 270

His Pro Asn Ile Glu Val Ile Pro Ile Glu Tyr Ala Asn Glu Ala Leu 275 280 285

Glu Arg Leu Ile Asn Arg Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Val 290 295 300

Glu Asn Ser Leu Lys Glu Lys 305 310 <210> 5

<211> 519

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 5 tcatcacaag tgtgagaaaa attatgagtt ccaaaggtgt tggtgaagat 60 ggatccttac tgcctgggat gggcagcaag agatgcatcc ggagttctat caccttacaa attcagtcgc 120 aggactcttg ggaacgaaga tgttcatatt aaaattacgc actgtggtgt ttgcttcgct 180 gatgtagttt ggacaaggaa taaacatggt gactcaaagt atcctgtcgt gcctggtcat 240 gagattgctg ggattgtgac aaaggttggc gccaatgtcc accattttaa ggttggcgac 300 catgttggag tggggactta tataaactca tgtagggatt gtgagtattg taatgatgga 360 caagaagttc attgtaccaa gggatctgta tacactttta atggtgttga ttttgatggt 420 acaattacaa aaggaggata ctccagttac atagtagtcc atgagaggta ctgcttcatg 480 ataccaaaaa gctatccatt ggcttccgca gctcctttg 519 <210> 6 <211> 1301 <212> DNA <213> Glycine max <4 00> 6 tcatcacaag tgtgagaaaa attatgagtt ccaaaggtgt tggtgaagat 60 ggatccttac tgcctgggat gggcagcaag agatgcatcc ggagttctat caccttacaa attcagtcgc 120 aggactcttg ggaacgaaga tgttcatatt aaaattacgc actgtggtgt ttgcttcgct 180 gatgtagttt ggacaaggaa taaacatggt gactcaaagt atcctgtcgt gcctggtcat 240 gagattgctg ggattgtgac aaaggttggc gccaatgtcc accattttaa ggttggcgac 300 catgttggag tggggactta tataaactca tgtagggatt gtgagtattg taatgatgga 360 caagaagttc attgtaccaa gggatctgta tacactttta atggtgttga ttttgatggt 420 acaattacaa aaggaggata ctccagttac atagtagtcc atgagaggta ctgcttcatg 480 ataccaaaaa gctatccatt ggcttccgca gctcctttgc tttgtgctgg aattactgtt 540 tattcaccga tggtccgcca caagatgaat caacctggta aatctctagg agtgattggt 600 cttggtggcc tcggtcatat ggcggtgaaa tttggaaagg catttggttt gagtgtaacg 660 gtttttagca ctagtatatc caagaaagag gaggcactga gcctgcttgg cgcagacaaa 720 tttgttgttt catctaatca agaggaaatg acggcgttgg ctaaatcgtt ggactttata 780 atcgacacag catctggtga tcactcgttt gatccttaca tgtcactgct gaagacatat 840 ggtgtttttg tcctagttgg tttccctagt caagtcaaat ttatccctgc aagccttaat 900 ataggatcaa agactgttgc cggaagtgtt acaggtggta CâS-S-âCfSLtclt acaggagatg 960 attggcttct gtgctgcaaa cgagattcac ccaaatatag aggtgattcc aatcgagtat 1020 gccaatgaag ctcttgagag gctcataaat agggacgtca agtaccggtt tgtaatagat 1080 gttgagaatt ccctgaaaga aaaatgagtt gttgcctccc aaattggaca ttattggact 1140 tcaccttgtt cgataaataa tgatggtcgg agttcgtaat ttacttacat agagttgatt 1200 tgaattttct ttaattattt tgtgaactaa tattatgtga ttataagaat attttggatt 1260 tttaaataat aataattatg gaaatcaaaa a 1301 <210> 7

<211> 357

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 7

Met Ser Ser Lys Gly Val Gly Glu Asp Cys Leu Gly Trp Ala Ala Arg 10 15

Asp Ala Ser Gly Val Leu Ser Pro Tyr Lys Phe Ser Arg Arg Thr Leu 20 25 30

Gly Asn Glu Asp Val His Ile Lys Ile Thr His Cys Gly Val Cys Phe 35 40 45

Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys His Gly Asp Ser Lys Tyr Pro 50 55 60

Val Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Ile Val Thr Lys Val Gly Ala 65 70 75 80

Asn Val His His Phe Lys Val Gly Asp His Val Gly Val Gly Thr Tyr 85 90 95

Ile Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Gln Glu Val 100 105 110

His Cys Thr Lys Gly Ser Val Tyr Thr Phe Asn Gly Val Asp Phe Asp 115 120 125

Gly Thr Ile Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser Tyr Ile Val Val His Glu 130 135 140

Arg Tyr Cys Phe Met Ile Pro Lys Ser Tyr Pro Leu Ala Ser Ala Ala 145 150 155 160

Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Val Arg His 165

170

175

Lys Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu Gly Gly 180 185 190

Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu Ser Val 195 200 205

Thr Val Phe Ser Thr Ser Ile Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu Ser Leu 210 215 220

Leu Gly Ala Asp Lys Phe Val Val Ser Ser Asn Gln Glu Glu Met Thr 225 230 235 240

Ala Leu Ala Lys Ser Leu Asp Phe Ile Ile Asp Thr Ala Ser Gly Asp 245 250 255

His Ser Phe Asp Pro Tyr Met Ser Leu Leu Lys Thr Tyr Gly Val Phe 260 265 270

Val Leu Val Gly Phe Pro Ser Gln Val Lys Phe Ile Pro Ala Ser Leu 275 280 285

Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val Ala Gly Ser Val Thr Gly Gly Thr Lys 290 295 300

Asp Ile Gln Glu Met Ile Gly Phe Cys Ala Ala Asn Glu Ile His Pro 305 310 315 320

Asn Ile Glu Val Ile Pro Ile Glu Tyr Ala Asn Glu Ala Leu Glu Arg 325 330 335

Leu Ile Asn Arg Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Val Glu Asn 340 345 350

Ser Leu Lys Glu Lys 355

<210> 8 <211> 1068 <212> DNA

<213> Vitis vinifera <400> 8

atgacttctg aaagtgcaga tgacaactgc ttagcatggg cggcaagaga tccatctggc cttctatcac cttacaaatt cagccgcagg gctcttggaa gtgatgatgt ttcattgaat

