CN1473198A - 植物中富含丁香基的木质素的遗传工程 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的DNA序列，其编码一种先前未鉴别的木质素生物合成途径的酶，芥子醇脱氢酶(SAD)，该酶调节植物中丁香基木质素的生物合成。本发明还提供了将这一新SAD基因或其基本相似序列掺入植物基因组以在植物中进行富含丁香基的木质素的遗传工程的方法。

Description

植物中富含丁香基的木质素的遗传工程
相关申请交叉参考
本申请要求2000年4月5日提请的美国临时申请No.60/230,086的优先权，该申请在此并入参考。关于联邦政府赞助的研究或开发的声明：
本发明是在美国能源部能源生物科学计划和美国农业部研究资金第USDA99-35103-7896，USDA0 1-03749和DOE DE-FG02-01ER15179号给予的美国政府支持下完成，美国政府在本发明中拥有一定权利。发明背景
本发明涉及一种新的DNA序列，其编码一种先前未鉴别的木质素生物合成途径酶，芥子醇脱氢酶(SAD)，其调节植物中丁香基木质素的生物合成。本发明还提供了将此新SAD基因序列或与此SAD基因相似的序列导入植物基因组中以遗传工程化植物中富含丁香基的木质素的方法。
木质素，一种复杂的酚聚合物，是大多数木本植物包括被子植物和裸子植物的支持结构的主要部分，所述木本植物是造纸和纤维素产品的纤维首要来源。木质素通常构成木材干重的大约25％，使其成为地球上在纤维素之后第二丰富的有机化合物。木质素提供了木材的硬度，部分由于其对生物化学降解的抗性而使其非常适用。
尽管木质素对植物生长和结构具有重要性，但其在基于纤维素的木材/农作物收获后加工生产纤维、化学品和能源生产等方面仍存在问题，因为必须花费很大地将木质素从纤维素中除去或降解。木质素的一些结构成分如愈创木基组分，促进单体交联，提高木质素降解抗性(Sarkanen，1971；Chang和Sarkanen，1973；Chiang和Funaoka，1990)。在被子植物中，木质素由愈创木基和丁香基单木质醇(monolignols)的混合物组成，并可以在比裸子植物木质素相对低能量和化学成本下降解，所述裸子植物木质素几乎全部由愈创木基组分组成(Freudenberg，1965)。如果丁香基木质素可以经遗传掺入裸子植物愈创木基木质素或被子植物中，以提高丁香基木质素含量，估计与其野生型相比这种遗传工程化植物的加工每年的节约仅在美国就在60亿至100亿美元范围。因此，长期以来一直尝试了解丁香基单木质醇(monolignol)的生物合成，以遗传工程化植物使其含有更多的丁香基木质素，从而便于木材/农作物加工(Trotter，1990；Bugos等，1991；Boudet等，1995；Hu等，1999)。
尽管已知丁香基木质素得自愈创木基木质素，但只揭示了一部分丁香基单木质醇途径及其编码催化所述途径步骤的酶的基因。这部分单木质醇途径在松柏醛处与愈创木基途径分开，是由分别编码松柏醛5-羟化酶(CAld5H)(Osakabe等，1999)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性5-羟基松柏醛O-甲基转移酶(AldOMT)(LI等，2000)的基因介导，形成芥子醛(见图1)。然而，芥子醛必须酶促转变为芥子醇，即丁香基单木质醇，以在植物中生物合成丁香基木质素(见图1)。编码这种酶即芥子醇脱氢酶(SAD)的基因，从未被鉴别或克隆，其代表一种丢失基因，该基因在植物的丁香基木质素遗传工程化中是必不可少的。因此，需要鉴别和分离这种关键基因(SAD)，以在植物中遗传增加丁香基单木质醇生物合成及用于包含使用这种关键基因的遗传操纵方法。
发明概述
本发明提供了一种分离的完整DNA序列，其编码一种新酶，芥子醇脱氢酶SAD，其是植物中丁香基木质素生物合成所必须的并发挥主要作用。SAD催化芥子醛转化为芥子醇，即丁香基单木质醇。SAD的产生及因此丁香基单木质醇的产生，可以通过供应额外的SAD基因拷贝而提高，或者如果需要，通过将SAD基因或其一部分以反义方向插入植物基因组以使催化芥子醇的SAD数量减少而降低。
本发明一方面提供了含有提高丁香基木质素的产生及抑制愈创木基木质素的产生的基因的完整裸子植物。因此本发明提供了易于在制浆过程中脱木质化的裸子植物物种。
本发明另一方面提供了生产一种表达盒的方法，所述表达盒可插入裸子植物细胞中以在衍生自所述细胞的裸子植物中诱导丁香基木质素的形成。
本发明再一方面提供了修饰参与裸子植物物种中木质素生物合成的基因的方法，这样丁香基木质素的产生增加而愈创木基木质素的产生被抑制。
本发明有利地鉴别、分离和/或克隆了被子植物中与丁香基木质素的产生相关的那些基因。本发明还有益地提供了编码被子植物物种芥子醇脱氢酶(SAD)的多核苷酸的鉴别和分离，及这种多核苷酸在改变裸子植物中木质素生物合成中的应用。
附图简述
图1是产生松柏醇和芥子醇的植物单木质醇途径的示意图。
图2示出了SAD多核苷酸DNA序列(SEQ ID NO：1)及其相应的SAD氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，分别示于图2A和图2B。
图3是白杨SAD和植物CAD的系统发生分析。
图4示出白杨PtCAD和PtSAD的分子鉴定。
图5示出重组PtCAD和PtSAD反应的HPLC-UV/MS分析。
图6示出PtCAD和PtSAD的抑制动力学。
图7示出白杨茎中愈创木基和丁香基木质素的定位。
图8示出白杨茎中PtCAld5H和PtSAD蛋白的免疫学定位。
图9示出各种植物中CAD和SAD蛋白质的免疫反应性。
发明详述
本发明涉及编码芥子醇脱氢酶(SAD)的一种基因，所述酶是丁香基单木质醇生物合成中最后一个关键酶，本发明提供了编码所述新酶SAD的分离的完整DNA序列。本发明还提供了改变植物中木质素组成即生产富含丁香基的木质素的方法，所述方法通过用所述SAD基因转化植物进行，其中所述基因被表达并导致木质素聚合物的丁香基含量增加。
本发明对造纸和制浆业尤为有价值，因为含有较高丁香基单体含量的木质素更易于化学脱木质化。目前在脱木质化过程中需要大量的能源和时间。用活性SAD基因转化的木本植物在常规造纸原料脱木质化过程中具有明显优势。相似地，通过插入和表达异源SAD基因改变草类中木质素组成，是提高该草类可消化性的一种独特方法，而且对农场业和农业具有明显的经济利益。
本发明提供了用于转化植物组织以改变木质素单体组成的基因和DNA构建体。根据本发明适于转化的植物包括天然缺乏丁香基木质素的植物或以高愈创木基-丁香基比率累积木质素的那些植物。根据本发明也适于转化的植物包括其木质素可以使用降低转基因植物木质素的丁香基含量的反义转化构建体改变的那些植物，如果这种改变是所需的。特别地，适当植物包括但非限于裸子植物，被子植物，草类，豆类，饲料作物等。
本说明书中所用术语一般具有在现有技术中，本发明文中和在使用其的具体场合中的普通含义。在下文或本说明书的其他段落描述了某些术语，为本领域技术人员提供了阐述本发明组合物和方法及怎样使用它们的进一步指导。应意识到可以以一种以上的方式阐述相同的事情。因此，可以使用本文所讨论的一或多个术语的替代术语和同义词，本文讨论的术语均没有任何特殊意义。提供了一些术语的同义词。引用一或多个同义词不除外使用其它的同义词。在本说明书任何之处的举例应用，包括本文举例揭示的任何术语，只是例证性的，而无任何限制本发明或任何举例术语的范围和含义之意。同样，本发明不限于所述优选的实施方案。
如本文所用，“基因”是指表达一种特异蛋白质的一个核酸片段，包括在编码区域或编码序列之前的(5’非编码序列)和之后的(3’非编码序列)调节序列。“天然”基因是指在自然界中发现的具有其自身调节序列的基因。
“内源基因”是指通常在基因组中其天然位置中发现的天然基因。
“转基因”是指通过基因转移导入宿主生物中的基因。
“编码序列”或“编码区域”是指含有编码多肽信息的基因部分。编码序列的边界由在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括例如原核序列，来自真核mRNA的cDNA，基因组DNA，及甚至合成的DNA序列。
“启动子”或“启动子序列”是指在给定基因中的DNA序列，该序列通过提供RNA聚合酶的识别位点和正确转录所需的其它因子控制编码序列的表达。大多数基因具有启动子DNA序列，其调节基因表达。启动子区域在原核和真核细胞中均典型见于编码序列上游的5’侧翼DNA序列。启动子序列提供了对下游基因序列转录的调节，其典型地包括大约50一2000个核苷酸碱基对。启动子序列还含有调节序列如可影响基因表达水平的增强子序列。一些分离的启动子序列可以提供异源DNA的基因表达，所述异源DNA即不同于天然同源DNA的DNA。启动子序列还已知是强或弱或可诱导的。强启动子提供了高水平基因表达，而弱启动子提供了非常低水平基因表达。可诱导启动子是这样的启动子，其应答外源添加的制剂或环境或发育刺激而引发或关闭基因表达。对异源DNA而言是强启动子的一种分离的启动子序列是有益的，因为其提供了足够水平的基因表达以易于检测和选择转化的细胞，并当需要时提供高水平基因表达。启动子还可以含有参与蛋白质因子结合的DNA序列，其控制应答生理或发育条件的转录起始的效力。
