JP4880819B2 - 植物においてセルロース生合成を増強し、リグニン生合成を改変する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、1999年、５月２１日出願の米国仮出願番号60/135,280の利益を要求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド分子、セルロースシンターゼのプロモーターおよびセルロースシンターゼポリペプチド、セルロースおよびリグニン生合成を遺伝的に改変する方法、および、樹木の幼若木質及び線維の強度特性を改善する方法に関する。本発明は更に、セルロースシンターゼプロモーター中の制御要素およびそのような制御要素に結合する転写因子を同定する方法、およびセルロースシンターゼプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチドの発現を増大させる方法に関する。
【０００３】
発明の背景
リグニンおよびセルロースは機械的強度および強固さを提供する植物細胞壁の主要な構築単位である。植物において、特に樹木において、これらの２つの有機物質は機械的強度、水輸送能および生物的および非生物的環境ストレスからの保護を与える動的平衡にある。通常、オーブン加熱した木材は30〜50％セルロース、20〜30％リグニンおよび20〜30％ヘミセルロース（Higuchi、1997）を含んでいる。
リグニンおよびセルロースの割合は天然環境の変動によって変化することが知られている。例えば、針葉樹の圧縮あて材(compression wood)発達の間に、リグニンのパーセンテージは30から40％に増加し、セルロース含量はそれに応じて40から30％に低下する（Timmell、1986）。逆に、被子植物の引張あて材（tension wood）においては、セルロースのパーセンテージは30から40％に増加し、一方、リグニン含量は30から20％に低下する（Timmell、1986）。
【０００４】
近年、リグニン生合成経路の組織特異的なキー酵素、4CLの遺伝的ダウンレギュレーションがトランスジェニックポプラス属(aspen)樹木においてリグニン含量を45％まで低下させることが発見された（Huら、1999）。このダウンレギュレーションはまた、セルロース含量において15％の増加を伴っていた。この逆が真であるならば、すなわち、セルロース生合成の遺伝的アップレギュレーションによってセルロース含量を増加させることがリグニン含量を低下させるのであれば、パルプ収率を増加させることができる。これによって、パルプ製造の際に大幅に化学的およびエネルギー的コストを削減することができるであろう。なぜならば、例えば、リグニンはパルプ製造過程で分解及び除去されなければならないからである。
セルロースはβ-D-1,4-結合したグルコース残基からなる直線状グルカンである。セルロースはUDP-グルコース単位の集合を触媒するセルロースシンターゼ酵素によって「パーティクルロゼット」として知られる原形質膜複合体において形成される（DelmerとAmor、1995）。セルロースシンターゼは８つの膜貫通結合ドメインによって膜にアンカーされ、植物細胞壁におけるセルロース生合成機構の基礎を形成すると考えられている（Pearら、1996）。
【０００５】
高等植物において、一次および二次細胞壁のセルロース微小繊維中のグルカン鎖はその重合の程度が異なっている（Brownら、1996）。例えば、二次細胞壁は高重合度のセルロースを含有していることが知られているが、一次細胞壁では重合の程度はそれより低い。別の例では、張力ストレスがかかっている木部細胞壁は、そのストレスに応答して、曲げた被子植物の上部に引っ張りあて材を形成する。これらの細胞では、非常に高い結晶性を有するセルロース量が上昇している。高度に結晶化したセルロースの形成は木部繊維の高い引っ張り強度を得るために重要である。同じ幹の下部の木部細胞壁は圧縮ストレスを受けるが、高度に結晶化したセルロースを生成しない。発達の過程における細胞壁の重合の程度のこのような変動は、グルコース単位を異なる擬似結晶配列に整える異なったセルロースシンターゼのためであると考えられている（HaiglerとBlanton、1996）。従って、トランスジェニック樹木から優れた強度特性を有する木材パルプの高い収率を得るために、高度に結晶化したセルロースの合成に関する分子的基礎を決定することは有利であろう。トランスジェニック樹木における高度結晶化セルロースの生成はまた、通常の樹木において形成される幼若木部の機械的強度特性を著しく改善するであろう。幼若材は機械的強度が劣るために一般には固体木材応用に望ましくないので、このことは工業に大きな利益となるであろう。
【０００６】
樹木におけるセルロースおよびリグニンの沈着は補償的様式で制御されているため、セルロース生合成の遺伝的増強はリグニン沈着に対して抑制的効果を有するかもしれない。重合度および結晶度はセルロース生合成機構に取り込まれているセルロースシンターゼの型に依存することがあるため、異種セルロースシンターゼまたはそれらのUDP-グルコース結合領域の発現（例えば、テーダマツにおけるスイートガムタンパク質）は、トランスジェニック植物においてセルロースの品質を増加することができるであろう。また、異種セルロースシンターゼの過剰発現はトランスジェニック植物のセルロース量を増加させるかもしれない。従って、セルロース生合成の遺伝的操作はトランスジェニック植物においてセルロース品質及び量を増強し、一方、リグニン含量を低下させるためのストラテジーを提供することができる。
【０００７】
木質部形成に至る生化学的過程をよりよく理解することにより、パルプおよび紙工業はより効率的に、減少する生産面積からの木材に対する増大する要求を満たす道具として遺伝的操作を利用できるであろう。この目的で、大部分のリグニン生合成遺伝子を含む多くの木部特異的遺伝子が樹木種を含む種々の植物の発達中の木部組織から単離されている（YeとVarner、1993；Fukuda、1996；Whettenら、1998）。樹木に対して穀物植物においてセルロース生合成を制御する遺伝子はすでに単離されている（Pearら、1996およびArioliら、1998）。しかしながら、セルロース生合成に直接関与する樹木の遺伝子の単離は今だ難題を残している。
【０００８】
30年以上の間、高等植物のセルロースシンターゼをコードする遺伝子(CelA)は同定されていない。近年、Pearら(1996)は、活性な二次壁セルロース合成を有する綿線維から調製したcDNAライブラリー中で、UDP-グルコース結合配列を探索することにより最初に推定的高等植物CelA cDNA、GhCelA（GenBank No. GHU58283）を単離した。GhCelは、綿線維中で強く発現しており、二次壁セルロースを盛んに合成しており、８つの膜貫通ドメインを有し、UDP-グルコースに結合し、植物に固有の他の２つのドメインを有していたので、セルロースシンターゼ触媒サブユニットをコードすると考えられた。
近年、Arioliら(1998)は、CelAホモログ、RSW1（放射方向膨潤）（GenBank No.AF027172）を、Arabidopsis（アラビドプシス）から温度感受性セルロース欠損変異株の欠損遺伝子座への染色体ウォーキングによってクローン化した。rsw1変異株の野生型完全長ゲノムRSW1クローンによる相補は正常な表現型を回復した。この相補性は、植物CelA遺伝子がセルロースシンターゼの触媒サブユニットをコードし、セルロース微小繊維の生合成において機能することの最初の遺伝子的証拠を与えるものである。完全長Arabidopsis RSW1は、トランスジェニック系において更にセルロース生合成を明らかにするために利用できる、現在知られた唯一の入手可能なセルロースシンターゼcDNAである(Wuら、1998)。
【０００９】
RSW1遺伝子の発見は、セルロースシンターゼの原形質膜への集合は機能的セルロース生合成機構および植物細胞壁において結晶セルロース微小線維を生成するために必要だという考えを実証した。最も重要なことに、単一のCelA遺伝子、例えばRSW1は、植物、例えばArabidopsisにおけるセルロース微小繊維の生合成に充分である。従って、RSW1はトランスジェニック植物においてセルロース形成の増強を操作するための主要な標的である。
社会の線維、化学的およびエネルギー的需要の多くは木材からの工業的規模のセルロース生産によって満たされているため、樹木のセルロース生合成機構の遺伝的操作はより高いパルプ収率を生成することができるであろう。このことにより、パルプ及び製紙工業による投資に対するより大きな利益還元を可能とするであろう。従って、木材の特性を改善するためにセルロース生合成に関与する遺伝子を樹木から単離し、特性解析することは利益であろう。
【００１０】
発明の概略
本発明はセルロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ストレス誘導性プロモーターを含むセルロースシンターゼの制御配列、セルロースシンターゼタンパク質またはその機能的ドメイン、および植物においてセルロース生合成を増強する方法に関する。
従って、一つの側面において、本発明はセルロースシンターゼをコードする配列を含むポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチド断片、UDP-グルコース結合ドメインのようなセルロースシンターゼの機能的ドメインをコードする断片を提供する。本発明はまた、セルロースシンターゼまたは、UDP-グルコース結合ドメインおよび８つの膜貫通ドメインの少なくとも一つを含めて、その機能的ドメイン又は断片を提供する。本発明は更に、セルロースシンターゼプロモーターまたは、１以上の機械的ストレス応答要素(MSRE)を含むその機能的断片を提供する。
【００１１】
別の側面では、本発明は植物細胞のセルロース量を改変し、および、場合により細胞中のリグニンの含量を低下させることによる木材の品質を改善する方法に関する。本発明はまた、セルロースシンターゼまたはそのUDP-グルコース結合ドメインをコードする外来性ポリヌクレオチドを植物で発現させることにより植物の生長およびセルロース含量を改変する方法に関する。本発明は更にストレス誘導性セルロースシンターゼプロモーターを用いて選択したポリヌクレオチドを発現させることによる、植物細胞におけるストレス誘導性遺伝子発現を生じさせる方法を提供する。
更に別の側面では、本発明はセルロースシンターゼプロモーター中の機械的ストレス応答要素(MSRE)を決定する方法およびおよびMSREに結合する転写因子を同定する方法に関する。
【００１２】
更なる側面において、本発明は、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合する特性を有する転写因子をコードする外来性ポリヌクレオチドを発現させる、または、負のMSREに結合する特性を有する転写因子をコードするアンチポリヌクレオチドを発現させてその転写因子の発現を阻害することにより、セルロースシンターゼの発現を改変（増加又は減少）、すなわち、制御する方法を提供する。
本発明の他の側面は、本発明の詳細な説明及び、図面および添付の請求の範囲を考慮することによって理解できるであろう。
【００１３】
発明の詳細な説明
この明細書で挙げるすべての特許、特許出願及び参照文献は、引用によりその全体が本明細書に取り込まれるものとする。何らかの不一致がある場合は、本開示が優先する。
（定義）
この明細書で使用する用語は、本発明の文脈内で、また各用語が用いられる特有の文脈で技術的に通常の意味を有する。特定の用語については、以下に或いは本明細書の他のどこかで説明し、本発明の組成物と方法及びそれらの作り方と用い方を述べる上で当業者にさらに手引きを提供する。同一の物が１つの方法以外で言われることがあることは理解されるだろう。その結果として、本明細書で議論されるいずれの１つ以上の用語についても代替の言葉及び同義語が用いられることがあり、またある１つの用語が本明細書で詳述され、又は議論されるとしても何らかの特定の意義が置かれるものではない。特定の用語については同義語が与えられる。１つ以上の同義語は他の同義語を排除するものではない。この明細書のどこかで例を使用するときは、本明細書で議論されるどの用語の例をも含め、説明のためだけであり、決して本発明及びどの例示された用語の範囲と意味を制限するものではない。同様に、本発明は好ましい実施形態によっても制限されない。
【００１４】
用語「植物」は、植物全体及び植物器官（例えば、根、茎、葉等）を含む植物の部分を含む。
用語「被子植物」は、子房に包まれた種子を生成する植物を意味する。被子植物の特定の例はLiquidambar styraciflua（Ｌ．）[モミジバフウ]である。
用語「裸子植物」は、裸の種子、すなわち子房に包まれていない種子を生成する植物を意味する。裸子植物の特定の例としては、Pinus taeda（Ｌ．）[テーダマツ]が挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、一本又は二本鎖ゲノム、cDNA、ＲＮＡ、何らかの合成的及び遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、及び一緒に若しくは個々にセンスとアンチセンス鎖の両方を包含するものである（ここでは、センス又はアンチセンス鎖のみが提示されるかもしれないが）。これは、一本鎖及び二本鎖分子、すなわちDNA−DNA、DNA−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのみならず、塩基をアミノ酸骨格に結合することによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）をも包含する。これは、例えばチオ−ウラシル、チオ−グアニン及びフルオロ−ウラシルのような修飾された塩基を含有する核酸をも包含する。
【００１５】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合はその自然環境）から離されている成分を意味する。単離された核酸又はポリペプチドは、それが最初に結合されていた細胞成分を、約50％未満、好ましくは約75％未満、最も好ましくは約90％未満含むことがある。ＰＣＲによって増幅され、その細胞成分の残りから十分かつ容易に区別できる（例えば、ゲル上で）ポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされる。本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、「実質的に純粋」、すなわち技術的に公知の精製法を用いて達成できる最高度の純度を有する。
【００１６】
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基の対合によって相補鎖と結合するプロセスを意味する。あるポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖が所定のストリンジェンシー条件下で別のポリヌクレオチドの鎖にアニールできる場合、ポリヌクレオチドは相互に「ハイブリッド可能」である。ハイブリダイゼーションは、２つのポリヌクレオチドが実質的に相補的配列を含む必要があり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって決まるが、ミスマッチは許容されうる。典型的には、高いストリンジェンシー（例えば、65℃の0.5Ｘ ＳＳＣの水溶液中におけるような）での２つの配列のハイブリダイゼーションは、それら配列がその全配列に渡ってかなり高度の相補性を示す必要がある。中間のストリンジェンシー（例えば、65℃の２Ｘ ＳＳＣの水溶液のような）及び低い厳密性（例えば、55℃の２Ｘ ＳＳＣの水溶液のような）の条件は、そのハイブリダイズする配列間で全体的に対応して相補的である必要性は少ない。（１Ｘ ＳＳＣは、0.15Ｍ ＮａＣｌ、0.015Ｍ Ｎａシトレート。）ここで使用する場合、上記溶液及び温度はハイブリダイゼーション手順のプローブ洗浄段階を指す。用語「ストリンジェントな（低い、中間の）条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、一本鎖のみが別のポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするとはいえ、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの両方を包含するものである。
【００１７】
「配列保存的変異体」は、別のポリヌクレオチドと比較して与えられたコドン位置で１つ以上のヌクレオチドが変化しているが、その変化は当該位置でコードされるアミノ酸にいかなる変化もきたさないようなポリヌクレオチドである。
「機能保存的変異体」は、限定するものではないが、同様の物理化学的性質（例えば、酸性、塩基性、疎水性等のような）を有するものとアミノ酸の置換を含む、ポリペプチドの全体的なコンホメーション及び機能を変えることなく、変化させられた与えられたアミノ酸残基を有するポリペプチド（又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）である。同様の物理化学的性質を有するアミノ酸は技術的に周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり、相互交換可能である。同様に、疎水性のアミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン又はバリンと置換できる。配列−及び機能保存的変異体については、遺伝コードの縮重に関連してさらに詳しく後述する。
【００１８】
「機能的ドメイン」又は「機能的断片」は、タンパク質又はポリペプチド又はポリヌクレオチドのいずれかの領域又は部分を意味し、より大きいタンパク質又はポリヌクレオチドの領域又は部分であり、その領域又は部分は、より大きいタンパク質又はポリヌクレオチドに起因しうる特有の活性又は特有の機能を有しており、例えば、セルロースシンターゼの機能的ドメインはUDP−グルコース結合ドメインである。
用語「％同一性」は、Genetics Computer Group Wisconsin（ＧＣＧ）パッケージのプログラムＧＡＰ（バージョン9.0）（マジソン，WI）によって同定されるような、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが別の配列のヌクレオチド／アミノ酸と同一であるポリヌクレオチド／ポリペプチドのヌクレオチド／アミノ酸のパーセンテージを意味する。ＧＡＰは、Needleman及びWunsch（J.Mol.Biol 48:443-453,1970）のアルゴリズムを使用して、好一対の数を最大にし、かつギャップ数を最少にする、２本の完全配列のアラインメントを見つける。上記アルゴリズムを実行するのに必要なパラメータが特定されないときは、プログラムによって提供されるデフォルト値が考慮される。デフォルト値として（ポリヌクレオチドに対して）次のパラメータがＧＣＧプログラムＧＡＰで使用される：ギャップ創造ペナルティ：50；ギャップ拡張ペナルティ：３；スコアリングマトリックス：nwsgapdna.cpm（ローカルデータファイル）。
【００１９】
２本のポリペプチド配列間の「％類似性」又は「％相同性」は、２本の配列で共有される類似位置の数の関数であり、使用するスコアリングマトリックスを基準として比較される位置の数で除してから100が掛けられる。この比較は、２本の配列が整列され（必要な場合ギャップを導入して）、最大の相同性を決定するときに行われる。米国国立バイオテクノロジー情報センターによって実施されるPowerBlastプログラムを使用して最適なギャップドアラインメントを計算できる。Genetics Computer Group WisconsinパッケージのＧＡＰプログラム（バージョン9.0）（マジソン,WI）も使用できる。ＧＡＰは、Needleman及びWunsch（J.Mol.Biol 48:443-453,1970）のアルゴリズムを使用して、好一対の数を最大にし、かつギャップ数を最少にする、２本の完全配列のアラインメントを見つける。上記アルゴリズムを実行するのに必要なパラメータが特定されないときは、プログラムによって提供されるデフォルト値が考慮される。デフォルト値として（ポリペプチドに対して）次のパラメータがＧＣＧプログラムＧＡＰで使用される：ギャップ創造ペナルティ：12；ギャップ拡張ペナルティ：４；スコアリングマトリックス：Blosum62.cpm（ローカルデータファイル）。
【００２０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に少なくとも10、好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは少なくとも20ヌクレオチドの核酸であり、遺伝子、mRNA、cDNA、又は関心のある核酸とは別の核酸をコードするゲノムDNA分子、cDNA分子、又はmRNA分子にハイブリダイズ可能な核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば32Ｐ−ヌクレオチド又はビオチンのような標識が共有結合されているヌクレオチドによって標識することができる。一実施形態では、標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド（標識されうる１つ又は両方）をＰＣＲプライマーとして使用して、全長若しくはCelAの断片をクローニングし、又はCelAをコードする核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、CelA DNA分子と三重らせんを形成できる。さらに別の実施形態では、シリコンウエハ又はチップのような固体支持体上に配置されるオリゴヌクレオチドのライブラリを用いて、関心のある種々の多型性を検出できる。一般的に、オリゴヌクレオチドは合成によって、好ましくは核酸シンセサイザーで調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等のような天然に存在しないリン酸エステル類似体結合で調製されうる。