60

120

atcacacact gtggggtttg ttatgctgat gtagtctgga ctaggaataa atttggagac 180 tctaagtatc ctgtggtacc tggacatgag attgctggaa ttgtaaaaga ggttggctca 240 aatgttcgtc gcttcaaagt tggtgaccat gttggagtgg gaacctatgt caactcatgc 300 agggattgtg agtactgcaa tgatggactt gaagttcatt gtgcgagggg gtcggtgttc 360 acttttaatg gtgttgatgt tgatggtacg gtcaccaaag gaggttattc cagtcacatt 420 gttgttcatg aaaggtactg cttcaagata cctgacaact acccattagc ttcagcagca 480 cctttgctat gtgctggaat tactgtttac actcccatga tgcgccacaa gatgaaccaa 540 cctggtaaat ccctcggggt gattgggcta ggtggtcttg gtcacttggc tgtgaagttt 600 ggcaaggctt ttggattgcg tgtcacagtt ctcagcacaa gcatatccaa gaaagaagaa 660 gctctgaatc tgcttggagc agacaaattt gtggtctcat cagacgaaca gcagatgatg 720 gctctttcta gatcactcga ctttataatt gatactgcat caggtgatca cccattcgat 780 ccatacttgt ctctgttgaa gactgccgga gtcctagttc tggtggggtt cccaagtgaa 840 gtgaaattca gtcctggaag cattgtcatg ggtatgagaa ctgtttctgg tagcgctaca 900 ggtggtacaa aagatacaca agaaatgctt gacttttgtg ctgcacatgg aattcaccca 960 gagatcgaag taattccaat tcagtatgca aatgaagccc ttgagaggct aataaagaag 1020 gacgtgaagt accgttttgt gattgatatt gaaaactctc tgaagtga 1068 <210> 9 <211> 355 <212> PRT

<213> Vitis vinifera <400> 9

Met Thr Ser Glu Ser Ala Asp Asp Asn Cys Leu Ala Trp Ala Ala Arg 10 15

Asp Pro Ser Gly Leu Leu Ser Pro Tyr Lys Phe Ser Arg Arg Ala Leu 20 25 30

Gly Ser Asp Asp Val Ser Leu Asn Ile Thr His Cys Gly Val Cys Tyr 35 40 45

Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys Phe Gly Asp Ser Lys Tyr Pro 50 55 60

Val Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Ile Val Lys Glu Val Gly Ser 65 70 75 80

Asn Val Arg Arg Phe Lys Val Gly Asp His Val Gly Val Gly Thr Tyr 85 90 95

Val Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Leu Glu Val 100 105 110

His Cys Ala Arg Gly Ser Val Phe Thr Phe Asn Gly Val Asp Val Asp 115 120 125

Gly Thr Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser His Ile Val Val His Glu 130 135 140

Arg Tyr Cys Phe Lys Ile Pro Asp Asn Tyr Pro Leu Ala Ser Ala Ala 145 150 155 160

Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Thr Pro Met Met Arg His 165 170 175

Lys Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile Gly Leu Gly Gly 180 185 190

Leu Gly His Leu Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu Arg Val 195 200 205

Thr Val Leu Ser Thr Ser Ile Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu Asn Leu 210 215 220

Leu Gly Ala Asp Lys Phe Val Val Ser Ser Asp Glu Gln Gln Met Met 225 230 235 240

Ala Leu Ser Arg Ser Leu Asp Phe Ile Ile Asp Thr Ala Ser Gly Asp 245 250 255

His Pro Phe Asp Pro Tyr Leu Ser Leu Leu Lys Thr Ala Gly Val Leu 260 265 270

Val Leu Val Gly Phe Pro Ser Glu Val Lys Phe Ser Pro Gly Ser Ile 275 280 285

Val Met Gly Met Arg Thr Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Thr Lys 290 295 300

Asp Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Cys Ala Ala His Gly Ile His Pro 305 310 315 320

Glu Ile Glu Val Ile Pro Ile Gln Tyr Ala Asn Glu Ala Leu Glu Arg 325 330 335

Leu Ile Lys Lys Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Ile Glu Asn 340 345 350

Ser Leu Lys 355

<210> 10

<211> 1068

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

atgagttctt cagagagtgt ggaaaacgag tgcatgtgtt gggctgcaag agatccatct 60 ggtcttcttt ctcctcatac tatcactcgc aggtctgtta caactgacga tgtttcactc 120 acaatcactc attgtggagt gtgttacgct gatgttatct ggagtagaaa ccaacatgga 180 gactccaagt accctttggt tcctgggcat gagattgctg gaatagtgac taaggttggg 240 cctaatgttc aacgattcaa agttggagac catgttggtg ttggaacgta tgttaactcc 300 tgcagggagt gtgaatattg taatgaagga caagaagtta attgtgcgaa aggagttttt 360 actttcaatg gcattgatca tgatggctct gttactaaag gaggctactc tagtcacatt 420 gttgttcatg aaaggtactg ctacaagata cctgtggact atcccttgga atcagctgca 480 ccattactct gtgctggaat cacggtttat gctcctatga tgcgtcacaa tatgaatcaa 540 cctggtaaat ctcttggggt gatcgggcta ggtggtcttg gacacatggc ggttaagttt 600 ggcaaggctt ttggacttag tgttacggtt tttagcacca gcatttccaa gaaagaagaa 660 gctttgaatc tgctaggagc tgagaatttc gttatctcat ctgaccatga ccagatgaag 720 gcactagaga aatctctaga ctttctagtt gacacagcat ctggtgatca cgcgtttgat 780 ccttacatgt ctctcttgaa gattgctgga acttatgtat tggttggttt cccaagtgaa 840 attaaaatca gtcctgccaa tctcaatctt ggtatgagaa tgctcgctgg aagtgtaacc 900 ggggggacca aaataacaca gcaaatgtta gatttctgtg cagctcataa gatttatcca 960 aacatagagg tgattcccat tcaaaagata aacgaagctc tcgaaagagt ggtgaagaag 1020 gacatcaagt accgtttcgt gattgacatc aagaactccc tcaaatag 1068 <210> 11 <211> 355 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <4 00> 11