“调节序列”是指位于编码序列上游(5’)，编码序列内和/或编码序列下游(3’)的核苷酸序列，其控制与细胞的蛋白质生物合成装置相关的编码序列表达。调节序列包括启动子，翻译前导序列，转录终止序列和聚腺苷酸化序列。
“编码”是指这样的过程，利用这一过程基因通过转录和翻译机制为细胞提供信息，从中一系列氨基酸可以装配成特异的氨基酸序列，以产生一种活性酶。应了解编码特异氨基酸序列的过程包括DNA序列，其可包含不引起编码的氨基酸变化的碱基改变，或者包含可以改变一或多个氨基酸，但不影响由此DNA序列编码的蛋白质的性质的碱基改变。因此应了解本发明涵盖了比具体举例序列更多的序列。本发明还涵盖了对所述序列的修饰，如序列中的缺失，插入或取代产生沉默改变，基本不影响所得蛋白质分子的功能性质。例如，本发明包括基因序列中的变化，其反映遗传密码的简并，或引起化学等价氨基酸在给定位点产生。因此，丙氨酸，一种疏水性氨基酸，其密码子可以由编码疏水性较弱的另一个残基如甘氨酸，或疏水性更强的残基如缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸的密码子取代。相似地，导致一个负电荷残基由另一个残基的取代，如天冬氨酸由谷氨酸取代，或者一个正电荷残基由另一个残基取代，如赖氨酸由精氨酸取代，也可以期望产生一种生物学等价产物。引起蛋白质分子N末端和C末端部分变化的核苷酸变化，预期也不改变蛋白质活性。在一些情况中，事实上需要产生序列的突变体以研究蛋白质生物学活性保留作用。这些提议的修饰均是本领域技术人员熟知的，在编码产物中确定生物学活性的保留也是本领域技术人员熟知的。另外，本领域技术人员意识到本发明涵盖的序列也通过其在严格条件下与本文举例的序列的杂交能力而阐明。
“表达”是指基因编码的蛋白质产物的产生。“过表达”是指转基因生物中基因产物的产生水平超过正常或未转化生物的水平。＂
酶的“功能部分”或“功能片段”是指含有结合一或多个反应物的活性位点的或能改善或调节反应速度的部分，片段或等价节段。所述活性位点可以由存在于一或多个多肽链上的各独立部分组成，并一般呈现高底物特异性。
“由一种核苷酸序列编码的酶”包括由包括部分分离的DNA序列的核苷酸序列编码的酶。
“转化”是指将一个外源基因转移至宿主生物基因组中，而且其通常稳定遗传。
“相同性百分比”是指通过一种程序鉴别的一个多核苷酸/多肽的核苷酸/氨基酸与另一个多核苷酸/多肽序列的核苷酸/氨基酸的相同性百分率，所述程序例如是GAP程序，得自Wisconsin遗传学计算机研究组(GCG)程序包(版本9.0)(Madison，WI)。GAP使用Needleman和Wunsch算式(分子生物学杂志48：443-453，1970)，进行两个完整序列的对比，使匹配数目最大化，使缺口数目最小化。当需要运行上述算式的参数是非特异性时，使用程序提供的默认值。
“基本同源”或“基本相似”是指70％或更高的相似性或70％的同源性，其中两个多肽序列之间的“相似性％”或“同源性％”是两个序列呈现的相似位置数目的函数，其基于所用比数矩阵除以对比的位置数目再乘以100。当对比两个序列(如果需要，导入缺口)以确定最大同源性时，进行这种对比。由国家生物技术信息中心提供的PowerBlast程序，可以用于计算最佳的有缺口的序列对比。也可以使用得自Wisconsin遗传学计算机研究组程序包的GAP程序(版本9.0)(Madison，WI)。
“木质素单体组成”是指在木质化植物组织中发现的愈创木基单体和丁香基单体的相对比率。
“植物”包括整个植物或植物的一部分，包括植物器官(例如根部，茎，叶等)。
“被子植物”是指产生的种子包入子房中的植物。被子植物的一个特异性实例是Liquidambar styraciflua(L.)[sweetgum]。
“裸子植物”是指产生裸露种子的植物，即种子未包入子房中。裸子植物的一个特异性实例是Pinus taeda(L.)[火炬松]。
如本文所用，针对核酸分子或多肽的术语“分离的和/或纯化的”是指核酸或多肽分子从其天然细胞环境中的体外分离，及与细胞的其它成分如核酸或多肽分离，以便能测序，复制和/或表达。
“载体”是一种重组核酸构建体，如可以附着本发明多核苷酸的质粒，噬菌体基因组，病毒基因组，粘粒，或人工染色体。在一个具体实施方案中，所述载体可以使附着的节段复制，例如在克隆载体的情况中。
“芥子醇脱氢酶”或称“SAD”是指植物苯丙素苷(phenylpropanoid)生物合成途径中的酶。其催化芥子醛转化为芥子醇并使丁香基木质素产生。在本发明一个实施方案中，所述SADDNA序列(图2A)从颤杨Populus tremuloides中鉴别。应了解这个序列可用作探针，通过本领域熟知的技术(EST，PCR，RT-PCR，抗SAD抗体，抗SAD多肽抗体等)从任何植物物种中克隆其等同物。SAD DNA序列在本文中定义为根据本发明所述酶分析方法，编码能特异性催化芥子醛转化为芥子醇的酶的任何DNA序列。苯丙素苷生物合成途径
参考图1，其示出从4-香豆酸(1)至愈创木基(松柏醇(6))和丁香基(芥子醇(9))单木质醇，以形成愈创木基-丁香基木质素的生物合成途径中不同步骤，及用于催化每个步骤的酶。每个反应步骤的酶是：4-香豆酸3-羟化酶(C3H)，其将4-香豆酸(1)转变为咖啡酸(2)；4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)，其将咖啡酸(2)转变为咖啡酰CoA(3)，咖啡酰CoA接着由咖啡酰-CoA O-甲基转移酶(CCoAOMT)转变为阿魏酰CoA(4)；肉桂酰-CoA还原酶(CCR)，其将阿魏酰CoA(4)转变为松柏醛(5)；松柏醇脱氢酶(CAD)将松柏醛(5)转变为愈创木基单木质醇松柏醇(6)；在松柏醛(5)处，所述途径分为两部分，其中松柏醛(5)也可以通过松柏醛5-羟化酶(CAld5H)转变为5-羟基松柏醛(7)；5-羟基松柏醛O-甲基转移酶(AldOMT)将5-羟基松柏醛(7)转变为芥子醛(8)，芥子醛(8)随后由芥子醇脱氢酶(SAD)转变为丁香基单木质醇，芥子醇(9)。
先前已经报道最后芥子醇形成的步骤由CAD催化。本发明首次揭示从芥子醛中形成芥子醇的一种分离的酶。CAD和SAD一起调节愈创木基-丁香基木质素的数量和成分。本发明提供了一种分离的SAD蛋白和SAD cDNA克隆，其现在可以用于改变木质化。SEQ IDNO：1提供了来自Populus tremuloides的SAD cDNA序列，而SEQ IDNO：2提供了推导的SAD多肽的序列。
下表1中提供了所有报道的类CAD酶的氨基酸序列与本发明新SAD酶的对比。CAD已经在一些不同物种中得到鉴定。表1中所列数值表示氨基酸相同性百分率。表1示出SAD与所有其它已知CAD只呈现大约50％氨基酸序列相同性，表明SAD是具有与其它CAD不同生物化学功能的一种不同的新揭示的酶。因此，所述SAD蛋白质序列与所有目前已知的单木质醇CAD的序列可以从系统发育加以区别。
表1：从数据库中获得的所有类CAD蛋白质序列对比，数值代表氨基酸序列相同性百分率
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16
  1
  2   79
  3   79   97
  4   80   85   84
  5   80   82   82   84
  6   79   80   80   81   94
  7   79   81   81   82   80   78
  8   79   81   80   81   80   78   80
  9   73   78   77   79   76   74   76   77
  10   73   78   78   79   77   74   76   76   99
  11   73   77   76   78   74   73   75   74   95   96
  12   67   70   71   69   70   70   69   68   67   68   68
  13   68   69   70   69   69   69   69   68   67   67   67   99
  14   67   69   70   68   69   69   68   68   67   67   67   99   95
  15   68   69   69   70   70   69   68   68   69   69   67   95   95   94
  16   51   53   53   54   53   52   52   53   49   50   48   53   53   54   54
