JP6224030B2 - フルクタン生合成の修飾、植物バイオマスの増大、および植物における生化学的経路の生産性を増強する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、植物におけるフルクタン生合成の修飾に、さらに詳細には、光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法に、そして関連の核酸および構築物に関する。
フルクタンは、ある種の水溶性の炭水化物であって、その主な機能は、植物の成長にとって容易に利用可能なエネルギー貯蔵をもたらすことである。フルクタンは草類における種々の有利な特徴、例えば、耐寒性および乾燥耐性、分げつ生残の増大、持続性の向上、切断または放牧後の良好な再成長、ストレスからの回復の改善、早春の成長、ならびに栄養質の増大に関連する。
従来技術に関係する困難および不足のうちの1つ以上を克服するかまたは少なくとも軽減することが本発明の目的である。
出願人らは、光合成細胞におけるフルクタン生合成経路の空間的再プログラミングによって、植物、例えば、飼料草を栄養的に向上させるか、および/または植物バイオマスを増大することが可能であることを見出している。このプロセスを用いれば、家畜によって主に食べられ、かつ正常にはフルクタンを蓄積し得ない植物の器官である葉身でのフルクタン蓄積を駆動することが可能である。従って、フルクタン(特に高い程度の重合化を呈するもの(「高DPフルクタン」))の蓄積によって、動物が草を摂食するのにさらに利用可能な栄養が得られる。フルクタンは茎および葉鞘において蓄積し、葉のフルクタンはCO2同化作用が増殖をしのぐ期間にのみ形成する。飼料草は、スクロースが合成される光合成細胞でフルクタン遺伝子を発現することによって栄養的に増強され得、これによってフルクタン蓄積は葉身で優先的に駆動して、草を摂食する家畜にさらにエネルギーを供給する。
非極性:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
非荷電極性:Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:Lys、Arg、His
他の保存的アミノ酸置換もまた、以下のとおり作製され得る:
芳香族:Phe、Tyr、His
プロトン供与体:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトン受容体;Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
特に好ましいフラグメントおよび改変体としては、1つ以上の保存的スクロース結合/加水分解ドメインが挙げられる。このようなドメインの例は、本明細書の図17、図18および図36に示される、例えば、(N/S)DP(N)G、FRDPおよびEC(I)D。
非極性:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
非荷電極性:Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性:Asp、Glu
塩基性:Lys、Arg、His
他の保存的アミノ酸置換もまた、以下のとおり作製され得る:
芳香族:Phe、Tyr、His
プロトン供与体:Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトン受容体;Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln
特に好ましいフラグメントおよび改変体としては、1つ以上の保存的スクロース結合/加水分解ドメインが挙げられる。このようなドメインの例は、本明細書の図17、図18および図36に示される、例えば、(N/S)DP(N)G、FRDPおよびEC(I)D。
・光合成プロモーターは、葉身、上の茎および外の茎を含む細胞の大きい群(55%を超える細胞)で活性である;
・それらは、スクロース産生細胞(葉肉細胞および実質性維管束鞘細胞)で活性である;
・それらの発現パターンはスクロース蓄積と時間的におよび空間的に重複する;
・フルクトシルトランスフェラーゼ活性は、ソースからスクロースを取り出し、それによって光合成に対するフィードバック抑制を妨げ、そしてCO2固定の増大を促進し得る。
本発明は、添付の実施例および図面を参照してここでさらに詳細に記載される。しかし、以下の説明は、例示でしかなく、上記の本発明の一般性を限定するとは決してとられるべきではないことが理解されるべきである。
光合成プロモーターの単離
パンコムギ由来の光合成のプロモーターのクローニング
リブロース−1,5−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ小サブユニット(RbcS)は、より高等な植物で十分特徴付けられた光調節性遺伝子である。パンコムギ(Triticum aestivum)、TaRbcS調節性配列(プロモーターおよびターミネーター)は、以前にクローニングされている(Zeng,ら、1995;Sasanuma,2001)。TaRbcS遺伝子(NCBIアクセッション番号AB042069)由来のTATAシグナルを含む以前に公開された配列由来の695bpのプロモーターフラグメントを、PCR増幅した。