Met Ser Ser Ser Glu Ser Val Glu Asn Glu Cys Met Cys Trp Ala Ala 10 15

Arg Asp Pro Ser Gly Leu Leu Ser Pro His Thr Ile Thr Arg Arg Ser 20 25 30

Val Thr Thr Asp Asp Val Ser Leu Thr Ile Thr His Cys Gly Val Cys 35 40 45 Tyr Ala Asp Val 50

Pro Leu Val Pro 65

Pro Asn Val Gln

Tyr Val Asn Ser 100

Val Asn Cys Ala 115

Gly Ser Val Thr 130

Arg Tyr Cys Tyr 145

Pro Leu Leu Cys

Asn Met Asn Gln 180

Leu Gly His Met 195

Thr Val Phe Ser 210

Leu Gly Ala Glu 225

Ala Leu Glu Lys

His Ala Phe Asp 260

Val Leu Val Gly 275

Asn Leu Gly Met

Ile Trp Ser Arg 55

Gly His Glu Ile 70

Arg Phe Lys Val 85

Cys Arg Glu Cys

Lys Gly Val Phe 120

Lys Gly Gly Tyr 135

Lys Ile Pro Val 150

Ala Gly Ile Thr 165

Pro Gly Lys Ser

Ala Val Lys Phe 200

Thr Ser Ile Ser 215

Asn Phe Val Ile 230

Ser Leu Asp Phe 245

Pro Tyr Met Ser

Phe Pro Ser Glu 280

Arg Met Leu Ala

Asn Gln His Gly 60

Ala Gly Ile Val 75

Gly Asp His Val 90

Glu Tyr Cys Asn 105

Thr Phe Asn Gly

Ser Ser His Ile 140

Asp Tyr Pro Leu 155

Val Tyr Ala Pro 170

Leu Gly Val Ile 185

Gly Lys Ala Phe

Lys Lys Glu Glu 220

Ser Ser Asp His 235

Leu Val Asp Thr 250

Leu Leu Lys Ile 265

Ile Lys Ile Ser

Gly Ser Val Thr

Asp Ser Lys Tyr

Thr Lys Val Gly 80

Gly Val Gly Thr 95

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Val Val His Glu

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Met Met Arg His 175

Gly Leu Gly Gly 190

Gly Leu Ser Val 205

Ala Leu Asn Leu

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Gly Gly Thr Lys 290 295 300

Ile Thr Gln Gln Met Leu Asp Phe Cys Ala Ala His Lys Ile Tyr Pro 305 310 315 320

Asn Ile Glu Val Ile Pro Ile Gln Lys Ile Asn Glu Ala Leu Glu Arg 325 330 335

Val Val Lys Lys Asp Ile Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Ile Lys Asn 340 345 350

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<210> 12 tgtaaaggat gggcagctcg agatccatca 60 <211> 1071 <212> DNA <213> Picea sitchensis <400> 12 atgaatacta aagaagactg caaggagaac ggtgttttgt caccttacca atttaaccga agagtcccag gccttgatga tatctcatta 120 aagataactc attgtggagt ttgttatgcc gatgttgtct ggacccggaa taaacatggt 180 gattcaaagt atccattggt gccagggcat gaaattgttg gaattgtgaa agaagttggc 240 atcaatgtgg tctcttttaa ggctggcgat catgttggag tgggtacata tgtcagttcc 300 tgtcagcaat gtgaatattg taacgaaagg atggaagtca attgtgaaaa agggtctgtt 360 ttcaccttta atggtatcga tgtagatggc acagtaacta aaggaggata ttctagtcac 420 attgttgttc accaaaggta ctgctttaag ataccagaca atctaccact ggcttcagct 480 gcacctttgc tctgtgcagg aattactgtt tacagcccta tgattcgtca tcacatgaat 540 catgcaggaa agtctcttgg agtaattggg ctaggaggtc ttggtcatat ggcagtaaaa 600 tttggaaagg cttttggact gaatgtaaca atttttagca catctgcatc aaagaaggat 660 gaagcattaa acattcttgg agcagataaa tttatagtgt catctgataa agatcagata 720 gaggcttcat caaagactct agatttcatc attgacaccg cttcagggga ccacccaatt 780 gatctttata tgccactttt gaagactgca ggagtgtttg tcatcgtagg tttccccagt 840 gaaatcaaga tccaccctgc caatcttatt ataggcatga aatcaattgc aggaagtgta 900 acaggtggca ccaaagacac tcaagaaatg cttgattttt gtgcaaagga aagagtatat 960 ccagacattg aagtcattcc aatccagtat gtgaatgagg ctttagaacg aatgattaac 1020 aaagatgtga aatatcgctt tgtgattgac attgagaatt ctctagtctg a 1071 <210> 13 <211> 356 <212> PRT

<213> Picea sitchensis

<400> 13

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Pro Gly Leu Asp Asp Ile Ser Leu Lys Ile Thr His Cys Gly Val Cys 35 40 45

Tyr Ala Asp Val Val Trp Thr Arg Asn Lys His Gly Asp Ser Lys Tyr 50 55 60

Pro Leu Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Ile Val Lys Glu Val Gly 65 70 75 80

Ile Asn Val Val Ser Phe Lys Ala Gly Asp His Val Gly Val Gly Thr 85 90 95

Tyr Val Ser Ser Cys Gln Gln Cys Glu Tyr Cys Asn Glu Arg Met Glu 100 105 110

Val Asn Cys Glu Lys Gly Ser Val Phe Thr Phe Asn Gly Ile Asp Val 115 120 125

Asp Gly Thr Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Ser His Ile Val Val His 130 135 140

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Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Ile Arg 165 170 175

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Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe Gly Leu Asn 195 200 205

Val Thr Ile Phe Ser Thr Ser Ala Ser Lys Lys Asp Glu Ala Leu Asn 210 215 220

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Phe Val Ile Val Gly Phe Pro Ser Glu Ile Lys Ile His Pro Ala Asn 275 280 285