1：M.sativa，AF083332；2：PtCAD，AF217957；3：P.deltoides，z19568；4：A.corada，D13991；5：N.tabacum，x62343；6：N.tabacum，x62344；7：E.globulus，AF038561；8：E.gunnii，x65631；9：Z.mays，aj005702；10：Z.mays，y13733；11：S.offininarum，AJ231135；12：P.radiada，u62394；13：P.taeda，z37992；14：P.taeda，z37991；15：P.abies，x27675；16：PtXAD(重新命名为PtSAD)。DNA构建体
根据本发明提供了一种DNA构建体，其是具有启动子序列，编码区和终止子序列的植物DNA。所述编码区编码木质素生物合成必需的SAD酶。所述编码区适当的最小大小为50个碱基。基因启动子位于转基因的5’末端(所述转基因可以是单独的SAD或SAD与来自植物单木质醇的另一种酶组合，如下文所述)，以控制转基因表达，基因终止子序列位于转基因的3’末端以发出转基因转录结束的信号。
根据本发明的DNA构建体可以通过转化掺入植物基因组中，以改变木质素生物合成，例如提供富集丁香基的木质素。所述DNA构建体可以包括本文提供的克隆，称为PtXAD(后来重新命名为PtSAD)，及其变体如通过遗传密码简并形成的变体，及其功能等价物。
本发明的DNA构建体可以插入植物中，以调节SAD酶的产生。根据所述构建体的性质，在植物生命的全部阶段或特殊时期，所述蛋白质的产生可以提高或降低。例如，DNA编码序列，启动子和终止序列的方向可以用于抑制木质素形成或增强木质素形成。为了木质素生物合成的负调节，所述DNA是反义方向。为了增强木质素生物合成，所述DNA是有义方向，由此在植物基因组中提供一或多个额外的DNA拷贝。在这种情况中，所述DNA合适地是全长cDNA拷贝。也可以将所述基因表达定向于植物的特殊细胞类型，如上皮，木质部，根部等。本发明的构建体可以通过本领域已知的各种方式用于转化单子叶和双子叶植物细胞。在许多情况中，可以培养这种植物细胞再生为整个植物，其随后繁殖提供经遗传修饰的植物的连续子代。根据本发明适当遗传修饰的植物例如包括但非限于树如白杨，杨树，松树和桉树。启动子和终止序列
本领域熟知各种基因启动子序列，并可用于本发明的DNA构建体中。本发明构建体中启动子适当提供连接的DNA节段表达。所述启动子也可以是可诱导的，以便基因表达可以用外源添加的因子启动或关闭。也可以优选组合所需的DNA节段和启动子，以在植物中提供组织特异性表达或发育调节的基因表达。
所述启动子可选自已知在植物中起作用的启动子，例如CaMV35S，GPAL2，GPAL3和控制相应酶表达的外源植物启动子。组成型启动子如CaMV35S启动子(Odell等，1985)或CaMV 19S(Lawton等，1987)可以用于驱动转基因在靶植物所有组织类型中表达。其它启动子是nos(Ebert等，1987)，Adh(Walker等，1987)，蔗糖合酶(Yang等，1990)，α-微管蛋白，遍在蛋白，肌动蛋白(Wang等，1992)，cab(Sullivan等，1989)，PEPCase(Hudspeth等，1989)或与R基因复合物结合的那些启动子(Chandler等，1989)。另一方面，组织特异性启动子的应用可以更加选择性控制功能。组织特异性启动子的应用具有这样的优点，即所需的蛋白质只在需要其功能的组织中产生。适当地，组织特异性启动子如限制转基因在发生木质化的发育木质部中表达的那些启动子，可以用于本发明的DNA构建体中。
通过如Sambrook等，第二版(1982)所述标准方法，可以将DNA节段与所述启动子组合。简而言之，可以如Jefferson(1987)所述构建含有启动子如CaMV 35S启动子的质粒，或者得自Clontech实验室，Palo Alto，加利福尼亚(例如pBI121或pBI221)。典型地，构建这些质粒以在所述启动子下游提供特异于不同限制酶的多克隆位点。DNA节段可以使用限制酶亚克隆在启动子下游，以保证所述DNA以针对相关启动子的正确方向插入，以便所述DNA可以表达。
基因终止序列位于待转录的DNA序列的3’。本领域已知的各种基因终止序列可以用于本发明的构建体中。这些包括胭脂氨酸合酶(NOS)基因终止序列(见例如2000年10月6日提请的PCT申请PCT/US/0027704所述，题目为“在植物中导入多个基因的方法”，在此并入参考)。标记基因
在本发明构建体中还可掺入标记基因，以助于选择具有转基因阳性整合的植物组织。“标记基因”是为表达所述标记基因的细胞赋予一种独特表型，并因此使这种转化的细胞可与不具有标记的细胞相区分的基因。本领域已知许多适当标记基因的实例，并可以用于本发明实践中，如新霉素磷酸转移酶II(NPT II)基因，其赋予卡那霉素或潮霉素抗性，所述抗生素杀死不含有NPT II基因的未转化的植物组织(Bevan等，1983)。用于本发明方法中的多种其它标记基因实例示于引入本文作入参考的2000年10月6日提请的PCT/US/0027704，题目为“在植物中导入多个基因的方法”中。转化
用本发明的DNA构建体转化来自植物例如树木中的组织或细胞，并随后产生转基因植物，可以通过本领域已知的各种方法实现。例如，将DNA构建体移至宿主植物组织中的农杆菌和微粒介导的方法特别适用于树木物种(Tsai等，1994；Ellis等，1993；及2000年10月6日提请的发明名称为“在植物中导入多个基因的方法”的PCT申请PCT/US00/27704所述)。在转化后，使用本领域熟知的方法(见于Tsai等，1994；Ellis等，1993；及2000年10月6日提请的PCT申请PCT/US00/27704所述)可以选择对例如抗生素如卡那霉素有抗性的转基因植物组织，并培养再生为整个植物。
转化和再生方法易于适应许多植物物种。针对植物物种已经公布了许多转化和再生方法(见于PCT申请PCT/US00/27704，如前)。DNA克隆
编码来自Populus tremuloides的松柏醇脱氢酶(CAD，图1)的愈创木基途径基因(GenBank#AF217957)首先被克隆。这个cDNA称为PtCAD(GenBank#AF217957)。鉴定大肠杆菌表达的重组PtCAD蛋白对松柏醛和芥子醛的催化活性。因为单木质醇生物合成途径中间体一起存在于木质化组织中(Osakabe等，1999；Li等，2000)，因此用松柏醛和芥子醛的混合物分析PtCAD酶活性。如图5(a)和(c)所示，所述反应混合物在酶反应后通过HPLC分离。通过基于质谱分析法的化学结构分析确证从松柏醛中只形成松柏醇，而且PtCAD与芥子醛不反应。因此，PtCAD具有特异性催化松柏醛生物合成愈创木基单木质醇松柏醇反应的功能(图1)。CAD底物对松柏醛的特异性也证实在丁香基单木质醇芥子醇的生物合成中，需要另一种酶—本发明的SAD，如图1所示。
设计一不同的克隆策略以基于与CAD的可辨别序列分离候选的SAD基因，如上所述。使用PtCAD cDNA作为探针对Populustremuloides木质部cDNA文库的1.8×104pfu的低严格性和高严格性的示差筛选(见实施例2所述)，基于序列分析分离出两组阳性克隆，即I组和II组序列。I组12个克隆的序列与PtCAD相同，II组cDNA的序列彼此相同但不同于PtCAD。II组中8个克隆中有2个是全长cDNA，并称为PtSAD。PtSAD cDNA(SEQ ID NO：1)长度为1446bp，编码362个氨基酸的一个ORF(SEQ ID NO：2)，计算MW为38991，pI为6.69。在PtSAD cDNA中发现了在常见醇脱氢酶(ADH)中鉴别的辅因子和锌结合序列(Jomvall等，1987；O’Malley等，1992；Galliano等，1993)。Zn1结合基序和结构性Zn2共有序列分别位于第71-85位氨基酸残基和第91-117位氨基酸残基。一个NADP结合位点经鉴别位于第191-196位残基。
另外，PtSAD与所有其它已知全长单木质醇CAD只呈现大约50％氨基酸序列相同性(见上表1)。然而，其与那些据信与防御病原体功能相关的ADH示出无意义的低氨基酸序列相同性(10-40％)(Jornvall等，1987；Brill等，1999)。这些序列特性证实PtSAD属于一类新ADH，与通常已知的单木质醇CAD可区分。这一点由通过对PtSAD及已知全长单木质醇CAD蛋白质序列进行系统发育分析的结果充分支持，所述分析示出这些单木质醇CAD(图3)形成与PtSAD明显分离的一簇。鉴于这些基因与愈创木基特异性PtCAD和来自火炬松和云杉CAD的氨基酸序列的广泛相同性(80-98％)，这一簇单木质醇CAD是愈创木基特异性的，所述单拷贝基因参与裸子植物中愈创木基单木质醇的生物合成(O’Malley等，1992；Galliano等，1993；MacKay等，1995)。因此，系统发育分析可以反映出愈创木基CAD系统发育组在远古即分支成PtSAD所属的一更加丁香基特异性的系统发育组。用PtCAD或PtSAD cDNA探针重复筛选Populus tremuloides木质部cDNA文库的独立系列pfu，总是可以分离出与PtCAD或PtSAD相同的克隆，表明木质化木质部中两种主要的单木质醇ADH，CAD和SAD。