【００２１】
用語「コード配列」は、ポリペプチドをコードするための情報を含む、遺伝子の当該部分を意味する。コード配列の境界は、５'（アミノ）末端における開始コドンと、３'（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、限定するものではないが、原核生物の配列、原核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物の（例えば、哺乳類の）DNA由来のゲノムDNA配列、及び均一合成のDNA配列が挙げられる。
【００２２】
「プロモーター」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合でき、かつ下流（３'方向）のコード配列の転写を開始できる要素（例えば、ＴＡＴＡボックス）を含むポリヌクレオチドである。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列は、その３'末端で転写開始部位によって制限され、かつ上流（５'方向）に伸長して、バックグラウンドを越えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基又は要素の最小数を包含する。プロモーター配列内で、転写開始部位（例えばヌクレアーゼS1でマッピングすることによって好都合に定義される）、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見つけられる。本発明で使用できるプロモーターの例としては、PtCelAP、4CL-1及び35Sが挙げられる。
【００２３】
用語「構成的プロモーター」は、典型的には、結合したコード配列の発現を活性化するために正の制御タンパク質を必要としないプロモーターを意味し、すなわち構成的プロモーターは発現のいくらかの基礎的レベルを維持している。一般に、構成的プロモーターは発現カセットの創造に使用される。構成的プロモーターの例は、Clonetech,Palo Alto,CAから入手可能な35S CaMV（カリフラワーモザイクウイルス）である。
用語「誘導性プロモーター」は、関連コード配列の発現を活性化するために正の制御を必要とするプロモーターを意味する。このようなプロモーターの例は、本明細書で述べられるポプラス属植物由来のストレス誘発性のセルロースシンターゼプロモーターである。
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写するときに、細胞内で転写及び翻訳制御配列の「制御下」にあり、それからトランス−ＲＮＡスプライシングされて、そのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される。
【００２４】
「ベクター」は、本発明のポリヌクレオチドが結合されうるプラスミド、ファージゲノム、ウイルスゲノム、コスミド、又は人工染色体のような組換え核酸構築物である。特有の実施形態では、ベクターは、例えばクローニングベクターの場合、結合されているセグメントの複製を惹起しうる。
用語「発現カセット」は、該発現カセットを細胞中に挿入すると、与えられたタンパク質の発現が達成されるようなプロモーター及びタンパク質コード配列の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。
細胞は、外来性又は異種ポリヌクレオチドによって、このようなポリヌクレオチドが細胞の内側に導入されたとき「トランスフェクション」される。細胞は、このトランスフェクションされたポリヌクレオチドが表現型変化を生じた場合に、外来性又は異種ポリヌクレオチドによって「形質転換」される。好ましくは、この形質転換するポリヌクレオチドは、該細胞のゲノムを構成している染色体DNA中に組み込まれる（共有結合される）べきである。
【００２５】
「外来性」とは、細胞から単離されていて、その後同一又は異なる細胞中に導入される、ポリヌクレオチド又はタンパク質のような生体物質を指す。例えば、本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、特定種の樹木の木部細胞からクローン化され、プラスミド中に挿入され、かつ同種又は異種の木部細胞中に再導入されうる。従って、この種は外来性のセルロースシンターゼポリヌクレオチドを含有する。
「異種ポリヌクレオチド」とは、それが導入される細胞内には天然に存在しない外来性のポリヌクレオチドを意味する。
「同種ポリヌクレオチド」とは、それが導入される細胞内に天然に存在する外来性のポリヌクレオチドを意味する。
【００２６】
本発明は、植物、特に樹木由来のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの単離及び特徴づけに関し、セルロースシンターゼの全長又は天然に存在する形態、機能的ドメイン、プロモーター及び制御要素を包含する。従って、本発明により、本技術のスキル内で従来の分子生物学、微生物学、及び組換えDNA技術を利用できる。このような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook,Frisch＆Maniatis,分子クローニング：実験室マニュアル、第２版(1989)Cold Spring Harabor Laboratory Press,Cold Spring Harabor New York（本明細書では“Sambrookら,1989”）；DNAクローニング：実用的アプローチ,Ｉ及びII巻（D.N.Glover版1985）；オリゴヌクレオチド合成（M.J.Gait版1984）；核酸ハイブリダイゼーション[B.D.Hames＆S.J.Higgins版(1985)]；転写と翻訳[B.D.Hames＆S.J.Higgins版(1984)]；動物細胞培養[R.I.Freshney版(1986)]；固定化細胞及び酵素[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,分子クローニングへの実用ガイド(1984)；F.M.Ausubelら(版),分子生物学における現在のプロトコル,John Wiley＆Sons,Inc.(1994)を参照せよ。
【００２７】
本発明は、新規な全長セルロースシンターゼ遺伝子（CelA）、セルロースシンターゼの新規なストレス誘導性プロモーター（CelAP）、及び樹木由来のセルロースシンターゼタンパク質に関し、それらのUDP−グルコース触媒ドメインを含む。本発明は、セルロース含量が増加され、リグニン含量が低減され、ひいては木繊維特性が改良されたトランスジェニック樹木の変種開発を可能にする。さらに、操業可能な生産計画において、商業的に適切なトランスジェニック森林樹木の色々な種でセルロースの量と質を高める生産が熟考される。さらに、本発明は、樹木中におけるCelA遺伝子の発現及び機能の研究用の新しい実験システムを提供する。
【００２８】
セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びその断片
本発明は、本発明のセルロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列又はその機能的断片を含むポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは樹木セルロースシンターゼをコードする配列、最も好ましくはポプラス属植物由来のセルロースシンターゼをコードする配列を含む。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、完全なセルロースシンターゼコード領域、例えば配列番号:1のヌクレオチド69〜3,005を含む。本発明の別の局面では、Arabidopsisセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドが提供される（配列番号:4及び配列番号:5の翻訳されたタンパク質を参照せよ）。
【００２９】
また、本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの断片も本発明の範囲内であり、この断片は少なくとも１種の膜貫通ドメイン及び／又はUDP−グルコース結合ドメインをコードする。例えば、ポプラス属植物セルロースシンターゼのUDP−グルコース結合ドメインをコードするヌクレオチド（例えば、配列番号:1のヌクレオチド660〜2250）又は配列番号:4の対応するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは本発明の範囲内である。UDP−グルコース結合ドメインをコードするヌクレオチドは、例えば、後述するようなタンパク質配列のアラインメントによって決定することができる。
本発明は、さらに配列番号:1及び4のコードタンパク質の配列保存的変異体に関する。
【００３０】
低い、中間の、及び高いストリンジェンシーの条件下で配列番号:1及び4にハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらのそれぞれのコード部分も本発明の範囲内である。好ましくは、配列番号:1及び4、又はそれらのそれぞれのコード部分のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、当該配列とほぼ同一長さであり、例えば、せいぜい約10〜約20ヌクレオチド長いか或いは短い。本発明の別の実施形態では、このハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、少なくとも1500ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも2500ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも3000ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、このハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、配列番号:1若しくは4に見られるようなUDP−グルコース結合ドメイン、又は少なくとも保存領域QVLRWを含む。最も好ましくは、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、UDP−グルコース結合活性を有する。
【００３１】
本来天然に存在するポリヌクレオチドは、本明細書に記載され或いは技術的に周知な方法によって、それらを含有する生物体から単離することができる。天然に存在しないポリヌクレオチドは、組換えDNAの分野で公知の種々の操作によって調製することができる。例えば、クローン化CelAポリヌクレオチドは、Sambrookら,1989に記載された方法に従って改変できる。配列は、試験管内で適切な部位で制限酵素により切断され、その後所望によりさらに酵素修飾され、単離され、かつ連結されうる。改変ポリヌクレオチドの生産では、例えば、その改変ポリヌクレオチドが適切な翻訳読取り枠内に確実に留まるように（発現されるべき場合）、又は翻訳停止信号によって中断されないように注意を払うべきである。さらなる実施例として、CelAをコードする核酸配列は、インビトロ又はインビボ変異されて、翻訳、開始、及び／又は終止配列を創造及び／又は破壊し、或いはコード領域内で変異を引き起こし、及び／又は新しい制限酵素部位を形成し或いは既存の部位を破壊して、さらにインビトロ改変を促進することができる。好ましくは、このような変異は、その変異されたCelAポリヌクレオチドの機能活性を高める。技術的に公知のいずれの突然変異誘発法も使用でき、限定するものではないが、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson,C.ら,1978,J.Biol.Chem. 253:6551；Zoller及びSmith,1984,DNA３:479-488；Oliphantら,1986,遺伝子 44:177；Hutchinson,C.ら1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83:710)、ＴＡＢリンカーの使用（Pharmacia）等が挙げられる。ＰＣＲ法は、部位特異的突然変異誘発に好ましい（Higuchi,1989,“ＰＣＲを用いてDNAを操作する”,ＰＣＲ技術：DNA増幅の原理と応用,H.Erlich版,Stockton Press,６章,61〜70ページ参照）。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドは、植物又は非植物の複製用に適合する種々のベクター中に導入することができる。これらは技術的に周知であり、従ってこのようなベクターの選択、構築及び使用は本技術の当業者の十分スキル内である。可能なベクターとしては、限定するものではないが、植物のプラスミド又は改変ウイルスが挙げられるが、ベクター系は使用する宿主細胞と適合しなければならない。好適なベクターの例は、Tiプラスミドである。例えば、クローニングベクター中への挿入は、そのDNA断片を、相補的付着末端を有するクローニングベクター中に連結させることによって達成される。しかし、DNA断片に使用される相補的制限部位がクローニングベクター内に存在しない場合、DNA分子の末端は酵素的に修飾されうる。代わりに、所望のいずれの部位もヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端上に連結することによって生成することができ；これら連結されたリンカーは、制限酵素認識配列をコードする特異的に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含みうる。セルロースシンターゼ又はその組換え分子を含有する発現カセットは、炭化ケイ素ウィスカー、形質転換プロトプラスト、形質転換、例えばAgrobacterium（アグロバクテリウム）ベクター（後述する）、エレクトロポレーション、インフェクション等によって宿主細胞中に導入され、該遺伝子配列の多くの複製が生成される。好ましくは、このクローン化遺伝子はシャトルベクタープラスミド上に収容され、クローニング細胞、例えば大腸菌中における増殖、及び所望によって引き続き適切な発現細胞系中に挿入するために簡易精製に供される。例えば、１種類より多くの生物体内で複製可能なベクターであるシャトルベクターは、大腸菌プラスミド由来の配列を酵母菌２ｍプラスミド由来の配列と連結することによって、大腸菌と酵母(Saccharomyces cerevisiae)の両方での複製用に調製される。
【００３３】
ここで記載されるポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック植物もまた本発明の範囲内である。外来性ポリヌクレオチドを植物細胞中に導入し、トランスジェニック植物を再生する方法は周知である。いくつかについて、以下に述べる。
一実施形態では、本発明のCelAコード配列又はプロモーターを含有するプラスミドを植物中に導入するため、選択可能なマーカー発現カセット含有プラスミドDNAと、セルロースシンターゼ発現カセット含有プラスミドDNAとの１：１混合物を金と共に沈殿させて微小射出物を形成する。この微小射出物を無水エタノール中ですすぎ、アリコートをHercules,CAのBioRadから入手可能なマクロキャリヤーのようなマクロキャリヤー上で乾燥させる。照射前に、胚性組織は、好ましくは無菌の層流フード下乾燥される。この乾燥された組織が半固体の増殖培地に移される。調製された微小射出物が、BioRad PDS-1000/HE粒子銃のような適宜の装置を用いて、マクロキャリヤーから乾燥標的細胞中に加速される。好ましい方法では、各プレートは一度照射されると180度回転され、２度めの照射をされる。好ましい照射パラメータは、9.31×106Pa(1350psi)の破裂板圧、破裂板とマクロキャリヤーとの距離（ギャップ距離）が６mm、１cmのマクロキャリヤー移動距離、及びマクロキャリヤー停止スクリーンと培養プレートとの距離（ミクロキャリヤー移動距離）が10cmである。そして、照射後、ハイグロマイシンＢのような選択薬剤を含有する半固体の増殖培地に２日間移される。
【００３４】
セルロースシンターゼタンパク質及びその断片
本発明のセルロースシンターゼは、グルコースからグルカンを合成するためのUDP−グルコース結合活性を有する触媒的サブユニットと、セルロースシンターゼを細胞膜に局在化させるための８個の膜貫通ドメインとを含む植物タンパク質である。本発明のセルロースシンターゼは、８個の膜貫通結合ドメインを有しており；２個はアミノ末端に、６個はカルボキシル末端にある。UDP−グルコース結合ドメインは、膜貫通ドメイン２と３の間に位置する。このタンパク質構造の例は、ポプラス属植物のセルロースシンターゼのみならず、RSW1及びGhCelAのセルロースシンターゼにも見られる。膜貫通ドメインの位置は後述され、かつ実施例で例示されるように同定することができる。好ましくは、本発明のセルロースシンターゼは樹木のセルロースシンターゼのアミノ酸配列を有する。
【００３５】
一実施形態では、本発明のセルロースシンターゼタンパク質はポプラス属植物(aspen)から単離される。このポプラス属植物のセルロースシンターゼは、約978個のアミノ酸を含み、かつ約110kDaの分子量と約6.58のpIを有する。一実施形態では、このポプラス属植物のセルロースシンターゼは、図１に示されるように配列番号:2のアミノ酸配列を有する。別の局面では、本発明は配列番号:5のセルロースシンターゼに関する。
さらに、本発明は、少なくとも１種の膜貫通領域及び／又はUDP−グルコース結合ドメインを含有する断片のような、植物セルロースシンターゼの断片に関する。膜貫通領域は、Hoffmann及びStoffelの方法（1993）を用いることによって、実施例で述べるように同定することができる。
【００３６】
UDP−グルコース結合ドメインを含有するセルロースシンターゼ断片は、該タンパク質の残り部分がなくても機能的する。この分離可能な活性は実施例に示されるとおりである。この結果は、以前に同定されたUDP−グルコース結合ドメインは、そのタンパク質の他の部分から単離された場合に機能するとは知られていなかったので驚くべきことであり、かつ予想外だった。従って、UDP−グルコース結合ドメインを含み、かつ独立して機能的である（PtCelA、RSW1、GhCelA及び配列番号:5のような）いずれのセルロースシンターゼの断片も本発明の範囲内である。UDP−グルコース結合ドメインの機能は、実施例で述べる分析によって決定できる。本発明のUDP−グルコース結合ドメインは、セルロースシンターゼの第２及び第３の膜貫通領域間に位置し、配列QVLRW及び保存Ｄ残基のようなUDP−グルコース結合のためのアミノ酸配列を保存していた。このUDP−グルコース結合ドメインとここに保存されている領域は、本明細書の指導及び本技術の一般知識、例えばBrown,1996を使用して、セルロースシンターゼ内に配置することができる。一実施形態では、UDP−グルコース結合ドメイン及びここに保存されている領域は、本明細書に記載され或いは本技術で一般的に公知のアルゴリズムを用いて、問題のセルロースシンターゼのアミノ酸配列と、ポプラス属植物のセルロースシンターゼのアミノ酸配列とを比較することによって同定することができる。例えば、配列番号:2のUDP−グルコース結合ドメインは、アミノ酸220〜749の位置にある。保存QVLRW配列は、配列番号:2の715〜719位に位置する。
【００３７】
上述のPower Blast又はＧＡＰアルゴリズムを用いて、配列番号:2、配列番号:2のアミノ酸220-749、配列番号:5又はそのUDP−グルコース結合ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、最も好ましくは少なくとも95％の類似性を有するポリペプチド。好ましい実施形態では、これらポリペプチドは、配列番号:2又は配列番号:2のアミノ酸220〜749のポリペプチドとほど同一長さである。例えば、このポリペプチドは約２〜３乃至約５〜７及び約10〜15アミノ酸分長いか或いは短い。別の実施形態では、このパラグラフで述べているポリペプチドは、Arabidopsis又はワタには本来見られ（すなわち、天然に存在し）ない。これらポリペプチドは、例えば、技術的に周知の方法で配列番号:2又は配列番号:5のタンパク質をコードするクローン化ポリヌクレオチドの核酸配列を変えることによって調製できる。
【００３８】
また、セルロースシンターゼの機能保存的変異体も本発明の範囲内であり、かつセルロースシンターゼ又はその断片をコードするクローン化ポリヌクレオチドの配列を変えることによって調製できる。本技術で使用されている従来法を用いて１種以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を行って、機能的に等価の分子を与えることができる。例えば、UDP−グルコース結合ドメインの外側で、該タンパク質のアミノ及び／又はカルボキシル末端に置換、欠失及び／又は付加のある機能保存的変異体は、本発明の範囲内である。好ましくは、未変性のセルロースシンターゼに対して機能活性が高められ、つまり改良された変異体が作られる。この目的に定方向進化の方法を使用できる。
【００３９】
