JP2004515224A

JP2004515224A - 植物におけるリグニン含量及び組成、及びセルロース含量の同時制御方法

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Publication number: JP2004515224A
Application number: JP2002525724A
Authority: JP
Inventors: ヴィンセントリーシーチャン; ライジェンリ
Original assignee: ボードオブコントロールオブミシガンテクノロジカルユニヴァーシティー
Priority date: 2000-09-05
Filing date: 2001-09-05
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2021-09-05
Also published as: IL154760A; CA2421215A1; AU2001288716A1; AU2001288765B2; BR0113654A; AU8876501A; AR030616A1; IL154759A0; US20020138870A1; US7514596B2; IL154759A; IL154760A0; ZA200301785B; WO2002020717A2; AU2001288765C1; WO2002020812A1; US6812377B2; JP2004520015A; EP1320617A4; AU2001288716A8

Abstract

本発明は、複数の遺伝子を植物に同時に導入する方法に関し、樹木が提供される。該方法は、４ＣＬ、Ｃａｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＳＡＤ及びＣＡＤ遺伝子及びその組み合わせを含むフェニルプロパノイド経路由来の複数の遺伝子による植物の同時形質転換を含み、変化した農業形質を示すトランスジェニック植物の種々の系統を産生する。植物の農業形質は、植物ゲノムに組み込まれる特異的な遺伝子の配向及び選択される遺伝子の組み合わせによって調節される。

Description

【０００１】
（関連出願の相互参照）
本件出願は２０００年９月５日に出願された米国仮出願第６０／２３０，０８６号の利益を主張し、前記仮出願は本願に引用して援用する。
【０００２】
（連邦政府による委託研究又は開発に関する説明書）
本発明はエネルギー生物科学プログラム、アメリカエネルギー省及びアメリカ農務省によって認められた合衆国政府の支援、研究費補助番号ＵＳＤＡ９９−３５１０３−７９８６、ＵＳＤＡ０１−０３７４９、及びＤＯＥＥＤ−ＦＧ０２−０１ＥＲ１５１７９により行われた。合衆国政府は本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明はリグニン生合成に関係する２つ以上遺伝子を植物細胞に導入する方法を提供する。本発明の方法はアグロバクテリウム媒介又はその他の適した植物遺伝子送達システムのいずれかを使用し、それによって単一の選択可能なマーカー遺伝子と一緒に複数の遺伝子が同時に植物ゲノムに高頻度で導入及び挿入される。
外来性遺伝子を植物に導入する能力は植物の農業形質工学に必須である。おもにアグロバクテリウム又は微粒子銃媒介形質転換のいずれかに関係する多くのシステムが外来性遺伝子を植物細胞に導入するために開発されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９６）。これらのすべてのシステムの原理は、非トランスジェニック細胞からのトランスジェニック細胞の選択に役立たせるために、ターゲット遺伝子を抗生物質又は除草剤耐性のいずれかをコードする選択可能なマーカー遺伝子と一緒に宿主植物ゲノムに挿入することに関する。これらのシステムは、一般に単一のターゲット遺伝子を宿主植物に導入するためにのみ有効である。
一般に自然状態では多遺伝子である農業形質を変えるためには、複雑な生合成経路に関連する複数の遺伝子が植物細胞に導入及び発現されなければならない。このような状況において、従来の単一遺伝子導入システムは以下の２つの理由により実質的に役に立たない。１）単一の遺伝子をトランスジェニック植物に繰り返し挿入することによって複数の遺伝子を導入することは、トランスジェニック組織の回収に要求される時間及び努力のために、非現実的である。特に、繰り返し単一遺伝子アプローチは、種に応じて、トランスジェニック組織選択及び樹木への再生に関して２〜３年を要する樹木のような植物種について非常に非現実的である。２）トランスジェニック系統における選択可能なマーカー遺伝子の存在は、その系統由来の植物材料の続く形質転換において同じマーカー遺伝子の使用を妨げる。さらに、入手可能なマーカー遺伝子の数は限られており、多くの植物種では、適切な抗生物質又は除草剤の選択が使用されない限り、再生することが困難である。
【０００４】
Ｃｈｅｎら（１９９８）は、最近複数の遺伝子構築物の胚形成懸濁組織への同時照射によって複数の遺伝を有するイネの遺伝子形質転換を報告した。しかしながら、胚形成組織への粒子照射媒介遺伝子導入は種依存性が高く、胚形成細胞からの植物全体の再生は種々の植物種について達成できていない（Ｈｏｒｓｃｈら，１９８５）。
対照的に、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入及び器官形成を介した植物全体の再生は簡単なプロセスであり、照射媒介形質転換及び胚形成を経た再生よりも種依存性の低いシステムである。しかしながら、アグロバクテリウムを介した単一のプラスミドベクターにおける１つ以上の遺伝子の導入は技術的に厄介であり、ターゲット遺伝子の数又はサイズによって制限される（Ｃｈｅｎら，１９９８）。例えば、Ｔｒｉｃｏｌｉら（１９９５）はアグロバクテリウム媒介遺伝子導入を経たカボチャへの３つのターゲット遺伝子の導入を報告した。３つのターゲット遺伝子を含んでいるバイナリープラスミドベクターはアグロバクテリウム菌株に組み込まれ、続いてカボチャの葉組織に感染させるために使用された。多くの感染したカボチャ組織からターゲット遺伝子のすべてを含んだある系統のみが回収されるため、多数の遺伝子を有する単一のバイナリーベクターの使用は複数の遺伝子導入によってトランスジェニック植物を産生するのに非常に効率の悪い方法であるように見える。従って、アグロバクテリウムを経た複数の遺伝子導入の成功が、共通の出願人により２０００年１０月６日に出願されたＣｈｉａｎｇらの同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／００２７７０４，発明の名称“ＭｅｔｈｏｄｔｏＩｎｔｒｏｄｕｃｅＭｕｌｔｉｐｌｅＧｅｎｅｓｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ”（本願に引用して援用する）に最初に報告されるまで、アグロバクテリウム媒介形質転換を経た複数の遺伝子の導入が非現実的であることが一般に受け入れられていた（Ｅｂｉｎｕｍａら，１９９７）。しかしながら、非形質転換植物と比較して、リグニン含量を特異的に変え、Ｓ／Ｇ（シリンギル：グアイアシル）リグニン比を増大し、セルロース量を増大するためのトランスジェニック樹木の相同的組織特異的製剤は、成功しなかった。
依然として、植物におけるリグニン含量及び組成の変化は植物における遺伝子改変形質の目的である。リグニン（複合フェノールポリマー）は、紙及びセルロース製品を製造するための主たるファイバー源でもある被子植物及び裸子植物の樹木を含むほとんどの木本の支持構造の主要な部分である。リグニンは一般に木部の乾燥重量の約２５％を構成し、セルロースの次に地球上で最も豊富な有機化合物である。リグニンは、生化学的分解に対するその耐性のために、非常に適している木部に剛性を与える。
【０００５】
植物の成長及び構造にとって重要であるにも関わらず、リグニンは多大な費用をかけてセルロースから除去又は分解されなければならないため、収穫後のファイバー、化学物質及びエネルギー生成のためのセルロースベース木部／農作物プロセシングに問題がある。グアイアシル（Ｇ）成分のようなリグニンのある構造成分は、分解に対するリグニン耐性を増大するモノマー架橋反応を促進する（Ｓａｒｋａｎｅｎ，１９７１；Ｃｈａｎｇ及びＳａｒｋａｎｅｎ，１９７３；Ｃｈｉａｎｇ及びＦｕｎａｏｋａ，１９９０）。被子植物において、リグニンはグアイアシル（Ｇ）及びシリンギル（Ｓ）モノリグノール（ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌ）の混合物を含み、ほとんどすべてがグアイアシル成分からなる裸子植物のリグニンよりもかなり低いエネルギー及び化学物質コストで分解できる（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ，１９６５）。推測されるように、シリンギルリグニンを裸子植物のグアイアシルリグニン又は被子植物に遺伝子工学的に組み込んでシリンギルリグニン含量を増大することができれば、野生型に対してそのような遺伝子改変植物のプロセシングにおける年間の節約は米国単独で６０億〜１００億ドルの範囲になるであろう。従って、遺伝子改変植物のシリンギルモノリグノールの生合成を理解してより多くのシリンギルリグニンを含有させるための長年の動機があり、それ故、木部／作物プロセシングを促進している（Ｔｒｏｔｔｅｒ，１９９０；Ｂｕｇｏｓら，１９９１；Ｂｏｕｄｅｔら，１９９５；Ｈｕら，１９９９）。
【０００６】
植物のための使用に応じて、ある形質の遺伝子操作が試みられている。いくつかの植物について、前述の通り、リグニン及びセルロースを遺伝子改変してリグニン含量を低減して、セルロース含量を増大する長年の動機がある。例えば、反芻による飼料作物の消化性が植物中のリグニン含量に逆比例することが示されている（Ｂｕｘｔｏｎ及びＲｏｕｓｓｅｌ，１９８８，Ｃｒｏｐ．Ｓｃｉ．，２８，５５３−５５８；Ｊｕｎｇ及びＶｏｇｅｌ，１９８６，Ｊ．Ａｎｉｍ．，Ｓｃｉ．，６２，１７０３−１７１２）。従って、低減されたリグニン及び高いセルロースは飼料作物で望ましく、反芻によるその消化性を増大し、その結果単位飼料当たりより多くの栄養分を動物に与える。
その他の植物において、リグニンのＳ／Ｇ比を遺伝子的に増大することが探索されている。上で述べたように、被子植物におけるリグニンはグアイアシル（Ｇ）及びシリンギル（Ｓ）モノマー単位を含み、裸子植物のリグニンはすべてＧ単位からなる。裸子植物のリグニンにおけるＧ単位の構造的特性は、木材パルプ生産の際の化学薬品抽出に対するリグニン耐性を増大するモノマー架橋反応を促進する。しかしながら、被子植物のリグニンに存在するＳ単位は、そのような化学薬品耐性架橋を妨げる。従って、例外なく、裸子植物のパルプ化のＧリグニンの化学薬品抽出は、被子植物のパルプ化の際のＧ−Ｓリグニンの抽出よりも多くの化学薬品、より長い反応時間及びより高いエネルギーレベルを必要とする（Ｓａｒｋａｎｅｎ，Ｋ．Ｖ．，１９７１，ｉｎＬｉｇｎｉｎｓ：Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＲｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｒｋａｎｅｎ，Ｋ．Ｖ．及びＬｕｄｗｉｇ，Ｃ．Ｈ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｍ．及びＳａｒｋａｎｅｎ，Ｋ．Ｖ．，１９７３，ＴＡＰＰＩ，５６：１３２−１３６）。一般に、木材パルプ化の際のリグニン抽出の反応速度はリグニン中のＳ単位の量に正比例する（Ｃｈａｎｇ，Ｈ．Ｍ．及びＳａｒｋａｎｅｎ，Ｋ．Ｖ．，１９７３，ＴＡＰＰＩ，５６：１３２−１３６）。従って、リグニンを裸子植物においてより反応性のＧ−Ｓタイプに変え、被子植物において高Ｓ／Ｇ比に変えることは、現在のパルプ化及び漂白効率を高め、より良く、より経済的で、より環境保全型の木部の利用を与える重要な可能性を示すであろう。
最近の結果は、高Ｓ／Ｇ比が植物にさらに機械的な利点を与え、厳しいリグニンの還元による植物の強度の起こりうる低下の平衡化を示している（Ｌｉら，２００１，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１３：１５６７−１５８５）。さらにまた、高Ｓ／Ｇリグニン比は、反芻による飼料作物の消化性をも改善するであろう（Ｂｕｘｔｏｎ及びＲｏｕｓｓｅｌ，１９８８，Ｃｒｏｐ．Ｓｃｉ．，２８，５５３−５５８；Ｊｕｎｇ及びＶｏｇｅｌ，１９８６，Ｊ．Ａｎｉｍ．，Ｓｃｉ．，６２，１７０３−１７１２）。
【０００７】
使用目的によっては、高リグニン含量及び高Ｓ／Ｇ比の両方が求められる（すなわち、植物においてこれら２つの形質を組み合わせる）。例えば、リグニンが化学的パルプ化の際に木部から抽出される場合、パルプ液におけるリグニンは通常燃料源として使用されて、パルプ化及び漂白操作にエネルギーを与えることが示されている。購入されたエネルギー用燃料を用いるパルプ製造機に必要でない、このリグニン関連エネルギー源は、抽出されたリグニンのような、エネルギーの自給できる内部源に依存するいくつかのパルプ製造機に必須である。従って、この目的のために、パルプ材種のリグニン含量を増大し、同時にこれらの種のＳ／Ｇ比を増大して、燃料として使用されるより多くのリグニンの抽出を促進することが望ましい。
さらに、穀物生産及びその他の非関連目的のために、増大されたリグニン含量及び／又はＳ／Ｇリグニン比は、植物に特別な強度を与えて、植物の空気中で成長する部分の除去及び損傷により、社会的及び経済的に重要な食用作物の損失を防ぐのに望ましい。
【０００８】