为证实PtSAD基因的生物化学功能，将PtSAD cDNA在大肠杆菌中表达，以产生其重组蛋白。当将PtSAD重组蛋白与松柏醛单独温育时，对酶反应产物的HPLC-MS分析表明PtSAD对松柏醛具有786nmol/分钟/mg蛋白质的比活性。然而，PtSAD对芥子醛具有6964nmol/分钟/mg蛋白质的比活性，表明PtSAD对芥子醛的催化活性是对松柏醛的活性的9倍。因此，PtSAD特异于芥子醛而且SAD芥子醇脱氢酶催化芥子醛转化为芥子醇。
PtSAD的芥子醛特异性证据来自PtSAD重组蛋白与松柏醛和芥子醛混合物的反应。PtSAD与松柏醛和芥子醛混合物反应的HPLC-MS分析(图5)结论性地表明芥子醇是芥子醛的唯一产物，而且在一种体内情况中PtSAD与松柏醛不反应。
因此，总而言之，CAD对愈创木基单木质醇—松柏醇—的形成是愈创木基特异性的，SAD只催化丁香基单木质醇—芥子醇—的生物合成。另外，这些结果提示CAD和SAD蛋白在协调植物中愈创木基和丁香基木质素的细胞特异性生物合成中的各自作用。
现在首次克隆了编码这种SAD酶的cDNA。SAD酶的存在是植物中丁香基木质素生物合成所必需的，而且在转基因植物中掺入SAD基因是在植物中成功工程化丁香基木质素的可行机制。
本发明通过以下非限制性实施例进行进一步阐述。实施例1：从白杨Populus tremuloides中分离SAD cDNA
根据厂商指导(GIBCO BRL)在λgt22A载体中构建白杨发育的木质部cDNA文库。白杨CAD cDNA(GenBank#AF217957)用作探针以在高和低严格杂交条件下示差筛选所述cDNA文库。将来自所述cDNA文库的大约6000pfu印在4个单独的尼龙膜上。将两个这样印迹的膜与32P标记的CAD cDNA探针在低严格杂交条件(50℃)下杂交，其它两个在高严格条件(65℃)下杂交。以此方式共筛查18000个pfu。在用高或低严格条件下探查的膜上检测到高密度杂交信号。然而，低密度信号只在低严格杂交条件下探查的膜上检测到。高严格膜上高密度信号与低严格膜上高密度信号完美排列，可以示差分离具有低密度信号的阳性克隆。高密度克隆证实为白杨CAD cDNA。对具有低密度信号的阳性克隆进行进一步筛查直至分离单个克隆。然后将纯化的λgt22A克隆通过NotI和EcoRI克隆位点亚克隆入pBluescriptS/K质粒载体中。测序结果表明所述分离的cDNA克隆长度为1425bp(SEQ ID NO：1)，编码一个362个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)，其示出与白杨CAD蛋白具有53％序列相同性。这个cDNA克隆最初命名为PtXAD，随后在证实其生物化学功能之后重新命名为SAD。
只在低严格杂交条件下与所述探针杂交的克隆的序列彼此相同，但与PtCAD不同。发现这些低严格度与探针杂交的克隆中有两个是全长cDNA；将它们命名为PtSAD并以两个方向测序(ABI31O；Perkin-Elmer)(GenBank登记号AF273256)。实施例2：从白杨中克隆新的醇脱氢酶基因PtSAD
为测试被子植物中不同的CAD和SAD基因的假说，从白杨发育木质部克隆CAD cDNA，PtCAD，并用于在相同物种中筛选相关序列。低和高严格性示差筛查白杨木质部cDNA文库的2.4×104个噬斑形成单位(pfu)(Wu等，2000)，可分离两组阳性克隆。I组含有12个序列与PtCAD相同的cDNA。II组由8个cDNA组成，其序列彼此相同但不同于PtCAD。II组中8个克隆中有两个是全长cDNA，将其暂时命名为PtSAD。
PtSAD的开放读框长度为1086bp，编码pI为6.69的一个39kD蛋白质。PtSAD推导的氨基酸序列与PtCAD呈53％相同性，与其它被子植物单木质醇CAD序列呈约50％的相同性，但其与病原体防御相关的醇脱氢酶(ADH)的序列不明显相同(10-40％)(Brill等，1999)。另一方面，PtCAD示出与来自以下植物的CAD具有广泛的氨基酸序列相同性：Populus trichocarpa X Populus deltaides(97％)(PtCADA；Van Doorsselaere等，1995)，Eucalyptus gunnii(81％)  (pEuCAD2；Grima-Pettenati等，1993)，烟草(82％)(pTCAD14；Knight等，1992)，苜蓿(79％)(MsaCad2；Brill等，1999)，及其它报道的被子植物(～80％)(Brill等，1999)。因此，PtSAD属于一类新的ADH。
PtSAD中存在在ADH中保守的辅助子和锌结合序列(Jomvall等，1987)(图1)。Zn1结合基序和结构性Zn2共有区域(Jomvall等，1987；MacKay等，1995)分别位于第71-85和第91-117位氨基酸残基。NADP结合位点(Jomvall等，1987)经鉴别在第191-196位残基。用PtCAD或PtSAD cDNA探针重复筛查白杨木质部cDNA文库总可以分离与PtCAD或PtSAD相同的克隆，表明它们是木质化木质部中两种主要的单木质醇相关ADH。
对PtSAD及获得的全长单木质醇CAD蛋白质序列的系统发育分析示出：裸子植物和被子植物CAD形成一不包括PtSAD的簇(图2)。这个簇中的被子植物单木质醇CAD与裸子植物CAD呈现～70％氨基酸序列相同性，但与PtSAD呈现～50％氨基酸序列相同性，提示所有这些推定的被子植物单木质醇CAD均可能是愈创木基特异性的。这些结果还可能反映愈创木基CAD系统发育组分支成PtSAD所属的更加丁香基特异性组。实施例3：DNA和RNA凝胶印迹分析
如述从各种白杨组织中分离白杨基因组DNA和总RNA(Li等，1997；Hu等，1998)。为确定在白杨中是否有其它的PtCAD和PtSAD相关序列，用白杨基因组DNA进行凝胶印迹分析，所述DNA用各种限制酶消化并与PtCAD(图4A)或PtSAD(图4B)全长cDNA探针杂交。在高严格条件下进行DNA和RNA凝胶印迹杂交(Hu等，1998)。探针是用DECA引发标记系统(Ambion，Austin，TX)经α-32p-dATP(Amersham)标记的PtCAD或PtSAD cDNA。
在每个泳道中均有一条强单条带，但在每个泳道中也检测到一弱的单条带，也许是不太相关序列的迹象。综合cDNA筛查结果，我们解释这些数据表明PtCAD和PtSAD可能是白杨中一小基因家族的主要成员。
DNA印迹分析还清楚表明PtCAD和PtSAD彼此不交叉杂交。因此，使用相同杂交条件及PtCAD和PtSAD全长cDNA探针进行RNA凝胶印迹分析，以研究白杨中PtCAD和PtSAD的组织特异性表达。在含有大量木质化木质部的组织中发现最强的PtCAD表达，但其表达在富集韧皮部的组织中较低(1-3节间；图4C)。在经历迅速韧皮部(1-3节间；图4D)和木质部(4-9节间；图4D)发育的组织中检测到PtSAD强表达。在除去维管中脉的叶中未观测到PtCAD和PtSAD表达。
还进行了蛋白质凝胶印迹分析以核实PtCAD和PtSAD的组织特异性表达。获得针对在大肠杆菌中产生的经亲和纯化的PtCAD和PtSAD重组蛋白的多克隆抗血清，并使用蛋白质凝胶印迹核实抗PtCAD和PtSAD重组蛋白的PtCAD和PtSAD抗体的特异性。针对所测试的各种重组蛋白的量(直至75ng)，PtCAD抗体与PtSAD蛋白不交叉反应(图4F)。PtCAD蛋白呈现期望的～39kD分子量，而且在木质部的蛋白质提取物中比韧皮部组织中更丰富。相反，在韧皮部蛋白质提取物中检测到使用PtSAD抗体的最强信号(图4F)。RNA和蛋白质凝胶印迹分析一致表明PtCAD和PtSAD均与木质化相关。富含丁香基木质素的韧皮部中强PtSAD表达(Grand等，1982)提示PtSAD在丁香基单木质醇生物合成中的特殊作用。因此，本文鉴定的是PtCAD和PtSAD基因的生物化学功能。实施例4：酶活性测定
为测定具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的白杨SAD的酶活性，进行以下实验：
(i)PtCAD和PtSAD重组蛋白的表达和纯化及植物蛋白提取物的制备
PtCAD和PtSAD的编码序列通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用指定引物在其起始和终止密码子上游导入NdeI和Not1位点，所用引物是有义引物SEQ ID NO：3(5’GG CATATGTCCAAGTCACCAGAA3’)和反义引物SEQ ID NO：4(5’TGCGGCCGCGGGCTTCGTAGCTGCCAA3’)。将所述PCR产物克隆入pET23b+载体(Novagen，Madison，WI)的NdeI和Not1位点，以在克隆的序列羧基末端融合一His标记。在证实序列后，将工程化的pET23b+构建体移至大肠杆菌宿主菌株BL21(DE3)(Novagen)中。如述进行重组PtCAD和PtSAD的诱导和纯化(Li等，2000)。在生长季节从以下植物中收集分化的茎木质部，并用于如述分离蛋白质粗提物(Li等，2000)：白杨，霍布叶铁木(Ostrya virginiana)，红桦(Betula alleghaniensis)，糖槭(Acer saccharum)，红花槭(Acer rubrum)，胶皮糖香树(Liquidambar styracifla)，和火炬松(Pinus taeda)。