本発明は、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基と置換されて保存的なアミノ酸置換となる、変更された配列を含む機能保存的変異体をも包含する。例えば、配列内の１種以上のアミノ酸残基は、機能的な等価物として作用する、類似極性の別のアミノ酸によって置換され、その結果サイレント変化となりうる。配列内におけるアミノ酸の置換は、該アミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択できる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンである。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。このような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又は等電点によって決定されるような見掛けの分子量に影響しないと考えられる。特に好ましい置換は以下である：（ｉ）Argに対してLys及びその逆で、正電荷を維持できる；（ii）Aspに対してGlu及びその逆で、負電荷を維持できる；（iii）Thrに対してSerで、遊離の-ＯＨを維持できる；及び（iv）Asnに対してGlnで、遊離のＣＯＮＨ2を維持できる。また、アミノ酸置換を導入して、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換することができる。例えば、Cysは、別のCysとのジスルフィド架橋の可能性部位として導入できる。Hisは、特定の「触媒作用」部位として導入できる（すなわち、Hisは酸又は塩基として作用でき、かつ生化学触媒作用で最も一般的なアミノ酸である）。Proを導入することができ、その特有の平面構造のため該タンパク質の構造内でｂ−ターンを生じさせる。
本発明のセルロースシンターゼは、セルロースシンターゼをコードするクローン化ポリヌクレオチドを発現させることによってのみならず、直接的なタンパク質精製法を用いても単離できる。これら方法は、当業者には明かだろう。
【００４０】
セルロースシンターゼプロモーターを含有するポリヌクレオチド
本発明は、さらにセルロースシンターゼプロモーターに関する。このプロモーターはストレス誘導性プロモーターであり、かつ植物、好ましくは樹木の高結晶性セルロースを多量に合成するのに使用できる。これにより、トランスジェニック植物中のセルロースの比率を高め、幼若の木部及び繊維の強度を高め、かつ全体的な成長速度を促進することができる。
【００４１】
一実施形態では、本発明のプロモーターはポプラス属植物由来であり、図４に提示されている。このプロモーター配列は、配列番号:3のヌクレオチド１〜840の領域内に位置している。当業者には、プロモーターの機能のためには全配列は必要でなく、かつ保存ボックスを探索し、また通常の欠失解析を行うことによって、容易に臨界領域を同定できることが判るだろう。従って、配列番号:1の機能的断片は、本発明の範囲内である。
低い、中間の、及び高いストリンジェンシーの条件下で配列番号:3にハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びその非コードタンパク質も本発明の範囲内である。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズする配列とほぼ同一長さであり、例えば、せいぜい約10〜約20ヌクレオチド長いか或いは短い。別の実施形態では、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、少なくとも約200ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約400ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、後述する方法で同定される少なくとも１つのMSRE要素を含む。
【００４２】
本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、典型的には木部における組織特異的な遺伝子制御を与えるのみならず、他の組織内、例えば引張ストレス下の師部でも遺伝子発現のアップレギュレーションを可能にする。さらに、セルロースシンターゼの発現は、植物のストレス下の領域に局在化される。
このストレス誘発性の現象は、正及び負の機械的ストレス応答要素（MSREs）によって制御される。これらMSREは、ストレス条件下、転写因子の結合を通じてセルロースシンターゼポリヌクレオチドの発現をアップレギュレーション（正）又はダウンレギュレーション（負）する。MSRE−制御されるセルロースシンターゼの発現は、高い結晶性のセルロースの合成を可能にする。
【００４３】
セルロースシンターゼのMSREは改変することができ、又は他のやり方で、トランスジェニック植物に対する機械的ストレス（例えば、引張又は圧縮）に応じて、MSREを含有するプロモーターに機能可能に連結したセルロースシンターゼを含む、ポリヌクレオチドの発現を制御する方法に使用することができる。
セルロースシンターゼプロモーターの負のMSREを改変し、除去又は遮断してセルロースシンターゼの発現を改良し、ひいてはセルロースの生産を増やし、かつ木の品質を改良することができる。代わりに、正のMSREを除去又は遮断して、セルロースシンターゼの発現を減らし、セルロースの生産を減少させ、かつリグニンの析出を増やすことができる。これは、リグニンがセルロースより高いBTU値を有するので、木材の燃料価値を高めるのに有用である。さらに、改変されたセルロースシンターゼプロモーターを関心のあるポリヌクレオチドに機能可能に連結して、それを保持する植物に対する機械的ストレスによる発現をコントロールすることができる。
【００４４】
配列番号:3内のMSRE要素の位置は、例えば、プロモーター欠失解析、DNAseフットプリント解析、及びMSRE用発現ライブラリのサウスウェスタンスクリーニングによって同定できる。一実施形態では、１個以上のタンパク質が欠失され、かつレポーター配列に機能可能に連結されているセルロースシンターゼプロモーターが、植物又は植物細胞中に導入される。正のMSREは、植物にストレスを誘発後トランスジェニック植物又は組織、例えば師部内でリポーターの量が相対的に変化しないか或いは増加するのを観測することで検出され、かつ負のMSREは、植物に対して何らストレスがない場合に植物内のレポーターの量が増加するのを観測することによって検出される。正の要素は、それを除去することによってGUS発現が下がり、それを加えることによって同レベル以上で維持されるときに検出される。負の要素はGUSの発現を援助或いは抑制せず、かつ、それを除去することによって、負の要素が存在するときに比し、通常の又は増強されたGUS発現が観察される。
【００４５】
MSRE結合部位の操作及び／又はその部位に結合する転写因子を供給することが、トランスジェニック植物の木質の植物細胞壁内で高い結晶性セルロースを連続的に生成するための機序を与える。例えば、当業者は負のMSRE要素を欠失させ或いは阻害し、又は正のMSREを結合するタンパク質をコードするcDNAを供給して、機械的ストレスを必要とせずにセルロースシンターゼの構成的発現をさせることができる。セルロースシンターゼが増加され、ひいてはセルロース含量が高められ、幼若の木質部及び繊維の強度特性を改良することができる。また、正のMSREを欠失させ或いは遮断し、又はセンス方向では正のMSREを結合するタンパク質をコードするアンチセンス方向のcDNAを供給して、セルロースシンターゼ活性を減少させ、セルロース生産を減らすことができる。
【００４６】
セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの単離方法
本発明は、さらに、植物、例えば樹木のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを同定かつ単離することに関する（実施例で提供され、かつ図１及び図７に示されているポリヌクレオチドに加えて）。これらポリヌクレオチドは、木材のセルロース含量と特性を改善するという目的でセルロースシンターゼの発現を操作するために使用できる。
本方法は、プローブ又はプライマーとして配列番号:1又は4の断片を用いて、セルロースシンターゼ又はその一部をコードする配列を含有する核酸断片を同定することを含む。同定されると、セルロースシンターゼ又はその一部をコードする配列を含有する核酸断片が単離される。
本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、cDNA、又はそれらの断片であろうと、多くの供給源、特に植物、好ましくは樹木（例えば、ポプラ、モミジバフウ、テーダマツ、ユーカリ、及び他の被子植物及び裸子植物）由来のcDNA又はゲノムライブラリから単離することができる。セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを得る分子生物学的方法は、上述したように技術的に周知である（例えば、前出のSambrookら,1989参照）。
【００４７】
従って、どの種の植物由来の細胞も、本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの分子クローニング用の核酸源として役立つ可能性がある。DNAは技術的に公知の標準的な手順でクローン化DNA（例えば、DNA“ライブラリ”）から得ることができ、好ましくはセルロースシンターゼを高レベルで発現する組織（例えば、木部組織の細胞は非常に高レベルのCelAの発現を証明しているので、木部組織）から調製されたcDNAライブラリから、化学合成によって、又はcDNAクローニングによって、又は所望の細胞から精製されたゲノムDNA、若しくはその断片のクローニングによって得られる（例えば、Sambrookら,1989,前出；Glover,D.M.(ed.),DNAクローニング：実用的アプローチ,MRL Press,Ltd.,Oxford,U.K.Ｉ,II巻を参照せよ）。ゲノムDNAに由来するクローンは、コード領域に加えて制御及びイントロンDNA領域を含みうる；cDNAに由来するクローンはイントロン配列を含まない。供給源が何であれ、ポリヌクレオチドは、その増殖用に適したベクター中に分子的にクローン化されるべきである。
【００４８】
ゲノムDNAから本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを分子クローニングするための他の実施形態では、DNA断片は、植物由来のような関心のあるゲノム、又はさらに具体的には樹木ゲノムで、その一部が所望のポリヌクレオチドに対応しているゲノムから生成される。DNAは、種々の制限酵素を用いて特異的部位で切断することができる。代わりに、マンガンの存在下で該DNAを断片化するためにDNAseを使用することができ、又は例えば超音波処理によってのように物理的にDNAをせん断することができる。そして、サイズによって、アガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びカラムクロマトグラフィー（これらに限定されない）を含む標準的な方法で、直鎖状DNA断片を分離できる。
【００４９】
DNA断片が生成されると、所望のCelA配列を含有する特異的なDNA断片の同定は、多くの手段で達成することができる。例えば、ある量のCelA配列若しくはその特異的ＲＮＡの一部、又はそれらの断片を利用でき、かつ精製して標識化できる場合、その生成されたDNA断片は、標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングされうる（Benton及びDavis,1977,Science 196:180；Grunstein及びHogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72:3961）。例えば、樹木由来のCelAタンパク質に対して得られた部分的なアミノ酸配列の情報に対応する１組のオリゴヌクレオチドを調製し、かつセルロースシンターゼをコードするDNA用のプローブとして、又はcDNA若しくはmRNA用のプライマーとして（例えば、RT-PCR用のpoly-Tプライマーと組み合わせて）使用できる。好ましくは、UDP−グルコース結合領域のような、本発明のセルロースシンターゼに高度に特異的な断片が選択される。該プローブに対して実質的に相同性であるそれらDNA断片がハイブリダイズする。上述したように、相同性の度合が増すほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用できる。より具体的な実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて、樹木又は他の植物由来のCelA相同配列を同定できる。
【００５０】
従って、一実施形態では、例えば、Populus tremuloides（ヤマナラシ）由来の標識化セルロースシンターゼcDNA（PtCelA）を用いて、植物、特に被子植物及び裸子植物のいろいろな種由来の遺伝子又はDNA断片のライブラリを探査し、何れかが本発明のCelAに結合しているかどうかを決定することができる。遺伝子又は断片が同定さると、それらを標準的なＰＣＲ法で増幅し、ベクター、例えばpBluescriptベクター（Lajolla,CAのStrataGene）中でクローン化し、また細菌、例えばDH5α大腸菌株（Gaithersburg,MDのGibco BRL）へ形質転換することができる。典型的には、細菌コロニーを試験して、何れかがセルロースシンターゼをコードする核酸を含むかどうかを決定する。結合性を通じて陽性クローンが同定されると、それは末端、好ましくは３'末端から配列決定される。
【００５１】
Stratagene,Lajolla,CAから入手可能なlambda ZAPIIのような種々の宿主内で、ポプラス属植物の師部から単離されたpoly(A)＋ＲＮＡを用いて、Bugosらによって記載された方法（Biotechnique 19:734-737,1995）に従い、cDNAライブラリを構築することができる。上述のプローブを用いてポプラス属植物のcDNAライブラリを検定し、セルロースシンターゼの産生に関与する酵素についてコードするcDNAを位置づけることができる。セルロースシンターゼ配列が位置づけられると、それは技術的に公知の方法でクローン化されて配列決定される。
【００５２】
遺伝子の特性に基づいて、例えば、該遺伝子が上述したような本発明のセルロースシンターゼタンパク質の等電点、電気泳動、ヒドロパシープロット、アミノ酸組成、又は部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質生成物をコードする場合、さらに選択を実行することができる。従って、該遺伝子の存在は、その発現された生成物の物理的、化学的、又は免疫学的特性に基づいた分析によって検出することができる。例えば、適切なmRNAをハイブリッド選択するcDNAクローン又はDNAクローンを用いて、本発明のセルロースシンターゼについて知られるのと同様の特性を有するタンパク質を生成することができる。このような特性としては、例えば、同様な又は同一の電気泳動的移動パターン、等電点電気泳動若しくは非平衡ｐＨゲル電気泳動の挙動、タンパク質消化マップ、ヒドロパシープロット、又は機能特性（単離された機能的なUDP−グルコース結合ドメインのような）が挙げられる。
【００５３】
本発明のセルロースシンターゼポリヌクレオチドは、mRNA選択によって、、すなわち核酸ハイブリダイゼーション後インビトロ翻訳によっても同定することができる。この手順では、ヌクレオチド断片を使用して、ハイブリダイゼーションによって相補的なmRNAを単離する。このようなDNA断片は、入手可能な精製されたCelA DNAを意味し、又は部分的なアミノ酸配列の情報から設計された合成オリゴヌクレオチドであってよい。単離されたmRNA生成物のインビトロ翻訳生成物の機能分析（例えば、UDP−グルコース活性）によって、mRNA、ひいては所望の配列を含む相補的DNA断片を同定する。
放射能標識されたCelA cDNAは、鋳型として任意のmRNAを用いて合成することができる。そして、その放射能標識されたmRNA又はcDNAをプローブとして用いて、他のゲノムDNA断片の中からCelA DNA相同断片を同定することができる。
本発明のCelAに加え、他のポリヌクレオチドをCelAプロモーターに操作的に連結して、機械的ストレスの適用によるポリヌクレオチドの発現をコントロールできることが理解されるだろう。
【００５４】
CelA ポリペプチドの発現
キメラタンパク質を含むCelA、またはその機能的断片、誘導体もしくはアナログをコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、即ち、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入し得る。好ましくは、発現ベクターは、複製開始点を含む。上記の要素は、本明細書においては総称的に“プロモーター”と称する。即ち、本発明のCelAをコードする核酸は、本発明の発現ベクター中のプロモーターと機能可能に会合させ得る。cDNA配列およびゲノム配列は、共にクローン化することができ、そのような制御配列の制御下に発現させ得る。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、組換え発現ベクター上に付与でき、或いはCelAおよび/またはその側方領域をコードする本来の遺伝子によって供給できる。
CelAP以外に、セルロースシンターゼの発現は、当該技術において公知の任意のプロモーター/エンハンサー要素によって制御できるが、これらの調節要素は、発現に用いた宿主中で機能しなければならない。CelAポリヌクレオチド発現を制御するのに使用し得るプロモーターは、構成的、発生特異的および組織特異的のものがある。これらプロモーターの例としては、35Sカリフラワーモザイクウィルス、頂生花および４CL-1がある。即ち、実施者の求めに応じ、種々のプロモーターを用いて植物の成長を変化させる各種の方法がある。
【００５５】
上記ヌクレオチド配列は、実施者の要求に応じてセンスまたはアンチセンス方向に挿入し得る。例えば、セルロース生合成の増強を所望する場合、例えばセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター中にセンス方向に挿入してセルロースシンターゼ産生、即ちセルロース生合成を増大させ得る。また、セルロース生合成を低減させるか或いはリグニン含有量を増大させることを所望する場合、例えばセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、アンチセンス方向に挿入し、転写時に、アンチセンスmＲＮＡがセンス配向の他の相補性転写物にハイブリッド化して翻訳を防止するようにすることができる。他の実施態様においては、上記ポリヌクレオチドは、UDPグルコース結合性ドメインをコードし、上述したのと同様な方法で使用される。
【００５６】
本発明の組換えCelAタンパク質、またはその機能的断片、誘導体、キメラ構造体もしくはアナログは、組換えによるコード配列の組込み後に、染色体的に発現させ得る。この点については、上述したように、植物用の任意の多くの増幅系を用いて高レベルの安定遺伝子発現を達成できる。DNA断片のクローニングベクターへの挿入に関して前述した方法のどれかを用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルおよび上記タンパク質コード配列からなる遺伝子を含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成方法、およびインビボ組換え(遺伝子組換え)を含む。
【００５７】
本発明のCelAをコードする核酸を含有する発現ベクターは、4つの一般的方法によって同定できる：(a)所望プラスミドDNAまたは特異的mRNAのPCR増幅、(b)核酸ハイブリダイゼーション、(c)選択マーカー遺伝子機能の存在または不存在、(d)適切な制限エンドヌクリアーゼによる分析、および(e)挿入配列の発現。第1の方法においては、核酸をPCRにより増幅させて増幅生成物の検出を行うことができる。第2の方法においては、発現ベクター中に挿入した外来遺伝子の存在を、挿入マーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションにより検出できる。第3の方法においては、組換えベクター/宿主系を、ベクター中への外来遺伝子の挿入により生じたある種の“選択マーカー”遺伝子機能(例えば、β-グルクロニダーゼ活性、抗生剤に対する耐性、形質転換表現型等)の存在または不存在に基づいて同定し、選択できる。別の例においては、CelAをコードする核酸をベクターの“選択マーカー”遺伝子配列内に挿入した場合、CelA挿入物含有組換え体を、CelA遺伝子機能の不存在により同定できる。第4の方法においては、組換え発現ベクターを、適切な制限酵素による消化によって同定する。第5の方法においては、組換え発現ベクターを、組換体によって発現させた遺伝子産生物の活性、生化学特性または免疫学特性についてアッセイすることによって同定できるが、発現タンパク質は機能的活性コンフォメーションを想定することを条件とする。
【００５８】
特定の組換えDNA分子を同定し分離した後、当該技術において公知の幾つかの方法を用いてそのDNA分子を増殖させ得る。適切な宿主および増殖条件を確立させると同時に、組換え発現ベクターを増殖させ、量的に調製できる。前述したように、使用できる発現ベクターとしては、限定するものではないが、前述したベクターまたはその誘導体がある。
ベクターは、当該技術において公知の方法、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)介在形質転換(後でさらに詳細に説明する)、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって所望の宿主細胞中に導入する(例えば、Wu et el., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967；Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624；1990年3月15日に出願されたHartmut等のカナダ特許出願第2,013,311号を参照されたい)。