植物モノリグノール生合成経路は図１に示され、以下により詳細に説明される。シナピアルデヒド（ｓｉｎａｐａｌｄｅｈｙｄｅ）の生成の場合、モノリグノール生合成経路におけるキーとなるリグニン制御部分は、それぞれ酵素４−クマラート（ｃｏｕｍａｒａｔｅ）−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）（Ｌｅｅら，１９９７）、コニフェリルアルデヒド５−ヒドロキシラーゼ（ＣＡｌｄ５Ｈ）（Ｏｓａｋａｂｅら，１９９９）及びＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）−依存性５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド（ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＡｌｄＯＭＴ）（Ｌｉら，２０００）をコードする遺伝子によって媒介される（図１を参照のこと）。さらに、コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）（ＭａｃＫａｙら，１９９７）は、コニフェリルアルコールの基質コニフェリルアルデヒド（ｃｏｎｉｆｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含む反応を触媒する。シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）が、植物におけるシリンギルリグニンの生合成のためにシナピアルデヒドをシナピルアルコール（シリンギルモノリグノール）に酵素的に変換することが最近発見された（図１を参照のこと）。発明の名称が“ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＳｙｒｉｎｇｙｌ−ＥｎｒｉｃｈｅｄＬｉｇｎｉｎｉｎＰｌａｎｔｓ”である共通の出願人により同時に出願された米国非仮出願を参照のこと（本願に引用して援用する）。注目すべきは、酵素シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）をコードする遺伝子が植物におけるシリンギルリグニンの遺伝子操作に欠くことのできない最後の遺伝子を表すことである。
【０００９】
上記の各蛋白質のコード配列に含まれる保存領域の概要は以下に記載される。ＳＡＤはアスペンにおいて最近発見された酵素であるため、その他の代表種との配列アラインメントは実施できなかった。
植物ＡｌｄＯＭＴの蛋白質配列アラインメントは図９に示される。すべてのＡｌｄＯＭＴは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）（ＯＭＴ反応用補基質又はメチルドナー）の結合部位である３つの保存配列モチーフ（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）を有する（Ｉｂｒａｈｉｍ，１９９７，ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ．，２：２４９−２５０；Ｌｉら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：５４６１−５４６６；Ｊｏｓｈｉ及びＣｈｉａｎｇ，１９９８，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３７：６６３−６７４）。これらのシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列モチーフ及びこれらの蛋白質のＰｔＡｌｄＯＭＴとの高い配列相同性は、５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒドのシナピアルデヒドへの変換に特異的であるＡｌｄＯＭＴとしてのその機能を証明する（Ｌｉら，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：６５３７−６５４５）。また、このＡｌｄＯＭＴ（ＣＡｌｄ５Ｈに似た）は、植物モノリグノール生合成経路のアルデヒドレベルで機能する。
植物ＣＡＤの蛋白質配列アラインメントは図１０に示される。ＣＡＤが実際にグアイアシルモノリグノール経路特異的であることが最近わかった（Ｌｉら，２００１，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１３：１５６７−１５８５）。高い配列相同性に基づいて、アラインメントプログラムは、被子植物、同様にＧリグニンのみを有する裸子植物（ラジアータマツ、テーダマツ及びトウヒ）由来のＣＡＤを選び出した。すべてのＣＡＤは、Ｚｎ１結合モチーフ及び構造Ｚｎ２コンセンサス領域、同様にＮＡＤＰ結合部位を有する（Ｊｏｒｎｖａｌｌら，１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６７：１９５−２０１；ＭａｃＫａｙら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４７：５３７−５４５）。これらすべての配列の特徴及びＰｔＣＡＤとの高い配列相同性は、Ｇモノリグノール特異的ＣＡＤとしてのこれらのＣＡＤの機能を証明する（Ｌｉら，２００１，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１３：１５６７−１５８５）。
【００１０】
植物Ｃａｌｄ５Ｈの蛋白質配列アラインメントは図１１に示される。５−ヒドロキシラーゼの異なるタイプ、すなわちＦ５Ｈが存在するが、ＣＡｌｄ５Ｈはコニフェリルアルデヒドの５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒドへの変換を特異的に触媒する唯一の酵素である。すべての全長ＣＡｌｄ５Ｈは、ミクロソームＰ４５０ｓの正しい折り畳みのプロセスに関係すると考えられ、またＰ４５０ｓに組み込まれるヘムにおいて重要であるアミノ酸４０〜４５に位置するプロリンリッチ領域を有する（Ｙａｍａｚａｋｉら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：６５２−６５７）。また、それらすべては、すべてのＰ４５０蛋白質において保存されるヘム結合領域（ＰＦＧＸＧＸＸＸＣＸＧ）を有する（Ｎｅｌｓｏｎら，１９９６，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：１−４１）。これらのシグネチャー配列及びこれらの蛋白質のＰｔＣＡｌｄ５Ｈとの高い配列相同性は、コニフェリルアルデヒドの５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒドへの変換に特異的である５−ヒドロキシラーゼとしてのその機能を証明する（Ｏｓａｋａｂｅら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：８９５５−８９６０）。
植物４ＣＬの蛋白質配列アラインメントは図１２に示される。一般に、４ＣＬはヒドロキシ桂皮酸のその対応するヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡエステルへの活性化を触媒する。４ＣＬはｐ−クマル酸と共に最も高い活性を有する。４ＣＬｃＤＮＡ配列は多くの代表的な被子植物及び裸子植物から報告され、２つの高い保存領域、推定ＡＭＰ結合領域（ＳＳＧＴＴＧＬＰＫＧＶ）、及び触媒モチーフ（ＧＥＩＣＩＲＧ）を示す。植物由来の４ＣＬのアミノ酸配列は合計５つの保存Ｃｙｓ残基を含む。
リグニン生合成においてこれらがキーとなる酵素であるとの認識にもかかわらず、複数の遺伝子を植物細胞に導入することによって、植物におけるリグニン量、リグニン組成、及びセルロース含量を同時に制御する改良された方法を開発することが依然として必要である。
【００１１】
（発明の要約）
本発明は、２つ以上の独立したベクターに存在するリグニン生合成に関する２つ以上の遺伝子を植物細胞に導入する方法を提供する。本発明の方法は、適宜にアグロバクテリウム媒介又は他の遺伝子送達システムを利用し、それによって単一の選択可能なマーカー遺伝子と一緒に複数の遺伝子を高頻度で植物のゲノムに同時に導入及び挿入する。
アグロバクテリウム媒介遺伝子送達システムを使用する場合、所定の各遺伝子はアグロバクテリウムに導入されてバイナリーベクターを含む分離されたアグロバクテリウムの菌株を生じるバイナリーベクターに存在する。さらに、所定の１つよりも多い遺伝子は各バイナリーベクターに存在してもよい。ターゲット植物種由来の、植物細胞を含む植物物質、例えば植物の種子、植物の一部又は葉円盤状組織（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）のようなエクスプラント物質を含む植物組織は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ又はそれ以上の分離された、それぞれ所定の異なる遺伝子を含むアグロバクテリウムの菌株によって適宜に接種される。菌株の混合物は適宜に植物細胞と接触させられる。分離されたアグロバクテリウムの菌株における少なくとも１つのバイナリーベクターは、マーカー遺伝子を含み、形質転換細胞を非形質転換細胞から選択するために形質をコードする任意のマーカー遺伝子を使用してもよい。形質転換植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得、そのゲノムは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つのバイナリーベクター由来のＤＮＡによって増える。
従って、本発明の方法は、アグロバクテリウム又はその他の遺伝子送達システムによって遺伝情報を導入できるすべての植物種に適用できる。本発明の方法に有用である適した植物種としては、農業及び飼料作物、同様に単子葉植物が挙げられる。特に、本発明の方法に有用である植物種としては、樹木、例えば被子植物及び裸子植物、より好適には森林樹が挙げられるが、樹木に限定されない。
【００１２】
本発明の方法は、適宜に２つ以上の遺伝子の発現を変えることによって所望の農業形質を高めるために使用される。そのような形質としては、リグニン生合成（例えば、低減、増大及び／又は構造的変化）、セルロース生合成（例えば、増大、低減、及び／又は高い重合度及び結晶化度を含む品質）、成長、木材品質（例えば、高密度、低若年性木部、高成熟木部、低反応木材、所望の繊維角度）、ストレス耐性（例えば、耐寒性、耐熱性、及び耐塩性、病原体耐性、昆虫耐性及びその他の耐病性、除草剤耐性）、不稔性、高穀物収量（飼料作物及び食用作物）、及び高栄養レベルの変化が挙げられる。
従って、本発明は、減少したリグニン含量、増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比及び増加したセルロース含量を有し、単一の形質又は複数の形質が変化する裸子植物及び被子植物を有利に提供する。
他の局面において、本発明はシリンギル富化リグニン及び／又は増加したリグニン含量及び／又は増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比を有する裸子植物を提供する。
同様に、また本発明は増加したリグニン含量を有する被子植物も提供する。
本発明のその他の利点及び特定の性質及び変化のより完全な適用は、特許請求の範囲と共に典型的な実施態様等の以下の詳細な記載の試験によって得られるであろう。
当然のことながら、添付図面の図は実例を示し、説明することのみを目的とし、本発明の限界を決定するものとして意図していない。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、リグニンモノマー組成の変更、増大したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比及び増大したセルロース含量のための植物組織の形質転換に有用である方法及びＤＮＡ構築物を提供し、トランスジェニック植物はそのような形質転換から得られる。より高いシリンギルモノマー含量を含むリグニンは化学的脱リグニンに対してより敏感であるため、本発明は製紙業及びパルプ産業にとって特に価値がある。本明細書で提供されるＤＮＡ構築物によって形質転換された木本は、脱リグニンプロセスにおける従来の紙の供給原料への明らかな利点を提供する。同様に、非相同的ＳＡＤ遺伝子の挿入及び発現によるイネ科草本（ｇｒａｓｓｅｓ）におけるリグニン組成の改変は、イネ科草本の消化性を増大する独特の方法を提供し、農場及び農業にとって大きな潜在的経済的利益になる。
【００１４】
本明細書で使用される用語は、一般にその技術における通常の意味、本発明の状況の範囲内での通常の意味及び各用語が使用される特定の状況における通常の意味を有する。ある特定の用語は以下に、又は本明細書の他の部分に記載して、さらに本発明の組成物及び方法及びそれらの生成及び使用方法の記載において、当業者へのガイダンスを提供する。当然のことながら、同じものであっても１つ以上の方法で呼ばれる場合がある。従って、他の言語及び同義語として、本明細書に記載される用語のうちのいずれか１つ又は複数を使用してもよく、用語が本明細書で詳細に述べられているかどうか、又は議論されているかどうかによって認識されるべき特別な重要性はない。ある用語の類義語が与えられる。１つ以上の類義語の詳述は他の類義語の使用を排除しない。本明細書で議論される任意の用語の例を含む本明細書のいずれかの例の使用は一例に過ぎず、決して本発明の範囲及び意味又は例示されたどんな用語の範囲及び意味を制限しない。同様に、本発明は好ましい実施態様に限定されない。
