KR100780476B1 - 애기장대 ＡｔＰＦＰα1 프로모터 및 상기 프로모터로형질전환된 식물 - Google Patents

애기장대 ＡｔＰＦＰα1 프로모터 및 상기 프로모터로형질전환된 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase) α1(AtPFP α1) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물, 상기 식물의 종자 및 상기 형질전환 식물의 제조 방법에 관한 것이다.
애기장대, AtPFPα1, 프로모터, 식물, 형질전환, GUS

Description

애기장대 ＡｔＰＦＰα1 프로모터 및 상기 프로모터로 형질전환된 식물{Arabidopsis thaliana AtPFPα1 promoter and plant transformed with the same}
도 1은 본 발명에 이용된 AtPFPα1(상단) 유전자 및 AtPFPα1 유전자를 갖는 프로모터::GUS 융합 벡터의 게놈 구조(하단)를 나타낸다.
도 2는 AtPFP α1:: GUS 형질전환 식물에서 GUS 유전자 발현을 나타낸다. AtPFP α1:: GUS 식물의 묘목(seedling) (a) 및 꽃 (b). 막대기, 1 mm. G, 암술; P, 꽃잎, Se, 꽃받침; St, 수술.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate : fructose -6-phosphate 1- phosphotransferase) α1(AtPFP α1) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물, 상기 식물의 종자 및 상기 형질전환 식물의 제조 방법에 관한 것이 다.
세포질에서 주요 탄수화물 대사 동안, 프럭토오스-6-포스페이트 (Fru-6-P) 및 프럭토오스-1,6-비스포스페이트 (Fru-1,6-bisP) 사이의 전환은 해당과정 및 글루코스신합성 양자에서 율속 단계이다. 상기 반응은 많은 고등 식물에서 2가지 기작에 의해 촉매된다 (Carlisle et al., (1990) J Biol Chem 265:18366-18371; Nielsen et al., (2004) Trends Plant Sci 9:556-563; Nielsen and Stitt (2001) Planta 214:106-116; Todd et al., (1995) Gene 152:181-186). 상기 기작 중의 하나는 2가지 효소, 즉, Fru-6-P의 Fru-1,6-bisP로의 해당과정 전환을 촉매하는 ATP-의존성 포스포프럭토키나아제 (PFK), 및 역 글루코스신합성 반응을 촉매하는 세포질 프럭토오스-1,6-비스포스파타아제(FBPase)에 의해 조절된다.
대안적인 경로로, 양방향 효소인 피로포스페이트:프럭토오스-6-포스페이트 1-포스포트랜스퍼라아제(PFP)는 가역 반응을 촉매한다. 식물은 PFP 및 PFK 양자를 포함하는 반면, 박테리아 및 원생동물은 둘 중에 하나를 포함하나, 양자를 포함하지는 않으며, 효모 및 동물은 단지 PFK를 이용한다 (Alves et al., (1996) J Bacteriol 178:149-155; Mertens E (1990) Mol Biochem Parasitol 40:147-149).
PFP는 다양한 식물 조직에 존재하며, 이의 활성은 PFK의 활성과 동일하거나 또는 종종 초과한다. 그러나, PFP의 정확한 기능 및 중요성은 여전히 불명확하며 논쟁의 여지가 있다. 식물 대사 동안 PFP의 중요성에 대한 간접적인 증거로서, 상기 효소의 활성은 발생 단계 및 성장 조건에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 지금까지, PFP의 다양한 역할은 또한 수개의 경로, 예를 들면, 해당과정 (Hajirezaei et al., (1994) Planta 192:16-30), 글루코스신합성 (Fahrendorf et al., (1987) Plant Physiol 84:182-187), 헥소오스- 및 트리오스-포스페이트 풀의 평형화 (Dennis and Greyson (1987) Physiol Plant 69:395-404), 및 스트레스 조건에 대한 일반적인 적응력 (Black et al., (1987) Physiol Plant 69:387-394)에서 제안되어 왔다.
많은 식물 조직에 존재하는 PFP의 천연 형태는 독특한 α 및 β 서브유닛으로 이루어진 복수 형태, 통상적으로 β2 및 α2β2로 존재한다(Kruger & Dennis (1987) Arch Biochem Biophys 256:273-279; Wang & Shi (1999) FEBS Lett 459:448-452). 또한, β 서브유닛은 촉매 자리를 가지는 반면, α 서브유닛은 프럭토오스-2,6-비스포스페이트 (Fru-2,6-bisP)의 촉매 활성을 조절한다. Fru-2,6-bisP는 PFP를 활성화시키나, 세포질 FBPase를 강력하게 저해하여, Fru-6-P 및 Fru-1,6-bisP 사이의 유동을 조절한다.