CelAをコードする核酸を含む組換えベクターが入った細胞は、この細胞によってCelAの発現を与える条件で、適切な細胞培地中で培養する。さらに、挿入配列の発現を調節し、或いは遺伝子産生物を所望する特異的な形で改変し加工する宿主細胞株を選択できる。種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳時および翻訳後の加工および改変(例えばシグナル配列のグリコシル化、開裂のような)において特徴的で且つ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系を選択して発現させた外来タンパク質の所望の改変および加工を確実にすることができる。
【００５９】
アグロバクテリウム介在形質転換および体性胚誘導
本発明において使用し、アグロバクテリウムを形質転換するための培地は、有効量の上述の培地成分(例えば、基本培地、増殖調節剤、炭素源)の各々を含有する。本発明を説明するのに使用するとき、ある培地成分の“有効量”とは、説明した効果を生ずるのに必要な量である。例えば、一次カルス増殖培地中の成長ホルモンの有効量は、他の培地成分と組合せたときにカルス形成を誘導させる成長ホルモンの量である。ビタミン類およびゲル化剤のような組織培養培地において有用であることが知られている他の成分も本発明の培地の任意成分として使用できる。
植物、例えば、樹木由来の細胞の形質転換、並びにその後の当該技術において公知であり本明細書においてさらに説明するアグロバクテリウム介在形質転換手法を使用するトランスジェニック植物の作製は、外来遺伝子を樹木に導入する方法の1例である。トランスジェニック植物は、下記の工程によるような種々の方法によって作製することができる：(i)アグロバクテリウムを低pH誘導培地中で低温で培養し予備調製する、即ち、バクテリアを癒傷タバコ葉抽出物と一緒に共培養して、その生成物がT-DNA転移体中に関与するアグロバクテリウムvir遺伝子の高レベルの発現を誘導する；(ii) 培養外植体から誘導した接合子性および/または体細胞性胚性組織のような所望植物組織を刺激したアグロバクテリウムと一緒に共培養する；(iii)抗生物質を含有する培地で形質転換カルス組織を選択する；および(v)上記の胚を苗木に転換する。
【００６０】
無害化(disarmed)Tiプラスミドを保持している任意の非腫瘍原性A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)株を本発明の方法において使用できる。任意のアグロバクテリウム系を使用できる。例えば、Tiプラスミド/バイナリーベクター系または1個のTiプラスミドを有する共組込みベクター系を使用できる。また、例えば、疾病に対する耐性を与える遺伝子またはセルロース含有量を改善する遺伝子のような、形質転換された細胞、カルス、胚または植物を選択する能力を与える任意のマーカー遺伝子またはポリヌクレオチド、並びに任意の他の遺伝子も使用できる。例えば、本発明のPtCelAPおよび上述したようなプロモーターのような任意の所望プロモーターも使用できる。当業者であれば、どのマーカーと遺伝子を特定の求めに応じて使用するのかは決定できることである。
本発明の目的において、“形質転換”または“トランスジェニック”とは、選択性のマーカー特性を与える少なくとも1個のマーカー遺伝子またはポリヌクレオチドを植物細胞、カルス、胚または植物のDNAに導入することを意味する。さらに、任意の遺伝子が導入されてよい。
【００６１】
上記バクテリアの感染性を増大させるためには、アグロバクテリウムを、低pH誘導培地、即ち、4.5〜6.0、最も好ましくは約5.2に調製したpH値を有する任意のバクテリア培養培地中で、例えば約19〜30℃、好ましくは約21〜26℃のような低温で培養する。この低pHおよび低温条件は、アグロバクテリウムに病原性活性を誘導するための良好に構成された臨界的要因内にある(例えば、Altmorbe et al., Mol. Plant-Microbe. Interac. 2: 301,1989；Fullner et al., Science 273: 1107, 1996；Fullner and Nester, J. Bacteriol. 178: 1498, 1996)。
上記バクテリアを癒傷タバコ葉抽出物(当該方法において一般に公知の方法に従って調製した)と一緒に共培養してアグロバクテリウムvir遺伝子の高レベル発現を誘導することによって予備調製する。植物の体細胞性胚の接種前に、アグロバクテリウム細胞は、インビトロ増殖させたタバコ植物の癒傷葉組織から調製したタバコ抽出物で処理してもよい。癒傷誘導代謝物および他の細胞因子によるアグロバクテリウムvir遺伝子の発現の最適刺激を達成させるためには、タバコ葉を癒傷させて、一夜予備培養してもよい。低pH培地における低温でのバクテリアの培養は、バクテリアvir遺伝子発現と感染性をさらに高めるのに使用できる。タバコ葉抽出物による予備調製およびT-DNA輸送課程に関与するvir遺伝子は、当該技術において一般によく知られたものである。
【００６２】
上述のようにして処理したアグロバクテリウムを、その後、例えば接合体性組織および/または体細胞性胚組織のような植物組織外植体と一緒に共培養する。非接合体性（即ち、体細胞性）または接合体性組織を使用できる。任意の植物組織を外植体源として使用できる。例えば、種子からの子葉、若葉組織、根組織、結節外植体のような茎の1部、および根軸のような1次体性胚からの組織を使用できる。一般に、幼若組織が好ましい外植体源である。
また、本発明は、結果として植物の成長を変化させる本発明のポリヌクレオチドを発現させることによって植物の成長を改変させる方法にも関する。本発明において使用するポリヌクレオチドは、同種ポリヌクレオチドでも異種ポリヌクレオチドでもよく、上記で詳細に説明した。例えば、全長およびUDPグルコース結合領域含有断片の両方を発現させ得る。さらに、本発明方法の目的に応じ、上記ポリヌクレオチドは、植物中にセンス配向またはアンチセンス配向で導入できる。任意の適切なプロモーターを用いて発現を実施し得る。プロモーターまたはその機能的断片を上記ポリヌクレオチドに機能可能に結合させる。このプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生特異的植物プロモーターであってよい。適切なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウィルス35S、４CL、セルロースシンターゼプロモーター、PtCelAPおよび頂生花プロモーターである。
【００６３】
さらに、本発明は、上述したような本発明のポリヌクレオチドを発現させることによって植物中のセルロース含有量を変化させる方法に関する。本発明方法は、本発明の外因性ポリヌクレオチドを導入した植物中のリグニンに対するセルロース比を増大させるのに使用できる。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを植物細胞中に導入しこのポリヌクレオチドを発現させることによって植物細胞中でのセルロースシンターゼの発現を変化させる方法に関する。上述したポリヌクレオチドおよびプロモーターを使用できる。
植物細胞中にストレス誘導性遺伝子発現を生じさせる方法も本発明の範囲に属する。この方法は、(i)植物または植物細胞中に、セルロースシンターゼプロモーターまたはその機能的断片を含む発現カセットを導入すること、或いは上記発現カセットを含む植物または植物細胞を提供すること(上記カセットのプロモーターは、選択したコード配列に機能可能に結合させる)；および(ii)機械的ストレスを植物に加えて所望の前記コード配列の発現を誘導させることを含む。
【００６４】
また、セルロースシンターゼプロモーター中の正の機械的ストレス応答性要素(MSRE)を測定する方法も、本発明の範囲に属し、(i)例えば配列番号:3のようなセルロースシンターゼプロモーター中の系列的欠失体を調製すること；(ii)レポーター配列をコードするポリヌクレオチドに結合させたこの欠失体を植物細胞中に導入すること；および(iii)ストレスを植物に誘導させた後、この植物中の前記レポーターの減少量を検出することを含む。同様に、セルロースシンターゼプロモーター中の負のMSREの測定方法も提供される。その方法は、(i)例えば配列番号:3のようなセルロースシンターゼプロモーター中の系列的欠失体を調製すること；(ii)レポーター配列をコードするポリヌクレオチドに結合させたこの欠失体を植物細胞中に導入すること；および(iii)ストレスを植物に誘導した後に、この植物中の前記レポーターの増大量を検出することを含む。
【００６５】
下記の各方法も本発明の範囲に属する：セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドに機能可能に結合させた組織特異性プロモーターで植物を形質転換させることを含む組織特異性様式でセルロースシンターゼを発現させる方法；植物中に、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコードするcDNAを導入し、それによってこの植物中にセルロース発現の増大をもたらすことを含み、前記正のMSREへの結合がセルロースシンターゼの発現を生じさせるものである、植物においてセルロースシンターゼ発現を誘導する方法；植物中にアンチセンス配向のcDNAを導入することを含み、センス配向の前記cDNAは正のMSREに結合するタンパク質をコードし且つセルロースシンターゼの発現を生じさせるものである、セルロースシンターゼ発現を低減させる方法；植物中に、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコードするcDNAを導入することを含み、この正のMSREへのタンパク質結合がセルロースシンターゼ発現を生じさせるものである、植物においてセルロース生合成を増大させる方法；および植物中にアンチセンス配向のcDNAを導入することを含み、センス配向の前記cDNAはセルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコードするもおんである、植物においてセルロース生合成を低減させる方法。
【００６６】
実施例
セルロースシンターゼの分子クローニング
本実施例は、RSW1 cDNAを用いてポプラス属(aspen)の木の発達中の二次木質部からクローン化した最初の樹木セルロースシンターゼcDNA (PtCelA、GenBank No. AF072131)を記載する。
本発明前には、作物由来のセルロースシンターゼの部分クローンおよび綿GhCelAが見出されているのみであり、これらは互いに有意の相同性を有している。本発明者等は、アラビドプシス(Arabidopsis)1次ライブラリー由来の新規な全長セルロースシンターゼcDNAであるAraxCelA(ジーンバンクNo. AF062485) (図7、[配列番号:4])を見出し、クローン化した。AraxCelAは、セルロースシンターゼの新規な1員であり、他のアラビドプシスCelAメンバーとアミノ酸配列において63〜85％の同一性と72〜90％の類似性を有する。
別のセルロースシンターゼを、ポプラス属植物中で、中心位置にUDPグルコース結合ドメインをコードするアラビドプシスCelA cDNAの32P標識した1651bp鎖長EcoRI断片を用いてクローン化し、ポプラス属植物 (Populus tremuloides（ヤマナラシ）)由来の約500,000 pfuの発達中の木質部cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した(Ge and Chiang, 1996)。4つの陽性クローンが3回のプラーク精製後に得られた。これら４つのcDNAの3'末端のシーケンシングは、これらが同一のクローンであることを示した。最長のcDNAクローンを十分にシーケンシングして3232 bpのヌクレオチド配列を有する全長cDNAであることを決定した(図1)[配列番号:1]；このクローンは、978個のアミノ酸のタンパク質をコードしている[配列番号:2]。
【００６７】
ポプラス属植物由来のセルロースシンターゼの特性決定
PtCelAの最初のAUGコドンは、Joshi(1987a)およびJoshi等(1997)によって開示された最適状況配列に基づき、転写開始について最適状況にあった。推定のポリアデニル化シグナル(AATACA)は、28 bpのポリアデニル化尾部上流の16 bpで見出され、これは、提案された植物構造(Joshi, 1987b)に類似している。5'の翻訳されていない先導部は、68 bpを有することが測定され、3'の翻訳されていない後続部は227 bpであった。これら領域は、共に多くの植物遺伝子において観察される典型的な長さを有する(Joshi, 1987aおよびJoshi, 1987b)。このcDNAクローンは、綿由来のセルロースシンターゼ(GhCelA)との90％のアミノ酸配列類似性、およびアラビドプシス由来のセルロースシンターゼ(RSW1)との71％類似性を示し、この特定の樹木ホモログもセルロースシンターゼをコードしていることを示唆した。
【００６８】
上記全長cDNAは、PtCelAと表示され、6.58の等電点(pI)および8個の荷電分子を有する110,278 Daのポリペプチドをコードしている。そのヒ疎水性曲線は、この特定のセルロースシンターゼが８個の膜貫通結合性ドメインを有することを示した；HoffmanおよびStoffelの方法(1993)を用いて、アミノ末端に2個、カルボキシル末端に6個。このタンパク質構造は、RSWlおよびGhCelAの構造と類似である。QVLRWおよび保存Ｄ残基のようなUDPグルコース結合のための保存ドメインのすべてが、本発明のセルロースシンターゼ、例えば、PtCelA中にも存在している(Brown et al., 1996)。即ち、配列および分子解析に基づき、PtCelAは、アラビドプシスにおけるRSWlのように、ポプラス属植物のセルロース生合成組織において不可欠である触媒性サブユニットをコードしているものと結論付けた。
【００６９】
茎の１次および２次成長によって形成された発生勾配に沿うPtCelA mRNA転写物のin situの局在決定は、セルロースシンターゼ発現が２次壁肥大を受ける発達中の木質部細胞に対して専ら確認されることを明らかにした。PtCelA遺伝子発現のこの細胞タイプ特異性は、異種プロモーター-β-グルクロニダーゼ(GUS)融合分析に基づくセルロースシンターゼプロモーター(PtCelAP)の木質部特異活性とも一致していた。結局、この結果は、セルロースシンターゼがポプラス属植物のような樹木の木質部における２次壁形成中のセルロース生合成に主として関与する遺伝子であることの数条の証しを提供するものである。本発明等による以前の結果(Hu et al., 1999)は、セルロースとリグニンが木材中で補償的な形で沈着していることを示していた。ポプラス属植物のような樹木中でのセルロースシンターゼの発見は、セルロース産生を上昇させるタンパク質のアップレギュレーションを可能にする。驚くべきことに、樹木中のCelAの発現は、リグニン生合成を抑制して樹木の木材特性をさらに改善した。
【００７０】
トランスジェニック植物の調製
UDP-グルコース結合性配列をpBI121にサブクローン化し、これを、トランスジェニックタバコ植物を調製するのに用いた(Hu et al., 1998)。異種UDP-グルコース結合性配列の発現は、著しい成長促進効果をもたらした。このことは、植物セルロースシンターゼの機能についての現在の知識においては、セルロースシンターゼがセルロース生合成を開始するためには、UDP-グルコース配列はCelA中の他の機能的ドメイン、例えば、膜貫通ドメインとインタクトのままでなければならないことが教示されていることから、驚くべきことである。トランスジェニックタバコにおいて観察された植物バイオマス中での著しい成長と恐るべき肥大は、セルロースの増大した沈着に基づいているようであり、UPDグルコース単独で植物中のセルロース生合成の遺伝子的増強において十分であることを示していた。
【００７１】
新規なセルロースシンターゼのゲノム機構と発現
図1のcDNAクローン[配列番号:1]がセルロースシンターゼであることを確認するため、ゲノムサザンブロット分析を、このcDNAを用いての高および低ストリンジェンシーの両条件下で行った。ポプラス属植物由来のゲノムDNAをPstI(レーンＰ)、HindIII(レーンＨ)およびEcoRI(レーンＥ)で消化し、図１のセルロースシンターゼの5'末端由来の1kb 32P-標識断片を用いてプロービングした。このサザンブロットは、ポプラス属植物ゲノム内の小群のセルロースシンターゼ遺伝子の小さなファミリーの存在を示唆した(図2、パネルaおよびｂ)。ポプラス属植物木質部cDNAライブラリーの各種植物CelA関連プローブによる繰り返しのスクリーニングは、同じセルロースシンターゼcDNAクローンの分離を常にもたらした。このことは、クローン化されたセルロースシンターゼcDNA(図１)[配列番号:1]が、活性なセルロース沈着が生ずる場合に、ポプラス属植物のような樹木の木質部発達において主要な、最も豊富なセルロースシンターゼコード遺伝子を表すことを示唆していた。また、セルロースシンターゼ遺伝子発現操作が樹木におけるセルロース生合成に深い影響を及ぼすことも示している。
【００７２】
in situ ハイブリダイゼーション
標識プローブ(上述したような)を用いたポプラス属植物の実生茎の節間からの総RNAのノーザンブロット分析(図2、パネルc)は、１次成長を受けた組織においてセルロースシンターゼ転写物が殆ど存在しないこと(節間1〜4)、およびセルロースシンターゼ転写物の存在は茎組織の2次成長中に生じていること(節間5〜11)を明らかにした。しかしながら、1次成長中の弱いノーザンシグナルは、セルロースシンターゼ遺伝子発現が１次成長組織においては殆ど存在しない木質部に特異性であることを示唆しているだけかもしれない。
高等植物における木部形成(xylogenesis)は、形成組織細胞分裂の順次的実行、木質部細胞分化へのコミットメント、および木質部細胞死の最盛期を含む、特有のモデルを提供する(Fukuda, 1996)。１次および2次木質部細胞は異なるタイプの形成組織、即ち、前形成層および束索間/束索内形成組織に由来しているけれども、両組織は、大量のセルロースおよびリグニン沈着を伴う顕著な２次壁発生を示す(Esau, 1965)。細胞レベルでの空間的および一時的セルロースシンターゼ遺伝子発現パターンをさらに試験するため、in situハイブリダイゼーションを用いてセルロースシンターゼmRNAを茎の１次および2次成長によって形成された発生勾配に沿って局在化させた。
【００７３】
種々の成長段階での茎中のセルロースシンターゼ遺伝子転写物(RNA)の局在化も観察された。図3は、説明したようなジゴキシゲニン(DIG)ラベル化セルロースシンターゼアンチセンスまたはセンス(対照)RNAプローブでハイブリッド化した第2、第4および第6節間からの横断面を示す。
PtCelA転写物を、PtCelA cDNAの高可変性5'領域(PstIおよびSacIから産生させた771 bp長鎖断片)の転写物によるin situハイブリダイゼーションによって若いポプラス属植物茎切片において検出した。この領域を、先ず、T7(アンチセンス転写物用)およびSP6(センス転写物用)RNAポリメラーゼ(DIG系；Boehringer Mannheim社)を用い、ジゴキシゲニン(DIG)ラベル化転写物を生成させるために、プラスミドベクター、pGEM,-3Zf (+) (Promega社)中にサブクローン化した。各プローブは、100 mM NaHCO3、pH 10.2中で60℃でのインキュベーションによる穏やかなアルカリ性加水分解に供し、約200 bpの断片を産生させた。
【００７４】
ポプラス属植物幼若茎を用い、100 mMリン酸塩緩衝液(pH 7.0)中の4％(w/v)パラホルムアルデヒド中で60℃で一夜固定化することによって切片化し、氷上のエタノール系で脱水し、パラプラスト(Paraplast)培地(Sigma社)中に埋め込んだ。10μm切片をスーパーフロスト/プラス(Superfrost/plus) (Fisher社)スライド上に42℃で一夜取付け、脱ワックスし、次いで勾配エタノール系で再水和させた。各切片をプロティナーゼＫ(100 mM Tris-HCl、50 mM EDTA、pH 7.5中10μg/ml)と一緒に30分間インキュベートし、FAAで後固定させた。各切片を、ハイブリダイゼーション前に、0.1 Mトリエタノールアミン-HCl(pH 8.0)中の0.33％(v/v)無水酢酸でアセチル化した。次いで、ハイブリダイゼーション混合物(約2μg/mlのDIG標識プローブ、50％(v/v)のホルムアミド、2 X SSPE、10％(w/v)硫酸デキストラン、125μg/mlのtRNA、pH 7.5)中で45℃、12〜16時間インキュベートした。ハイブリダイズしていない一本鎖RNAプローブを500 mM NaClを含むTE緩衝液中の20μg/mlのRNase Aによる処理によって除去した。ハイブリダイズしたDIG標識プローブを、製造業者の仕様書(DIG系；Boehringer Mannheim社)に記載されているように、1：1500希釈の抗ジゴキシゲニン抗血清を用いて検出した。各切片をEclipse 400光学顕微鏡(Nikon社)により検査し、写真撮影した。
【００７５】
１次成長段階(図3、パネルaおよびｂ)中に、セルロースシンターゼの強い発現が1次木質部(PX)細胞に専ら局在化して見出された。この段階においては、幼弱節間は、伸びる最中であり、２次壁の形成による1次木質部細胞の肥大化を生ずる(Esau, 1968)。苗条伸長とセルロースシンターゼの高発現の同時発生は、セルロースシンターゼタンパク質と2次細胞壁セルロース合成の相関を強く示唆している。1次成長の後期段階(図3、パネルｂ)は、1次木質部細胞の順序だった配列の出現に特徴を示す。活性なセルロース生合成は、これらの1次木質部細胞中でのセルロースシンターゼの強い発現によって示されるように、細胞伸長誘導性壁肥大化を伴う。