Leu Ile Ile Gly Met Lys Ser Ile Ala Gly Ser Val Thr Gly Gly Thr 290 295 300

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Pro Asp Ile Glu Val Ile Pro Ile Gln Tyr Val Asn Glu Ala Leu Glu 325 330 335

Arg Met Ile Asn Lys Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Ile Glu 340 345 350

Asn Ser Leu Val 355

<210> 14

<211> 1032

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 14

atggctgctg aatgtgggag tggcaactgt gatgcttggg cagcgagaga tccttccgga 60 atcctctccc cgtacaaatt caaccgcagg gaagtacaga gtgaagatgt ttctttgagg 120 atcacacact gtggagtatg ttatgctgat gtcatttgga cacggaatat gttcaacgat 180 tcgatatacc ctttggttcc tgggcacgag atagctggag ttgtaactga ggttggtgca 240 gacgtcaagg ggttcaaagt gggcgaccat gactgcgaga actgcaatag ctctctggag 300 aaccactgct cgaaatgtgt cgtcacttac aacagtgttg attcagacgg gaccgtaaca 360 aagggtggat attccagtca tatactagtg catcaaaggt actgctttaa aatacctgct 420 gactaccctt tgtcaaaggc agcaccactg ctttgtgcgg gaattaccgt atatactcca 480 atgatacgac ataacatgaa ccaaccaggg aagtcacttg gcgtcattgg actaggtggg 540 ttgggtcaca tggcagtaaa atttgggaaa gcctttggac tcaaagtgac agtttttagt 600 acaagtgaat caaagagaga agaagctatc aaccttcttg gtgcagataa ttttgtgata 660 tcatcagatg aaaatcagat ggagtcactg aaaagttccc ttcacttcat tattgatact 720 gcatctggtg atcaccagtt cgatccttat ctctcgcttc tgaaagttgg tggtgtaatg 780 gtgctactta gcttcccaag tgaaatcaaa gttcatcctg aaaaccttaa tctcgctgcg 840 cggagcttag ctggtagtgt aacagggggt acaaaggata tccaggagat gataaacttc 900 tgtgctgcaa acaatgttta cccagatata gagatgatca agatagacta cgtcaacgag 960 gctcttcaga ggctcatcaa ccgggatgtg agattccgct ttgtaatcga catcgagaac 1020 tctttcaagt ag 1032 <210> 15

<211> 343

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<4 00> 15

Met Ala Ala Glu Cys Gly Ser Gly Asn Cys Asp Ala Trp Ala Ala Arg 10 15

Asp Pro Ser Gly Ile Leu Ser Pro Tyr Lys Phe Asn Arg Arg Glu Val 20 25 30

Gln Ser Glu Asp Val Ser Leu Arg Ile Thr His Cys Gly Val Cys Tyr 35 40 45

Ala Asp Val Ile Trp Thr Arg Asn Met Phe Asn Asp Ser Ile Tyr Pro 50 55 60

Leu Val Pro Gly His Glu Ile Ala Gly Val Val Thr Glu Val Gly Ala 65 70 75 80

Asp Val Lys Gly Phe Lys Val Gly Asp His Asp Cys Glu Asn Cys Asn 85 90 95

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Met Ile Arg His Asn Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly Val Ile 165 170 175

Gly Leu Gly Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys Ala Phe 180 185 190

Gly Leu Lys Val Thr Val Phe Ser Thr Ser Glu Ser Lys Arg Glu Glu 195 200 205

Ala Ile Asn Leu Leu Gly Ala Asp Asn Phe Val Ile Ser Ser Asp Glu 210 215 220

Asn Gln Met Glu Ser Leu Lys Ser Ser Leu His Phe Ile Ile Asp Thr 225 230 235 240

Ala Ser Gly Asp His Gln Phe Asp Pro Tyr Leu Ser Leu Leu Lys Val 245 250 255

Gly Gly Val Met Val Leu Leu Ser Phe Pro Ser Glu Ile Lys Val His 260 265 270

Pro Glu Asn Leu Asn Leu Ala Ala Arg Ser Leu Ala Gly Ser Val Thr 275 280 285

Gly Gly Thr Lys Asp Ile Gln Glu Met Ile Asn Phe Cys Ala Ala Asn 290 295 300

Asn Val Tyr Pro Asp Ile Glu Met Ile Lys Ile Asp Tyr Val Asn Glu 305 310 315 320

Ala Leu Gln Arg Leu Ile Asn Arg Asp Val Arg Phe Arg Phe Val Ile 325 330 335

Asp Ile Glu Asn Ser Phe Lys 340

<210> 16

<211> 894

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 16

atgaaattgt gtctaaattt caatatgagt aggcatgaga tagcaggagt tgtaactgag gttggtgcag acgtcaagag cttcaaagtg ggtgaccatg taggtgttgg cacatacgtg aattcatgcc gggactgtga gaactgcaat agctctctag agaactactg ctcacaacat gtcttcactt tcaatggtgt tgacactgat gggactgtca caaagggagg atattctact

60

120

180

240

cacatagtag tacatgagag gtattgcttt aaaatacctg atggctaccc tttggaaaag 300 gcagcacctt tactttgtgc tggcatcact gtatatagtc cgatgatgcg gcataatatg 360 aaccagccag ggaagtcact cggcgtcatt ggacttggtg gcttgggtca catggcagta 420 aaatttggga aagcctttgg actgaaagtc acagttatta gtactagtga atcaaagaga 480 aaagaagcta ttgaccttct tggtgcagat aatttcgtgg tgtcatcgga tgaaaatcag 540 atggagacct tgaaaagctc tctgaacttc attattgaca cagcctccgg cgatcaccca 600 ttcgatcctt atctcacgct tctgaaagtt ggtggtgtaa tggcactact tagcttccca 660 agtgaaatca aagtgcatcc tgcaaacctt aatctcggtg ggcggagttt atctggtagt 720 gtaactggag gtacgaagga catccaggag atgataaact tctgtgcggc aaacaaaatc 780 tacccagata tcgagatgat caagatagat tacatcaacg aggctcttca gaggcttgtt 840 gaccgggatg tcagatttcg ctttgtaatc gacattgaga actcgttcaa gtag 894 <210> 17