本明細書で使用される“遺伝子”は特定の蛋白質を発現し、コード領域又はコード配列（以下を参照のこと。）に先行する調節配列（５’非コーディング）及びコード領域又はコード配列に続く調節配列（３’非コーディング）を含む核酸フラグメントを参照する。“未変性”遺伝子は、本来それ自身の調節配列によって見出される遺伝子を参照する。
“内在性遺伝子”はゲノムにおけるその本来の位置で正常に見出される未変性遺伝子を参照する。
“導入遺伝子”は遺伝子導入によって宿主生物体に導入される遺伝子を参照する。
“コード配列”又は“コード領域”はポリペプチドをコードする情報を含む遺伝子の部分を参照する。コード配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、例えば原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられ、たとえ合成ＤＮＡ配列であってもよい。
【００１５】
“プロモーター”又は“プロモーター配列”は、与えられた遺伝子において、ＲＮＡポリメラーゼのために認識部位を提供し、固有の転写のためにその他の要求される因子を提供することによってコード配列の発現を制御するＤＮＡ配列を参照する。多くの遺伝子は遺伝子発現を調節するプロモーター配列であるＤＮＡ配列の領域を有する。プロモーター領域は原核生物及び真核生物細胞の両方のコード配列から上流の５’フランキングＤＮＡ配列において典型的に見られる。プロモーター配列は下流遺伝子配列の転写の調節を与え、典型的には約５０〜約２０００ヌクレオチド塩基対を含む。また、プロモーター配列は、遺伝子発現のレベルに影響を及ぼすことができるエンハンサー配列のような調節配列を含む。いくつかの分離されたプロモーター配列は、天然の相同的ＤＮＡと異なるＤＮＡである非相同的ＤＮＡの遺伝子発現を提供できる。また、プロモーター配列は、強い、又は弱い、あるいは誘導性であることで知られている。強いプロモーターは高レベルの遺伝子発現を提供するが、弱いプロモーターは非常に低レベルの遺伝子発現を提供する。誘導性プロモーターは外因的に加えられた媒介物（ａｇｅｎｔ）及び環境の刺激又は発育上の（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）刺激に応答して遺伝子発現をオン・オフすることを提供するプロモーターである。非相同的ＤＮＡのための強いプロモーターである分離されたプロモーター配列は、形質転換した細胞の容易な検出及び選択を可能にするのに十分なレベルの遺伝子発現を提供し、所望する場合、高レベルの遺伝子発現を提供するため有利である。また、プロモーターは、生理学的又は発育上の条件に応答して転写開始の有効性を調節する蛋白質因子の結合に関連するＤＮＡ配列を含んでもよい。
【００１６】
“調節配列”は、コード配列の上流（５’）、内部、及び／又は下流（３’）に位置するヌクレオチド配列を参照し、細胞の蛋白質生合成機構と協同してコード配列の転写及び／又は発現を制御する。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、転写終結配列及びポリアデニル化配列を含む。
“コード化する（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）”及び“コード化する（ｃｏｄｉｎｇ）”は、一連のアミノ酸が集まって特定のアミノ酸配列を構築して活性酵素を産生する情報を、遺伝子がそれによって（転写及び翻訳のメカニズムを介して）細胞に与えるプロセスを参照する。当然のことながら、特定のアミノ酸配列をコードするプロセスはコードされるアミノ酸の変化を生じない塩基置換を含んでもよいＤＮＡ配列、又は１個又は複数のアミノ酸が変化してもよい塩基置換を含むＤＮＡ配列を含むが、ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の機能特性に影響を及ぼさない。従って、当然のことながら、本発明は単に特定の具体的な配列を包含するにとどまらない。また、結果として得られる蛋白質分子の機能特性に実質的に影響を及ぼさないわずかな変更を生じる配列の欠失、挿入又は置換のような配列の改変は考慮される。例えば、遺伝コードの縮重を反映する、又は与えられた部位で化学的に等価なアミノ酸の産生を生じる遺伝子配列の変更は考慮される。このように、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシンのようなより小さい他の疎水性残基又はバリン、ロイシン又はイソロイシンのようなより大きい他の疎水性残基をコードするコドンによって置換されてもよい。また、同様に、結果としてグルタミン酸からアスパラギン酸への置換のような他の残基から１つの負の荷電残基への置換、又はアルギニンからリジンへの置換のような他の残基から１つの正の荷電残基への置換を生じる変化は、生物学的に等価な産物を産生することが期待できる。また、結果として蛋白質分子のＮ−末端及びＣ−末端部分の変更を生じるヌクレオチド変化は、蛋白質の活性を変えないことが期待される。一部の例では、実際に、蛋白質の生物学的活性の保持の効果を研究するために配列の変異体を生成することが望ましいかもしれない。これらの提案される各改変は、コードされる産物の生物学的活性の保持の決定であるように、当業界における通常の技術の範囲内である。さらに、当業者は、本発明に包含される配列がストリンジェントな条件下で本明細書に例示される配列とハイブリダイズする能力によっても定義されることを理解する。
【００１７】
“発現”は、遺伝子によってコードされる蛋白質産物の産生を参照しなけばならない。“過剰発現”は、正常又は形質転換されない生物体における産生のレベルを超えるトランスジェニック生物体における遺伝子産物の産生を参照する。
酵素の“機能的部分”又は“機能的フラグメント”又は“機能的等価物”は、１つ又は複数の反応物を結合する活性部位を含む部分、フラグメント又は等価部分、又は反応速度を改善又は調節できる部分、フラグメント又は等価部分である。活性部位は１つ又は複数のポリペプチド鎖に存在する別々の部分から構成される場合があり、一般に高い基質特異性を示す。
“ヌクレオチド配列によってコードされる酵素”は、部分的に分離されたＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる酵素を含む。
“形質転換”は、外来性遺伝子の宿主生物体のゲノム及びその遺伝的に安定な遺伝形質への導入を参照する。
“％同一性”は、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐＷｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＧＣＧ）パッケージ（バージョン９．０）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得られるＧＡＰのようなプログラムによって同定されるような、ポリヌクレオチド／ポリペプチドの他の配列のヌクレオチド／アミノ酸と同一である特定のポリヌクレオチド／ポリペプチドのヌクレオチド／アミノ酸のパーセンテージを参照する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムを使用して、一致する数を最大にし、ギャップの数を最小にする２つの完全な配列のアラインメントを見出す。上記アルゴリズムを実行するために必要なパラメータが特定できない場合、そのプログラムによって提供されるデフォルト値が検討される。
“実質的な相同性”又は“実質的な類似性”は、７０％又はそれよりも高い類似性又は７０％の相同性を参照し、２つのポリペプチド配列の間の“％類似性”又は“％相同性”は、使用されるスコアリングマトリックスに基づいて２つの配列によって共有される類似する位置の数を比較される位置の数で割り、次いで１００を掛けた関数である。この比較は、２つの配列を並べて（必要な場合には、ギャップを導入して）最大の相同性を決定する場合に行われる。全米バイオテクノロジー情報センターによって提供されるＰｏｗｅｒＢｌａｓｔプログラムを使用して、ギャップを導入した最適のアラインメントを計算することができる。また、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐＷｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ（バージョン９．０）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰプログラムも使用できる。
【００１８】
“リグニンモノマー組成”は、リグニン化した植物組織で見出されるグアイアシルモノマーとシリンギルモノマーの相対比を参照する。
“植物”には、植物全体及び植物器官（例えば、根、茎、葉等）を含む植物の部分が含まれる。
“被子植物”は、子房で覆われた種子を生成する植物を参照する。被子植物の具体的な例はモミジバフウ（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂａｒｓｔｙｒａｃｉｆｌｕａ）（Ｌ．）［ｓｗｅｅｔｇｕｍ］である。
“裸子植物”は、裸の種子、すなわち子房で覆われていない種子を生成する植物を参照する。裸子植物の具体的な例はデーダマツ（Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ）（Ｌ．）［ｌｏｂｌｏｌｌｙｐｉｎｅ］である。
核酸分子又はポリペプチドに関して、本明細書で使用される用語“分離及び／又は精製”は、配列決定、複製及び／又は発現することができるように、その天然細胞の周囲及び細胞のその他の成分（例えば、核酸又はポリペプチド）との関連から核酸又はポリペプチド分子をインビトロ分離することを参照する。
アグロバクテリウムの“分離される”菌株は、分離されたバイナリーベクターによってインビトロで形質転換されるアグロバクテリウムのクローン由来の細胞を参照する。
“ベクター”は、プラスミド、ファージ、ゲノム、ウイルスゲノム、コスミド、又は人工染色体のような組換え核酸構築物であり、本発明のポリヌクレオチドはそれに付着する場合がある。具体的な実施態様において、ベクターは、例えばクローニングベクターの場合、付着セグメントの複製を導く場合がある。
“シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ”すなわち“ＳＡＤ”、コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼすなわち“ＣＡＤ”、コニフェリルアルデヒド５−ヒドロキシラーゼすなわち“Ｃａｌｄ５Ｈ”、５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒドＯ−メチルトランスフェラーゼすなわち“ＡｌｄＯＭＴ”、及び４−クマルラート（ｃｏｕｍａｒａｔｅ）−ＣｏＡリガーゼすなわち“４ＣＬ”は、植物フェニルプロパノイド生合成経路における酵素を参照する。本発明の例示された実施態様において、これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、クェーキングアスペン（ｑｕａｋｉｎｇａｓｐｅｎ，Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）から同定された。当然のことながら、各配列は、技術的によく知られた技術（ＥＳＴ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、抗体等）によって任意の植物種からその等価物をクローン化するためにプローブとして使用できる。
【００１９】
（フェニルプロパノイド生合成経路）
各工程を触媒する役割を有する酵素と共にグアイアシル−シリンギルリグニンの生成のための４−クマラート（１）からグアイアシル（コニフェリルアルコール（６））及びシリンギル（シナピルアルコール（９））モノリグノールへの生合成経路における種々の工程を示す図１を参照する。各反応工程で表示される酵素は以下のものである。４−クマラート（１）をカフェアート（ｃａｆｆｅａｔｅ）（２）に変換する４−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（Ｃ３Ｈ）、カフェアート（２）を、カフェオイル（ｃａｆｆｅｏｙｌ）−ＣｏＡＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＣｏＡＯＭＴ）によってフェルロイル（ｆｅｒｕｌｏｙｌ）ＣｏＡ（４）に変換されるカフェオイルＣｏＡ（３）に変換する４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、フェルロイルＣｏＡ（４）をコニフェリルアルデヒド（５）に変換するシンナモイル（ｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）、コニフェリルアルデヒド（５）をグアイアシルモノリグノールコニフェリルアルコール（６）に変換するコニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）、コニフェリルアルデヒド（５）で経路は分かれ、コニフェリルアルデヒド（５）はコニフェリルアルデヒド５−ヒドロキシラーゼ（Ｃａｌｄ５Ｈ）によって５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド（７）にも変換され、５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒドＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＡｌｄＯＭＴ）は５−ヒドロキシコニフェリルアルデヒド（７）を、シナピルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＳＡＤ）によってシリンギルモノリグノール、シナピルアルコール（９）に変換されるシナピアルデヒド（８）に変換する。