(ii)抗PtCAD和抗PtSAD抗体的制备及蛋白质凝胶印迹分析
将经亲和纯化的PtCAD和PtSAD重组蛋白质用于免疫接种兔(Alpha Diagnostic，San Antonio，TX)。1∶3000稀释的抗体用于木质部蛋白质粗提物的蛋白质凝胶印迹分析中(Osakabe等，1999)。通过Bio-Rad蛋白质分析系统测定蛋白质浓度。
(iii)SAD酶活性分析
在不同pH的总体积为300μl的溶液中进行SAD酶反应，所述溶液含有100mM磷酸钠缓冲液，500μM底物丁香醛(或松柏醛)，1ug重组SAD蛋白，2.5mMβ-巯基乙醇和500μM NADPH，所述pH值为5.4，6.0，6.4，7.0，7.4，8.0或8.4。在30℃反应10分钟后，终止反应并用0.5ml乙酸乙酯提取。重复4次提取并将合并的乙酸乙酯蒸发及溶解于HPLC流动相中，以对反应产物进行LC-MS鉴别和定量(Osakabe等，1999；Li等，2000)。发现SAD反应最佳pH值为7.0。因此，在上述条件下在最佳pH7.0用混合底物，芥子醛和松柏醛进行SAD反应。
(iv)酶功能及反应动力学的HPLC-UV/MS分析
基本酶反应混合物含有50mM磷酸钠缓冲液，5mMβ-巯基乙醇，500μM NADPH或NADP，纯化的重组蛋白(煮沸的蛋白质用作对照)，和酚底物，总体积为500μl。针对底物特异性测试，使用500μM醛底物和1ug纯化的重组PtCAD或PtSAD蛋白(～25pmol)。为确定酶的最佳pH值，将所述底物和重组PtCAD或PtSAD蛋白浓缩物用于pH5-8.5的磷酸钠缓冲液中。所有反应均在30℃进行10分钟。
就正常和抑制动力学分析而言，针对PtCAD的反应时间为4分钟及pH为8.0(1.2μg纯化重组蛋白)，针对PtSAD的反应时间为4分钟、pH为7.0(0.1ug)。针对动力学，使用不同浓度的(0.5-200μM)的p-香豆醛，咖啡醛，松柏醛，5-羟基松柏醛或芥子醛，以测定Km，Vmax及酶转换数Kcat。针对抑制动力学，PtCAD介导的芥子醛(1-200μM)还原在存在1-5μM松柏醛的情况下分析，PtSAD催化的松柏醛(1-200μM)还原在存在1-5μM芥子醛的情况下分析。所有反应均通过加入10μL的6N HCl(将pH调节为2)和500ng内标o-香豆酸终止，并通过HPLC-UV/MS分析。
将100μL反应混合物等份直接注射于具有自动样品注射的Supelcosil LC-ABZ柱(15cm×4.6mm×5μm；Supelco，Bellefonte，PA)上，并用Hewlett-Packard(HP)1100液相层析系统在40℃，以流速0.25mL/分钟等度分离。梯度程序是20％乙腈于10mM甲酸中，pH2.5，12分钟，20％一100％乙腈，12-16分钟，及在100％乙腈保持5-10分钟；用HP1100二级管阵列检测仪及具有气压离电离-电喷射源的HP1100液相层析MS检测仪系统以阴性离子模式进行检测。通过将在70V下MS扫描中所述产物的电离片段化模式与真标准相对比鉴别和证实反应产物。如述测定上述产物的量和Km，Vmax，Kcat及表观抑制常数(Ki)值(平均值±SE)(Osakabe等，1999；Li等，2000)。使用各种底物测试的CAD酶(即表2)和SAD酶(即表3)的抑制动力学结果如下所示。
表2
                  重组PtCAD蛋白的动力学性质底物           Km(μM)     Vmax(nmol/分钟/ug)    Kcat a(/分)   Vmax/Km(％)p-香豆醛       6.2±1.1     0.17±0.04             6.8±0.2        30.1咖啡醛         37.0±5.4    0.15±0.03             6.0±0.2        4.4松柏醛         2.3±0.8     0.21±0.03             8.4±0.3        1005-羟基松柏醛   17.5±2.5    0.17±0.04             6.8±0.4        10.6芥子醛         9.1±1.2     0.10±0.01             4.0±                        12.0akcat，酶转换数数值是三个独立实验结果的平均值±SE
                          表3
                重组PtSAD蛋白的动力学性质底物          Km(μM)     Vmax(nmol/分钟/μg)     Kcat a(/分)    Vmax/Km(％)p-香豆醛      15.6±1.4    2.9±0.3                 116±11        27.4咖啡醛        140.0±9.1   2.0±0.1                 80±4          2.2松柏醛        12.7±1.5    2.3±0.2                 92±6          26.65-羟基松柏醛  36.1±2.3    3.8±0.4                 152±16        15.5芥子醛        7.4±1.1     5.0±0.3                 200±13        100aKcat，酶转换数数值是三个独立实验结果的平均值±SE实施例5：白杨茎单木质醇成分的化学合成和硫酸解分析
除了以下原料所有醛及其醇衍生物均得自Sigma/Aldrich：p-香豆醛，p-香豆醇，咖啡醛，咖啡醇，5-羟基松柏醛及5-羟基松柏醇是如述从其相应苯醛衍生物中化学制备(Osakabe等，1999；Li等2000)。这些化合物的结构性质通过1H-NMR证实。p-香豆醛：δ(丙酮-d6；使用标准碳数目)，6.48(1H，dd，J1＝15.9，J2＝7.8，C8H)，6.80(2H，m，Ar-H)，7.46(1H，d，J＝15.8，C7H)，7.48(2H，m，Ar-H)，9.50(1H，d，C9H)；ρ-香豆醇：δ(丙酮-d6)，4.1 8(2H，dd，J1＝49，J2＝1，C9H)，6.19(1H，dt，J1＝15.9，J2＝5.5，C8H)，6.49(1H，d，J＝15.9，C7H)，6.78(2H，m，Ar-H)，7.26(2M，m，Ar-H)；咖啡醛：δ(丙酮-d6)，6.53(1H，dd，J1＝15.7，J2＝7.6，C8H)，6.90(1H，dt，J＝7.9，C5H)，7.10(1H，dd，J1＝7.9，J2＝2.1，C6H)，7.20(1H，d，J＝2.1，C2H)，7.51(1H，d，J＝15.7，C7H)，9.61(1H，d，J＝7.6，C9H)；咖啡醇：δ(丙酮-d6)，4.17(2H，d，J5.5，C9H)，6.14(1H，dt，J1＝15.9，J2＝5.5，C8H)，6.43(1H，dt，J1＝15.9，J2＝1.5，C7H)，6.75(2H，d，J＝1.5，C5H，C6H)，6.92(1H，d，J＝1.5，C2H)；5-羟基松柏醛：δ(丙酮-d6)，3.88(3H，s，OCH3)，6.60(1H，dd，J1＝15.6，J2＝7.8，C8H)，6.88(1H，d，J＝1.7，C6H)，6.95(1H，d，J＝1.7，C2H)，7.50(1H，d，J＝15.6，C7H)，9.61(1H，d，J＝7.8，C9H)；5-羟基松柏醇：δ(丙酮-d6)，3.87(3H，s，OCH3)，4.28(2H，t，J＝5.5，C9H)，6.20(1H，dt，J1＝15.9，J2＝5.5，C8H)，6.47(1H，d，J＝15.9，C7H)，6.51(1H，d，J＝1.8，C6H)，6.64(1H，d，J＝1.8，C2H)。为进行单木质醇组成分析，用苯/醇提取白杨茎节间并进行基于气相层析-质谱(MS)的硫酸解分析(Rolando等人，1992；Tsai等人，1998)。实施例6：木质素的组织化学分析，免疫定位及显微镜检
为进行木质素的组织化学定位，将从4月龄温室生长的白杨植物(克隆271)茎节间的新鲜手工切片(厚度为～20μm)，立即在新制备的饱和氯水中在4℃温育10分钟。在用水冲洗3次后，将切片在室温在4％亚硫酸钠中温育5分钟，在50％甘油中封固，并用Nikon(日本东京)Eclipse 400荧光显微镜照相。将得自用于组织化学分析的相同节间的节段(厚度为～1mm)基于加以修改的Wittich等(1999)所述方法用于免疫定位。在4℃将所述节段在4％低聚甲醛于0.1M PBS(4mM磷酸钠，pH7.4，和200mM NaCl)中固定12小时。在4℃在PBS中冲洗2小时后，将所述节段在乙醇系列中脱水，渗滤并包埋于丁基甲基甲基丙烯酸酯中。