애기장대 게놈은 각각 AtPFP α1 및 AtPFP α2, AtPFP β1 및 AtPFP β2로 표시되는 2개의 PFP α 및 2개의 PFP β 유전자를 가지고 있는 것 같다(Nielsen et al., (2004) Trends Plant Sci 9:556-563).
본 발명에서는 AtPFP α1 유전자의 프로모터 서열을 분리하였으며, 상기 서열이 애기장대의 모든 조직에서 AtPFP α1 유전자의 정상적인 발현을 유도한다는 것을 보여주었다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase) α1(AtPFPα1) 유전자의 프로모터를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환된 식물의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate : fructose -6- phosphate 1-phosphotransferase) α1(AtPFPα1) 유전자의 프로모터를 제공한다.
애기장대 게놈은 AtPFPα1 및 AtPFPα2의 2개의 PFPα 유전자를 가지고 있는데, 본 발명에서는 AtPFPα1 유전자의 프로모터를 분리하였다. 상기 프로모터를 분리하기 위해, 애기장대 게놈 DNA를 주형으로 하여, 하기 실시예에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 2177bp의 AtPFPα1의 5' 상류 단편을 분리하였으며, 이는 AtPFPα1 유전자의 엑손 1, 인트론 1 및 엑손 2의 일부를 포함한다. 2177 bp 중에서 AtPFPα1 의 프로모터는 ( 1629 )bp 이며, 이의 서열은 서열번호 1에 기재하였다 .
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 상류 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 유전자에서, 상기 프로모터는 애기장대의 모든 조직, 바람직하게는 잎, 뿌리, 또는 꽃 조직에서 발현될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 유전자에서, AtPFPα1 유전자의 프로모터는 서열번호 1의 염기 서열을 포함한다. 또한, 상기 프로모터는 서열번호 1의 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 AtPFP α1 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서는 식물 발현 벡터 중의 하나인 pBI101.1 벡터를 이용하였다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 진핵세포 배양에 대해 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성을 포함한다. 가장 널리 이용되는 식물 형질전환 마커는 Tn5로부터 분리된 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(nptII) 유전자이며, 또 다른 마커 유전자는 항생제 하이그 로마이신에 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 노팔린 신타아제(NOS) 또는 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다. 본 발명에서는 NOS 터미네이터를 이용하였다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다. 상기 식물은 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
재조합 구축물은 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 트랜스벡션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 진균 세포, 예를 들면, 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들면, 초파리 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들면, CHO, COS 및 Bowes 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 숙주 세포에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에서는 AtPFP α1 유전자 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개 형질전환을 이용하여 애기장대를 형질전환시켰다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환 식물의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 식물은 애기장대이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516 호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물 세포는 애기장대 유래이나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