<211> 297

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 17

Met Lys Leu Cys Leu Asn Phe Asn Met Ser Arg His Glu Ile Ala Gly 10 15

Val Val Thr Glu Val Gly Ala Asp Val Lys Ser Phe Lys Val Gly Asp 20 25 30

His Val Gly Val Gly Thr Tyr Val Asn Ser Cys Arg Asp Cys Glu Asn 35 40 45

Cys Asn Ser Ser Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Gln His Val Phe Thr Phe 50 55 60

Asn Gly Val Asp Thr Asp Gly Thr Val Thr Lys Gly Gly Tyr Ser Thr 65 70 75 80

His Ile Val Val His Glu Arg Tyr Cys Phe Lys Ile Pro Asp Gly Tyr 85 90 95

Pro Leu Glu Lys Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr 100 105 110

Ser Pro Met Met Arg His Asn Met Asn Gln Pro Gly Lys Ser Leu Gly 115 120 125

Val Ile Gly Leu Gly Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Gly Lys 130 135 140 Ala Phe Gly Leu Lys Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Glu Ser Lys Arg 145 150 155 160

Lys Glu Ala Ile Asp Leu Leu Gly Ala Asp Asn Phe Val Val Ser Ser 165 170 175

Asp Glu Asn Gln Met Glu Thr Leu Lys Ser Ser Leu Asn Phe Ile Ile 180 185 190

Asp Thr Ala Ser Gly Asp His Pro Phe Asp Pro Tyr Leu Thr Leu Leu 195 200 205

Lys Val Gly Gly Val Met Ala Leu Leu Ser Phe Pro Ser Glu Ile Lys 210 215 220

Val His Pro Ala Asn Leu Asn Leu Gly Gly Arg Ser Leu Ser Gly Ser 225 230 235 240

Val Thr Gly Gly Thr Lys Asp Ile Gln Glu Met Ile Asn Phe Cys Ala 245 250 255

Ala Asn Lys Ile Tyr Pro Asp Ile Glu Met Ile Lys Ile Asp Tyr Ile 260 265 270

Asn Glu Ala Leu Gln Arg Leu Val Asp Arg Asp Val Arg Phe Arg Phe 275 280 285

Val Ile Asp Ile Glu Asn Ser Phe Lys 290 295

<210> 18

<211> 1089

<212> DNA

<213> Populus trichocarpa

<4 00> 18

atggcaaaat caccagaagt agaacatcca cataaggctt ttggctgggc tgccaaagat 60 agttctgggg tcctttctcc ctttcatttc tcaagaaggg acaatggagt tgaagatgtg 120 accataaaaa tcctgtactg tggagtttgc cattcggact tgcacgctgc caagaatgaa 180 tgggggtttt ccagatatcc tttgattcct gggcatgaaa ttgttggtat tgtgacaaaa 240 attggaagca atgtgaagaa gttcaaagtg gacgatcagg ttggtgttgg agtactggtg 300 aactcctgta agtcatgcga gtattgcgac caggacttgg agaattactg ccctaaaatg 360 atatttacat acaatgccca aaaccatgat gggacaaaaa cttatggtgg ttattctgat 420 acaattgtgg ttgaccagca ctttgtactc cgtattcctg atagcatgcc tgctgatggg 480 gctgcaccac tattatgtgc tgggatcaca acagaaccag ggaagcattt gggaatcgta aagattggta aggcctttgg tttgaaagtt agcgaagcac ttgatagact tggtgctgat atgaaggcag catttggcac tatggattac ttggctccac ttcttagtct gctgaagaca gagaagcccc ttgagctgcc tatcttccct agtgatattg gaggggtgaa agagactcaa attacctcag atgttgaggt gatccgaatg gccaaatcgg atgtcaggta ccggtttgtg cagttatga <210> 19

<211> 362

<212> PRT

<213> Populus trichocarpa

<4 00> 19

gtgtacagcc caatgaaata ttatggaatg ggattggggg ggcttggaca tgttgctgtg acagtcatca gttcatcatc aagaaaggag tcattccttg tgagcagtga ccctgagaaa atcattgaca ctgtgtctgc agttcatgcc aatggaaaac ttgttacttt gggcttgcct ttggtcttgg ggcgaaagct agttggtgga gagatgttgg acttctgtgc gaagcacaat gatcaaatca acacagccat ggataggctt attgatgtgg ccaactccct gtcacaatct Lys Ala Phe Gly Trp 15

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Tyr Cys Asp Gln Asp 110

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Val Cys His Ser Asp Leu His Ala Ala Lys Asn 50 55

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540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1089

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135

140

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Lys Val Thr Val Ile Ser Ser Ser Ser Arg Lys Glu Ser Glu Ala Leu 210 215 220

Asp Arg Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Lys 225 230 235 240

Met Lys Ala Ala Phe Gly Thr Met Asp Tyr Ile Ile Asp Thr Val Ser 245 250 255

Ala Val His Ala Leu Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Lys Thr Asn Gly 260 265 270

Lys Leu Val Thr Leu Gly Leu Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Ile 275 280 285

Phe Pro Leu Val Leu Gly Arg Lys Leu Val Gly Gly Ser Asp Ile Gly 290 295 300

Gly Val Lys Glu Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Cys Ala Lys His Asn 305 310 315 320

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Met Asp Arg Leu Ala Lys Ser Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asp 340 345 350