在UVC2 CRYO室(PELCO，Redding，CA)中于-20℃在UV光下进行聚合40小时。用Leica(wetzlar，德国)RM2155切片机制备切片(厚度为3μm)，并在Superfrost/plus(Fisher)玻片上封固。将玻片用丙酮漂洗以除去丁基甲基甲基丙烯酸酯，将玻片再在乙醇系列中再水合并首先用0.1M氯化羟铵封闭5分钟，然后与1％BSA在室温温育30分钟。在与抗PtCAD，抗PtCAD5H(Osakabe等，1999)，抗PtAldOMT(Li等，2000)，或抗PtSAD抗体(1∶500稀释)在37℃温育2小时后，将玻片在含有0.1％BSA的PBS中冲洗，并与缀合碱性磷酸酶的山羊抗兔抗体(1∶100；BoehringerMannheim)在37℃温育1.5小时。在PBS中冲洗后，将与抗PtSAD，抗PtCAId5H或抗PtAIDOMT抗体温育的玻片与二甲基甲酰胺和氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的混合物在pH9.5反应，并将与抗PtCAD抗体温育的那些玻片用Fast Red TR/Naphthol AS-MX(Sigma)处理；这两种处理均在室温进行20-30分钟。免疫前血清用作对照。然后将玻片在50％甘油中封固，并用Nikon Eclipse 400显微镜观测，使用Sony(日本东京)DKC-5000数码相机照相。实施例7：白杨茎维管组织中愈创木基和丁香基木质素分布的组织化学和化学检测
PtCAD/PtSAD和愈创木基丁香基木质素生物合成之间的原位关系，通过分析愈创木基和丁香基木质素在白杨茎的维管组织中的分布而鉴别。丁香基木质素可以通过Cross/Bevan或Maule颜色反应(Nakano和Meshitsuka，1992)与愈创木基木质素原位显色区分。这两种方法中基于木质素的发色团形成机制是相似的。丁香基核心的氯化产生粉色(正在木质化的细胞)或红色(已经木质化的细胞)，而愈创木基核心产生淡褐色(正在木质化细胞)至深褐色(已经木质化细胞)(Bland，1966；Wardrop，1981)。在这些实验中使用Cross/Bevan方法，因为其反应条件适度，解决了在Maule生色反应中通常发生的薄组织切片破坏的问题。
在初生维管组织中，木质素只在木质部中观测到，而且是愈创木基类型，通过在茎节间1-4之间原生木质部和后生木质部导管元件的褐色染色而证实(图7A和7B)。这一点可以通过对茎木质素进行硫酸解分析而进一步证实，其表明只检测到愈创木基单体(图7D)。初生木质部是唯一含有纯化的愈创木基木质素的茎组织(图7E-7G)。在次生维管系统分化期间出现愈创木基-丁香基木质素，这通过对茎节间5及远端进行化学分析表明(图7H)。然而，丁香基木质素在愈创木基木质素之后在次生木质部中沉积，这通过分别在发育中，部分木质化，及广泛木质化次生木质部元件中由淡褐色至粉色然后红色的颜色变化而表明(图7G)。这与报道的丁香基木质素在愈创木基之后在被子植物木质部细胞中相继沉积相一致(Terashima等，1986；Saka和Goring，1988)。
聚集的原生韧皮部实质细胞，初级韧皮部纤维的前体(Esau，1965)，存在于初级生长组织中(图7A-7C)，但这些细胞不发生木质素染色，可能因为其缺少次生壁增厚过程。一旦木质化和次生增厚过程开始，它们也不能愈创木基木质素染色(图7I)。取而代之，随着它们分化为纤维，在这些细胞中发生丁香基阳性粉色(图7I)至红色(图7E和7F)生色。事实上，已知韧皮部纤维富含丁香基木质素，但它们也积聚愈创木基-丁香基木质素(Grand等，1982)。总而言之，这些观测表明与次生木质部元件中木质化顺序不同，在初级韧皮部纤维中丁香基木质素的生物合成领先，愈创木基木质素生物合成被压制。
免疫定位用于证实PtCAD是否与合成愈创木基木质素的初级木质部相关，及PtCAD和PtSAD的分布是否与韧皮部和木质部分子中愈创木基和丁香基木质素沉积模式一致。也分析了另一种丁香基途径蛋白PtCAd5H的分布。实施例8：白杨茎节间中PtCAD，PtCAd5H和PtSAD的免疫定位
使用与在蛋白质凝胶印迹分析期间的那些相似条件进行细胞免疫定位，通过这些条件证实PtCAD和PtSAD抗体的特异性(图4E和4F)。在与氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物进行抗兔IgG-碱性磷酸酶反应后，在组织切片中显色PtSAD和PtCAld5H。用Fast Red底物显示PtCAD信号。分析系列切片。与抗PtCAD，抗PtSAD或抗PtCAId5H抗血清在相同蛋白质浓度使用的免疫前血清不产生免疫标记信号(数据未示出)。在第三个节间，几乎仅在发育的后生木质部维管中检测到PtCAD(图8A)。在后生维管中未检测到PtSAD，但其在原生韧皮部实质细胞和实质贮藏组织髓鞘中最显著(图8B)。
PtCAld5H的细胞分布(图8C)与PtSAD的细胞分布一致。在第三个节间，木质化和次生壁增厚已经在后生木质部维管中开始，但在原生韧皮部实质细胞中未开始(图7A-7C)。一致地，在原生韧皮部实质细胞中观测不到木质素生色反应(图7A)，尽管在这些细胞中检测到PtSAD和PtCAld5H(图8B和8C)。然而，在第6节间，丁香基木质素沉积(图7I)和PtSAD信号(数据未示出)在这些分化为初级韧皮部纤维的细胞中均观测到。在第8节间，在这些分化的纤维细胞中PtSAD信号消失(图8E)，意味着在这些细胞中接近完全的丁香基单木质醇生物合成(图7E)。
在这个阶段，在这些成熟纤维中PtCAD比PtSAD更显著(图8D)，表示愈创木基单木质醇的活性生物合成。由于初级韧皮部持续其向心分化进程，新的韧皮部实质细胞在朝向茎中心的成熟纤维邻近出现。这些新初级韧皮部纤维前体(Esau，1965)用PtSAD得以标记(图8E)，但仍然不能用PtCAD标记(图8D)。在第12节间，PtSAD信号在初级韧皮部纤维中消失(图8I)，提示在这些细胞中丁香基单木质醇生物合成完成。然而，PtCAD信号在这些成熟纤维中明显保持(图8H)。在第15节间，PtCAD或PtSAD在完全木质化的这些纤维中均检测不到(数据未示出)。这些结果与组织化学木质素定位结果一致，表明在初级韧皮部纤维中丁香基木质素的生物合成领先于愈创木基木质素的生物合成。
然而，这些原形成层衍生的初级韧皮部分子和次生木质部呈现相反的木质化顺序。PtCAD比PtSAD在木质部纺锤状原始细胞中出现的早(图8H和8I)，与在次生木质部中丁香基木质素的生物合成落后于愈创木基木质素生物合成的化学和组织化学结果一致。另外，在分化的次生木质部中，PtCAD信号在成熟维管中最显著(图8F和8H)，但在发育的纤维和辐射状细胞中也很明显。PtSAD信号在富含丁香基木质素的径向和轴向辐射细胞中最强(图8G)(Wardrop和Dadswell，1952；Musha和Goring，1975)，而且在成熟纤维细胞中也较显著，但在发育的维管中几乎没有(图8G和8I)。次生木质部中这些蛋白质分布模式在较早的节间保持不变(数据未示出)。这些结果与组织化学观测结果一致，表明PtCAD与在愈创木基木质素合成中特异的细胞相关，PtSAD和PtCAd5H与含有富含丁香基木质素的维管元件相关。实施例9：在转化植物中富含丁香基的木质素的产生
以下遗传转化举例示出了植物中富含丁香基的木质素的产生：
A.为在被子植物中产生富含丁香基的木质素，将被子植物用在任何适当启动子驱动下的有义SAD基因通过任何适当遗传转化系统遗传转化。
B.为在裸子植物中产生富含丁香基的木质素，将裸子植物用在任何适当启动子驱动下的有义SAD基因通过任适当遗传转化系统遗传转化。
现在对本发明已经加以描述及特异性举例描述，本领域技术人员意识到可以在所述范围内进行各种修改，包括变化，添加及省略。因此，本发明也涵盖了这些修改，而且本发明的范围仅限于所附权利要求书的最广泛的法定解释范围内。
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                              序列表<110>密歇根理工大学管理委员会<120>植物中富含丁香基的木质素的遗传工程<130>066040-9686<140>Unknown<141>2001-09-05<150>60/230,086<151>2000-09-05<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1446<212>DNA<213>aspen populus tremuloides<400>1tttttttttt tttcctagcc ttccttctcg acgatatttc tctatctgaa gcaagcacca    60tgtccaagtc accagaagaa gaacaccctg tgaaggcctt cgggtgggct gctagggatc    120aatctggtca tctttctccc ttcaacttct ccaggagggc aactggtgaa gaggatgtga    180ggttcaaggt gctgtactgc gggatatgcc attctgacct tcacagtatc aagaatgact    240ggggcttctc catgtaccct