より成長した節間における2次成長の初期においては、セルロースシンターゼの発現は、ここでも、木質部細胞に専ら局在化していることが観察された(図3、パネルｃのSX)。分裂活性に遠位的な節間内の伸びの代りに、この段階での成長は、2次木質部の2次細胞壁の肥大化のために主としてラジカルである。同時に、PtCelA遺伝子の発現は、2次発生木質部細胞に局在化するようになり(図3、パネルｃ)、ここでも、PtCelAが2次細胞壁セルロースシンターゼをコードするという着想と一致している。この段階において、2次木質部細胞は、伸長し分化した1次木質部細胞を覆い、PtCelA遺伝子発現は最早検出できない(図3、パネルｃ)。これらの結果は、PtCelA遺伝子の発現が木質部特異性であり、図1のセルロースシンターゼ[配列番号:1]が木質部細胞の２次壁中でのセルロース生合成に関連するセルロースシンターゼをコードしていることを示唆している。セルロースシンターゼの木質部特異性発現をさらに確認するために、セルロースシンターゼ遺伝子プロモーター配列をクローン化し、制御活性について特性決定した。
【００７６】
セルロースシンターゼプロモーターによって制御された発現の特性解析
図1のセルロースシンターゼ5' 1,200 bp cDNA断片[配列番号:1]をプローブとして用いて新規なセルロースシンターゼ遺伝子、PtCelAの5'制御配列についてポプラス属植物ゲノムライブラリーをスクリーニングした。このライブラリーは、部分消化し蔗糖勾配選択したSau3AI消化物から生成したポプラス属植物ゲノムDNA断片をLambda DASH IIベクター(カリフォルニア州ラホヤのStratagene社)のBamHIサイト中にクローン化することによって構築した。5つの陽性クローンが約150,000 pfuから得られ、Lambda DNAを精製した。約20 kbのDNA挿入サイズを有する1つのクローンを制限マッピングおよび部分シーケンシング用に選択した。これによって、約1 kbのPtCelA遺伝子の5'側方領域の同定が得られた。PtCelAPと表示したこのゲノム断片(図4)[配列番号:3]は、約800 bpのプロモーター配列、68 bpの5'末端未翻訳領域および160 bpのコード配列を含有していた。細胞レベルでの組織特異性セルロースシンターゼ発現の制御を試験するために、プロモーター活性を、GUSタンパク質の組織化学染色によりトランスジェニックタバコ植物中で分析した。PtCelAP-GUS融合バイナリーベクターは、pBI121中でPtCelAP [配列番号:3]で置換した35Sプロモーターにより構築し、Hu等(1998年)に従ってタバコ(Nicotiana tabacum)に導入した。
【００７７】
CelAP-GUS融合を保持する11個の独立のトランスジェニック系を作製した。図5は、トランスジェニックタバコ植物中で本発明のセルロースシンターゼプロモーターにより駆動されたGUS発現の組織化学分析を示す。第3(パネルa)、第5(パネルｂ)、第7(パネルｃ)および第8(パネルｄおよびｆ)節間からの横断面をGUS活性により染色し、蛍光顕微鏡検査を用いてUV照射下に発現を可視化した。
GUS染色は、茎、根および葉柄の木質部組織において専ら検出された。茎においては、強いGUS活性が1次(図5、パネルa)および2次成長(図5、パネルｂ〜ｄおよびｆ)を受ける木質部細胞に局在化しているのが見出された。GUS発現は、1次成長段階においては木質部細胞に検定され、2次成長中の2次木質部細胞の発生においてより局在化するようになった。第8節間からの切片は、全体がGUS活性に対して染色した(図5、パネルｆ)。これらの結果は、ポプラス属植物茎中のセルロースシンターゼのインビボ発現パターンと一致している。リグニン自己蛍光はUV照射後に可視化した。師部繊維は、これもセルロースおよびリグニン生合成において活性である(図5、パネルｄおよびe)が、GUS活性を示さず、セルロースシンターゼ遺伝子発現は木質部以外のタイプの細胞中でのセルロース生合成とは関連しないことを示唆していた。根、茎、葉、葯および果実中のGUS活性試験も、これら器官全部の木質部組織中でGUS発現を示し、本発明のセルロースシンターゼが木質部特異性セルロースであり、植物器官全部において発現することを示唆していた。
【００７８】
1つの特定の源(ヤマナラシ)由来の本発明のセルロースシンターゼのプロモーター活性および細胞性発現の特性決定は、その発現が2次細胞壁特異性セルロースシンターゼをコードし、発達中の木質部細胞に特異的に区画化されるタンパク質を産生させることを示していた。セルロースシンターゼ遺伝子プロモーター配列の特性決定は、セルロースシンターゼの細胞タイプ特異的発現を確認することのみならず、セルロースシンターゼを組織特異な形で過剰発現させて木質部におけるセルロース産生を増強する方法も提供する。
【００７９】
引張りストレス下でのセルロースシンターゼの発現
前述したように、本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、セルロースシンターゼの新規な遺伝子制御現象に関連している。本発明のセルロースシンターゼをさらに特性決定するために、ポプラス属植物セルロースシンターゼプロモーター(PtCelAP)により誘導されたGUS発現を、トランスジェニックタバコ植物において引張りストレスなし、または引張りストレス下で観察した。そのストレスは、植物を曲げて押え、その曲げ位置にて40時間以上維持する(例えば、結ぶ)ことによって誘導した。接戦方向および縦(軸)方向切片を、曲げる前、および曲げた後の4時間、20時間および40時間で採取した(それぞれ、パネルa〜d)。
上記セルロースシンターゼプロモーターGUS融合バイナリー構築物は、引張りストレスなしでGUSの排他的木質部特異的発現を示した(図6、パネルa)。しかしながら、本来的に被子植物が耐える引張りストレス条件下では、上記トランスジェニックタバコ植物は、応力の最初の4時間以内で茎の上部に木質部および師部特異的発現を誘導した(図6、パネルｂ)。
【００８０】
これは、引張り中に木質部発達繊維が高結晶性のセルロースを産生して、曲っている茎に本質的機械強度を与えたので、驚くべき観察であった。本観察は、樹木中の高結晶性セルロース発生に直接関与するセルロースシンターゼプロモーターを介したセルロースシンターゼの転写アップレギュレーションの最初の提示であった。さらにまた、引張りストレス20時間後では、木質部と師部は共にGUS発現を示したが、引張りストレス下にある茎の上側のみであった；即ち、下側のGUS発現は抑制された(図6、パネルｃ)。延長されたストレス(40時間まで)においては、GUS発現は、最高の引張りストレスが存在する茎の上側上の1つの小領域のみに限られた(図6、パネルｄ)。引張りストレス下での木質部細胞中でのGUSシグナルの観察および圧縮下またはストレスなしでのGUSの不存在に基づき、本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、茎へのストレスの存在およびタイプによってセルロースシンターゼ遺伝子を刺激または抑制する機械的ストレス応答要素(MSRE)を有するものと結論付けた。
【００８１】
上記結果は、正のMSREが、引張りストレスに応答して転写因子を結合しセルロースシンターゼの発現を制御し、且つより高結晶性のセルロースの生合成を増大させる本発明のセルロースシンターゼプロモーター中に存在することを示している。このことは、引張りストレスに曝された茎の上側での木質部および師部組織中でのGUSの発現に基づき顕著であるが、下部側上の組織が圧縮に曝されるかまたは応力に曝されない場合にはそうではない。さらにまた、圧縮ストレスに曝された茎の下部側の組織はGUS発現を示さなかった、即ち、発現は抑制された。このことは、転写因子を結合して茎の下部側ではセルロースシンターゼの発現を抑制する負のMSREの存在を示した。負のMSREは、正常な樹木中の高結晶性セルロースの発生を抑制するようである。
【００８２】
これらの結果は、強度特性を向上させるための幼若樹木における高結晶性セルロースの遺伝子工学的合成、および反応樹木中での高割合のセルロースの合成におけるメカニズムを提供する。正のMSREおよびその同族転写因子は、高引張り強度を有する高結晶性セルロースの合成において重要であり、負のMSREおよびその同族転写因子の抑制も同様である。かくして、本発明は、当該技術において公知の方法に従って正および負のMSREに結合する転写因子に対してcDNAをクローニングする出発点を提供する。正のMSRE転写因子に対するcDNAの構成的発現は、トランスジェニック樹木中での高結晶性セルロースの連続産生を可能にし、一方、負のMSRE転写因子に対するアンチセンスcDNAの発現は、セルロースシンターゼが抑制し得ないように転写因子を抑制する。この組み合わせは、樹木中の高結晶性セルロースの連続産生を確約するであろう。
【００８３】
トランスジェニック植物中のセルロースシンターゼの遺伝子操作
上述したように、本発明のセルロースシンターゼのヌクレオチド配列、例えば、ポプラス属植物由来のPtCelA cDNAは、標準セルロースシンターゼクローンと言われているセルロースシンターゼタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと有意の相同性を示す。セルロースシンターゼ活性をさらに特性決定するために、4つの構築物をPBI121プラスミド中で調製した。
1) 構成的植物プロモーターカリフラワーモザイクウィルス35SをPtCelAに機能可能に結合させ(35SP-PtCelA-s)、トランスジェニック植物中で過剰発現させた。このことは、セルロースの過剰産生を生じ、リグニン含有量の低減をもたらす。タバコとポプラス属植物をこの構築物で形質転換させた。
2) カリフラワーモザイクウィルス35SをPtCelA由来のアンチセンスRNAに機能可能に結合させ((35SP-PtCelA-a)、構成的に発現させてトランスジェニック植物中のセルロース産生を低減させリグニン含有量を増大させた。このネガティブコントロール構築物は、セルロースが植物成長と発育に不可欠であるので、健全な植物を生じないことがある。ポプラス属植物植物をこの構築物で形質転換させた。
3) ポプラス属植物4CL-1プロモーター(Hu et al., 1998)をPtCelAに活機能可能に結合させ(Pt4CLP-PtCelA) (PBI121の35Sプロモーターは、この構築物においては除去した)、組織特異的様式で発達中のトランスジェニックポプラス属植物の2次木質部で発現させた。この発現は、被子植物組織の生来のセルロース産生を増強させ、リグニン含有量を低減させる。タバコとポプラス属植物をこの構築物で形質転換させた。
4) セルロース生合成の際にUDP-グルコース結合に関与すると教示されている３つの保存領域を含有するPtCelAの細胞質ドメインを35Sプロモーターに結合させてバイナリー構築物を作製した(35S-PtCelA UDP-グルコース)。このプロモーターによる発現は、トランスジェニック植物においてPtCelAのUDP-グルコース結合性ドメインの構成的発現を可能にする。タバコとポプラス属植物をこの構築物で形質転換させた。
【００８４】
35S-GUS構築物(pBI121、カリフォルニアのClon Tech社)を、各構築物による試験において対照として用いた。トランスジェニックタバコ植物を各構築物で形質転換した。下記の表は、T0タバコ植物の一般的成長測定値を示す。PtCelA構築物を担持する植物は、pBI121(対照)構築物を担持する対照植物よりもはるかに早く成長した。発生特異的4CLと構成的35SのプロモーターのPtCelA発現の制御の比較において、35Sの方がより効果的であり、トランスジェニックタバコ植物のより早い成長を可能にした。最も早い成長は、PtCelA由来の35Sプロモーター駆動UDP-Gドメインを担持するトランスジェニック植物において観察された。
T0世代植物が、その組織培養処理からの効果を持越し得ることに留意されたい。従って、種子を、T1世代におけるこの成長現象を試験するために収集した。トランスジェニックタバコ植物を導入遺伝子の存在について分析し、すべてが各々の遺伝子構築物に対して陽性であった。
【００８５】
【表１】
表
土壌に移植した後の約 1.5 ヶ月間のトランスジェニックタバコ植物測定値 (N=2)
注：すべての値は、葉の枚数を除いてcmで測定した。
【００８６】
当業者であれば、本発明の実施例および好ましい実施態様が例示的でり、本発明は同じ発明概念を有する種々の実施態様で実施し得ることを理解するであろう。
【００８７】
文献
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Higuchi, 1997, Biochemistry and Molecular Biology of Wood, Springer Verlag
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Populus tremuloides（ヤマナラシ）のセルロースシンターゼをコードする核酸配列（配列番号１）およびそのタンパク質配列（配列番号２）を示す。
【図２】 図２a-c（まとめて、図２という）は、図１に示したヤマナラシcDNAの断片をプローブとした、低いストリンジェンシー（パネルａ）および高いストリンジェンシー（パネルｂ）におけるヤマナラシゲノムDNAのサザンブロット解析、および、同じプローブを用いた幹の節間からのヤマナラシ全RNAのノーザンブロット解析を示す。
【図３】 図３a-d（まとめて図３という）は、第２節間（パネルａ）、第４節間（パネルｂ）、第６節間（パネルｃ）および第５節間（パネルｄ）からの横断切片におけるセルロースシンターゼ遺伝子転写物のin situ局在を示す。
【図４】 プロモーター領域およびコード配列の５'部分を含む、ヤマナラシセルロースシンターゼ遺伝子の５'領域の核酸配列を示す（配列番号３）。
【図５】 図５a-f（まとめて図５という）は、トランスジェニックタバコの、本発明のセルロースシンターゼプロモーターによって駆動されるGUS遺伝子発現についての組織化学的解析（パネルａ−ｄおよびｆ）および蛍光顕微鏡写真（パネルｅ）を示す。
【図６】 図６ａ−ｄ（まとめて図６という）は、本発明のヤマナラシセルロースシンターゼプロモーターによって駆動させるGUS遺伝子発現の組織化学的解析を示す；曲げる前（パネルａ）、および曲げた４時間後（パネルｂ）、20時間後（パネルｃ）および40時間後（パネルｄ）に接線方向および軸方向の切片を集めGUS発現について染色した。
【図７】 図７は、Arabidopsisから単離したセルロースシンターゼをコードするcDNAを示す（配列番号４）。
【図８】 図８は、図７に記載したcDNAによってコードされるArabidopsisセルロースシンターゼを示す（配列番号５）。
【配列表】
関連する出願の相互参照
本出願は、1999年、５月２１日出願の米国仮出願番号60/135,280の利益を要求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド分子、セルロースシンターゼのプロモーターおよびセルロースシンターゼポリペプチド、セルロースおよびリグニン生合成を遺伝的に改変する方法、および、樹木の幼若木質及び線維の強度特性を改善する方法に関する。本発明は更に、セルロースシンターゼプロモーター中の制御要素およびそのような制御要素に結合する転写因子を同定する方法、およびセルロースシンターゼプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチドの発現を増大させる方法に関する。
【０００３】
発明の背景
リグニンおよびセルロースは機械的強度および強固さを提供する植物細胞壁の主要な構築単位である。植物において、特に樹木において、これらの２つの有機物質は機械的強度、水輸送能および生物的および非生物的環境ストレスからの保護を与える動的平衡にある。通常、オーブン加熱した木材は30〜50％セルロース、20〜30％リグニンおよび20〜30％ヘミセルロース（Higuchi、1997）を含んでいる。
リグニンおよびセルロースの割合は天然環境の変動によって変化することが知られている。例えば、針葉樹の圧縮あて材(compression wood)発達の間に、リグニンのパーセンテージは30から40％に増加し、セルロース含量はそれに応じて40から30％に低下する（Timmell、1986）。逆に、被子植物の引張あて材（tension wood）においては、セルロースのパーセンテージは30から40％に増加し、一方、リグニン含量は30から20％に低下する（Timmell、1986）。
【０００４】
近年、リグニン生合成経路の組織特異的なキー酵素、4CLの遺伝的ダウンレギュレーションがトランスジェニックポプラス属(aspen)樹木においてリグニン含量を45％まで低下させることが発見された（Huら、1999）。このダウンレギュレーションはまた、セルロース含量において15％の増加を伴っていた。この逆が真であるならば、すなわち、セルロース生合成の遺伝的アップレギュレーションによってセルロース含量を増加させることがリグニン含量を低下させるのであれば、パルプ収率を増加させることができる。これによって、パルプ製造の際に大幅に化学的およびエネルギー的コストを削減することができるであろう。なぜならば、例えば、リグニンはパルプ製造過程で分解及び除去されなければならないからである。
セルロースはβ-D-1,4-結合したグルコース残基からなる直線状グルカンである。セルロースはUDP-グルコース単位の集合を触媒するセルロースシンターゼ酵素によって「パーティクルロゼット」として知られる原形質膜複合体において形成される（DelmerとAmor、1995）。セルロースシンターゼは８つの膜貫通結合ドメインによって膜にアンカーされ、植物細胞壁におけるセルロース生合成機構の基礎を形成すると考えられている（Pearら、1996）。
【０００５】
高等植物において、一次および二次細胞壁のセルロース微小繊維中のグルカン鎖はその重合の程度が異なっている（Brownら、1996）。例えば、二次細胞壁は高重合度のセルロースを含有していることが知られているが、一次細胞壁では重合の程度はそれより低い。別の例では、張力ストレスがかかっている木部細胞壁は、そのストレスに応答して、曲げた被子植物の上部に引っ張りあて材を形成する。これらの細胞では、非常に高い結晶性を有するセルロース量が上昇している。高度に結晶化したセルロースの形成は木部繊維の高い引っ張り強度を得るために重要である。同じ幹の下部の木部細胞壁は圧縮ストレスを受けるが、高度に結晶化したセルロースを生成しない。発達の過程における細胞壁の重合の程度のこのような変動は、グルコース単位を異なる擬似結晶配列に整える異なったセルロースシンターゼのためであると考えられている（HaiglerとBlanton、1996）。従って、トランスジェニック樹木から優れた強度特性を有する木材パルプの高い収率を得るために、高度に結晶化したセルロースの合成に関する分子的基礎を決定することは有利であろう。トランスジェニック樹木における高度結晶化セルロースの生成はまた、通常の樹木において形成される幼若木部の機械的強度特性を著しく改善するであろう。幼若材は機械的強度が劣るために一般には固体木材応用に望ましくないので、このことは工業に大きな利益となるであろう。
【０００６】
樹木におけるセルロースおよびリグニンの沈着は補償的様式で制御されているため、セルロース生合成の遺伝的増強はリグニン沈着に対して抑制的効果を有するかもしれない。重合度および結晶度はセルロース生合成機構に取り込まれているセルロースシンターゼの型に依存することがあるため、異種セルロースシンターゼまたはそれらのUDP-グルコース結合領域の発現（例えば、テーダマツにおけるスイートガムタンパク質）は、トランスジェニック植物においてセルロースの品質を増加することができるであろう。また、異種セルロースシンターゼの過剰発現はトランスジェニック植物のセルロース量を増加させるかもしれない。従って、セルロース生合成の遺伝的操作はトランスジェニック植物においてセルロース品質及び量を増強し、一方、リグニン含量を低下させるためのストラテジーを提供することができる。
【０００７】
木質部形成に至る生化学的過程をよりよく理解することにより、パルプおよび紙工業はより効率的に、減少する生産面積からの木材に対する増大する要求を満たす道具として遺伝的操作を利用できるであろう。この目的で、大部分のリグニン生合成遺伝子を含む多くの木部特異的遺伝子が樹木種を含む種々の植物の発達中の木部組織から単離されている（YeとVarner、1993；Fukuda、1996；Whettenら、1998）。樹木に対して穀物植物においてセルロース生合成を制御する遺伝子はすでに単離されている（Pearら、1996およびArioliら、1998）。しかしながら、セルロース生合成に直接関与する樹木の遺伝子の単離は今だ難題を残している。
【０００８】
30年以上の間、高等植物のセルロースシンターゼをコードする遺伝子(CelA)は同定されていない。近年、Pearら(1996)は、活性な二次壁セルロース合成を有する綿線維から調製したcDNAライブラリー中で、UDP-グルコース結合配列を探索することにより最初に推定的高等植物CelA cDNA、GhCelA（GenBank No. GHU58283）を単離した。GhCelは、綿線維中で強く発現しており、二次壁セルロースを盛んに合成しており、８つの膜貫通ドメインを有し、UDP-グルコースに結合し、植物に固有の他の２つのドメインを有していたので、セルロースシンターゼ触媒サブユニットをコードすると考えられた。
近年、Arioliら(1998)は、CelAホモログ、RSW1（放射方向膨潤）（GenBank No.AF027172）を、Arabidopsis（アラビドプシス）から温度感受性セルロース欠損変異株の欠損遺伝子座への染色体ウォーキングによってクローン化した。rsw1変異株の野生型完全長ゲノムRSW1クローンによる相補は正常な表現型を回復した。この相補性は、植物CelA遺伝子がセルロースシンターゼの触媒サブユニットをコードし、セルロース微小繊維の生合成において機能することの最初の遺伝子的証拠を与えるものである。完全長Arabidopsis RSW1は、トランスジェニック系において更にセルロース生合成を明らかにするために利用できる、現在知られた唯一の入手可能なセルロースシンターゼcDNAである(Wuら、1998)。