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<210> 20

<211> 1080

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum. <400> 20 tatatgagaa tgaacaccca gtaaaggcct ttggatgggc agctagagat 60 atggcaaaat acttctggtg ttctttctcc ttttaacttt tcaagaagag ccacgggtga aaaggatgtg 120 cagtttaaag ttatgtattg tggaatttgt cattctgatc ttcatcagct caagaatgaa 180 tggagcacta gcatatatcc aatggtacct gggcatgagg ttgctggtgt ggtaactgat 240 gttggtagca aggttgagaa atttaaggtt ggtgacaaag taggagttgg atgtttggta 300 ggatcatgtc gcaaatgtga aaactgtgac aataatctcg agaattactg tcccggtcag 360 ataatgacat acaacggtat ttacatcgat ggaaccacca cgtatggagg atactccaat 420 attatggtaa cggacgagca ctacgtggtt cactggcctg agaacttgcc aatggaagcg 480 gctccattgt tatgtgctgg aattacaaca tatagtcctt tgaaatattt tggactcgat 540 aaacctggaa tgcacattgg tgttgttggt cttggtggtc ttggtcatat ggctgtgaaa 600 tttgctaagg cattcggaac aaaagtgact gttattagta catctgctag taagaaacaa 660 gaagcaattg ggcgtttggg tgcggactca tttttggtta gtcgtgaccc tgaccaaatg 720 caggctgcag caggctcgct tgatggcatc attgacactg tctctgcaat tcaccctctt 780 cttccattga ttaatttgtt gaaaactcat gggaagcttg taatggttgg cgcaccagaa 840 aaaccattag agttgcccgt atttcccttg cttttaggaa ggaagctagt agcagggagt 900 gccataggag ggataaagga gacacaagag atggtagatt tcgcggcaaa gcataacatt 960 acaccagatg ttgaagtcgt gccaatggac tatgtgaata cagctttaga ccgtcttttg 1020 aaatcggatg ttaagtaccg ttttgtactt gacgttggca atacattaaa caagaattag 1080 <210> 21 <211> 359 <212> PRT

<213> Nicotiana tabacum <400> 21

Met Ala Lys Leu Tyr Glu Asn Glu His Pro Val Lys Ala Phe Gly Trp 10 15

Ala Ala Arg Asp Thr Ser Gly Val Leu Ser Pro Phe Asn Phe Ser Arg 20 25 30

Arg Ala Thr Gly Glu Lys Asp Val Gln Phe Lys Val Met Tyr Cys Gly 35 40 45

Ile Cys His Ser Asp Leu His Gln Leu Lys Asn Glu Trp Ser Thr Ser 50 55 60

Ile Tyr Pro Met Val Pro Gly His Glu Val Ala Gly Val Val Thr Asp 65 70 75 80

Val Gly Ser Lys Val Glu Lys Phe Lys Val Gly Asp Lys Val Gly Val 85 90 95

Gly Cys Leu Val Gly Ser Cys Arg Lys Cys Glu Asn Cys Asp Asn Asn 100 105 110

Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Gly Gln Ile Met Thr Tyr Asn Gly Ile Tyr 115 120 125

Ile Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asn Ile Met Val Thr 130 135 140

Asp Glu His Tyr Val Val His Trp Pro Glu Asn Leu Pro Met Glu Ala 145 150 155 160

Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Lys Tyr 165 170 175

Phe Gly Leu Asp Lys Pro Gly Met His Ile Gly Val Val Gly Leu Gly 180 185 190

Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Ala Lys Ala Phe Gly Thr Lys 195 200 205

Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Ala Ser Lys Lys Gln Glu Ala Ile Gly 210 215 220

Arg Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Ser Arg Asp Pro Asp Gln Met 225 230 235 240

Gln Ala Ala Ala Gly Ser Leu Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Ser Ala 245 250 255

Ile His Pro Leu Leu Pro Leu Ile Asn Leu Leu Lys Thr His Gly Lys 260 265 270

Leu Val Met Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Val Phe 275 280 285

Pro Leu Leu Leu Gly Arg Lys Leu Val Ala Gly Ser Ala Ile Gly Gly 290 295 300

Ile Lys Glu Thr Gln Glu Met Val Asp Phe Ala Ala Lys His Asn Ile 305 310 315 320 Thr Pro Asp Val Glu Val Val Pro Met Asp Tyr Val Asn Thr Ala Leu 325 330 335

Asp Arg Leu Leu Lys Ser Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Leu Asp Val 340 345 350

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<210> 22

<211> 1083

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 22

atggcgaaat ctccagaaac agagcatccg aacaaagtct ttggttgggg tgctagagac 60 aaatccggtg ttctctctcc ttttcacttc tctagaagag acaatggtga aaatgatgtg 120 acagtgaaga tcttgttctg tggagtttgc cacactgatt tacacaccat caaaaacgac 180 tggggatact cgtattaccc agtagttcca gggcatgaaa tcgttgggat cgctacaaaa 240 gttggtaaga acgtgactaa attcaaagaa ggagatcgtg tcggagtagg agtgatcagt 300 ggctcgtgcc aatcttgcga atcttgtgac caagatcttg aaaactactg tcctcaaatg 360 tctttcacat acaatgcgat tggatccgat ggaaccaaga attacggtgg ctattcggag 420 aacattgtgg ttgatcaacg gtttgttttg cggtttccgg agaatttacc gagcgattcg 480 ggtgcgccgt tgctgtgtgc tggaatcact gtgtatagtc caatgaagta ttatggtatg 540 actgaggcag ggaagcattt aggggttgct ggacttggtg ggcttggtca tgttgctgtt 600 aagattggta aagcttttgg tttgaaagtt actgtcatta gttcttcttc tacgaaagca 660 gaggaagcca ttaatcatct tggtgctgat tcgtttcttg tcacaactga tcctcagaaa 720 atgaaggctg caattggaac aatggactac attatcgata cgatatcagc agtacatgct 780 ctgtatccgt tgctcggttt actcaaagtc aacggaaagc tcattgcttt aggcttacct 840 gagaagcctc tcgagctacc aatgttccct cttgttctcg gaaggaaaat ggttggagga 900 agtgacgtgg gagggatgaa ggagacacaa gagatgcttg atttctgcgc taagcacaac 960 attacagctg atattgaatt gattaagatg gatgagatta acactgcgat ggagaggctt 1020 gctaagtctg atgttaggta caggttcgtg atcaacgtgg ctaactcctt gagccctcca 1080 tga 1083 <210> 23

<211> 360

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 23 Met Ala Lys Ser Pro Glu Thr Glu His Pro Asn Lys Val Phe Gly Trp 10 15

Gly Ala Arg Asp Lys Ser Gly Val Leu Ser Pro Phe His Phe Ser Arg 20 25 30

Arg Asp Asn Gly Glu Asn Asp Val Thr Val Lys Ile Leu Phe Cys Gly 35 40 45

Val Cys His Thr Asp Leu His Thr Ile Lys Asn Asp Trp Gly Tyr Ser 50 55 60

Tyr Tyr Pro Val Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Ile Ala Thr Lys 65 70 75 80