ttggttcctg ggcatgaaat tgtgggggaa gtgacagaag    300ttgggagcaa ggtgaaaaag gttaatgtgg gagacaaagt gggcgtggga tgcttggttg    360gtgcatgtca ctcctgtgag agttgtgcca atgatcttga aaattactgt ccaaaaatga    420tcctgacata  cgcctccatc  taccatgacg  gaaccatcac  ttacggtggc  tactcagatc    480acatggtcgc  taacgaacgc  tacatcattc  gattccccga  taacatgccg  cttgacggtg    540gcgctcctct  cctttgtgcc  gggattacag  tgtatagtcc  cttgaaatat  tttggactag    600atgaacccgg  taagcatatc  ggtatcgttg  gcttaggtgg  acttggtcac  gtggctgtca    660aatttgccaa  ggcctttgga  tctaaagtga  cagtaattag  tacctcccct  tccaagaagg    720aggaggcttt  gaagaacttc  ggtgcagact  catttttggt  tagtcgtgac  caagagcaaa    780tgcaggctgc  cgcaggaaca  ttagatggca  tcatcgatac  agtttctgca  gttcaccccc    840ttttgccatt  gtttggactg  ttgaagtctc  acgggaagct  tatcttggtg  ggtgcaccgg    900aaaagcctct  tgagctacct  gccttttctt  tgattgctgg  aaggaagata  gttgccggga    960gtggtattgg  aggcatgaag  gagacacaag  agatgattga  ttttgcagca  aaacacaaca    1020tcacagcaga  tatcgaagtt  atttcaacgg  actatcttaa  tacggcgata  gaacgtttgg    1080ctaaaaacga  tgtcagatac  cgattcgtca  ttgacgttgg  caatactttg  gcagctacga    1140agccctaagg  agaagatccc  atgttctcga  accctttata  aaatctgata  acatgtgttg    1200atttcatgaa  taaatagatt  atctttggga  tttttcttta  ataaacgaag  tgttctcgaa    1260aacttaacat  cggcaatacc  ctggcagcta  cgagaaacgc  tttagaattg  tttgtaagtt    1320tgtttcatta  gggtgatacc  atgctctcga  gtcctttgta  agatccattt  atagttgcgt    1380gaatgctatg  aacaaataat  atgtttgcgg  cttctcttca  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa    1440aaaaaa                                                                    1446<210>2<211>362<212>PRT<213>aspen populus  tremuloides<400>2Met Ser Lys Ser Pro Glu Glu Glu His Pro Val Lys Ala Phe Gly Trp1               5                   10                  15Ala Ala Arg Asp Gln Ser Gly His Leu Ser Pro Phe Asn Phe Ser Arg
        20                   25                  30Arg Ala Thr Gly Glu Glu Asp Val Arg phe Lys Val Leu Tyr Cys Gly
    35                  40                  45Ile Cys His Ser Asp Leu His Ser Ile Lys Asn Asp Trp Gly Phe Ser
 50                 55                   60Met Tyr Pro Leu Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Glu Val Thr Glu65                  70                  75                   80Val Gly Ser Lys Val Lys Lys Val Asn Val Gly Asp Lys Val Gly Val
            85                  90                  95Gly Cys Leu Val Gly Ala Cys His Ser Cys Glu Ser Cys Ala Asn Asp
       100                  105                 110Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Lys Met Ile Leu Thr Tyr Ala Ser Ile Tyr
   115                  120                 125His Asp Gly Thr Ile Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asp His Met Val Ala
130                135                 140Asn Glu Arg Tyr Ile Ile Arg Phe Pro Asp Asn Met Pro Leu Asp Gly145                150                  155                 160Gly Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Leu Lys
           165                  170                 175Tyr Phe Gly Leu Asp Glu Pro Gly Lys His Ile Gly Ile Val Gly Leu
       180                  185                 190Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Phe Ala Lys Ala Phe Gly Ser
   195                  200                 205Lys Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Pro Ser Lys Lys Glu Glu Ala Leu
210                 215                 220Lys Asn Phe Gly Ala Asp Ser Phe Leu Val Ser Arg Asp Gln Glu Gln225                230                  235                 240Met Gln Ala Ala Ala Gly Thr Leu Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Ser
           245                  250                 255Ala Val His Pro Leu Leu Pro Leu Phe Gly Leu Leu Lys Ser His Gly
       260                  265                 270Lys Leu Ile Leu Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Ala