【００２０】
（ＤＮＡ構築物）
本発明に従って、プロモーター配列、コード領域及びターミネーター配列を有する植物ＤＮＡであるＤＮＡ構築物が提供される。コード領域はリグニン生合成に必須である酵素の組み合わせ、特にＳＡＤ、ＣＡＤ、Ｃａｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及び４ＣＬ蛋白質配列、実質的に類似する配列、又はその機能的フラグメントをコードする。コード領域は、適宜に５０塩基の最小サイズである。遺伝子プロモーターは、導入遺伝子発現を調節するために導入遺伝子（例えば、以下に記載されるように、４ＣＬ単独で、又はＳＡＤ、Ｃａｌｄ５Ｈ、及びＡｌｄＯＭＴ、及びそれらの組み合わせと一緒に、又は４ＣＬ及びＣＡＤ単独で、又はＣＡｌｄ５Ｈ、ＳＡＤ、及びＡｌｄＯＭＴ、及びそれらの組み合わせと一緒に）の５’−末端に位置し、遺伝子終結配列は導入遺伝子の転写の終わりを知らせるために導入遺伝子の３’−末端に位置する。
本発明のＤＮＡ構築物は、形質転換によって植物のゲノムに組み込まれて、リグニン生合成を変え、シリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比を増大し、セルロース含量を増大することができる。ＤＮＡ構築物は、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＳＡＤ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及び４ＣＬクローン、及び遺伝コードの縮重によって許容されるようなそれらの変異体及びそれらの機能的等価物を含んでいてもよい。
本発明のＤＮＡ構築物を植物に挿入して以下の酵素：ＣＡｌｄ５Ｈ、ＳＡＤ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及び４ＣＬの産生を調節してもよい。該構築物の性質に応じて、植物の生涯の全体にわたって、又は特定の段階で、構築物をそのゲノムに組み込まない同様のコントロール植物に対して該蛋白質の産生を増大又は低減してもよい。例えば、ＤＮＡコード配列、プロモーター、及び終結配列の配向は、リグニン生成を抑制するか、又はリグニン生成を増幅するのに役立つことができる。リグニン合成の下方調節のためには、ＤＮＡはアンチセンス配向である。リグニン生合成の増幅のためには、ＤＮＡはセンス配向であり、これにより植物ゲノムのＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを提供する。この場合、ＤＮＡは全長ｃＤＮＡコピーであるのがよい。また、表皮、木部、根等のような植物の特定の細胞型を狙って遺伝子を発現させることが可能である。本発明の構築物を使用して、技術的に知られた種々の方法で、単子葉植物及び双子葉植物の両方の細胞を形質転換してもよい。多くの場合、そのような植物細胞を培養して、遺伝的に改変された植物の連続的な産生を与えるために実質的に複製する植物全体を再生してもよい。本発明に従って安定に遺伝的に改変された植物の例としては、アスペン、ポプラ、マツ及びユーカリのような樹木が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
（プロモーター及び終結配列）
種々の遺伝子プロモーター配列は技術的によく知られており、本発明のＤＮＡ構築物で使用することができる。本発明の構築物のプロモーターは、適宜に結合されたＤＮＡセグメントの発現を提供できる。また、プロモーターは誘発性であり、その結果遺伝子発現は外来性付加剤によってオン・オフできる。また、所望のＤＮＡセグメントと、植物における組織特異的発現又は発育上調節される遺伝子発現を提供するプロモーターとを組み合わせることは好ましい。
プロモーターは植物において操作するために知られるプロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓ、ＧＰＡＬ２、ＧＰＡＬ３及び所定の酵素の発現を調節する外来性植物プロモーターから選択してもよい。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら，１９８５）、又はＣａＭＶ１９Ｓ（Ｌａｗｔｏｎら，１９８７）のような構成プロモーターの使用は、ターゲット植物のすべての組織タイプにおける導入遺伝子の発現を促進するために使用できる。その他のプロモーターは、ｎｏｓ（Ｅｂｅｒｔら，１９８７）、Ａｄｈ（Ｗａｌｋｅｒら，１９８７）、スクロースシンターゼ（Ｙａｎｇら，１９９０）、α−チューブリン、ユビキチン、アクチン（Ｗａｎｇら，１９９２）、ｃａｂ（Ｓｕｌｌｉｖａｎら，１９８９）、ＰＥＰＣａｓｅ（Ｈｕｄｓｐｅｔｈら，１９８９）又はそれらと結合したＲ遺伝子複合体（Ｃｈａｎｄｌｅｒら，１９８９）である。一方、組織特異的プロモーターの使用は、より選択的に調節されるべき機能を与える。組織特異的プロモーターの使用は、その作用が要求される組織内にのみ所望の酵素が産生されるという利点を有する。導入遺伝の発現をリグニン化が生じる発育中の木部に限定するもののような組織特異的プロモーターは、適宜に本発明のＤＮＡ構築物で使用してもよい。
ＤＮＡセグメントは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２ｎｄｅｄ．（１９８２）に記載される標準的な方法によってプロモーターと結合できる。簡単に説明すると、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのようなプロモーターを含むプラスミドはＪｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）に記載される通りに構築することができ、又はＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得ることができる（例えば、ｐＢＩ１２１又はｐＢＩ２２１）。典型的には、これらのプラスミドは、プロモーターから下流の異なる制限酵素に対して特異性を有する複数のクローン部位を提供するために構築される。ＤＮＡセグメントは制限酵素を用いるプロモーターから下流にサブクローニングされて、ＤＮＡがプロモーターに関して適切な配向で挿入され、その結果ＤＮＡは発現できることを保証できる。
遺伝子終結配列は転写されるべきＤＮＡ配列の３’に位置する。技術的に知られる種々の遺伝子終結配列は本発明の構築物で使用してもよい。このようなものとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子終結配列が挙げられる（例えば、共通の出願人により２０００年１０月６日に出願された同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／００２７７０４ “ＭｅｔｈｏｄｔｏＩｎｔｒｏｄｕｃｅＭｕｌｔｉｐｌｅＧｅｎｅｓｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ”の参考文献を参照のこと（本願に引用して援用する））。
【００２２】
（マーカー遺伝子）
また、マーカー遺伝子は本発明のＤＮＡ構築物に組み込まれて、導入遺伝子のポジティブな組み込みを有する植物組織の選択を助けることができる。“マーカー遺伝子”は、マーカー遺伝子を発現する細胞に異なる表現形を与える遺伝子であり、こうしてマーカーを有しない細胞と区別されるべきそのような形質転換された細胞を与える。適したマーカー遺伝子の多くの例は技術的に知られており、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子を含まない形質転換されない植物組織を死滅させるカナマイシン又はハイグロマイシン抗生物質に対する耐性を与えるＮＴＰＩＩ遺伝子は、本発明の実施において使用できる（Ｂｅｖａｎら，１９８３）。本発明の方法で使用される多くのその他の具体的なマーカー遺伝子は、共通の出願人により２０００年１０月６日に出願された同時継続出願ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／００２７７０４ “ＭｅｔｈｏｄｔｏＩｎｔｒｏｄｕｃｅＭｕｌｔｉｐｌｅＧｅｎｅｓｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ”の表１に記載される（本願に引用して援用する）。
従って、当然のことながら、以下の議論は網羅的であるというよりも、具体例としてのものである。本明細書に開示される技術及び技術的に知られている不変的組換え技術を考慮して、本発明は、マーカー遺伝子を含む任意の遺伝子のレシピエント細胞への導入を可能にして、形質転換された植物を産生する。
【００２３】
（発現カセットにおいて必要に応じて選択してもよい配列）
また、本発明のＤＮＡ配列を含む発現カセットは、必要に応じてその他のＤＮＡ配列を含むことができる。エンハンサーの転写又はエンハンサーの複製を使用して、特定のプロモーターからの発現を増大できる。本発明に従って用いる新規組織特異的プロモーター配列を得ることを望む場合がある。これを達成するために、関係する組織由来のｃＤＮＡクローンを最初に分離し、例えばノーザンブロットを用いる組織において特異的に発現されるそれらクローンを同定する場合がある。理想的には、高コピー数に存在しない遺伝子を同定することを望むが、その遺伝子産物は特異的な組織で相対的に豊富である。次いで、プロモーター及び対応するゲノムクローンの制御成分は、当業者に知られた分子生物学の技術を用いて局在化してもよい。
トランスジェニック植物におけるある遺伝子の発現は、特異的な条件下でのみ生じる。環境に反応する多数の遺伝子が存在することが知られている。本発明のある実施態様において、トランスジェニック植物におけるＤＮＡセグメントの発現は、植物の発育中のある期間でのみ生じる。発育中のタイミングは、しばしば組織特異的遺伝子発現と相関する。
転写開始点とコード配列の起点の間に挿入されるＤＮＡ配列、すなわち非翻訳リーダー配列は、遺伝子発現に影響を及ぼすことができるために、また特定のリーダー配列を利用することができる。好ましいリーダー配列としては、付着遺伝子の最適発現を誘導するために、すなわち、ｍＲＮＡの安定性を増大又は維持し、翻訳の不適当な開始を防止することができる好ましいコンセンサスリーダー配列を含むために選択される配列を含むものが挙げられる（Ｊｏｓｈｉ，１９８７）。そのような配列は当業者に知られている。植物において高く発現される遺伝子に由来する配列が最も好ましい。
さらに、発現カセットを構成し、使用して、ＤＮＡセグメントの遺伝子産物を植物細胞内の細胞内区画を対象とし、又は蛋白質を細胞外環境に誘導することができる。これは、輸送又はシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡセグメントのコード配列と連結することによって、一般に達成できる。また、ＤＮＡセグメントは特定の細胞小器官、例えば細胞質よりも葉緑体に誘導される。
あるいは、輸送ペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、上で記載されたもののような輸送ペプチドの公知の配列の全体又は一部が化学的に合成されてもよい。発現カセットにおいて必要に応じて選択される配列の説明は、共通の出願人により２０００年１０月６日に出願された同時継続ＰＣＴ／ＵＳ／００２７７０４ “ＭｅｔｈｏｄｔｏＩｎｔｒｏｄｕｃｅＭｕｌｔｉｐｌｅＧｅｎｅｓｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ”に記載される（本願に引用して援用する）。
【００２４】
（形質転換）
植物、例えば樹木由来の細胞の形質転換、続いて、例えば技術的に知られたアグロバクテリウム媒介形質転換方法及びさらに本明細書に記載される方法を用いるトランスジェニック植物の産生は、外来性遺伝子を植物に導入する方法の一例である。本発明の方法は形質転換のその他のモードによって行うことができるが、アグロバクテリウム媒介形質転換方法が本明細書において例として引用される。例えば、トランスジェニック植物は以下の工程によって産生してもよい。（ｉ）アグロバクテリウムを低ｐＨ誘導培地中で、低温で培養する工程及び予め調整する工程、すなわち細菌を傷のついたタバコの葉抽出物と共培養して、その産物がＴ−ＤＮＡ導入に関係するアグロバクテリウムｖｉｒ遺伝子の高レベルの発現を誘導する工程、（ｉｉ）培養されたエクスプラント由来の接合体及び／又は体細胞胚組織を含む所望の植物組織エクスプラントを誘発されたアグロバクテリウムと共培養する工程、（ｉｉｉ）抗生物質を含む培地上で形質転換されたカルス組織を選別する工程、及び（ｉｖ）胚を血小板に転換する工程
安全化したＴｉプラスミドを宿している任意の非腫瘍形成性アグロバクテリウム（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株は本発明の方法で使用してもよい。任意のアグロバクテリウムシステムを使用してもよい。例えば、Ｔｉプラスミド／バイナリーベクターシステム又は１つのＴｉプラスミドを有する融合体（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターシステムを使用してもよい。また、形質転換細胞、カルス、胚又は植物を選別する能力を与える任意のマーカー遺伝子又はポリヌクレオチド及び例えば疾病に対する耐性を与える遺伝子のような任意のその他の遺伝子、又はリグニン含量又は構造又はセルロース含量を改良するものも、使用してもよい。当業者は、どのマーカー及び遺伝子を特別な要求に応じて使用するかを決定することができる。