Val Gly Lys Asn Val Thr Lys Phe Lys Glu Gly Asp Arg Val Gly Val 85 90 95

Gly Val Ile Ser Gly Ser Cys Gln Ser Cys Glu Ser Cys Asp Gln Asp 100 105 110

Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Gln Met Ser Phe Thr Tyr Asn Ala Ile Gly 115 120 125

Ser Asp Gly Thr Lys Asn Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Asn Ile Val Val 130 135 140

Asp Gln Arg Phe Val Leu Arg Phe Pro Glu Asn Leu Pro Ser Asp Ser 145 150 155 160

Gly Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Met Lys 165 170 175

Tyr Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Lys His Leu Gly Val Ala Gly Leu 180 185 190

Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Ile Gly Lys Ala Phe Gly Leu 195 200 205

Lys Val Thr Val Ile Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Glu Glu Ala Ile 210 215 220

Asn His Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Thr Thr Asp Pro Gln Lys 225 230 235 240

Met Lys Ala Ala Ile Gly Thr Met Asp Tyr Ile Ile Asp Thr Ile Ser 245 250 255 Ala Val His Ala Leu Tyr Pro Leu Leu Gly Leu Leu Lys Val Asn Gly 260 265 270

Lys Leu Ile Ala Leu Gly Leu Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Met 275 280 285

Phe Pro Leu Val Leu Gly Arg Lys Met Val Gly Gly Ser Asp Val Gly 290 295 300

Gly Met Lys Glu Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Cys Ala Lys His Asn 305 310 315 320

Ile Thr Ala Asp Ile Glu Leu Ile Lys Met Asp Glu Ile Asn Thr Ala 325 330 335

Met Glu Arg Leu Ala Lys Ser Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asn 340 345 350

Val Ala Asn Ser Leu Ser Pro Pro 355 360

<210> 24

<211> 1074

<212> DNA

<213> Pinus taeda

<4 00> 24

atgggaagct tggaatctga aaaaactgtt acaggatatg cagctcggga ctccagtggc 60 cacttgtccc cttacactta caatctcaga aagaaaggac ctgaggatgt aattgtaaag 120 gtcatttact gcggaatctg ccactctgat ttagttcaaa tgcgtaatga aatgggcatg 180 tctcattacc caatggtccc tgggcatgaa gtggtgggga ttgtaacaga gattggtagc 240 gaggtgaaga aattcaaagt gggagagcat gtaggggttg gttgcattgt tgggtcctgt 300 cgcagttgcg gtaactgcaa tcagagcatg gaacaatact gcagcaagag gatttggacc 360 tacaatgatg tgaaccatga cggcacccct actcagggag gatttgcaag cagtatggtg 420 gttgatcaga tgtttgtggt tcgaatcccg gagaatcttc ctctggaaca agcagcccct 480 ctgttatgtg caggggttac agttttcagc ccaatgaagc atttcgccat gacagagccc 540 gggaagaaat gtgggatttt gggtttagga ggcgtggggc acatgggtgt caagattgcc 600 aaagcctttg gacttcacgt gacggttatc agttcgtctg ataaaaagaa agaagaagcc 660 atggaagtcc tcggcgccga tgcttatctt gttagcaagg atactgaaaa gatgatggaa 720 gcagcagaga gcctagatta cataatggac accattccag ttgctcatcc tctggaacca 780 tatcttgccc ttctgaagac aaatggaaag ctagtgatgc tgggcgttgt tccagagccg 840 ttgcacttcg tgactcctct cttaatactt gggagaagga gcatagctgg aagtttcatt 900 ggcagcatgg aggaaacaca ggaaactcta gatttctgtg cagagaagaa ggtatcatcg 960 atgattgagg ttgtgggcct ggactacatc aacacggcca tgaaaaggtt ggagaagaac 1020 gatgtccgtt acagatttgt ggtggatgtt gctgcaagca agctggataa ctag 1074 <210> 25

<211> 357

<212> PRT

<213> Pinus taeda

<400> 25

Met Gly Ser Leu Glu Ser Glu Lys Thr Val Thr Gly Tyr Ala Ala Arg 10 15

Asp Ser Ser Gly His Leu Ser Pro Tyr Thr Tyr Asn Leu Arg Lys Lys 20 25 30

Gly Pro Glu Asp Val Ile Val Lys Val Ile Tyr Cys Gly Ile Cys His 35 40 45

Ser Asp Leu Val Gln Met Arg Asn Glu Met Gly Met Ser His Tyr Pro 50 55 60

Met Val Pro Gly His Glu Val Val Gly Ile Val Thr Glu Ile Gly Ser 65 70 75 80

Glu Val Lys Lys Phe Lys Val Gly Glu His Val Gly Val Gly Cys Ile 85 90 95

Val Gly Ser Cys Arg Ser Cys Gly Asn Cys Asn Gln Ser Met Glu Gln 100 105 110

Tyr Cys Ser Lys Arg Ile Trp Thr Tyr Asn Asp Val Asn His Asp Gly 115 120 125

Thr Pro Thr Gln Gly Gly Phe Ala Ser Ser Met Val Val Asp Gln Met 130 135 140

Phe Val Val Arg Ile Pro Glu Asn Leu Pro Leu Glu Gln Ala Ala Pro 145 150 155 160

Leu Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Phe Ser Pro Met Lys His Phe Ala 165 170 175

Met Thr Glu Pro Gly Lys Lys Cys Gly Ile Leu Gly Leu Gly Gly Val 180 185 190 Gly His Met Gly Val Lys Ile Ala Lys Ala Phe Gly Leu His Val Thr 195 200 205

Val Ile Ser Ser Ser Asp Lys Lys Lys Glu Glu Ala Met Glu Val Leu 210 215 220

Gly Ala Asp Ala Tyr Leu Val Ser Lys Asp Thr Glu Lys Met Met Glu 225 230 235 240

Ala Ala Glu Ser Leu Asp Tyr Ile Met Asp Thr Ile Pro Val Ala His 245 250 255

Pro Leu Glu Pro Tyr Leu Ala Leu Leu Lys Thr Asn Gly Lys Leu Val 260 265 270

Met Leu Gly Val Val Pro Glu Pro Leu His Phe Val Thr Pro Leu Leu 275 280 285

Ile Leu Gly Arg Arg Ser Ile Ala Gly Ser Phe Ile Gly Ser Met Glu 290 295 300

Glu Thr Gln Glu Thr Leu Asp Phe Cys Ala Glu Lys Lys Val Ser Ser 305 310 315 320

Met Ile Glu Val Val Gly Leu Asp Tyr Ile Asn Thr Ala Met Lys Arg 325 330 335

Leu Glu Lys Asn Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Val Asp Val Ala Ala 340 345 350