   275                  280                 285Phe Ser Leu Ile Ala Gly Arg Lys Ile Val Ala Gly Ser Gly Ile Gly290                 295                  300Gly Met Lys Glu Thr Gln Glu Met Ile Asp Phe Ala Ala Lys His Asn305                310                  315                 320Ile Thr Ala Asp Ile Glu Val Ile Ser Thr Asp Tyr Leu Asn Thr Ala
           325                  330                 335Ile Glu Arg Leu Ala Lys Asn Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asp
        340                 345                 350Val Gly Asn Thr Leu Ala Ala Thr Lys Pro
    355                 360<210>3<21l>23<212>DNA<213>aspen populus tremuloides<400>3ggcatatgtc caagtcacca gaa          23<210>4<211>27<212>DNA<213>aspen populus tremuloides<400>4tgcggccgcg  ggcttcgtag  ctgccaa    27

Claims (44)

1.一种分离的芥子醇脱氢酶(SAD)基因。
2.一种cDNA，其包含编码SAD或其功能片段的核苷酸序列。
3.一种cDNA，其包含编码具有与SAD基本相似氨基酸序列并呈SAD活性的多肽的核苷酸序列。
4.权利要求2的cDNA，其由SEQ ID NO：1组成。
5.一种分离并纯化的DNA分子，其包含具有植物SAD基因转录调节区域的DNA节段。
6.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1核苷酸序列的互补序列、反向互补序列和反向序列的一个核苷酸序列。
7.一种分离的多核苷酸，其包含在严格杂交条件下与以下序列杂交的一个核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1；
(b)(a)序列的互补序列；
(c)(a)序列的反向互补序列；及
(d)(a)序列的反向序列。
8.一种多核苷酸，其包含与以下序列只有一或多个保守缺失、插入或取代而不同的一个核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1；
(b)(a)序列的互补序列；
(c)(a)序列的反向互补序列；及
(d)(a)序列的反向序列。
9.一种多核苷酸，其包含与以下序列有至少70％序列相似性的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1；
(b)(a)序列的互补序列；
(c)(a)序列的反向互补序列；及
(d)(a)序列的反向序列。
10.由权利要求2的cDNA编码的多肽，其包含具有SAD序列的氨基酸序列，或其具有基本类似于SAD或其功能片段的氨基酸序列的序列保守变体。
11.权利要求10的多肽，其由SEQ ID NO：2组成。
12.一种改变植物组织中木质素单体组成的方法，包括：
(a)导入一种DNA构建体，其包含编码SAD或基本类似于SAD的多肽序列的核苷酸序列，其中所述序列可操纵地与在植物宿主中起作用的启动子和基因终止序列连接；
(b)再生所述植物细胞以提供转基因植物；及
(c)在转基因植物细胞中以有效改变植物的木质素单体组成的量表达所述DNA构建体。
13.权利要求12的方法，其中所述植物组织是植物细胞，植物器官或完整植物。
14.权利要求12的方法，其中所述植物组织选自由被子植物和裸子植物组成的一组。
15.一种产生具有改变的木质素结构的植物细胞的方法，包括：
(a)用权利要求9的多核苷酸转化植物细胞以产生转基因植物细胞；及
(b)在有利于再生和成熟植物生长的条件下培养所述转基因细胞。
16.一种修饰植物中酶活性的方法，包括在植物基因组中稳定掺入权利要求9的多核苷酸。
17.一种改变植物中木质素含量或组成的方法，包括通过转化将一个重组DNA稳定掺入植物基因组，所述重组DNA包含一个基因启动子序列和一个基因终止子及一个间插区域，所述间插区域包含一个编码与内源性植物芥子醇脱氢酶基因具有足够序列相似性的DNA序列的核苷酸序列，以便当所述核苷酸序列表达时，所述内源性植物芥子醇脱氢酶基因的表达被抑制，而且其中所述核苷酸序列是植物芥子醇脱氢酶基因或其功能片段。
18.一种提高植物中芥子醇脱氢酶活性的方法，包括通过转化将一个重组DNA稳定掺入植物细胞培养物的基因组中，所述重组DNA包含一个基因启动子序列和一个基因终止子及一个间插区域，所述间插区域包含一个编码与内源性植物芥子醇脱氢酶基因具有足够序列相似性的DNA序列的核苷酸序列，以便当所述核苷酸序列表达时，所述内源性植物芥子醇脱氢酶基因表达提高；从含有插入的重组DNA的培养物中选择细胞；从选择的细胞中再生完整植物；并选择再生自所选择细胞的具有特征在于芥子醇脱氢酶活性降低的表型的完整植物，其中所述核苷酸序列是植物芥子醇脱氢酶基因或其功能片段。
19.一种在基因组中掺入了重组DNA分子的植物，所述重组DNA分子包含编码SAD的核苷酸序列。
20.权利要求19的植物，其是树。
21.权利要求19的植物，其中所述编码SAD的核苷酸序列是有义方向。
22.权利要求19的植物，其中所述植物是被子植物。
23.权利要求19的植物，其中所述植物是裸子植物。
24.一种具有实质性改变的木质素单体组成的转基因植物，其包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子包含可操纵地连接于一个启动子的编码植物SAD的核苷酸序列，所述重组DNA以有效改变植物的木质素单体组成的量表达。
25.一种转基因植物细胞，其包含一种DNA构建体，所述DNA构建体具有一个启动子序列，一个SAD编码区域和一个终止子序列。
26.一种包含权利要求25的转基因植物细胞的植物，及其果实，种子和后代。
27.一种用于掺入植物基因组以改变植物木质素单体组成的DNA构建体，其包含一个可操纵连接的基因启动子序列，一个编码SAD的核苷酸序列或与其基本相似的序列，及在植物细胞中起作用的基因终止子。
28.一种转基因植物，其包含权利要求27的DNA构建体。
29.权利要求27的DNA构建体，其中所述植物是裸子植物。
30.权利要求27的DNA构建体，其中所述植物是被子植物。
31.权利要求27的DNA构建体，其中所述编码SAD的核苷酸序列是有义方向。
32.权利要求27的DNA构建体，其中所述编码SAD的核苷酸序列是反义方向。
33.权利要求27的DNA构建体，其中所述启动子可以是组成型或组织特异性的。
34.权利要求27的DNA构建体，其中所述启动子可以是同源或异源的。
35.一种DNA构建体，其从5’至3’方向包含：
(a)一个基因启动子序列，
(b)一个多核苷酸，其具有权利要求8或9任一项的序列，SEQID NO：1或基本相似序列，包含编码参与木质素生物合成途径的酶的基因；及
(c)一个基因终止序列。
36.权利要求27的DNA构建体，其中所述非编码区是有义方向。
37.权利要求27的DNA构建体，其中所述非编码区是反义方向。
38.权利要求27的DNA构建体，其中所述基因启动子序列提供在木质部中转录。
39.一种DNA构建体，其包含一个基因启动子序列，和一个基因终止子，及一个间插区域，所述间插区域包含编码一种蛋白质的核苷酸序列，该核苷酸序列与内源性植物芥子醇脱氢酶基因具有足够序列相似性，当所述核苷酸序列表达时，所述内源性植物基因的表达被抑制，所述内源性植物基因是编码芥子醇脱氢酶的基因，其中所述核苷酸序列是植物芥子醇脱氢酶基因或其功能片段。
40.一种DNA构建体，其从5’至3’方向包含：
(a)一个基因启动子序列，
(b)权利要求8或9任一项的多核苷酸，其包含编码参与木质素生物合成途径的一种酶的至少一个功能部分的至少一个开放读框；及
(c)一个基因终止序列。
41.一种改变植物中木质素组成的方法，包括在所述植物基因组中掺入权利要求27的DNA构建体，所述掺入在使得至少一部分植物细胞有效将所述构建体掺入植物基因组的量和条件下进行。
42.权利要求41的方法，其中所述改变的木质素组成与相对于基因组中未掺入所述DNA构建体的相似对照植物而言丁香基单木质醇的增加相关。
43.一种获得植物中芥子醇脱氢酶表达改变的方法，包括在所述植物基因组中掺入权利要求27的DNA构建体。
44.权利要求43的方法，其中所述改变的表达与与相对于基因组中未掺入所述DNA构建体的相似对照植物而言芥子醇脱氢酶表达的增加相关。
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