【００２５】
細菌の感染力を高めるために、アグロバクテリウムを低ｐＨ誘導培地、すなわち４．５〜６．０、最も好ましくは約５．２に調整されたｐＨ値を有する任意の細菌培地で、例えば約１９〜３０℃、好ましくは約２１〜２６℃のような低温で培養する。低ｐＨ及び低温の条件はアグロバクテリウムにおける病原性活性を含む明確な重要な因子の一つである（例えば、Ａｌｔｍｏｒｂｅら，１９８９；Ｆｕｌｌｎｅｒら，１９９６；Ｆｕｌｌｎｅｒ及びＮｅｓｔｅｒ，１９９６）。
細菌を傷のついたタバコの葉抽出物（技術的に一般に知られている方法によって調製される）と共培養することによって予め調整して、アグロバクテリウムｖｉｒ遺伝子の高レベルの発現を誘導する。植物体細胞胚の接種前に、アグロバクテリウム細胞は、インビトロで成長させたタバコ植物の傷のついた葉組織から調製されるタバコ抽出物によって処理することができる。傷誘導代謝産物及びその他の細胞因子によってアグロバクテリウムｖｉｒ遺伝子の発現の最適刺激を達成するために、タバコの葉を傷つけ、一晩予め培養することができる。低ｐＨ培地及び低温での細菌の培養を使用して、さらに細菌ｖｉｒ遺伝子発現及び感染力を高めることができる。タバコ抽出物及びＴ−ＤＮＡ導入プロセスに関連したｖｉｒ遺伝子によって予め調整することは技術的に一般に知られている。
次いで、上述のアグロバクテリウム処理は、例えば接合体及び／又は体細胞胚組織のような植物組織エクスプラントによって共培養される。非接合体（すなわち体細胞）又は接合体組織を使用することができる。任意の植物組織をエクスプラント源として使用してもよい。例えば、種子由来の子葉、若葉組織、根組織、結節エクスプラントを含む茎の一部、及び根軸（ｒｏｏｔａｘｉｓ）のような１次体細胞胚由来の組織を使用してもよい。一般に、若い組織は好ましいエクスプラント源である。
上述の形質転換及び再生プロトコルはその他の植物種に対しても容易に適応できる。その他の発表された植物種の形質転換及び再生プロトコルとしては、Ｄａｎｅｋａｒら，１９８７；ＭｃＧｒａｎａｈａｎら，１９８８；ＭｃＧｒａｎａｈａｎら，１９９０；Ｃｈｅｎ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，１９９１；Ｓｕｌｌｉｖａｎら，１９９３；Ｈｕａｎｇら，１９９１；Ｗｉｌｄｅら，１９９２；Ｍｉｎｏｃｈａら，１９８６；Ｐａｒｓｏｎｓら，１９８６；Ｆｉｌｌａｔｔｉら，１９８７；Ｐｙｔｈｏｕｄら，１９８７；ＤｅＢｌｏｃｋ，１９９０；Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏら，１９９１；Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏら，１９９２；Ｈｏｗｅら，１９９１；Ｋｌｏｐｆｅｎｓｔｅｉｎら，１９９１；Ｌｅｐｌｅら，１９９２；及びＮｉｌｓｓｏｎら，１９９２が挙げられる。
【００２６】
（特徴）
再生植物のＤＮＡセグメント又は“導入遺伝子”の存在を確認するために、種々のアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイとしては、例えば当業者によく知られた“分子生物学的”アッセイ、例えばサザン及びノーザンブロット及びＰＣＲ；“生化学的”アッセイ、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）又は酵素作用によって蛋白質産物の存在の検出；植物パートアッセイ、例えば葉又は根アッセイが挙げられ、また再生植物全体の表現型を分析することによる。
【００２７】
１．ＤＮＡ組み込み、ＲＮＡ発現及び遺伝
ゲノムＤＮＡをカルス細胞株又は任意の植物部分から分離して、当業者によく知られた技術の使用によりＤＮＡセグメントの存在を決定してもよい。おそらく、細胞における配列の再配列又は欠失によって、無傷の配列が常に存在するわけではないことに注意されたい。
本発明の方法によって導入されるＤＮＡ成分の存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定してもよい。この方法を用いて、ＤＮＡの目立たないフラグメントが増幅され、ゲル電気泳動によって検出される。この種の分析により、ＤＮＡフラグメントが安定な形質転換細胞に存在するかどうかを決定することができるが、導入されたＤＮＡセグメントの宿主細胞ゲノムへの組み込みは示さない。さらに、ＰＣＲ方法を用いて、形質転換細胞がゲノムの異なる部分に導入された外来性遺伝子を有するかどうか、すなわち形質転換細胞が独立起源であるかどうかを決定することはできない。ＰＣＲ方法を用いて、導入ＤＮＡセグメントに隣接する宿主ゲノムＤＮＡのフラグメントをクローン化することは可能であると考えられる。
宿主ゲノムへのＤＮＡの組み込み及び形質転換細胞の独立した同一性の積極的な証拠は、サザンハイブリダイゼーション方法を用いて決定される。この方法を用いて、宿主ゲノムに導入され、宿主ＤＮＡ配列に隣接する特異的ＤＮＡ配列を同定することができる。それ故、与えられた形質転換細胞のサザンハイブリダイゼーションパターンはその形質転換細胞の特徴を同定する方法として役に立つ。さらに、サザンハイブリダイゼーションにより、高分子量ＤＮＡにおける導入ＤＮＡセグメントの存在を示すこと、すなわち導入ＤＮＡセグメントが宿主細胞ゲノムに組み込まれていることを確認することができる。サザンハイブリダイゼーション方法は、ＰＣＲを用いて得られる情報、例えばＤＮＡセグメントの存在を提供するが、またゲノムへの組み込みを示し、個々の形質転換細胞を特徴付ける。
【００２８】
サザンハイブリダイゼーション方法の改良であるドット又はスロットブロットハイブリダイゼーション方法を用いることによって、ＰＣＲから誘導される同じ情報、例えばＤＮＡセグメントの存在を得ることができると考えられる。
ＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーション方法の両方を使用して、ＤＮＡセグメントの子孫への伝達を示すことができる。ほとんどの場合、与えられた形質転換細胞の固有サザンハイブリダイゼーションパターンは、１つ以上のメンデル遺伝子として子孫において分離し（Ｓｐｅｎｃｅｒら，１９９２；Ｌａｕｒｓｅｎら，１９９４）、遺伝子の安定な遺伝を示す。
ＤＮＡ分析方法は植物の任意の部分から分離されたＤＮＡを用いて行ってもよいが、ＲＮＡは特定の細胞又は組織タイプにおいてのみ発現され、それ故これらの組織から分析用ＲＮＡを調製することが必要である。また、ＰＣＲ方法は導入ＤＮＡセグメントから産生されるＲＮＡの検出及び定量化のために使用してもよい。ＰＣＲのこの応用において、最初に、逆転写酵素のような酵素を用いて、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する必要があり、次いで従来のＰＣＲ方法の使用によりＤＮＡを増幅する。たいていの場合、ＰＣＲ方法は有用であるが、ＲＮＡ産物が完全であることを示さない。ＲＮＡ産物の性質についてのさらなる情報はノーザンブロットによって得てもよい。この方法はＲＮＡ種の存在を示し、そのＲＮＡが完全であることについての情報を与える。また、ＲＮＡ種の存在又は非存在は、ドット又はスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを用いて決定できる。これらの技術はノーザンブロットの改良であり、ＲＮＡ種の存在又は非存在のみを示す。
【００２９】
２．遺伝子発現
サザンブロット及びＰＣＲを使用して問題となっているＤＮＡセグメントを検出することができるが、それらはＤＮＡセグメントが発現しているかどうか等についての情報を提供しない。発現は、導入ＤＮＡセグメントの蛋白質産物を特異的に同定するか、又はその発現によって誘導される表現型の変化を評価することによって評価してもよい。
特異的蛋白質の産生及び同定用アッセイは、蛋白質の物理化学的、構造的、機能的、又はその他の特性を利用してもよい。特有の物理化学的又は構造的特性は、未変性又は変性ゲル電気泳動法又は等電点分離法のような電気泳動方法、又はイオン交換又はゲル排除クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法によって蛋白質を分離及び同定することを可能にする。また、個々の蛋白質の特有の構造は、ＥＬＩＳＡアッセイのようなフォーマットにおけるその存在を検出するために特定の抗体の使用の機会を与える。抗体を使用して電気泳動法によって分離された個々の遺伝子産物を位置付けるウエスタンブロット法のようなさらに大きな特異性を有するアプローチの組み合わせを使用してもよい。付加的な方法を使用して、精製後のアミノ酸配列による評価のような所定の産物の同一性を絶対的に確認してもよい。これらは最も一般的な手段（ｅｍｐｌｏｙｅｄ）であるが、その他の方法を付加的に使用してもよい。
また、アッセイ方法を使用して、その機能性、特に特定の基質及び産物に関係する特定の化学反応を触媒する酵素の能力によって蛋白質の発現を同定してもよい。これらの反応に続いて、反応の基質の減少又は生成物の生成を物理的又は化学的方法によって提供し、定量化してもよい。実施例は分析される酵素と同様に様々であり、フォスフィノスリシンから放射標識アセチル化フォスフィノスリシンを生成してＰＡＴ酵素活性のアッセイを含んでもよい。
しばしば、遺伝子産物の発現は、その発現の表現型の結果を評価することによって決定される。また、これらのアッセイは、植物の化学組成、形態、又は生理学的性質の変化を分析することを含む多くの形式をなしてもよいが、それらに限定されない。化学組成は、酵素又はアミノ酸組成を変更する貯蔵蛋白質をコードするＤＮＡセグメントの発現によって変えられてもよく、アミノ酸分析、又は近赤外反射率分光測定によって分析されてもよいデンプン含量を変える酵素によって検出してもよい。形態学的変化としては、より高い背丈、又はより密な茎（ｓｔａｌｋ）が挙げられる。ほとんどの場合、課された処理に対する植物又は植物の部分の応答における変化は、バイオアッセイと名付けられた慎重に調節された条件の下で評価される。
本発明は以下の非制限的実施例によってより詳細に記載される。
【００３０】
実施例１：トランスジェニックアスペンの調製
バイナリーベクターの構築
ｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔ４ＣＬ１−ａ：アスペン４ＣＬ１木部特異的プロモーター（Ｐｐｔ_４ＣＬ，１．１ｋｂ，ＧｅｎＢａｎｋＡＦ０４１０５１）を調製し、アンチセンス方向に配向させたアスペン４ＣＬ１ｃＤＮＡ（Ｐｔ４ＣＬ１，ＧｅｎＢａｎｋＡＦ０４１０４９）と連結した。次いで、アスペン４ＣＬ１プロモーター及びアンチセンスアスペン４ＣＬ１ｃＤＮＡを含むカセットを、図１に示すように、植物形質転換バイナリーベクターに配置した（ｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔ４ＣＬ１−ａ構築物）。
ｐＢＫＰｐｔ_４ｃｌＰｔＣＡｌｄ５Ｈ−ｓ：ｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔ４ＣＬ−ａ構築物から、アンチセンスＰｔ４ＣＬ１をセンス配向のＰｔＣＡｌｄ５ＨｃＤＮＡに置き換え、図２に示すｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔＣＡｌｄ５Ｈ−ｓ形質転換バイナリー構築物を得た。
また、２０００年１０月６日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ／００２７７０４“ＭｅｔｈｏｄｏｆＩｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇａＰｌｕｒａｌｉｔｙｏｆＧｅｎｅｓｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ”の実施例１には、トランスジェニック植物を調製するための多数のその他の遺伝子構築物が記載されている（本願に引用して援用する）。植物は、フェニルプロパノイド経路の遺伝子（すなわち、４ＣＬ、ＡＥＯＭＴ、ＣｏＡＯＭＴ、及びＣＡｌｄ５Ｈ）によって、相同的又は非相同的及び構成的又は組織特異的プロモーターと機能できるように連結されたものを用いて形質転換される。
【００３１】
バイナリーベクターのアグロバクテリウムへの組み込み
Ｔｓａｉら（１９９４，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，１４：９４−９７）に記載されるプロトコルに従って、アグロバクテリウムＣ５８／ｐＭＰ９０菌株をＬＢ中でゲンタマイシンの選択により２８℃で一晩増殖させた。１０，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離して細胞を収集した。細胞ペレットを０．５容積の氷冷した２０ｍＭのＣａＣｌ_２で洗浄し、再度遠心分離した。次いで、細胞を０．１容積の氷冷した２０ｍＭのＣａＣｌ_２にサンプルチューブ中で再懸濁した。約１μｇのバイナリーベクターＤＮＡを２００μＬの細胞懸濁液に加え、ピペットで取ることによって混合した。サンプルチューブを液体Ｎ_２中で５分間冷却し、３７℃で５分間、水浴中で解凍した。１ｍＬのＬＢ培地を加え、混合物を２８℃で３時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。２０μＬの細胞を２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートに散布し、２８℃で２日間インキュベートした。ＰＣＲ（増幅条件、循環パラメータ及びプライマーは以下に記載される。）を使用して、形質転換したコロニー中のベクター由来ＤＮＡの存在を検証した。