Arabidopsis thalianaのリブロース−1,5−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ小サブユニット(AtRbcS)プロモーター配列の1700bpのフラグメントは、以前にクローニングされている。プライマーは、発現ベクターでの使用のためにAtRbcSプロモーター由来のTATAシグナルを含む、より小さいフラグメントを増幅するように設計される。
RbcSおよびクロロフィルa/b結合タンパク質(CAB)の発現は、高等植物で十分特徴付けられた光調節性遺伝子である。定量的なリアルタイムPCRによるペレニアルライグラスにおけるLpRbcS mRNA転写物の豊富さは、図2に図示される。
ティグは、公開されたLpRbcSのcDNA配列に対して相同であることが特定され、そして13個のコンティグがLpCABのcDNA配列と相同であることが見出された。2つのコンティグである、LPCL9_C359(LpRbcS)およびLpCL1112_C12(LpCAB)(単離されるべきプロモーターの遺伝子に相当する)は、それぞれ、(47)および(19)のEST配列を含んだ。これらの配列は、ある範囲の種々の組織に相当する種々のライブラリー由来であった。このデータをインシリコの発現分析に用いて、両方の遺伝子が光合成組織でのみ発現されることが示された(図3)。
フルクタン生合成遺伝子の単離
Lolium perenne由来のフルクタン生合成遺伝子の単離
Lp1−SSTおよびLp6G−FFTの配列をコードするLolium perenneのcDNAクローンは、ペレニアルライグラスのcDNAライブラリーから以前に単離されている(Chalmers,ら、2003;Chalmers,ら、2005)。単離されたペレニアルライグラスフルクトシルトランスフェラーゼ相同体の完全遺伝子配列が利用可能であり、かつLp1−SSTのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、国際特許出願PCT AU01/00705(配列番号11および12)に開示される。
、国際特許PCT/AU/01/01275の配列番号109および110に開示されている。全長クローンは、cDNAからPCR増幅し、クローニングして、配列決定した(図7)。Lp6G−FFT ORFを、L.perenne由来の公開されたLp6G−FFTと比較して、23個のヌクレオチド変化を記した。予想されるタンパク質配列の比較によって、2つのアミノ酸配列の間の2つの変化のみが明らかになった(図8)。
翻訳的なFT融合タンパク質の作製
FT翻訳的なFT融合物のクローニング
遺伝子FT融合は、図11に示される手順に従って、Lp1−SSTとLp6G−FFTのオープンリーディングフレームの間で作製した。Lp1−SST遺伝子は、フォワードプライマー中に組み込まれたGATEWAY組み換え部位でPCR増幅された。3つのグリシン残基続いてHindIII部位をコードする配列を、終止コドンを除去した、リバースプライマー中に組み込んだ。Lp6G−FFT遺伝子は、HindIII部位、続いて3つのグリシン残基をコードする配列およびATGなしの遺伝子特異的配列でPCR増幅した。Lp6G−FFT遺伝子のリバースプライマーは、第二のGATEWAY組み換え部位に隣接した。プライマー配列を表2に示す。精製されたフラグメントをHind IIIで消化して、連結された産物をInvitrogen GATEWAY pDONR221エントリー(Entry)ベクター中にクローニングした。得られたpENTRY1−Lp1−SST−Lp6G−FFT−2エントリークローンを配列決定した場合、1つの配列(FT融合物1)が、2つの遺伝子を連結するリンカー中に8つのアミノ酸を有する、予想産物であることを確認した(図12および13)。一方で、別の配列(FT融合物3)は、2つの連続したHind III部位を含み、この部位が別の2つのアミノ酸の付加を生じ、これが翻訳の際に2つのFT遺伝子の間の全部で10個のアミノ酸を生じる(図14および15)。
植物FTは、グリコシド加水分解酵素ファミリー32(GH32)のメンバーであり、かつモチーフ(N/S)DPNG(b−フルクトシダーゼモチーフとも呼ばれる)、RDPおよびECによって特徴付けられる3つの高度に保存された領域を共有する、液胞、酸インベルターゼ(b−フルクトシダーゼ)に対して高い程度のアミノ酸相同性を有する(Altenbachら、2005)(図17、図18および図36)。植物FTおよび液胞インベルターゼの別の共通の特徴は、それらが翻訳後プロセシングに起因して大きいサブユニットおよび小さいサブユニットから構成されるということである。上記の3つ全ての保存されたモチーフを保有する大きいサブユニットは、触媒的な特異性を決定する(Altenbachら、2004)。
・Lp6G−FFT::Lp1−SST
・Lp1−SST::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)
・(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::Lp1−SST