【０００９】
RSW1遺伝子の発見は、セルロースシンターゼの原形質膜への集合は機能的セルロース生合成機構および植物細胞壁において結晶セルロース微小線維を生成するために必要だという考えを実証した。最も重要なことに、単一のCelA遺伝子、例えばRSW1は、植物、例えばArabidopsisにおけるセルロース微小繊維の生合成に充分である。従って、RSW1はトランスジェニック植物においてセルロース形成の増強を操作するための主要な標的である。
社会の線維、化学的およびエネルギー的需要の多くは木材からの工業的規模のセルロース生産によって満たされているため、樹木のセルロース生合成機構の遺伝的操作はより高いパルプ収率を生成することができるであろう。このことにより、パルプ及び製紙工業による投資に対するより大きな利益還元を可能とするであろう。従って、木材の特性を改善するためにセルロース生合成に関与する遺伝子を樹木から単離し、特性解析することは利益であろう。
【００１０】
発明の概略
本発明はセルロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ストレス誘導性プロモーターを含むセルロースシンターゼの制御配列、セルロースシンターゼタンパク質またはその機能的ドメイン、および植物においてセルロース生合成を増強する方法に関する。
従って、一つの側面において、本発明はセルロースシンターゼをコードする配列を含むポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチド断片、UDP-グルコース結合ドメインのようなセルロースシンターゼの機能的ドメインをコードする断片を提供する。本発明はまた、セルロースシンターゼまたは、UDP-グルコース結合ドメインおよび８つの膜貫通ドメインの少なくとも一つを含めて、その機能的ドメイン又は断片を提供する。本発明は更に、セルロースシンターゼプロモーターまたは、１以上の機械的ストレス応答要素(MSRE)を含むその機能的断片を提供する。
【００１１】
別の側面では、本発明は植物細胞のセルロース量を改変し、および、場合により細胞中のリグニンの含量を低下させることによる木材の品質を改善する方法に関する。本発明はまた、セルロースシンターゼまたはそのUDP-グルコース結合ドメインをコードする外来性ポリヌクレオチドを植物で発現させることにより植物の生長およびセルロース含量を改変する方法に関する。本発明は更にストレス誘導性セルロースシンターゼプロモーターを用いて選択したポリヌクレオチドを発現させることによる、植物細胞におけるストレス誘導性遺伝子発現を生じさせる方法を提供する。
更に別の側面では、本発明はセルロースシンターゼプロモーター中の機械的ストレス応答要素(MSRE)を決定する方法およびおよびMSREに結合する転写因子を同定する方法に関する。
【００１２】
更なる側面において、本発明は、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合する特性を有する転写因子をコードする外来性ポリヌクレオチドを発現させる、または、負のMSREに結合する特性を有する転写因子をコードするアンチポリヌクレオチドを発現させてその転写因子の発現を阻害することにより、セルロースシンターゼの発現を改変（増加又は減少）、すなわち、制御する方法を提供する。
本発明の他の側面は、本発明の詳細な説明及び、図面および添付の請求の範囲を考慮することによって理解できるであろう。
【００１３】
発明の詳細な説明
この明細書で挙げるすべての特許、特許出願及び参照文献は、引用によりその全体が本明細書に取り込まれるものとする。何らかの不一致がある場合は、本開示が優先する。
（定義）
この明細書で使用する用語は、本発明の文脈内で、また各用語が用いられる特有の文脈で技術的に通常の意味を有する。特定の用語については、以下に或いは本明細書の他のどこかで説明し、本発明の組成物と方法及びそれらの作り方と用い方を述べる上で当業者にさらに手引きを提供する。同一の物が１つの方法以外で言われることがあることは理解されるだろう。その結果として、本明細書で議論されるいずれの１つ以上の用語についても代替の言葉及び同義語が用いられることがあり、またある１つの用語が本明細書で詳述され、又は議論されるとしても何らかの特定の意義が置かれるものではない。特定の用語については同義語が与えられる。１つ以上の同義語は他の同義語を排除するものではない。この明細書のどこかで例を使用するときは、本明細書で議論されるどの用語の例をも含め、説明のためだけであり、決して本発明及びどの例示された用語の範囲と意味を制限するものではない。同様に、本発明は好ましい実施形態によっても制限されない。
【００１４】
用語「植物」は、植物全体及び植物器官（例えば、根、茎、葉等）を含む植物の部分を含む。
用語「被子植物」は、子房に包まれた種子を生成する植物を意味する。被子植物の特定の例はLiquidambar styraciflua（Ｌ．）[モミジバフウ]である。
用語「裸子植物」は、裸の種子、すなわち子房に包まれていない種子を生成する植物を意味する。裸子植物の特定の例としては、Pinus taeda（Ｌ．）[テーダマツ]が挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、一本又は二本鎖ゲノム、cDNA、ＲＮＡ、何らかの合成的及び遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、及び一緒に若しくは個々にセンスとアンチセンス鎖の両方を包含するものである（ここでは、センス又はアンチセンス鎖のみが提示されるかもしれないが）。これは、一本鎖及び二本鎖分子、すなわちDNA−DNA、DNA−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのみならず、塩基をアミノ酸骨格に結合することによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）をも包含する。これは、例えばチオ−ウラシル、チオ−グアニン及びフルオロ−ウラシルのような修飾された塩基を含有する核酸をも包含する。
【００１５】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合はその自然環境）から離されている成分を意味する。単離された核酸又はポリペプチドは、それが最初に結合されていた細胞成分を、約50％未満、好ましくは約75％未満、最も好ましくは約90％未満含むことがある。ＰＣＲによって増幅され、その細胞成分の残りから十分かつ容易に区別できる（例えば、ゲル上で）ポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされる。本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、「実質的に純粋」、すなわち技術的に公知の精製法を用いて達成できる最高度の純度を有する。
【００１６】
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基の対合によって相補鎖と結合するプロセスを意味する。あるポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖が所定のストリンジェンシー条件下で別のポリヌクレオチドの鎖にアニールできる場合、ポリヌクレオチドは相互に「ハイブリッド可能」である。ハイブリダイゼーションは、２つのポリヌクレオチドが実質的に相補的配列を含む必要があり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって決まるが、ミスマッチは許容されうる。典型的には、高いストリンジェンシー（例えば、65℃の0.5Ｘ ＳＳＣの水溶液中におけるような）での２つの配列のハイブリダイゼーションは、それら配列がその全配列に渡ってかなり高度の相補性を示す必要がある。中間のストリンジェンシー（例えば、65℃の２Ｘ ＳＳＣの水溶液のような）及び低い厳密性（例えば、55℃の２Ｘ ＳＳＣの水溶液のような）の条件は、そのハイブリダイズする配列間で全体的に対応して相補的である必要性は少ない。（１Ｘ ＳＳＣは、0.15Ｍ ＮａＣｌ、0.015Ｍ Ｎａシトレート。）ここで使用する場合、上記溶液及び温度はハイブリダイゼーション手順のプローブ洗浄段階を指す。用語「ストリンジェントな（低い、中間の）条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、一本鎖のみが別のポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするとはいえ、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの両方を包含するものである。
【００１７】
「配列保存的変異体」は、別のポリヌクレオチドと比較して与えられたコドン位置で１つ以上のヌクレオチドが変化しているが、その変化は当該位置でコードされるアミノ酸にいかなる変化もきたさないようなポリヌクレオチドである。
「機能保存的変異体」は、限定するものではないが、同様の物理化学的性質（例えば、酸性、塩基性、疎水性等のような）を有するものとアミノ酸の置換を含む、ポリペプチドの全体的なコンホメーション及び機能を変えることなく、変化させられた与えられたアミノ酸残基を有するポリペプチド（又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）である。同様の物理化学的性質を有するアミノ酸は技術的に周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり、相互交換可能である。同様に、疎水性のアミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン又はバリンと置換できる。配列−及び機能保存的変異体については、遺伝コードの縮重に関連してさらに詳しく後述する。
【００１８】
「機能的ドメイン」又は「機能的断片」は、タンパク質又はポリペプチド又はポリヌクレオチドのいずれかの領域又は部分を意味し、より大きいタンパク質又はポリヌクレオチドの領域又は部分であり、その領域又は部分は、より大きいタンパク質又はポリヌクレオチドに起因しうる特有の活性又は特有の機能を有しており、例えば、セルロースシンターゼの機能的ドメインはUDP−グルコース結合ドメインである。
用語「％同一性」は、Genetics Computer Group Wisconsin（ＧＣＧ）パッケージのプログラムＧＡＰ（バージョン9.0）（マジソン，WI）によって同定されるような、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが別の配列のヌクレオチド／アミノ酸と同一であるポリヌクレオチド／ポリペプチドのヌクレオチド／アミノ酸のパーセンテージを意味する。ＧＡＰは、Needleman及びWunsch（J.Mol.Biol 48:443-453,1970）のアルゴリズムを使用して、好一対の数を最大にし、かつギャップ数を最少にする、２本の完全配列のアラインメントを見つける。上記アルゴリズムを実行するのに必要なパラメータが特定されないときは、プログラムによって提供されるデフォルト値が考慮される。デフォルト値として（ポリヌクレオチドに対して）次のパラメータがＧＣＧプログラムＧＡＰで使用される：ギャップ創造ペナルティ：50；ギャップ拡張ペナルティ：３；スコアリングマトリックス：nwsgapdna.cpm（ローカルデータファイル）。
【００１９】
２本のポリペプチド配列間の「％類似性」又は「％相同性」は、２本の配列で共有される類似位置の数の関数であり、使用するスコアリングマトリックスを基準として比較される位置の数で除してから100が掛けられる。この比較は、２本の配列が整列され（必要な場合ギャップを導入して）、最大の相同性を決定するときに行われる。米国国立バイオテクノロジー情報センターによって実施されるPowerBlastプログラムを使用して最適なギャップドアラインメントを計算できる。Genetics Computer Group WisconsinパッケージのＧＡＰプログラム（バージョン9.0）（マジソン,WI）も使用できる。ＧＡＰは、Needleman及びWunsch（J.Mol.Biol 48:443-453,1970）のアルゴリズムを使用して、好一対の数を最大にし、かつギャップ数を最少にする、２本の完全配列のアラインメントを見つける。上記アルゴリズムを実行するのに必要なパラメータが特定されないときは、プログラムによって提供されるデフォルト値が考慮される。デフォルト値として（ポリペプチドに対して）次のパラメータがＧＣＧプログラムＧＡＰで使用される：ギャップ創造ペナルティ：12；ギャップ拡張ペナルティ：４；スコアリングマトリックス：Blosum62.cpm（ローカルデータファイル）。
【００２０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に少なくとも10、好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは少なくとも20ヌクレオチドの核酸であり、遺伝子、mRNA、cDNA、又は関心のある核酸とは別の核酸をコードするゲノムDNA分子、cDNA分子、又はmRNA分子にハイブリダイズ可能な核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば32Ｐ−ヌクレオチド又はビオチンのような標識が共有結合されているヌクレオチドによって標識することができる。一実施形態では、標識されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド（標識されうる１つ又は両方）をＰＣＲプライマーとして使用して、全長若しくはCelAの断片をクローニングし、又はCelAをコードする核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、CelA DNA分子と三重らせんを形成できる。さらに別の実施形態では、シリコンウエハ又はチップのような固体支持体上に配置されるオリゴヌクレオチドのライブラリを用いて、関心のある種々の多型性を検出できる。一般的に、オリゴヌクレオチドは合成によって、好ましくは核酸シンセサイザーで調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等のような天然に存在しないリン酸エステル類似体結合で調製されうる。
【００２１】
用語「コード配列」は、ポリペプチドをコードするための情報を含む、遺伝子の当該部分を意味する。コード配列の境界は、５'（アミノ）末端における開始コドンと、３'（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、限定するものではないが、原核生物の配列、原核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物の（例えば、哺乳類の）DNA由来のゲノムDNA配列、及び均一合成のDNA配列が挙げられる。
【００２２】
「プロモーター」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合でき、かつ下流（３'方向）のコード配列の転写を開始できる要素（例えば、ＴＡＴＡボックス）を含むポリヌクレオチドである。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列は、その３'末端で転写開始部位によって制限され、かつ上流（５'方向）に伸長して、バックグラウンドを越えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な塩基又は要素の最小数を包含する。プロモーター配列内で、転写開始部位（例えばヌクレアーゼS1でマッピングすることによって好都合に定義される）、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見つけられる。本発明で使用できるプロモーターの例としては、PtCelAP、4CL-1及び35Sが挙げられる。
【００２３】
用語「構成的プロモーター」は、典型的には、結合したコード配列の発現を活性化するために正の制御タンパク質を必要としないプロモーターを意味し、すなわち構成的プロモーターは発現のいくらかの基礎的レベルを維持している。一般に、構成的プロモーターは発現カセットの創造に使用される。構成的プロモーターの例は、Clonetech,Palo Alto,CAから入手可能な35S CaMV（カリフラワーモザイクウイルス）である。
用語「誘導性プロモーター」は、関連コード配列の発現を活性化するために正の制御を必要とするプロモーターを意味する。このようなプロモーターの例は、本明細書で述べられるポプラス属植物由来のストレス誘発性のセルロースシンターゼプロモーターである。
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写するときに、細胞内で転写及び翻訳制御配列の「制御下」にあり、それからトランス−ＲＮＡスプライシングされて、そのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される。
【００２４】
「ベクター」は、本発明のポリヌクレオチドが結合されうるプラスミド、ファージゲノム、ウイルスゲノム、コスミド、又は人工染色体のような組換え核酸構築物である。特有の実施形態では、ベクターは、例えばクローニングベクターの場合、結合されているセグメントの複製を惹起しうる。
用語「発現カセット」は、該発現カセットを細胞中に挿入すると、与えられたタンパク質の発現が達成されるようなプロモーター及びタンパク質コード配列の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。
細胞は、外来性又は異種ポリヌクレオチドによって、このようなポリヌクレオチドが細胞の内側に導入されたとき「トランスフェクション」される。細胞は、このトランスフェクションされたポリヌクレオチドが表現型変化を生じた場合に、外来性又は異種ポリヌクレオチドによって「形質転換」される。好ましくは、この形質転換するポリヌクレオチドは、該細胞のゲノムを構成している染色体DNA中に組み込まれる（共有結合される）べきである。
【００２５】
「外来性」とは、細胞から単離されていて、その後同一又は異なる細胞中に導入される、ポリヌクレオチド又はタンパク質のような生体物質を指す。例えば、本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、特定種の樹木の木部細胞からクローン化され、プラスミド中に挿入され、かつ同種又は異種の木部細胞中に再導入されうる。従って、この種は外来性のセルロースシンターゼポリヌクレオチドを含有する。
「異種ポリヌクレオチド」とは、それが導入される細胞内には天然に存在しない外来性のポリヌクレオチドを意味する。
「同種ポリヌクレオチド」とは、それが導入される細胞内に天然に存在する外来性のポリヌクレオチドを意味する。
【００２６】
本発明は、植物、特に樹木由来のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの単離及び特徴づけに関し、セルロースシンターゼの全長又は天然に存在する形態、機能的ドメイン、プロモーター及び制御要素を包含する。従って、本発明により、本技術のスキル内で従来の分子生物学、微生物学、及び組換えDNA技術を利用できる。このような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook,Frisch＆Maniatis,分子クローニング：実験室マニュアル、第２版(1989)Cold Spring Harabor Laboratory Press,Cold Spring Harabor New York（本明細書では“Sambrookら,1989”）；DNAクローニング：実用的アプローチ,Ｉ及びII巻（D.N.Glover版1985）；オリゴヌクレオチド合成（M.J.Gait版1984）；核酸ハイブリダイゼーション[B.D.Hames＆S.J.Higgins版(1985)]；転写と翻訳[B.D.Hames＆S.J.Higgins版(1984)]；動物細胞培養[R.I.Freshney版(1986)]；固定化細胞及び酵素[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,分子クローニングへの実用ガイド(1984)；F.M.Ausubelら(版),分子生物学における現在のプロトコル,John Wiley＆Sons,Inc.(1994)を参照せよ。
【００２７】
本発明は、新規な全長セルロースシンターゼ遺伝子（CelA）、セルロースシンターゼの新規なストレス誘導性プロモーター（CelAP）、及び樹木由来のセルロースシンターゼタンパク質に関し、それらのUDP−グルコース触媒ドメインを含む。本発明は、セルロース含量が増加され、リグニン含量が低減され、ひいては木繊維特性が改良されたトランスジェニック樹木の変種開発を可能にする。さらに、操業可能な生産計画において、商業的に適切なトランスジェニック森林樹木の色々な種でセルロースの量と質を高める生産が熟考される。さらに、本発明は、樹木中におけるCelA遺伝子の発現及び機能の研究用の新しい実験システムを提供する。
【００２８】
セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びその断片