【００３２】
操作されたアグロバクテリウム菌株を介した複数の遺伝子によるアスペンの同時形質転換
複数の遺伝子、ｐＢＫＰｐｔ_４ｃｌＰｔ４ＣＬ−ａ及びｐＢＫＰｐｔ_４ｃｌＰｔＣａｌ５Ｈの同時形質転換のために、アグロバクテリウムクローンをＬＢ培地で、２８℃で一晩別個に培養した。アグロバクテリウム菌株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン及び２０μＭのアセトシリンゴン（ＤＭＳＯ中）を含む５０ｍＬのＬＢ（ｐＨ５．４）中に１００倍希釈することによって個別に継代培養し、２８℃で一晩振盪しながら増殖した。次いで、個別に培養したアグロバクテリウム菌株の同じ密度の等量を混合した。不稔性タバコ植物から削り取った葉を約５ｍｍ^２の大きさの小片にカットし、次いで葉円盤状組織（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）をアグロバクテリウム混合物中に５分間浸した。
過剰のアグロバクテリウム細胞を除去した後、処理した葉円盤状組織（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）をカルス誘導培地に置き（ＷＰＭ：木本培地，ＢＡ：６−ベンジルアデニン＋２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸；Ｔｓａｉら，１９９４，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，１４：９４−９７）、２日間培養した。次いで、予め培養した葉円盤状組織（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）を滅菌水で数回すすいで、アグロバクテリウム細胞を除去し、１ｍｇ／ｍＬのクラフォラン（ｃｌａｆｏｒａｎ）及び１ｍｇ／ｍＬのチカルシリン中で３時間振盪して洗浄し、アグロバクテリウムを死滅させた。短時間のブロット乾燥後、形質転換細胞の選択のために、予め培養し、洗浄した葉円盤状組織（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び３００μｇ／ｍＬのクラフォランを含むカルス誘導培地で培養した。２〜３継代培養後（１０日／継代培養）、葉円盤状組織（ｌｅａｆｄｉｓｃｓ）で増殖したカルスを削り取り、苗条（ｓｈｏｏｔ）を再生するために５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び３００μｇ／ｍｌのクラフォランを含む苗条誘導培地（ＷＰＭ＋ＴＤＺ：Ｎ−フェニル−Ｎ’−１，２，３−チアジアゾール−５−イル−ウレア）に移した。苗条を約０．５ｃｍの高さに成長させた後、それらを削り取り、発根培地（カナマイシン及びクラフォランを含むＷＰＭ）に植えた。約７ｃｍの高さの植物全体を土壌に移植し、続く分子特徴付けのために、温室に入れておいた。
【００３３】
ゲノムＤＮＡ分離
ゲノムＤＮＡをＨｕら（１９９８）に従って分離した。約１００ｍｇの若葉を温室で成長指せた各植物から収集し、液体Ｎ_２中ですり潰して、ＱＩＡＧＥＮ植物ＤＮＡ分離キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてＤＮＡを分離するために粉体状に細かくした。特異的に、粉末化組織を、２％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．４ＭのＮａＣｌ及び３０ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む抽出緩衝剤に５ｍＬ／ｇの組織で加えた。抽出混合物をチューブ中で、６０℃で１時間時々振盪してインキュベートした。１容積のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）を加え、緩やかに混合した。２つの相を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して分離した。水相を新しいチューブに移し、１％のＣＴＡＢ及び０．７ＭのＮａＣｌが存在するクロロホルムによって抽出した。ＤＮＡを２／３容積のイソプロパノールの添加により沈殿させ（−２０℃）、−２０℃で２０分間保持した。１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、ペレット化ＤＮＡを７０％のエタノール−１０ｍＭの酢酸アンモニアで洗浄した。次いで、ペレットを２ｍＬのＴＥ緩衝剤（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８）に溶解し、２μｇのＲＮａｓｅＡにより３７℃で２０分間処理した。ＤＮＡを２ｍＬの５Ｍ酢酸アンモニア及び１０ｍＬの９５％エタノールの添加により−２０℃で２０分間沈殿させた。遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。短時間の乾燥後、ゲノムＤＮＡをＴＥ緩衝剤に溶解した。
【００３４】
宿主植物ゲノムへの外来性遺伝子挿入のＰＣＲ検証
ＰＣＲを使用してトランスジェニック植物のゲノムへの遺伝子構築物の挿入を検証した。２つの特異的プライマーを各構築物について合成し、使用して、トランスジェニックアスペンのゲノム中の対応する構築物をＰＣＲ増幅した。ｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔ４ＣＬ１−ａ構築物の場合、４ＣＬｃＤＮＡフラグメントを増幅する２つの特異的プライマーを合成した。翻訳開始領域のＰｔ４ＣＬ１プロモーターセンスプライマー（５’ＣＡＧＧＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧ３’）（配列番号１１）及びＰｔ４ＣＬ１センスプライマー（５’ＡＴＧＡＡＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴ３’）（配列番号１２）。ｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔＣａｌｄ５Ｈ−ｓ構築物のＰＣＲ検証用プライマーは、翻訳終結領域のＰｔ４ＣＬ１プロモーターセンスプライマー（５’ＣＡＧＧＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧ３’）（配列番号１３）及びＰｔＣａｌｄ５Ｈアンチセンスプライマー（５’ＴＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧ３’）（配列番号１４）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）である。
ＰＣＲ反応混合物は、１００ｎｇの形質転換アスペンのゲノムＤＮＡ及び０．２μＭの各プライマー、１００μＭの各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、１×ＰＣＲ緩衝剤及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を５０μＬの合計体積中に含む。循環パラメータは以下の通りである：９４℃１分間、５６℃１分間（４ＣＬ及びＣＡｌｄ５Ｈの場合、又は使用したｃＤＮＡ鋳型間で、チェックした異なる遺伝子に従って変えることができる）及び７２℃２分間を、５分間７２℃で伸長と共に４０サイクル。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。
【００３５】
実施例２：その他のトランスジェニック植物の調製
本明細書で議論される、リグニン生合成経路に関連する植物遺伝子間の実質的なパーセンテージの配列相同性があることを認識することが重要である。この実質的な配列相同性は、本明細書で開示される本発明の方法がリグニン生合成経路に関連した必須の遺伝子を有するすべての植物に適用できるようにする。植物遺伝子間の実質的な配列相同性を示すために、パーセンテージ配列相同性を表にして、例えばＣａｌｄ５Ｈ遺伝子（表１）、ＡｌｄＯＭＴ遺伝子（表２）、ＣＡＤ遺伝子（表３）、及び４ＣＬ遺伝子（図１２を参照のこと。）を示す。従って、本明細書に記載される本発明の方法を用いることによって、すべての植物においてリグニンモノマー組成を変え、Ｓ／Ｇリグニン比を増大し、及びセルロース含量を増大することが可能である。
【００３６】
【表１】
表１
１）アスペン；２）ポプラ，ＡＪ０１０３２４；３）モミジバフウ，ＡＦ１３９５３２；４）シロイヌナズナ（フェルラ酸５−ヒドロキシラーゼ，Ｆ５Ｈ）由来の植物コニフェリルアルデヒド５−ヒドロキシラーゼ（ＣＡｌｄ５Ｈ）の蛋白質配列相同性（％）

【００３７】
【表２】
表２
１）アスペン，Ｘ６２０９６；２）ポプラ，Ｍ７３４３１；３）アーモンド，Ｘ８３２１７；４）イチゴ，ＡＦ２２０４９１；５）アルファルファ，Ｍ６３８５３；６）ユーカリ，Ｘ７４８１４；７）サンジソウ（Ｃｌａｒｋｉａｂｒｅｗｅｒｉ），ＡＦ００６００９；８）モミジバフウ，ＡＦ１３９５３３；９）シロイヌナズナ，Ｕ７０４２４；１０）タバコ，Ｘ７４４５２；１１）ブドウ，ＡＦ２３９７４０由来の植物ＡｌｄＯＭＴの蛋白質配列相同性（％）

【００３８】
【表３】
表３
１）アスペン，ＡＦ２１７９５７；２）ハコヤナギ，Ｚ１９５６８及び３）ウド，Ｄ１３９９１；４）タバコ，Ｘ６２３４３；５）タバコ，Ｘ６２３４４；６）ユーカリ，ＡＦ０３８５６１；７）ユーカリ，Ｘ６５６３１；８）アルファルファ（Ｌｕｃｅｒｎｅ），ＡＦ０８３３３２；９）アルファルファ（Ｌｕｃｅｒｎｅ），Ｚ１９５７３；１０）トウモロコシ，ＡＪ００５７０２；１１）トウモロコシ，Ｙ１３７３３；１２）サトウキビ，ＡＪ２３１１３５；１３）ラジアータマツ，Ｕ６２３９４；１４）テーダマツ，Ｚ３７９９２；１５）テーダマツ，Ｚ３７９９１；１６）ドイツトウヒ，Ｘ７２６７５由来の植物ＣＡＤの蛋白質配列相同性（％）

【００３９】
種々の外来性遺伝子の導入における本発明の汎用性及び草本種以外の植物への本発明の適応性をさらに示すために、異なるバイナリーベクターを作成し、アスペン（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）樹木に導入した。それぞれｃＤＮＡ配列及びカナマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）ｃＤＮＡを含む２つのバイナリーベクターを作成した。次いで、各ベクターをアグロバクテリウム菌株Ｃ５８に個別に移動して、２つの分離された（操作された）アグロバクテリウム菌株を産生した。注目すべきは、２０００年１０月６日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴＵＳ００２７７０４“ＭｅｔｈｏｄｔｏＩｎｔｒｏｄｕｃｅＭｕｌｔｉｐｌｅＧｅｎｅｓｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ”に記載されるように（本願に引用して援用する）、外来性遺伝子の４つの異なる組を含む約５０のトランスジェニックタバコ植物が同じ技術によって生成されたことである。
表４には、トランスジェニックアスペンの４ＣＬ及びＣＡｌｄ５Ｈの木部特異的発現を同時に操作することから生じる数値的結果をまとめる。本発明の方法によって示されるアグロバクテリウム媒介形質転換によって、ＤＮＡ構築物を植物細胞に組み込んだ後、かつ、導入遺伝子の組み込みのＰＣＲ確認後、１４のポジティブトランスジェニック樹木をランダムに選択し、３つの異なるトランスジェニックグループ、すなわちグループＩ、ＩＩ及びＩＩＩとした。グループＩ（植物＃２１、２２、２３、２５、及び３７）は、アンチセンスＰｔ４ＣＬ１ｃＤＮＡのみの組み込みを有するものから構成される（表４）。グループＩＩ植物（＃３２、８４、９３、及び９４）はセンスＰｔＣＡｌｄ５ＨｃＤＮＡのみを含むが、グループＩＩＩ植物（＃７１、７２、７４、及び１４１）はアンチセンスＰｔ４ＣＬ１及びセンスＰｔＣＡｌｄ５Ｈ導入遺伝子の両方を含む。次いで、これらのトランスジェニック樹木を、そのリグニン及びセルロース含量及びリグニンＳ／Ｇ比についてさらに分析した（表４）。コントロール、非形質転換アスペンと比較した場合、アンチセンスＰｔ４ＣＬ１導入遺伝子による４ＣＬ遺伝子の抑制のために操作されたトランスジェニック植物（＃２１、２２、２３、２５、及び３７）は、そのセルロース含量の有意な増加によって、そのリグニン含量の劇的な減少を有することが明かである。センスＰｔＣＡｌｄ５Ｈ導入遺伝子によってＣＡｌｄ５Ｈの過剰発現のために操作されたトランスジェニック植物（＃３２、８４、９３、及び１０８）は、そのＳ／Ｇ比の明かな増加を示したが、そのリグニン及びセルロース含量は本質的に影響されないままであった。４ＣＬ遺伝子の抑制及びＣＡｌｄ５Ｈ遺伝子の過剰発現を同時に操作した場合、すべてのトランスジェニック植物（＃７１、７２、７４、及び１４１）は低リグニン含量、高Ｓ／Ｇ比及び高セルロース量を示した。要約すると、これらの結果は、個別にアグロバクテリウム菌株によって運ばれる複数の遺伝子を植物ゲノム中に同時に組み込むことができることを示す。