三連のFT融合物はまた、類似の方法論を用いて作製され得る(図16B)。三連の融合物が、遺伝子Lp1−SST、Lp6G−FFTおよびLp1−FFT、Lp6−SFTまたはLp6−SSTを組み込むように構築されることが提唱される。2つのFT遺伝子を一緒に連結するために用いられるプライマー配列を変更することによって、リンカーの大きさを変化することおよび最大約30個までのアミノ酸を可能性として追加することが可能になる。FTタンパク質は、お互いと物理的に会合して、代謝チャネルを形成し得、従ってこの翻訳的な融合物内のFT遺伝子を隔てる距離がタンパク質機能に影響し得る。FT融合タンパク質は好ましくは、図17、図18および図36に示されるLolium perenne植物由来のFT、INVおよびFEHタンパク質の間で高度に保存されているドメインに相当する配列を含む。
フルクタン生合成遺伝子機能の一時的アッセイ
Lp1−SST、Lp6G−FFTおよびFT融合タンパク質の機能
Lp1−SST成熟タンパク質をコードするcDNA配列は、Pichia pastorisにおいて機能的な特徴付けのために以前に発現されており(Chalmers,ら、2003)、そしてこのタンパク質の発現によって、スクロースが1−ケストースへ変換することが実証された。同様に、Lp6G−FFTのcDNAを、機能的な特徴付けのための単離のために組み換えタンパク質の分泌を可能にする、メタノール誘導性プロモーターおよびSaccharomyces cerevisiae α因子配列を含む発現ベクターpPICZαA(Invitrogen)中にクローニングした。この組み換えLp6G−FFT酵素は、事前培養培地へ接種され、45時間にわたってメタノールの添加によって誘導された形質転換されたP.pastorisの単一のコロニーから産生された。この上清を濃縮して、サンプルを100mMのスクロースとともに一晩インキュベートした。産生された炭水化物を、コントロールとしてタマネギ由来のフルクタン抽出物を用いて、Chalmersら、2003に従って、HPAECによって分析した(図19)。
多数のベクターを、組み換えクローニングに基づくInvitrogen Multisite Gateway(商標)テクノロジー(製品のマニュアルについては、www.Invitrogen.comを参照のこと)を用いて構築した。この方法論は、組み換え部位に隣接する、プロモーター、目的の遺伝子(gene of interest)(GOI)、またはターミネーター配列のいずれかを含む、個々のエントリー(Entry)プラスミドの生成に依拠する。この組み換え部位によって、組み換えによる、Gateway可能デスティネーション・ベクターへのエントリー・プラスミドの各々の方向性の三重の挿入が容易になる。次いで、最終のベクターを配列決定して、プラスミドまたは発現カセット(植物の選択マーカーの発現のため)で植物を同時形質転換するために直接用いる。
・pPZP200−35S2::Lp6G−FFT::TaRbcS
・pPZP200−35S2::Lp1−SST::TaRbcS
・pPZP200−35S2::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::TaRbcS
・pPZP200−35S2::Lp1−SST::6G−FFT::TaRbcS(FT融合物1および3)
・pPZP200−35S2::GUS::TaRbcS
Invitrogen Multisite Gateway(商標)Technologyを利用して、Atrbcs光合成プロモーターおよび(CAMV)35Sターミネーターを一時的アッセイにおける使用のために含む以下のベクターを作製する。
・pPZP200−AtrbcS::Lp1−SST::35S
・pPZP200−AtrbcS::Lp6G−FFT::35S
・pPZP200−AtrbcS::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::35S
・pPZP200−AtrbcS::Lp1−SST::6G−FFT::35S(FT融合物1および3)
一時的な導入遺伝子発現アッセイにおけるLp1−SST、Lp6G−FFTおよびFT融合タンパク質の機能
機能証明(proof−of−function)のために、(CaMV)35Sプロモーターによって駆動されるキメラLp1−SST、Lp6G−FFTおよびFT融合タンパク質遺伝子を含む構築物の一時的発現を、タバコ植物で行った。なぜならタバコは天然にはフルクタンを産生しないからである。この方法は、N.benthamianaの葉への個々の構築物の土壌浸潤(Agro−infiltration)(Kapila,ら、1997;Wydro,ら、2006)、続いて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる生化学的分析を包含した。一時的発現手順のダイアグラムは、図21に示される。注射の3日後、植物物質を回収して、水溶性の炭水化物を、熱水抽出法を用いて抽出した。その抽出物を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)を用いて分離した。その結果、フルクタンの産生が示され、ここではFT融合タンパク質による1−ケストースおよび6G−ケストースの両方の産生の増大があった(図22)。等価な実験を用いて、AtRbcSプロモーターによって駆動される、キメラのLp1−SST、Lp6G−FFTおよびFT融合タンパク質遺伝子を含む機能構築物を評価する。