本発明は、本発明のセルロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列又はその機能的断片を含むポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは樹木セルロースシンターゼをコードする配列、最も好ましくはポプラス属植物由来のセルロースシンターゼをコードする配列を含む。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、完全なセルロースシンターゼコード領域、例えば配列番号:1のヌクレオチド69〜3,005を含む。本発明の別の局面では、Arabidopsisセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドが提供される（配列番号:4及び配列番号:5の翻訳されたタンパク質を参照せよ）。
【００２９】
また、本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの断片も本発明の範囲内であり、この断片は少なくとも１種の膜貫通ドメイン及び／又はUDP−グルコース結合ドメインをコードする。例えば、ポプラス属植物セルロースシンターゼのUDP−グルコース結合ドメインをコードするヌクレオチド（例えば、配列番号:1のヌクレオチド660〜2250）又は配列番号:4の対応するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは本発明の範囲内である。UDP−グルコース結合ドメインをコードするヌクレオチドは、例えば、後述するようなタンパク質配列のアラインメントによって決定することができる。
本発明は、さらに配列番号:1及び4のコードタンパク質の配列保存的変異体に関する。
【００３０】
低い、中間の、及び高いストリンジェンシーの条件下で配列番号:1及び4にハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらのそれぞれのコード部分も本発明の範囲内である。好ましくは、配列番号:1及び4、又はそれらのそれぞれのコード部分のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、当該配列とほぼ同一長さであり、例えば、せいぜい約10〜約20ヌクレオチド長いか或いは短い。本発明の別の実施形態では、このハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、少なくとも1500ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも2500ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも3000ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、このハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、配列番号:1若しくは4に見られるようなUDP−グルコース結合ドメイン、又は少なくとも保存領域QVLRWを含む。最も好ましくは、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、UDP−グルコース結合活性を有する。
【００３１】
本来天然に存在するポリヌクレオチドは、本明細書に記載され或いは技術的に周知な方法によって、それらを含有する生物体から単離することができる。天然に存在しないポリヌクレオチドは、組換えDNAの分野で公知の種々の操作によって調製することができる。例えば、クローン化CelAポリヌクレオチドは、Sambrookら,1989に記載された方法に従って改変できる。配列は、試験管内で適切な部位で制限酵素により切断され、その後所望によりさらに酵素修飾され、単離され、かつ連結されうる。改変ポリヌクレオチドの生産では、例えば、その改変ポリヌクレオチドが適切な翻訳読取り枠内に確実に留まるように（発現されるべき場合）、又は翻訳停止信号によって中断されないように注意を払うべきである。さらなる実施例として、CelAをコードする核酸配列は、インビトロ又はインビボ変異されて、翻訳、開始、及び／又は終止配列を創造及び／又は破壊し、或いはコード領域内で変異を引き起こし、及び／又は新しい制限酵素部位を形成し或いは既存の部位を破壊して、さらにインビトロ改変を促進することができる。好ましくは、このような変異は、その変異されたCelAポリヌクレオチドの機能活性を高める。技術的に公知のいずれの突然変異誘発法も使用でき、限定するものではないが、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson,C.ら,1978,J.Biol.Chem. 253:6551；Zoller及びSmith,1984,DNA３:479-488；Oliphantら,1986,遺伝子 44:177；Hutchinson,C.ら1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83:710)、ＴＡＢリンカーの使用（Pharmacia）等が挙げられる。ＰＣＲ法は、部位特異的突然変異誘発に好ましい（Higuchi,1989,“ＰＣＲを用いてDNAを操作する”,ＰＣＲ技術：DNA増幅の原理と応用,H.Erlich版,Stockton Press,６章,61〜70ページ参照）。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドは、植物又は非植物の複製用に適合する種々のベクター中に導入することができる。これらは技術的に周知であり、従ってこのようなベクターの選択、構築及び使用は本技術の当業者の十分スキル内である。可能なベクターとしては、限定するものではないが、植物のプラスミド又は改変ウイルスが挙げられるが、ベクター系は使用する宿主細胞と適合しなければならない。好適なベクターの例は、Tiプラスミドである。例えば、クローニングベクター中への挿入は、そのDNA断片を、相補的付着末端を有するクローニングベクター中に連結させることによって達成される。しかし、DNA断片に使用される相補的制限部位がクローニングベクター内に存在しない場合、DNA分子の末端は酵素的に修飾されうる。代わりに、所望のいずれの部位もヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端上に連結することによって生成することができ；これら連結されたリンカーは、制限酵素認識配列をコードする特異的に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含みうる。セルロースシンターゼ又はその組換え分子を含有する発現カセットは、炭化ケイ素ウィスカー、形質転換プロトプラスト、形質転換、例えばAgrobacterium（アグロバクテリウム）ベクター（後述する）、エレクトロポレーション、インフェクション等によって宿主細胞中に導入され、該遺伝子配列の多くの複製が生成される。好ましくは、このクローン化遺伝子はシャトルベクタープラスミド上に収容され、クローニング細胞、例えば大腸菌中における増殖、及び所望によって引き続き適切な発現細胞系中に挿入するために簡易精製に供される。例えば、１種類より多くの生物体内で複製可能なベクターであるシャトルベクターは、大腸菌プラスミド由来の配列を酵母菌２ｍプラスミド由来の配列と連結することによって、大腸菌と酵母(Saccharomyces cerevisiae)の両方での複製用に調製される。
【００３３】
ここで記載されるポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック植物もまた本発明の範囲内である。外来性ポリヌクレオチドを植物細胞中に導入し、トランスジェニック植物を再生する方法は周知である。いくつかについて、以下に述べる。
一実施形態では、本発明のCelAコード配列又はプロモーターを含有するプラスミドを植物中に導入するため、選択可能なマーカー発現カセット含有プラスミドDNAと、セルロースシンターゼ発現カセット含有プラスミドDNAとの１：１混合物を金と共に沈殿させて微小射出物を形成する。この微小射出物を無水エタノール中ですすぎ、アリコートをHercules,CAのBioRadから入手可能なマクロキャリヤーのようなマクロキャリヤー上で乾燥させる。照射前に、胚性組織は、好ましくは無菌の層流フード下乾燥される。この乾燥された組織が半固体の増殖培地に移される。調製された微小射出物が、BioRad PDS-1000/HE粒子銃のような適宜の装置を用いて、マクロキャリヤーから乾燥標的細胞中に加速される。好ましい方法では、各プレートは一度照射されると180度回転され、２度めの照射をされる。好ましい照射パラメータは、9.31×106Pa(1350psi)の破裂板圧、破裂板とマクロキャリヤーとの距離（ギャップ距離）が６mm、１cmのマクロキャリヤー移動距離、及びマクロキャリヤー停止スクリーンと培養プレートとの距離（ミクロキャリヤー移動距離）が10cmである。そして、照射後、ハイグロマイシンＢのような選択薬剤を含有する半固体の増殖培地に２日間移される。
【００３４】
セルロースシンターゼタンパク質及びその断片
本発明のセルロースシンターゼは、グルコースからグルカンを合成するためのUDP−グルコース結合活性を有する触媒的サブユニットと、セルロースシンターゼを細胞膜に局在化させるための８個の膜貫通ドメインとを含む植物タンパク質である。本発明のセルロースシンターゼは、８個の膜貫通結合ドメインを有しており；２個はアミノ末端に、６個はカルボキシル末端にある。UDP−グルコース結合ドメインは、膜貫通ドメイン２と３の間に位置する。このタンパク質構造の例は、ポプラス属植物のセルロースシンターゼのみならず、RSW1及びGhCelAのセルロースシンターゼにも見られる。膜貫通ドメインの位置は後述され、かつ実施例で例示されるように同定することができる。好ましくは、本発明のセルロースシンターゼは樹木のセルロースシンターゼのアミノ酸配列を有する。
【００３５】
一実施形態では、本発明のセルロースシンターゼタンパク質はポプラス属植物(aspen)から単離される。このポプラス属植物のセルロースシンターゼは、約978個のアミノ酸を含み、かつ約110kDaの分子量と約6.58のpIを有する。一実施形態では、このポプラス属植物のセルロースシンターゼは、図１に示されるように配列番号:2のアミノ酸配列を有する。別の局面では、本発明は配列番号:5のセルロースシンターゼに関する。
さらに、本発明は、少なくとも１種の膜貫通領域及び／又はUDP−グルコース結合ドメインを含有する断片のような、植物セルロースシンターゼの断片に関する。膜貫通領域は、Hoffmann及びStoffelの方法（1993）を用いることによって、実施例で述べるように同定することができる。
【００３６】
UDP−グルコース結合ドメインを含有するセルロースシンターゼ断片は、該タンパク質の残り部分がなくても機能的する。この分離可能な活性は実施例に示されるとおりである。この結果は、以前に同定されたUDP−グルコース結合ドメインは、そのタンパク質の他の部分から単離された場合に機能するとは知られていなかったので驚くべきことであり、かつ予想外だった。従って、UDP−グルコース結合ドメインを含み、かつ独立して機能的である（PtCelA、RSW1、GhCelA及び配列番号:5のような）いずれのセルロースシンターゼの断片も本発明の範囲内である。UDP−グルコース結合ドメインの機能は、実施例で述べる分析によって決定できる。本発明のUDP−グルコース結合ドメインは、セルロースシンターゼの第２及び第３の膜貫通領域間に位置し、配列QVLRW及び保存Ｄ残基のようなUDP−グルコース結合のためのアミノ酸配列を保存していた。このUDP−グルコース結合ドメインとここに保存されている領域は、本明細書の指導及び本技術の一般知識、例えばBrown,1996を使用して、セルロースシンターゼ内に配置することができる。一実施形態では、UDP−グルコース結合ドメイン及びここに保存されている領域は、本明細書に記載され或いは本技術で一般的に公知のアルゴリズムを用いて、問題のセルロースシンターゼのアミノ酸配列と、ポプラス属植物のセルロースシンターゼのアミノ酸配列とを比較することによって同定することができる。例えば、配列番号:2のUDP−グルコース結合ドメインは、アミノ酸220〜749の位置にある。保存QVLRW配列は、配列番号:2の715〜719位に位置する。
【００３７】
上述のPower Blast又はＧＡＰアルゴリズムを用いて、配列番号:2、配列番号:2のアミノ酸220-749、配列番号:5又はそのUDP−グルコース結合ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、最も好ましくは少なくとも95％の類似性を有するポリペプチド。好ましい実施形態では、これらポリペプチドは、配列番号:2又は配列番号:2のアミノ酸220〜749のポリペプチドとほど同一長さである。例えば、このポリペプチドは約２〜３乃至約５〜７及び約10〜15アミノ酸分長いか或いは短い。別の実施形態では、このパラグラフで述べているポリペプチドは、Arabidopsis又はワタには本来見られ（すなわち、天然に存在し）ない。これらポリペプチドは、例えば、技術的に周知の方法で配列番号:2又は配列番号:5のタンパク質をコードするクローン化ポリヌクレオチドの核酸配列を変えることによって調製できる。
【００３８】
また、セルロースシンターゼの機能保存的変異体も本発明の範囲内であり、かつセルロースシンターゼ又はその断片をコードするクローン化ポリヌクレオチドの配列を変えることによって調製できる。本技術で使用されている従来法を用いて１種以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を行って、機能的に等価の分子を与えることができる。例えば、UDP−グルコース結合ドメインの外側で、該タンパク質のアミノ及び／又はカルボキシル末端に置換、欠失及び／又は付加のある機能保存的変異体は、本発明の範囲内である。好ましくは、未変性のセルロースシンターゼに対して機能活性が高められ、つまり改良された変異体が作られる。この目的に定方向進化の方法を使用できる。
【００３９】
本発明は、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基と置換されて保存的なアミノ酸置換となる、変更された配列を含む機能保存的変異体をも包含する。例えば、配列内の１種以上のアミノ酸残基は、機能的な等価物として作用する、類似極性の別のアミノ酸によって置換され、その結果サイレント変化となりうる。配列内におけるアミノ酸の置換は、該アミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択できる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンである。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。このような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又は等電点によって決定されるような見掛けの分子量に影響しないと考えられる。特に好ましい置換は以下である：（ｉ）Argに対してLys及びその逆で、正電荷を維持できる；（ii）Aspに対してGlu及びその逆で、負電荷を維持できる；（iii）Thrに対してSerで、遊離の-ＯＨを維持できる；及び（iv）Asnに対してGlnで、遊離のＣＯＮＨ2を維持できる。また、アミノ酸置換を導入して、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換することができる。例えば、Cysは、別のCysとのジスルフィド架橋の可能性部位として導入できる。Hisは、特定の「触媒作用」部位として導入できる（すなわち、Hisは酸又は塩基として作用でき、かつ生化学触媒作用で最も一般的なアミノ酸である）。Proを導入することができ、その特有の平面構造のため該タンパク質の構造内でｂ−ターンを生じさせる。
本発明のセルロースシンターゼは、セルロースシンターゼをコードするクローン化ポリヌクレオチドを発現させることによってのみならず、直接的なタンパク質精製法を用いても単離できる。これら方法は、当業者には明かだろう。
【００４０】
セルロースシンターゼプロモーターを含有するポリヌクレオチド
本発明は、さらにセルロースシンターゼプロモーターに関する。このプロモーターはストレス誘導性プロモーターであり、かつ植物、好ましくは樹木の高結晶性セルロースを多量に合成するのに使用できる。これにより、トランスジェニック植物中のセルロースの比率を高め、幼若の木部及び繊維の強度を高め、かつ全体的な成長速度を促進することができる。
【００４１】
一実施形態では、本発明のプロモーターはポプラス属植物由来であり、図４に提示されている。このプロモーター配列は、配列番号:3のヌクレオチド１〜840の領域内に位置している。当業者には、プロモーターの機能のためには全配列は必要でなく、かつ保存ボックスを探索し、また通常の欠失解析を行うことによって、容易に臨界領域を同定できることが判るだろう。従って、配列番号:1の機能的断片は、本発明の範囲内である。
低い、中間の、及び高いストリンジェンシーの条件下で配列番号:3にハイブリダイズするポリヌクレオチド、及びその非コードタンパク質も本発明の範囲内である。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズする配列とほぼ同一長さであり、例えば、せいぜい約10〜約20ヌクレオチド長いか或いは短い。別の実施形態では、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、少なくとも約200ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約400ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも500ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、後述する方法で同定される少なくとも１つのMSRE要素を含む。
【００４２】
本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、典型的には木部における組織特異的な遺伝子制御を与えるのみならず、他の組織内、例えば引張ストレス下の師部でも遺伝子発現のアップレギュレーションを可能にする。さらに、セルロースシンターゼの発現は、植物のストレス下の領域に局在化される。
このストレス誘発性の現象は、正及び負の機械的ストレス応答要素（MSREs）によって制御される。これらMSREは、ストレス条件下、転写因子の結合を通じてセルロースシンターゼポリヌクレオチドの発現をアップレギュレーション（正）又はダウンレギュレーション（負）する。MSRE−制御されるセルロースシンターゼの発現は、高い結晶性のセルロースの合成を可能にする。
【００４３】
セルロースシンターゼのMSREは改変することができ、又は他のやり方で、トランスジェニック植物に対する機械的ストレス（例えば、引張又は圧縮）に応じて、MSREを含有するプロモーターに機能可能に連結したセルロースシンターゼを含む、ポリヌクレオチドの発現を制御する方法に使用することができる。
セルロースシンターゼプロモーターの負のMSREを改変し、除去又は遮断してセルロースシンターゼの発現を改良し、ひいてはセルロースの生産を増やし、かつ木の品質を改良することができる。代わりに、正のMSREを除去又は遮断して、セルロースシンターゼの発現を減らし、セルロースの生産を減少させ、かつリグニンの析出を増やすことができる。これは、リグニンがセルロースより高いBTU値を有するので、木材の燃料価値を高めるのに有用である。さらに、改変されたセルロースシンターゼプロモーターを関心のあるポリヌクレオチドに機能可能に連結して、それを保持する植物に対する機械的ストレスによる発現をコントロールすることができる。
【００４４】
配列番号:3内のMSRE要素の位置は、例えば、プロモーター欠失解析、DNAseフットプリント解析、及びMSRE用発現ライブラリのサウスウェスタンスクリーニングによって同定できる。一実施形態では、１個以上のタンパク質が欠失され、かつレポーター配列に機能可能に連結されているセルロースシンターゼプロモーターが、植物又は植物細胞中に導入される。正のMSREは、植物にストレスを誘発後トランスジェニック植物又は組織、例えば師部内でリポーターの量が相対的に変化しないか或いは増加するのを観測することで検出され、かつ負のMSREは、植物に対して何らストレスがない場合に植物内のレポーターの量が増加するのを観測することによって検出される。正の要素は、それを除去することによってGUS発現が下がり、それを加えることによって同レベル以上で維持されるときに検出される。負の要素はGUSの発現を援助或いは抑制せず、かつ、それを除去することによって、負の要素が存在するときに比し、通常の又は増強されたGUS発現が観察される。
【００４５】
MSRE結合部位の操作及び／又はその部位に結合する転写因子を供給することが、トランスジェニック植物の木質の植物細胞壁内で高い結晶性セルロースを連続的に生成するための機序を与える。例えば、当業者は負のMSRE要素を欠失させ或いは阻害し、又は正のMSREを結合するタンパク質をコードするcDNAを供給して、機械的ストレスを必要とせずにセルロースシンターゼの構成的発現をさせることができる。セルロースシンターゼが増加され、ひいてはセルロース含量が高められ、幼若の木質部及び繊維の強度特性を改良することができる。また、正のMSREを欠失させ或いは遮断し、又はセンス方向では正のMSREを結合するタンパク質をコードするアンチセンス方向のcDNAを供給して、セルロースシンターゼ活性を減少させ、セルロース生産を減らすことができる。
【００４６】
セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの単離方法