さらに、以下に示すように、Ｓ／Ｇ比の有意な増加に加えて、セルロース含量の約３０％の増加及び５０％を超えるリグニン量の低下を有するトランスジェニック植物を容易に生成できることが示された。また、より多くの遺伝子を一度に効率的に導入できると考えられる。ただ１つの適したマーカー遺伝子がこのシステムで必要とされるが、複数のマーカー遺伝子も利用することができる。
【００４０】
【表４】

【００４１】
実施例３：形質転換植物における商業的に所望される農業形質の産生
以下の形質転換は植物における商業的に所望される農業形質の産生を示す。
裸子植物
Ａ．裸子植物におけるシリンギル富化リグニンを産生するために、裸子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ、及びＡｌｄＯＭＴ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら３つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｂ．裸子植物における減少したリグニン含量、増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比及び増加したセルロース量を産生するために、裸子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ及びＡｌｄＯＭＴ遺伝子及びセンス又はアンチセンス配向の４ＣＬ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら４つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｃ．裸子植物における減少したリグニン含量、増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比及び増加したセルロース量を産生するために、裸子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ及びＡｌｄＯＭＴ遺伝子及びセンス又はアンチセンス配向の４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら５つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｄ．裸子植物における増加したリグニン含量を産生するために、裸子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向の４ＣＬ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。
Ｅ．裸子植物における増加したリグニン含量及び増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比を産生するために、裸子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及び４ＣＬ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら４つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｆ．裸子植物における増加したリグニン含量、増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比を産生するために、裸子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及び４ＣＬ遺伝子及びアンチセンス配向のＣＡＤ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら４つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
【００４２】
被子植物
Ａ．被子植物における増加したＳ／Ｇリグニン比を産生するために、被子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、又はＳＡＤ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら３つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｂ．被子植物における減少したリグニン含量、増加したＳ／Ｇリグニン比及び増加したセルロース量を産生するために、被子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ、又はＡｌｄＯＭＴ遺伝子及びセンス又はアンチセンス配向の４ＣＬ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら４つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｃ．被子植物における減少したリグニン含量、増加したＳ／Ｇリグニン比及び増加したセルロース量を産生するために、被子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ、又はＡｌｄＯＭＴ遺伝子及びセンス又はアンチセンス配向の４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら５つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｄ．被子植物における増加したリグニン含量を産生するために、被子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向の４ＣＬ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。
Ｅ．被子植物における増加したリグニン含量及び増加したＳ／Ｇ比を産生するために、被子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向の４ＣＬ遺伝子及び、またセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ、又はＡｌｄＯＭＴ遺伝子のいずれかで、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら４つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
Ｆ．被子植物における増加したリグニン含量及び増加したＳ／Ｇ比を産生するために、被子植物を任意の適したプロモーターによって誘導されるセンス配向の４ＣＬ遺伝子及び、またセンス配向のＳＡＤ、ＣＡｌｄ５Ｈ、又はＡｌｄＯＭＴ遺伝子のいずれか、及びアンチセンス配向のＣＡＤ遺伝子で、任意の適した形質転換システムにより形質転換される。これら４つの遺伝子は、同時に（１つ又は別個の構築物で）、又は任意の順に連続的に（別個の構築物で）宿主植物に導入できる。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願を本願に引用して援用する。先の明細書において、本発明がそのある好ましい実施態様に関して記載されている場合、及び多くの詳細な説明が例示を目的として示されている場合、本発明が追加の実施態様であってもよく、いくつかの本明細書の詳細な説明が本発明の基本的な原理から離れることなしにかなり変えられてもよいことは、当業者にとって明かであろう。従って、本発明は、特許請求の範囲で認められる広い解釈によってのみ制限される。
【００４３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】コニフェリルアルコール及びシナピルアルコール産生の植物モノリグノール経路の概略図である。
【図２Ａ】ＳＡＤポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号１）である。
【図２Ｂ】ＳＡＤアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図３Ａ】ＣＡｌｄ５ＨポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号３）である。
【図３Ｂ】ＣＡｌｄ５Ｈアミノ酸配列（配列番号４）である。
【図４Ａ】ＡｌｄＯＭＴポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号５）である。
【図４Ｂ】ＡｌｄＯＭＴアミノ酸配列（配列番号６）である。
【図５Ａ】４ＣＬポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号７）である。
【図５Ｂ】４ＣＬアミノ酸配列（配列番号１０）である。
【図６Ａ】ＣＡＤポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号８）である。
【図６Ｂ】ＣＡＤアミノ酸配列（配列番号９）である。
【図７】ＤＮＡ構築物、ｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔ４ＣＬ１−ａのマップであり、植物形質転換バイナリーベクター中に位置する。
【図８】ＤＮＡ構築物、ｐＢＫＰｐｔ_４ＣＬＰｔＣＡｌｄ５Ｈ−ｓのマップであり、植物形質転換バイナリーベクター中に位置する。
【図９】植物の代表種のＡｌｄＯＭＴの蛋白質配列アラインメントである。
【図１０】植物の代表種のＣＡＤの蛋白質配列アラインメントである。
【図１１】植物の代表種のＣＡｌｄ５Ｈの蛋白質配列アラインメントである。
【図１２】植物の代表種の４ＣＬの蛋白質配列アラインメントである。

Claims

フェニルプロパノイド経路由来の複数の遺伝子で同時に植物を形質転換する方法であって、４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及びＳＡＤ、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される複数の遺伝を植物のゲノムに組み込んで変化した農業形質を示す植物を産生することを含む前記方法。
ゲノムに組み込まれた遺伝子がセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント又はそれらの組み合わせであり、非形質転換植物と比較して植物中の増加したシリンギルリグニンを産生する、請求項１に記載の方法。
ゲノムに組み込まれた遺伝子がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメント及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント又はそれらの組み合わせであり、非形質転換植物と比較して植物中の４ＣＬ遺伝子発現を下方制御する、請求項１に記載の方法。
４ＣＬの下方制御が非形質転換植物と比較して減少したリグニン含量、増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比及び増加したセルロース含量と相関する、請求項３に記載の方法。
ゲノムに組み込まれた遺伝子がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子又は実質的に類似のそれらのフラグメント及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント又はそれらの組み合わせであり、非形質転換植物と比較して植物中の４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子発現を下方制御する、請求項１に記載の方法。
４ＣＬ及びＣＡＤの下方制御が非形質転換植物と比較して減少したリグニン含量、増加したＳ／Ｇリグニン比及び増加したセルロース含量と相関する、請求項５に記載の方法。
植物のゲノムに組み込まれた遺伝子がセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメントであり、非形質転換植物と比較して植物中の４ＣＬ遺伝子発現を上方制御する、請求項１に記載の方法。
４ＣＬ遺伝子を上方制御が非形質転換植物と比較して植物中の増加したリグニン含量と相関する、請求項７に記載の方法。
植物のゲノムに組み込まれた遺伝子がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント又はそれらの組み合わせであり、４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子発現を上方制御する、請求項１に記載の方法。
４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子の上方制御が非形質転換植物と比較して増加するリグニン含量及び増加するＳ／Ｇ比と相関する、請求項９に記載の方法。
植物のゲノムに組み込まれる遺伝子がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント又はそれらの組み合わせ及びアンチセンス配向でＣＡＤ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメントであり、非形質転換植物と比較して植物中の４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子発現を上方制御し、ＣＡＤ遺伝子発現を下方制御する、請求項１に記載の方法。
４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子発現の上方制御及びＣＡＤ遺伝子発現の下方制御が非形質転換植物と比較して増加したリグニン含量及び増加したＳ／Ｇ比と相関する、請求項１１に記載の方法。