細胞中で転写的に一緒に共同する場合、フルクタン生合成の機能を評価するために、三重の土壌浸潤実験を、下に概説するベクターの群を用いて行う。図21に示されるような一時的発現手順を用いて、3つのベクターを一緒に同じ植物組織に挿入する。注射の3日後、植物物質を回収して、熱水抽出法を用いて水溶性の炭水化物を抽出する。その抽出物を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)を用いて分離する。その結果、この植物ゲノム中の3つのフルクタン生合成遺伝子の独立した発現から生じる相違が示される。
・pPZP200−35S2::Lp6G−FFT::TaRbcS+
・pPZP200−35S2::Lp1−SST::TaRbcS+
・pPZP200−35S2::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::TaRbcS
・pPZP200−AtRbcS::Lp1−SST::35S+
・pPZP200−AtRbcS::Lp6G−FFT::35S+
・pPZP200−AtRbcS::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::35S
翻訳的な同時形質転換のためのFT融合ベクターを用いる土壌浸潤
転写的な同時形質転換に対して比較することによって、以前に考察されておりかつ下に示されているベクター内の一時的アッセイを行うことにより、翻訳的な同時形質転換を比較するための実験を行う。
・pPZP200−35S2::Lp1−SST_6G−FFT::TaRbcS(FT融合物1および3)
・pPZP200−AtRbcS::Lp1−SST_6G−FFT::35S(FT融合物1および3)
(実施例5)
トランスジェニック植物の安定な形質転換および産生のためのベクターの生成
微粒子銃およびAgrobacterium媒介性形質転換のためのLXR(登録商標)ベクターの産生
LXR(登録商標)テクノロジーは、AtMYB32遺伝子プロモーターの制御下に葉の老化の遅延についてイソペンテニルトランスフェラーゼ(IPT)をコードする1つのサイトキニン生合成遺伝子を含むベクターに基づく。微粒子銃形質転換(biolistic transformation)のためのLXR(登録商標)ベクターは、Gateway(商標)Multisiteテクノロジーを利用して構築した。バイナリー・ベクターpBS−ubi::bar::nos_AtMYB32_IPT_35Sの詳細は、国際特許出願PCT/AU01/01092に記載されている。
TaRbcS遺伝子(NCBIアクセッション番号AB042069)由来のTATAシグナルを含む以前に公開された配列由来の695kbのプロモーターフラグメントを、プライマーに隣接するGateway(商標)(Invitrogen)組み換え部位でPCR増幅した。このフラグメントを、Gateway(商標)組み換えテクノロジーを用いてInvitrogen pDONRP4−P1Rエントリー(Entry)ベクター中にクローニングした。696bpのTaRbcS遺伝子終止シグナル配列(Sasanuma,2001)をまた、組み換え部位でプライマーを用いてPCR増幅し、Invitrogen pDONRP2−P3Rエントリー・ベクター中にクローニングした。クローニングされたフラグメントを、配列を確認して、pDEST−R4R3デスティネーション・ベクター:pDESTR1−R2R−Lp1−SST、pDESTR1−R2−Lp6G−FFT、およびpDESTP1−P2R−Lp1−SST_Lp6G−FFT遺伝子FT融合物発現ベクターへの、クローニングされたGOI cDNA配列での3方向組み換えクローニングに用いた。用いられるべきTaRbcSプロモーターによるフルクトシルトランスフェラーゼの発現の光合成調節のための以下の構築物は、下に概説されており、かつ図23にグラフで示される。pDEST−TaRbcS::Lp1−SST::TaRbcS、pDEST−TaRbcS::Lp6G−FFT::TaRbcSおよびpDEST−TaRbcS::Lp1−SST_Lp6G−FFT::TaRbcS FT融合物1および3の発現カセット配列は、図24〜27に示される。
・pDEST−TaRbcS::Lp1−SST−TaRbcS
・pDEST−TaRbcS::Lp6G−FFT−TaRbcS
・pDEST−TaRbcS::Lp1−SST_Lp6G−FFT::TaRbcS FT融合物1および3
・pDEST−TaRbcS::GUS::TaRbcS
ドクムギ(ライグラス)光合成プロモーターを含む構築物
ドクムギ(ライグラス)光合成プロモーターを含む構築物を、従来のクローニング方法によって産生した。693塩基対(bp)のフルクトシルトランスフェラーゼ4遺伝子(LpFT4)終止配列(Lidgett,ら、2002)を、フォワードPCRプライマーの5’末端に制限エンドヌクレアーゼ(RE)部位EcoR Iを含む遺伝子特異的なプライマーを用いてPCRによって増幅した。EcoR VおよびXma Iエンドヌクレアーゼ制限部位を、リバースPCRプライマーの3’末端に組み込んだ。PCR産物を、pBlueScript SK(−)ベクターDNA(Short,ら、1988)のEcoR IおよびXma I制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングして、プラスミドpBS−LpFT4を得た(図28)。