재료 및 방법
식물 재료
애기장대 생태형 콜럼비아 및 형질전환 종자를 제어된 환경(120μmolm-2sec-1, 22℃, 16/8h 명/암 광주기)에서 발아시켰다. 식물을 이어서 제어된 기후 챔버에서 상단 토양, 페라이트 및 버미큘라이트(2:1:1)에서 키웠다.
AtPFPα1 의 5' 상류 DNA 단편의 PCR 클로닝
주형으로서 게놈 DNA를 이용하여, AtPFPα1의 5' 상류 유전자를 PCR로 증폭하였다. 이는 5' 상류 영역의 약 2kb 정도의 크기를 가지며 엑손과 인트론 서열을 포함한다. AtPFPα1 유전자의 5' 단편을 증폭하기 위해, PCR 프라이머는 5'-CCAAGCTTAGAACGCCAAGAGCTTCTCAAG-3'(서열번호 2)과 5'-CCCTCGAGTAAGGTATGCGGGAAAGCACG-3'(서열번호 3)을 이용하였다. PCR로 얻어진 HindIII와 XhoI 자리를 이용하여 서브클로닝에 이용하였다.
AtPFP α1의 클로닝된 게놈 DNA는 BAC 클론 AC007369의 44,828-46,390 bp 영역(2177 bp)과 일치하였다.
GUS 융합 벡터의 구축
AtPFP α1 유전자의 분리된 5' 상류 서열을 pBI101.1 벡터의 GUS 유전자에 융합하였다. 생성된 플라스미드는 AtPFP α1 프로모터::GUS를 포함하였으며, 이를 AtPFP α1::GUS로 표시하였다.
애기장대 형질전환
모든 형질전환 식물은 25 mg/L 카나마이신을 포함하는 Gamborg B5 배지에서 선별 하였다.
조직화학적 GUS 분석
조직화학적 GUS 분석은 식물체를 0.2 M 인산나트륨 (pH 7.0), 10 mM EDTA, 20% 메탄올, 2% DMSO, 0.1% 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-글루코피라노시드 (X-Gluc)를 포함하는 용액에서 반응을 시켰다. GUS 발현 양상은 SZX12 (Olympus, Japan; http://www.olympus.co.jp/en/)로 관찰하였고, ImagePro Express (Olympus, Japan)로 촬영하였다.
실시예 1: AtPFPα1 유전자의 5' 상류 서열의 분리
식물체 내에서의 애기장대 PFP α1 유전자의 발현 양상을 알아보기 위해, 5' 상류 DNA 조절 부분을 게놈 PCR로 분리하였다. AtPFP α1 (2177 bp)의 5' 상류 부분을 GUS 리포터 유전자와 전사적으로 융합하였다(도 1). 그리고 나서, 이 구축물을 애기장대로 아그로박테리움을 이용하여 형질전환한 후, 애기장대로 형질전환하였다.
실시예 2: GUS 형질전환 식물체의 제조
AtPFPα1::GUS를 가진 GUS 형질전환 식물체의 1세대를 21개 얻었다. 이들 형질전환 식물체를 조직화학적 GUS 분석을 이용하여 다양한 조직에서 분석하였다. 가장 많이 GUS 염색이 되는 AtPFP α1:: GUS의 A1-6 라인을 동형접합체 선별을 하였다. 동형접합체로 선별된 A1-6-4은 그 이후의 분석에 주로 이용하였다.
실시예 3: 형질전환된 애기장대에서 GUS 발현의 분석
AtPFP α1 프로모터가 융합된 A1-6-4은 애기장대 seedling의 잎과 뿌리 그리고 꽃 등 전체 조직에서 많이 발현되는 것으로 강한 GUS 염색 양상을 알 수 있었다(도 2a-b). 꽃에서는 4개의 기관인 그 꽃받침, 꽃잎, 수술, 암술 모두에서 GUS 염색된 것을 볼 수 있었다(도 2b).
본 발명에 따르면, PFPα1 프로모터 서열은 AtPFPα1 유전자 발현에 있어 중요한 조절 요소이며, DNA 결합 인자를 분리하는데 유용한 수단이 될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 애기장대의 잎, 뿌리, 또는 꽃 조직에서 발현되는, 애기장대 유래의 PFP(pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1- phosphotransferase) α1(AtPFP α1) 프로모터.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
  4. 제 3항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 식물.
  6. 제 4항 또는 제5항에 따른 식물의 종자.
  7. 제 3항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020060129558A 2006-12-18 2006-12-18 애기장대 ＡｔＰＦＰα1 프로모터 및 상기 프로모터로형질전환된 식물 KR100780476B1 (ko)

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Trends Plant Sci 9:556-563(2004)

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