Ser Lys Leu Asp Asn 355

<210> 26

<211> 1074

<212> DNA

<213> Glycine max

<4 00> 26

atgagttcca aaggtgttgg tgaagattgc ctgggatggg cagcaagaga tgcatccgga 60 gttctatcac cttacaaatt cagtcgcagg actcttggga acgaagatgt tcatattaaa 120 attacgcact gtggtgtttg cttcgctgat gtagtttgga caaggaataa acatggtgac 180 tcaaagtatc ctgtcgtgcc tggtcatgag attgctggga ttgtgacaaa ggttggcgcc 240 aatgtccacc attttaaggt tggcgaccat gttggagtgg ggacttatat aaactcatgt 300 agggattgtg agtattgtaa tgatggacaa gaagttcatt gtaccaaggg atctgtatac 360 acttttaatg gtgttgattt tgatggtaca attacaaaag gaggatactc cagttacata 420 gtagtccatg agaggtactg cttcatgata ccaaaaagct atccattggc ttccgcagct 480 cctttgcttt gtgctggaat tactgtttat tcaccgatgg tccgccacaa gatgaatcaa 540 cctggtaaat ctctaggagt gattggtctt ggtggcctcg gtcatatggc ggtgaaattt 600 ggaaaggcat ttggtttgag tgtaacggtt tttagcacta gtatatccaa gaaagaggag 660 gcactgagcc tgcttggcgc agacaaattt gttgtttcat ctaatcaaga ggaaatgacg 720 gcgttggcta aatcgttgga ctttataatc gacacagcat ctggtgatca ctcgtttgat 780 ccttacatgt cactgctgaa gacatatggt gtttttgtcc tagttggttt ccctagtcaa 840 gtcaaattta tccctgcaag ccttaatata ggatcaaaga ctgttgccgg aagtgttaca 900 ggtggtacaa aagatataca ggagatgatt ggcttctgtg ctgcaaacga gattcaccca 960 aatatagagg tgattccaat cgagtatgcc aatgaagctc ttgagaggct cataaatagg 1020 gacgtcaagt accggtttgt aatagatgtt gagaattccc tgaaagaaaa atga 1074

Claims (25)

1. Molécula de dsRNA, caracterizada pelo fato de compreender i) uma primeira fita compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene semelhante a CAD, e ii) uma segunda fita compreendendo uma seqüência substancialmente complementar à primeira fita, sendo que a porção do gene semelhante a CAD é uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25; e) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; f) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25; g) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e h) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25.

2. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24 ou26.

3. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como20 mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16 , 18, 20, 22,24 ou 26.

4. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15 , 7, 19, 21, 23, ou 25.

5. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19,21,23, ou 25.

6. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26.

7. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25.

8. Coleção de moléculas de dsRNA, caracterizada pelo fato de compreender uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de dsRNA são derivadas de uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25.

9. Coleção de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender o polinucleotídeo compreende uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, .22, 24 ou 26.

10. Coleção de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26.

11. Coleção de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23, ou 25.

12. Coleção de dsRNA de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25.

13. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser capaz de expressar um dsRNA que é substancialmente idêntico a uma porção de um gene semelhante a CAD, sendo que a porção do gene semelhante a CAD é de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou . 25; e) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; f) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, e25; g) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e h) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25.

14. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o dsRNA compreende uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25.

15.Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de milho, trigo, cevada, sorgo, centeio, triticale, arroz, cana-de-açúcar, árvores cítricas, ananás, coqueiro, bananeira, cafeeiro, chá, tabaco, girassol, ervilha, alfafa, feijão-soja, cenoura, aipo, tomateiro, batateira, algodoeiro, tabaco, berinjela, pimenteira, colza, canola, beterraba, repolho, couve-flor, brócolis, alface, Lotus sp., Medicago truncatula, gramínea perene, raigrás, e Arabidopsis thaliana.

16. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é feijão-soja.

17. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou26.

18. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tem pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou26.

19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15,17, 19,21,23, ou 25.

20. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO:3, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20,22, 24, 26, 28, ou 30.

21. Método de preparar uma planta transgênica capaz de expressar um dsRNA que inibe a expressão de um gene alvo semelhante a CAD na planta, dito método caracterizado pelo fato de compreender as etapas de i) preparar um ácido nucleico tendo uma região que é substancialmente idêntica a uma porção do gene semelhante a CAD, sendo que o ácido nucleico é capaz de formar um transcrito de fita dupla uma vez expressado na planta; ii) transformar uma planta recipiente com dito ácido nucleico; iii) produzir uma ou mais progênies transgênicas de dita planta recipiente; e iv) selecionar a progênie para expressão de dito transcrito, sendo que a porção do gene alvo é de 19 a 500 nucleotídeos de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, ou 25; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1,2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou25; e) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; f) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento codificador de uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25; g) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24 ou 26; e h) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou 25.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dsRNA compreende uma multiplicidade de moléculas de RNA cada uma compreendendo uma região de fita dupla tendo um comprimento de cerca de 19 a 24 nucleotídeos, sendo que ditas moléculas de RNA são derivadas de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, ou 25; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polinucleotídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26; e d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com um polipeptídeo tendo uma seqüência como mostrada em SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, ou25.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de feijão-soja, batateira, tomateiro, amendoim, algodoeiro, mandioca, cafeeiro, coqueiro, ananás, árvores cítricas, bananeira, milho, colza, beterraba, girassol, sorgo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, feijão verde, feijão lima, ervilha, e tabaco.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a planta é feijão-soja.

25. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é expressado em raízes de planta ou em sítios de alimentação de nematódeo.