・pBS−LpRbcS::Lp1−SST::LpFT4
・pBS−LpCAB::Lp6G−FFT::LpFT4
・pBS−LpRbcS::Lp1−SST_Lp6G−FFT::LpFT4 FT融合物1および3
Arabidopsis光合成のプロモーターを含む構築物
FT融合物3の発現を駆動するArabidopsis光合成プロモーターを含む構築物を、Multisite Gatewayクローニング方法−pPZP200_AtRbcS::Lp1−SST_6G−FFT::35S FT融合物3(図37)を用いて産生した。AtRbcS::Lp1−SST_6G−FFT::nos FT融合物3発現カセットの配列を図38に示す。
トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン(Ubi)遺伝子のプロモーターおよび最初のイントロンを含む構築物(Christensenら、1992)を、従来のクローニング方法によって生成した。Ubiプロモーターは、構成的プロモーターであるとみなされるが、発現は、若い活発に成長している草組織で最高である(Rookeら、2000)。
・p−Ubi::Lp1−SST::35S
・p−Ubi::Lp6G−FFT::35S
・p−Ubi::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::35S
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを含む構築物
強化されたカリフラワーモザイクウイルス(CAMV)35S2プロモーター(Kay,ら、1987)の制御下でフルクトシルトランスフェラーゼの発現を調節するための構築物は、前の節に記載され、かつ下に概説される。
・pPZP200−35S2::Lp6G−FFT::TaRbcS
・pPZP200−35S2::Lp1−SST::TaRbcS
・pPZP200−35S2::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::TaRbcS
・pPZP200−35S2::Lp1−SST_6G−FFT::TaRbcS FT融合物1および3
組織特異的プロモーターまたは調節性プロモーターを含む構築物
組織特異性を有するプロモーターは、特定の組織/器官における蓄積を標的し、それ以外の位置の望ましくない発現を回避するように作物中の導入遺伝子の発現を駆動することが望ましい。異なる目標のための導入遺伝子発現を駆動する種々のプロモーターの例は表5に示す。FT融合物に連結された、構成的(Ubi、(CAMV)35S2、RUBQ2、OsAct1)、塊茎および走根特異的な(Cathlnh)、ストレス調節性の(Atrd29a)およびスクロース反応性の(14−3−3タンパク質ファミリー16R)のプロモーターの代表例をそれぞれ図42〜図48に示す。
以下のベクターを、単独でまたはグループ(二重および三重)で形質転換して、低DPフルクタンおよび高DPフルクタンの生成のために必要な同時発現の相乗的な応答を評価する。
・pDEST−TaRbcS::Lp1−SST::TaRbcS
・pBS−LpRbcS::Lp1−SST::LpFT4
・p−Ubi::Lp1−SST::35S
・pPZP200−35S2::Lp1−SST::TaRbcS
・pDEST−TaRbcS::Lp6G−FFT::TaRbcS
・pBS−LpCAB::Lp6G−FFT::LpFT4
・p−Ubi::Lp6G−FFT::35S
・pPZP200−35S2::Lp6G−FFT::TaRbcS
・pDEST−TaRbcS::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::TaRbcS
・p−Ubi::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::35S
・pPZP200−35S2::(Lp1−FFT/Lp6−SFT/Lp−SST)::TaRbcS
翻訳的な同時形質転換のためにFT融合物ベクターを用いる
上記で示されるような転写的な同時形質転換と比較するために、翻訳的な同時形質転換の実験をまた、以前に考察されかつ下に示されるFT融合物ベクターを用いて行う。
・pDEST−TaRbcS::Lp1−SST_Lp6G−FFT::TaRbcS FT融合物1および3
・pBS−LpRbcS::Lp1−SST_Lp6G−FFT::LpFT4 FT融合物1および3
・pPZP200−35S2::Lp1−SST_6G−FFT::TaRbcS FT融合物1および3
(実施例6)
形質転換による安定なトランスジェニック植物の産生
植物の形質転換