植物が被子植物又は裸子植物である、請求項２に記載の方法。
植物が被子植物又は裸子植物である、請求項３に記載の方法。
植物が被子植物又は裸子植物である、請求項５に記載の方法。
そのゲノム中に複数のＤＮＡ構築物を有する植物細胞を調製する方法であって、
ａ）細胞のゲノムに複数のＤＮＡ構築物を組み込んで形質転換細胞を得る工程、ここで各構築物は、４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及びＳＡＤ、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質コードし、細胞中で機能するプロモーター配列と機能できるように連結されたポリヌクレオチド配列及び終結配列を含み、
ｂ）形質転換植物細胞を同定する工程、ここでそのゲノムは異なるＤＮＡ構築物由来のＤＮＡによって増加することを含む前記方法。
蛋白質の発現が植物細胞の農業形質と関連する、請求項１６に記載の方法。
形質がリグニン生合成、セルロース生合成、生育、木材品質、ストレス抵抗性、不稔性、子実収量又は栄養価である、請求項１７に記載の方法。
さらに、同定された形質転換植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得る工程を含む請求項１６に記載の方法。
植物細胞が再生可能である、請求項１６に記載の方法。
植物細胞が樹木細胞である、請求項１６に記載の方法。
植物細胞が被子植物細胞である、請求項１６に記載の方法。
植物細胞が裸子植物細胞である、請求項１６に記載の方法。
変化したリグニン及びセルロース組成を有するトランスジェニック植物を調製する方法であって、
ａ）複数のＤＮＡ構築物を有する植物のゲノムを準備して形質転換植物細胞を得る工程、ここで各構築物は、４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及びＳＡＤ、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列及び終結配列を含み、該ポリヌクレオチド配列は植物細胞中で機能するプロモーター配列と機能できるように連結され、
ｂ）形質転換植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得る工程、ここでそのゲノムは異なるＤＮＡ構築物由来のＤＮＡによって増加し、及び
ｃ）植物中のリグニン及びセルロース組成を変えるのに効果的な量でトランスジェニック植物の細胞中のＤＮＡ構築物を発現させる工程を含む前記方法。
プロモーター配列が構造的又は組織特異的である、請求項２４に記載の植物。
プロモーター配列が相同的又は非相同的である、請求項２４に記載の植物。
プロモーター配列が木部における転写を提供する、請求項２４に記載の植物。
植物が植物細胞、植物器官、又は植物全体である、請求項２４に記載の方法。
植物が植物果実、種子及びその子孫である、請求項２４に記載の方法。
植物が樹木である、請求項２４に記載の方法。
植物が被子植物である、請求項２４に記載の方法。
植物が裸子植物である、請求項２４に記載の方法。
請求項２４に記載の方法によって調製されたトランスジェニック植物。
請求項３２に記載のトランスジェニック植物の子孫植物。
ａ）樹木のゲノムに複数の所望のＤＮＡ構築物を組み込んで形質転換樹木細胞を産生する工程、ここで各構築物は４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及びＳＡＤ、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をコードし、細胞中で機能するプロモーター配列と機能できるように連結されたポリヌクレオチド配列及び終結配列を含み；
ｂ）形質転換樹木細胞を再生してトランスジェニック樹木を得る工程、ここでそのゲノムは複数のＤＮＡ構築物によって増加し；及び
ｃ）樹木のリグニン及びセルロース組成を変えるのに効果的な量でトランスジェニック樹木の細胞中のＤＮＡ構築物を発現させる工程を含むトランスジェニック樹木を調製する方法。
請求項３４に記載の方法によって調製されたトランスジェニック樹木。
トランスジェニック樹木がクェーキングアスペンである、請求項３４に記載の方法。
４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及びＳＡＤ、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される蛋白質をコードし、プロモーター配列と機能できるように連結されたポリヌクレオチド配列及び終結配列を含むＤＮＡ構築物をそのゲノムに組み込んだ植物。
プロモーター配列が構造的又は組織特異的である、請求項３８に記載の植物。
プロモーター配列が相同的又は非相同的である、請求項３８に記載の植物。
プロモーター配列が木部において転写を提供する、請求項３８に記載の植物。
樹木である請求項３８に記載の植物。
植物が裸子植物である、請求項３８に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して増加したシリンギルリグニンを生じる、請求項４３に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメント及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、及び実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して減少したリグニン含量、増加したシリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比及び増加したセルロース含量を生じる、請求項４３に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子又は実質的に類似のそれらのフラグメント及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して減少したリグニン含量、増加したＳ／Ｇリグニン比及び増加したセルロース含量を生じる、請求項４３に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメントをコードし、非形質転換植物と比較して増加したリグニン含量を生じる、請求項４３に記載の植物。
ゲノムに組み込まれるポリヌクレオチド配列がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせであり、非形質転換植物と比較して増加したリグニン含量及び増加したＳ／Ｇリグニン比を生じる、請求項４３に記載の植物。
ポリヌクレオチド配列がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせ及びアンチセンス配向でＣＡＤ遺伝子、又は実質的に類似のそのフラグメントをコードし、非形質転換植物と比較して増加したリグニン含量及び増加したＳ／Ｇリグニン比を生じる、請求項４３に記載の植物。
植物が被子植物である、請求項３８に記載の植物。
ポリヌクレオチド配列がセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して増加したＳ／Ｇリグニン比を生じる、請求項５０に記載の植物。
ポリヌクレオチド配列がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメント、及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して減少したリグニン含量、増加したＳ／Ｇリグニン比及び増加したセルロース含量を生じる、請求項５１に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子又は実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせ及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して減少したリグニン含量、増加したＳ／Ｇリグニン比及び増加したセルロース含量を生じる、請求項５０に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメントをコードし、非形質転換植物と比較して増加したリグニン含量を生じる、請求項５０に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して増加したリグニン含量及び増加したＳ／Ｇ比を生じる、請求項５０に記載の植物。
ヌクレオチド配列がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせ、及びアンチセンス配向でＣＡＤ遺伝子、実質的に類似のそのフラグメント、及びその組み合わせをコードし、非形質転換植物と比較して増加したリグニン含量及び増加したＳ／Ｇ比を生じる、請求項５０に記載の植物。
各ＤＮＡ構築物が５’−３’方向に、
ａ）遺伝子プロモーター配列、
ｂ）遺伝子終結配列、及び
ｃ）リグニン生合成経路に関連した４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、ＣＡＤ、及びＳＡＤ、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列であって、プロモーター及び終結配列と機能できるように連結された前記ポリヌクレオチド配列を含む、複数のＤＮＡ構築物群。
遺伝子プロモーター配列が構造的又は組織特異的プロモーターである、請求項５７に記載の複数のＤＮＡ構築物群。
遺伝子プロモーター配列が相同的又は比相同的である、請求項５７に記載の複数のＤＮＡ構築物群。
遺伝子プロモーター配列が木部特異的である、請求項５７に記載の複数のＤＮＡ構築物群。
裸子植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含んでいて、非形質転換植物と比較してシリンギルリグニンを産生する、前記複数のＤＮＡ構築物群。
裸子植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメント及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせを含んでいて、非形質転換植物と比較してリグニン含量を減少させ、シリンギル／グアイアシル（Ｓ／Ｇ）リグニン比を増加させ、セルロース含量を増加させる、前記複数のＤＮＡ構築物群。
裸子植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子又は実質的に類似のそれらのフラグメント及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせを含んでいて、非形質転換植物と比較してリグニン含量を減少させ、Ｓ／Ｇリグニン比を増加させ、セルロース含量を増加させる、前記複数のＤＮＡ構築物群。
センス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメントを含んでいて、非形質転換植物と比較してリグニン含量を増加させる、植物のゲノムに組み込まれるＤＮＡ構築物。
植物が被子植物又は裸子植物である、請求項６３に記載のＤＮＡ構築物。
植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント又はそれらの組み合わせを含んでいて、非形質転換植物と比較してリグニン含量を増加させ、Ｓ／Ｇ比を増加させる、前記複数のＤＮＡ構築物群。
植物が被子植物又は裸子植物である、請求項６５に記載の複数のＤＮＡ構築物群。
植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス配向で４ＣＬ、ＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせ及びアンチセンス配向でＣＡＤ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメントを含んでいて、非形質転換植物と比較してリグニン含量を増加させ、Ｓ／Ｇ比を増加させる、前記複数のＤＮＡ構築物群。
植物が被子植物又は裸子植物である、請求項６７に記載の複数のＤＮＡ構築物群。
被子植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント及びそれらの組み合わせを含んでいて、非形質転換植物と比較して高いＳ／Ｇリグニン比を誘導する、前記複数のＤＮＡ構築物群。
被子植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ遺伝子又は実質的に類似のそのフラグメント及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせを含んでいて、非形質転換植物と比較してリグニン含量を減少させ、Ｓ／Ｇリグニン比を増加させ、セルロース含量を増加させる、前記複数のＤＮＡ構築物群。
被子植物のゲノムに組み込まれる複数のＤＮＡ構築物群であって、構築物がセンス又はアンチセンス配向で４ＣＬ及びＣＡＤ遺伝子、実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせ及びセンス配向でＣＡｌｄ５Ｈ、ＡｌｄＯＭＴ、及びＳＡＤ遺伝子、又は実質的に類似のそれらのフラグメント、及びそれらの組み合わせを含んでいて、非形質転換植物と比較してリグニン含量を減少させ、Ｓ／Ｇリグニン比を増加させ、セルロース含量を増加させる、前記複数のＤＮＡ構築物群。