本発明の遺伝子構築物は、形質導入、トランスフェクション、形質転換または遺伝子標的によって植物細胞中に導入され得る。このような技術としては、Agrobacterium媒介性の導入、組織のエレクトロポレーション、細胞およびプロトプラスト、プロトプラスト融合物、生殖器官への注入、未熟胚への注入、ならびに細胞、組織、カルス、未熟および成熟胚への高速入射導入(high velocity projectile introduction)、細胞およびプロトプラストへのマイクロインジェクション、プロトプラストへのポリエチレングリコール媒介性直接遺伝子移入、微粒子銃形質転換、ウィスカー形質転換、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。技術の選択は、形質転換されるべき植物のタイプに大きく依存し、かつ選択される方法に適切なベクターが用いられる。
プラスミド全体を用いる粒子ボンバードメントによって、候補遺伝子は植物ゲノムに挿入され、それによってベクター骨格配列もゲノムに組み込まれ得る。トランスジェニック植物組織は、選択剤を含む組織培養培地上での生存によって回収される。
Agrobacterium媒介性形質転換では、土壌細菌Agrobacterium tumefaciensの天然の病原性活性を利用する。A.tumefaciensは、双子葉植物の根および茎に感染し、これによって、感染した植物細胞のゲノムへの特異的な遺伝子(T−DNA)の挿入により、腫瘍誘発性(Ti)プラスミドによって指向される感染が生じる。候補遺伝子を、Tiプラスミドに基づくバイナリー・ベクターを用いるAgrobacterium媒介性の形質転換によって植物ゲノムに挿入した。
トランスジェニックの多年生牧草の産生
光合成プロモーターを含む構築物の使用
個々のフルクタン遺伝子の発現を、またはFT翻訳的な融合物として駆動するTaRbcSおよびLpRbcS調節性配列を含むベクター、ならびにハイグロマイシン耐性のpAcH1ベクターでのペレニアルライグラスの微粒子銃同時形質転換を、ペレニアルライグラスについて胚発生カルスで行った。pAcH1ベクターは、以前に構築され、かつ植物形質転換実験に首尾よく用いられている(Bilang,ら、1991;Spangenberg,ら、1995a;Spangenberg,ら、1995b;Ye,ら、1997;Bai,ら、2001)。GUSマーカー遺伝子をまた、陽性コントロールとしてクローニングした。表6は、これらの株の生成のための形質転換および分子分析をまとめている。
トランスジェニックの多年生牧草の特徴付け
トランスジェニックのFTおよびFT融合ペレニアルライグラス植物の特徴付け
トランスジェニックのペレニアルライグラス植物の再生の間、株の間で成長の表現型の相違が注目された。FT融合物1およびFT融合物3のトランスジェニック植物の両方に由来する両方の組織培養物再生体および対応する土壌成長植物とも、単一のフルクタン生合成遺伝子を含むトランスジェニック植物、または選択マーカーhphのみを含むコントロール植物に比較して優れた成長能力の表現型を示した。組織培養物におけるトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の表現型の例は、図48〜51で、TaRbcSプロモーターおよびLpRbcS FT融合トランスジェニックについて示している。
FT融合およびLXR(登録商標)テクノロジーの同時形質転換によって、増強された成長表現型が得られた。ガラス温室条件下で成長させた植物は、コントロールのおよびLXR(登録商標)単独のトランスジェニック植物に比較して、増大した数の分げつおよび増強された根のバイオマスを示した(図65)。
L.perenne調節性配列(FT翻訳的融合物を駆動する)を含むベクターおよびハイグロマイシン耐性のためのpAcH1発現カセットを用いて、ヒロハノウシノケグサ草の形質転換を行った。ガラス温室条件下で成長させたトランスジェニックのヒロハノウシノケグサ植物は、コントロールのトランスジェニック植物に比べて分げつ数の増大および根バイオマスの増強を示した(図66)。
LpRbcS FT融合物3単独、TaRbcS FT融合物3単独、およびTaRbcS FT融合物3プラスLXR(登録商標)テクノロジー(AtMYB32::IPT)を一緒に発現するヒロハノウシノケグサ(Lolium arundinaceum cv Jesup S3)植物を産生した。表9はこれらの株の作製のための形質転換および分子分析をまとめている。
トランスジェニックのコムギ植物の産生
単一のフルクタン遺伝子またはFT翻訳的な融合物を発現する光調節性プロモーターの形質転換
個々のフルクタン遺伝子の発現を、または翻訳的なFT融合物として駆動する光合成プロモーター調節性配列を含むベクター、およびグルホシネート耐性のためのキメラUbi::bar::nos選択マーカー遺伝子を含むベクター(pAcH25)を用いるコムギの微粒子銃同時形質転換をコムギ胚発生カルスで行った。
形質転換ベクターを、グルホシネート耐性のためのキメラUbi::bar::nos選択マーカー遺伝子でキメラAtMYB32::IPT::35Sを含むコムギの微粒子銃形質転換のために構築した。LXR(登録商標)ベクターでのコムギの遺伝子形質転換は、国際特許出願PCT/AU01/01092に記載されるようなTriticum aestivum L Bobwhite 26 コムギ株由来の胚発生カルスの微粒子銃形質転換に基づいた。候補遺伝子を、プラスミド全体を用いて微粒子銃によってコムギのゲノム中に挿入し、これによってベクター骨格配列をまたゲノム中に組み込んでもよい。トランスジェニック植物組織は、選択因子を含む組織培養培地での生存によって回収した。
延長のためのトランスジェニック植物の産生
上記で概説された方法を用いて、光合成細胞における再プログラミングされたフルクタン生合成および光合成細胞の寿命延長のための、光調節性プロモーターによって駆動されるフルクタン生合成遺伝子およびLXR(登録商標)テクノロジーの両方を含むトランスジェニック植物を生成した。表8は、これらのトランスジェニック植物の作製のための形質転換および分子分析をまとめている。
トランスジェニックのコムギ植物の特徴付け
トランスジェニックFT融合コムギ植物の特徴付け
トランスジェニックのコムギ植物の再生の間、インビトロの成長表現型の相違が注目された。FT融合物1およびFT融合物3の両方のトランスジェニック植物に由来する組織培養物の再生によって、コントロールの植物に比較して優れた活発な表現型が示された。
LXR(登録商標)テクノロジー構築物を含むトランスジェニックのコムギ植物は、ガラス温室条件下のコントロールの植物に比較した場合、分げつの数の増大を示した(図73A)。それらはまた、ガラス温室条件下で35日後、光合成組織の増大を示した(図73B)。
トランスジェニックのPaspalum dilatatum植物の産生
葉の老化の遅延のためのAtMYB32プロモーターの制御下のIPT遺伝子の形質転換
Paspalum dilatatum(単為生殖のダリスグラス(dallisgrass))の遺伝子形質転換は、国際特許出願PCT/AU01/01092に記載のとおり微粒子銃形質転換に基づく。
光合成調節性フルクタン生合成遺伝子でのPaspalum dilatatumの遺伝子形質転換は、LXR(登録商標)のトランスジェニックのPaspalum dilatatum植物を産生するために用いたのと同じ方法を用いて行う。
トランスジェニックPaspalum dilatatum植物の特徴付け
LXR(登録商標)のトランスジェニックの植物は、優れた成長の表現型を示す。
トランスジェニックの双子葉植物の産生
LXR(登録商標)およびFT融合物プラスLXR(登録商標)双子葉植物の形質転換
FT融合物およびLXR(登録商標)テクノロジーを含むバイナリー・ベクターを、双子葉植物のAgrobacterium媒介性形質転換のために生成した。形質転換ベクターはまた、選択マーカー遺伝子としてキメラ35S::nptll::35Sまたは35S::hph::35Sも含んだ。
LXR(登録商標)テクノロジー単独(AtMYB3::IPT)、AtRbcS::Lp1−SST_Lp6G−FFT::35S FT融合物単独、ならびにLXR(登録商標)テクノロジーおよびAtRbcS::Lp1−SST_Lp6G−FFT::35S FT融合物を一緒に発現するトランスジェニックシロツメグサ(Trifolium repens)およびArabidopsis thalianaの植物を産生した(図77および80)。表11および12は、それぞれ、これらの株の生成のための形質転換および分子分析をまとめている。
定量的RT−PCRを用いて、形質転換体を確認し、かつ選択された株でのAtRbcS FT融合物の発現レベルを検出した(図78)。導入遺伝子の発現を示しているこれらの株はまた、増大したレベルのフルクタンを示した(図68B)。コントロールの株では発現は検出されなかった(図78)。
定量的なRT−PCRを用いて、形質転換体を確認し、選択した株におけるAtRbcS FT融合物の発現レベルを検出した(図81)。土壌中で成長したトランスジェニックのT2FT融合Arabidopsis植物を図82に示す。目的の遺伝子が陰性の植物(GOI−ve)もまた提示され、かつ導入遺伝子を発現することが示されているFT融合トランスジェニック植物に対して表現型の相違を示さない。
トランスジェニックの双子葉植物の特徴付け
トランスジェニックのLXR(登録商標)双子葉植物の特徴付け
AtMYB32プロモーターの機能的に活性なフラグメントを用いて、国際特許出願PCT/AU01/01092に記載されるように、トランスジェニックのシロツメグサおよびキャノーラ植物においてIPT発現を駆動した。双子葉植物においてLXR(登録商標)テクノロジーから観察された結果は、葉の老化の遅延;葉の成長動態の増強;ほふく枝死の減少;バイオマス産生の増強;累積緑葉面積の増大;種子収率の増大;乾燥耐性の増強;遮光耐性の増大;増強した第一胃発酵動態によって反映される牧草の質の向上、および乾物消化率の向上であった。
光合成細胞におけるフルクタン生合成を再プログラミングするため、およびこれらの光合成細胞の寿命を延長するためのトランスジェニック植物の産生
上記で概説された方法を用いて、光合成細胞におけるフルクタン生合成を再プログラミングするための光調節性、光合成プロモーターの制御下のフルクタン生合成遺伝子(FT融合遺伝子を含むFT)および光合成細胞の寿命延長のためのAtMYB32プロモーターで駆動されるIPT遺伝子の同時発現を通じたおよびLXR(登録商標)テクノロジーの両方を含むトランスジェニックの植物を生成した。
インビトロでトランスジェニック植物を特定するための選択ツールとしての特有の成長
表現型の使用
トランスジェニックのFT融合物1またはFT融合物3の植物の優れた成長表現型が、形質転換された全ての植物タイプ(例えば、ペレニアルライグラスおよびコムギ)で観察された。ドクムギ(ライグラス)およびコムギの両方で、これはプレート中で行われた植物再生の早期段階の間で最初に観察された。抗生物質選択なしで行う実験では、強力な苗条誘導が、ボンバードメント後にカルスを暗野条件に8週間保持した段階で観察された(図84A〜C)。プレートを光条件に移した後(移行7日後)、強力な苗条誘導がトランスジェニック植物で観察され、かなり低レベルの苗条再生がコントロール植物で検出された(図84D〜F)。
1.光合成プロモーター+hph選択マーカーによって調節されるFT融合物
2.LXR(登録商標)プラスhph選択マーカー
3.光合成プロモータープラスLXR(登録商標)プラスhph選択マーカーによって調節されるFT融合物
トランスジェニックについての抗生物質培地での選択を行い、各々の二重または三重の同時形質転換事象についての導入遺伝子の存在を決定し、これによって各々の事象について同時形質転換の効率の数が得られる。
1.光合成プロモーター+dsREDマーカーによって調製されるFT融合物
2.LXR(登録商標)プラスdsREDマーカー
3.光合成プロモータープラスLXR(登録商標)プラスdsREDマーカーによって調節されるFT融合物
苗条および/または根の成長速度の増大についての選択を行い、各々の二重または三重の同時形質転換事象についての導入遺伝子の存在を決定する。dsREDマーカー遺伝子の存在は、蛍光の可視化によって容易に決定され、これによって形質転換事象の各々についての同時形質転換の効率を決定することが補助される。選択マーカーの有無で決定した同時形質転換の効率の比較によって、選択ツールとして優れた表現型を用いることの効率を確立することが補助される。
Claims (14)
- 植物中のフルクタン生合成経路の生産性を増強する、または植物中のフルクタン生合成を増強することによりバイオマスを増強する方法であって、前記植物中に、1−SST、1−FFT、6−SFTおよび6G−FFTからなる群より選択される2つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を導入する工程を含み、前記核酸が連結されて、前記2つ以上の酵素の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を形成する、方法。
- 前記2つ以上のフルクタン生合成酵素が、1−SST、1−FFT、6−SFTおよび6G−FFTからなる群より選択され、前記植物がLoliumまたはTriticum種のものである、請求項1に記載の方法。
- 植物中のフルクタン生合成経路の生産性を増強し得る、または植物中のフルクタン生合成を増強することによりバイオマスを増強し得る遺伝子構築物であって、1−SST、1−FFT、6−SFTおよび6G−FFTからなる群より選択される2つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含み、前記核酸が連結されて、前記2つ以上の酵素の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を形成する、遺伝子構築物。
- 前記2つ以上のフルクタン生合成酵素が、1−SST、1−FFT、6−SFTおよび6G−FFTからなる群より選択され、前記植物がLoliumまたはTriticum種のものである、請求項3に記載の遺伝子構築物。
- 請求項3または4に記載の遺伝子構築物を含む、形質転換されていないコントロールの植物に対して修飾されたフルクタン生合成特徴または増強されたバイオマスを有する、トランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも10%の増大したバイオマスを有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも20%の増大したバイオマスを有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも30%の増大したバイオマスを有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも40%の増大したバイオマスを有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも10%の増大した可溶性の炭水化物を有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも20%の増大した可溶性の炭水化物を有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも30%の増大した可溶性の炭水化物を有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも40%の増大した可溶性の炭水化物を有する、請求項5に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
- 請求項1または2に記載の方法により生産された、生合成経路の増強した生産性、または増強したバイオマスを有する植物。
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