本発明は、さらに、植物、例えば樹木のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを同定かつ単離することに関する（実施例で提供され、かつ図１及び図７に示されているポリヌクレオチドに加えて）。これらポリヌクレオチドは、木材のセルロース含量と特性を改善するという目的でセルロースシンターゼの発現を操作するために使用できる。
本方法は、プローブ又はプライマーとして配列番号:1又は4の断片を用いて、セルロースシンターゼ又はその一部をコードする配列を含有する核酸断片を同定することを含む。同定されると、セルロースシンターゼ又はその一部をコードする配列を含有する核酸断片が単離される。
本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、cDNA、又はそれらの断片であろうと、多くの供給源、特に植物、好ましくは樹木（例えば、ポプラ、モミジバフウ、テーダマツ、ユーカリ、及び他の被子植物及び裸子植物）由来のcDNA又はゲノムライブラリから単離することができる。セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを得る分子生物学的方法は、上述したように技術的に周知である（例えば、前出のSambrookら,1989参照）。
【００４７】
従って、どの種の植物由来の細胞も、本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの分子クローニング用の核酸源として役立つ可能性がある。DNAは技術的に公知の標準的な手順でクローン化DNA（例えば、DNA“ライブラリ”）から得ることができ、好ましくはセルロースシンターゼを高レベルで発現する組織（例えば、木部組織の細胞は非常に高レベルのCelAの発現を証明しているので、木部組織）から調製されたcDNAライブラリから、化学合成によって、又はcDNAクローニングによって、又は所望の細胞から精製されたゲノムDNA、若しくはその断片のクローニングによって得られる（例えば、Sambrookら,1989,前出；Glover,D.M.(ed.),DNAクローニング：実用的アプローチ,MRL Press,Ltd.,Oxford,U.K.Ｉ,II巻を参照せよ）。ゲノムDNAに由来するクローンは、コード領域に加えて制御及びイントロンDNA領域を含みうる；cDNAに由来するクローンはイントロン配列を含まない。供給源が何であれ、ポリヌクレオチドは、その増殖用に適したベクター中に分子的にクローン化されるべきである。
【００４８】
ゲノムDNAから本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを分子クローニングするための他の実施形態では、DNA断片は、植物由来のような関心のあるゲノム、又はさらに具体的には樹木ゲノムで、その一部が所望のポリヌクレオチドに対応しているゲノムから生成される。DNAは、種々の制限酵素を用いて特異的部位で切断することができる。代わりに、マンガンの存在下で該DNAを断片化するためにDNAseを使用することができ、又は例えば超音波処理によってのように物理的にDNAをせん断することができる。そして、サイズによって、アガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びカラムクロマトグラフィー（これらに限定されない）を含む標準的な方法で、直鎖状DNA断片を分離できる。
【００４９】
DNA断片が生成されると、所望のCelA配列を含有する特異的なDNA断片の同定は、多くの手段で達成することができる。例えば、ある量のCelA配列若しくはその特異的ＲＮＡの一部、又はそれらの断片を利用でき、かつ精製して標識化できる場合、その生成されたDNA断片は、標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングされうる（Benton及びDavis,1977,Science 196:180；Grunstein及びHogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72:3961）。例えば、樹木由来のCelAタンパク質に対して得られた部分的なアミノ酸配列の情報に対応する１組のオリゴヌクレオチドを調製し、かつセルロースシンターゼをコードするDNA用のプローブとして、又はcDNA若しくはmRNA用のプライマーとして（例えば、RT-PCR用のpoly-Tプライマーと組み合わせて）使用できる。好ましくは、UDP−グルコース結合領域のような、本発明のセルロースシンターゼに高度に特異的な断片が選択される。該プローブに対して実質的に相同性であるそれらDNA断片がハイブリダイズする。上述したように、相同性の度合が増すほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用できる。より具体的な実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて、樹木又は他の植物由来のCelA相同配列を同定できる。
【００５０】
従って、一実施形態では、例えば、Populus tremuloides（ヤマナラシ）由来の標識化セルロースシンターゼcDNA（PtCelA）を用いて、植物、特に被子植物及び裸子植物のいろいろな種由来の遺伝子又はDNA断片のライブラリを探査し、何れかが本発明のCelAに結合しているかどうかを決定することができる。遺伝子又は断片が同定さると、それらを標準的なＰＣＲ法で増幅し、ベクター、例えばpBluescriptベクター（Lajolla,CAのStrataGene）中でクローン化し、また細菌、例えばDH5α大腸菌株（Gaithersburg,MDのGibco BRL）へ形質転換することができる。典型的には、細菌コロニーを試験して、何れかがセルロースシンターゼをコードする核酸を含むかどうかを決定する。結合性を通じて陽性クローンが同定されると、それは末端、好ましくは３'末端から配列決定される。
【００５１】
Stratagene,Lajolla,CAから入手可能なlambda ZAPIIのような種々の宿主内で、ポプラス属植物の師部から単離されたpoly(A)＋ＲＮＡを用いて、Bugosらによって記載された方法（Biotechnique 19:734-737,1995）に従い、cDNAライブラリを構築することができる。上述のプローブを用いてポプラス属植物のcDNAライブラリを検定し、セルロースシンターゼの産生に関与する酵素についてコードするcDNAを位置づけることができる。セルロースシンターゼ配列が位置づけられると、それは技術的に公知の方法でクローン化されて配列決定される。
【００５２】
遺伝子の特性に基づいて、例えば、該遺伝子が上述したような本発明のセルロースシンターゼタンパク質の等電点、電気泳動、ヒドロパシープロット、アミノ酸組成、又は部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質生成物をコードする場合、さらに選択を実行することができる。従って、該遺伝子の存在は、その発現された生成物の物理的、化学的、又は免疫学的特性に基づいた分析によって検出することができる。例えば、適切なmRNAをハイブリッド選択するcDNAクローン又はDNAクローンを用いて、本発明のセルロースシンターゼについて知られるのと同様の特性を有するタンパク質を生成することができる。このような特性としては、例えば、同様な又は同一の電気泳動的移動パターン、等電点電気泳動若しくは非平衡ｐＨゲル電気泳動の挙動、タンパク質消化マップ、ヒドロパシープロット、又は機能特性（単離された機能的なUDP−グルコース結合ドメインのような）が挙げられる。
【００５３】
本発明のセルロースシンターゼポリヌクレオチドは、mRNA選択によって、、すなわち核酸ハイブリダイゼーション後インビトロ翻訳によっても同定することができる。この手順では、ヌクレオチド断片を使用して、ハイブリダイゼーションによって相補的なmRNAを単離する。このようなDNA断片は、入手可能な精製されたCelA DNAを意味し、又は部分的なアミノ酸配列の情報から設計された合成オリゴヌクレオチドであってよい。単離されたmRNA生成物のインビトロ翻訳生成物の機能分析（例えば、UDP−グルコース活性）によって、mRNA、ひいては所望の配列を含む相補的DNA断片を同定する。
放射能標識されたCelA cDNAは、鋳型として任意のmRNAを用いて合成することができる。そして、その放射能標識されたmRNA又はcDNAをプローブとして用いて、他のゲノムDNA断片の中からCelA DNA相同断片を同定することができる。
本発明のCelAに加え、他のポリヌクレオチドをCelAプロモーターに操作的に連結して、機械的ストレスの適用によるポリヌクレオチドの発現をコントロールできることが理解されるだろう。
【００５４】
CelA ポリペプチドの発現
キメラタンパク質を含むCelA、またはその機能的断片、誘導体もしくはアナログをコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、即ち、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入し得る。好ましくは、発現ベクターは、複製開始点を含む。上記の要素は、本明細書においては総称的に“プロモーター”と称する。即ち、本発明のCelAをコードする核酸は、本発明の発現ベクター中のプロモーターと機能可能に会合させ得る。cDNA配列およびゲノム配列は、共にクローン化することができ、そのような制御配列の制御下に発現させ得る。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、組換え発現ベクター上に付与でき、或いはCelAおよび/またはその側方領域をコードする本来の遺伝子によって供給できる。
CelAP以外に、セルロースシンターゼの発現は、当該技術において公知の任意のプロモーター/エンハンサー要素によって制御できるが、これらの調節要素は、発現に用いた宿主中で機能しなければならない。CelAポリヌクレオチド発現を制御するのに使用し得るプロモーターは、構成的、発生特異的および組織特異的のものがある。これらプロモーターの例としては、35Sカリフラワーモザイクウィルス、頂生花および４CL-1がある。即ち、実施者の求めに応じ、種々のプロモーターを用いて植物の成長を変化させる各種の方法がある。
【００５５】
上記ヌクレオチド配列は、実施者の要求に応じてセンスまたはアンチセンス方向に挿入し得る。例えば、セルロース生合成の増強を所望する場合、例えばセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター中にセンス方向に挿入してセルロースシンターゼ産生、即ちセルロース生合成を増大させ得る。また、セルロース生合成を低減させるか或いはリグニン含有量を増大させることを所望する場合、例えばセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、アンチセンス方向に挿入し、転写時に、アンチセンスmＲＮＡがセンス配向の他の相補性転写物にハイブリッド化して翻訳を防止するようにすることができる。他の実施態様においては、上記ポリヌクレオチドは、UDPグルコース結合性ドメインをコードし、上述したのと同様な方法で使用される。
【００５６】
本発明の組換えCelAタンパク質、またはその機能的断片、誘導体、キメラ構造体もしくはアナログは、組換えによるコード配列の組込み後に、染色体的に発現させ得る。この点については、上述したように、植物用の任意の多くの増幅系を用いて高レベルの安定遺伝子発現を達成できる。DNA断片のクローニングベクターへの挿入に関して前述した方法のどれかを用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルおよび上記タンパク質コード配列からなる遺伝子を含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成方法、およびインビボ組換え(遺伝子組換え)を含む。
【００５７】
本発明のCelAをコードする核酸を含有する発現ベクターは、4つの一般的方法によって同定できる：(a)所望プラスミドDNAまたは特異的mRNAのPCR増幅、(b)核酸ハイブリダイゼーション、(c)選択マーカー遺伝子機能の存在または不存在、(d)適切な制限エンドヌクリアーゼによる分析、および(e)挿入配列の発現。第1の方法においては、核酸をPCRにより増幅させて増幅生成物の検出を行うことができる。第2の方法においては、発現ベクター中に挿入した外来遺伝子の存在を、挿入マーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションにより検出できる。第3の方法においては、組換えベクター/宿主系を、ベクター中への外来遺伝子の挿入により生じたある種の“選択マーカー”遺伝子機能(例えば、β-グルクロニダーゼ活性、抗生剤に対する耐性、形質転換表現型等)の存在または不存在に基づいて同定し、選択できる。別の例においては、CelAをコードする核酸をベクターの“選択マーカー”遺伝子配列内に挿入した場合、CelA挿入物含有組換え体を、CelA遺伝子機能の不存在により同定できる。第4の方法においては、組換え発現ベクターを、適切な制限酵素による消化によって同定する。第5の方法においては、組換え発現ベクターを、組換体によって発現させた遺伝子産生物の活性、生化学特性または免疫学特性についてアッセイすることによって同定できるが、発現タンパク質は機能的活性コンフォメーションを想定することを条件とする。
【００５８】
特定の組換えDNA分子を同定し分離した後、当該技術において公知の幾つかの方法を用いてそのDNA分子を増殖させ得る。適切な宿主および増殖条件を確立させると同時に、組換え発現ベクターを増殖させ、量的に調製できる。前述したように、使用できる発現ベクターとしては、限定するものではないが、前述したベクターまたはその誘導体がある。
ベクターは、当該技術において公知の方法、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)介在形質転換(後でさらに詳細に説明する)、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって所望の宿主細胞中に導入する(例えば、Wu et el., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967；Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624；1990年3月15日に出願されたHartmut等のカナダ特許出願第2,013,311号を参照されたい)。
CelAをコードする核酸を含む組換えベクターが入った細胞は、この細胞によってCelAの発現を与える条件で、適切な細胞培地中で培養する。さらに、挿入配列の発現を調節し、或いは遺伝子産生物を所望する特異的な形で改変し加工する宿主細胞株を選択できる。種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳時および翻訳後の加工および改変(例えばシグナル配列のグリコシル化、開裂のような)において特徴的で且つ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系を選択して発現させた外来タンパク質の所望の改変および加工を確実にすることができる。
【００５９】
アグロバクテリウム介在形質転換および体性胚誘導
本発明において使用し、アグロバクテリウムを形質転換するための培地は、有効量の上述の培地成分(例えば、基本培地、増殖調節剤、炭素源)の各々を含有する。本発明を説明するのに使用するとき、ある培地成分の“有効量”とは、説明した効果を生ずるのに必要な量である。例えば、一次カルス増殖培地中の成長ホルモンの有効量は、他の培地成分と組合せたときにカルス形成を誘導させる成長ホルモンの量である。ビタミン類およびゲル化剤のような組織培養培地において有用であることが知られている他の成分も本発明の培地の任意成分として使用できる。
植物、例えば、樹木由来の細胞の形質転換、並びにその後の当該技術において公知であり本明細書においてさらに説明するアグロバクテリウム介在形質転換手法を使用するトランスジェニック植物の作製は、外来遺伝子を樹木に導入する方法の1例である。トランスジェニック植物は、下記の工程によるような種々の方法によって作製することができる：(i)アグロバクテリウムを低pH誘導培地中で低温で培養し予備調製する、即ち、バクテリアを癒傷タバコ葉抽出物と一緒に共培養して、その生成物がT-DNA転移体中に関与するアグロバクテリウムvir遺伝子の高レベルの発現を誘導する；(ii) 培養外植体から誘導した接合子性および/または体細胞性胚性組織のような所望植物組織を刺激したアグロバクテリウムと一緒に共培養する；(iii)抗生物質を含有する培地で形質転換カルス組織を選択する；および(v)上記の胚を苗木に転換する。
【００６０】
無害化(disarmed)Tiプラスミドを保持している任意の非腫瘍原性A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)株を本発明の方法において使用できる。任意のアグロバクテリウム系を使用できる。例えば、Tiプラスミド/バイナリーベクター系または1個のTiプラスミドを有する共組込みベクター系を使用できる。また、例えば、疾病に対する耐性を与える遺伝子またはセルロース含有量を改善する遺伝子のような、形質転換された細胞、カルス、胚または植物を選択する能力を与える任意のマーカー遺伝子またはポリヌクレオチド、並びに任意の他の遺伝子も使用できる。例えば、本発明のPtCelAPおよび上述したようなプロモーターのような任意の所望プロモーターも使用できる。当業者であれば、どのマーカーと遺伝子を特定の求めに応じて使用するのかは決定できることである。
本発明の目的において、“形質転換”または“トランスジェニック”とは、選択性のマーカー特性を与える少なくとも1個のマーカー遺伝子またはポリヌクレオチドを植物細胞、カルス、胚または植物のDNAに導入することを意味する。さらに、任意の遺伝子が導入されてよい。
【００６１】
上記バクテリアの感染性を増大させるためには、アグロバクテリウムを、低pH誘導培地、即ち、4.5〜6.0、最も好ましくは約5.2に調製したpH値を有する任意のバクテリア培養培地中で、例えば約19〜30℃、好ましくは約21〜26℃のような低温で培養する。この低pHおよび低温条件は、アグロバクテリウムに病原性活性を誘導するための良好に構成された臨界的要因内にある(例えば、Altmorbe et al., Mol. Plant-Microbe. Interac. 2: 301,1989；Fullner et al., Science 273: 1107, 1996；Fullner and Nester, J. Bacteriol. 178: 1498, 1996)。
上記バクテリアを癒傷タバコ葉抽出物(当該方法において一般に公知の方法に従って調製した)と一緒に共培養してアグロバクテリウムvir遺伝子の高レベル発現を誘導することによって予備調製する。植物の体細胞性胚の接種前に、アグロバクテリウム細胞は、インビトロ増殖させたタバコ植物の癒傷葉組織から調製したタバコ抽出物で処理してもよい。癒傷誘導代謝物および他の細胞因子によるアグロバクテリウムvir遺伝子の発現の最適刺激を達成させるためには、タバコ葉を癒傷させて、一夜予備培養してもよい。低pH培地における低温でのバクテリアの培養は、バクテリアvir遺伝子発現と感染性をさらに高めるのに使用できる。タバコ葉抽出物による予備調製およびT-DNA輸送課程に関与するvir遺伝子は、当該技術において一般によく知られたものである。
【００６２】
上述のようにして処理したアグロバクテリウムを、その後、例えば接合体性組織および/または体細胞性胚組織のような植物組織外植体と一緒に共培養する。非接合体性（即ち、体細胞性）または接合体性組織を使用できる。任意の植物組織を外植体源として使用できる。例えば、種子からの子葉、若葉組織、根組織、結節外植体のような茎の1部、および根軸のような1次体性胚からの組織を使用できる。一般に、幼若組織が好ましい外植体源である。
また、本発明は、結果として植物の成長を変化させる本発明のポリヌクレオチドを発現させることによって植物の成長を改変させる方法にも関する。本発明において使用するポリヌクレオチドは、同種ポリヌクレオチドでも異種ポリヌクレオチドでもよく、上記で詳細に説明した。例えば、全長およびUDPグルコース結合領域含有断片の両方を発現させ得る。さらに、本発明方法の目的に応じ、上記ポリヌクレオチドは、植物中にセンス配向またはアンチセンス配向で導入できる。任意の適切なプロモーターを用いて発現を実施し得る。プロモーターまたはその機能的断片を上記ポリヌクレオチドに機能可能に結合させる。このプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生特異的植物プロモーターであってよい。適切なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウィルス35S、４CL、セルロースシンターゼプロモーター、PtCelAPおよび頂生花プロモーターである。
【００６３】
さらに、本発明は、上述したような本発明のポリヌクレオチドを発現させることによって植物中のセルロース含有量を変化させる方法に関する。本発明方法は、本発明の外因性ポリヌクレオチドを導入した植物中のリグニンに対するセルロース比を増大させるのに使用できる。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを植物細胞中に導入しこのポリヌクレオチドを発現させることによって植物細胞中でのセルロースシンターゼの発現を変化させる方法に関する。上述したポリヌクレオチドおよびプロモーターを使用できる。
植物細胞中にストレス誘導性遺伝子発現を生じさせる方法も本発明の範囲に属する。この方法は、(i)植物または植物細胞中に、セルロースシンターゼプロモーターまたはその機能的断片を含む発現カセットを導入すること、或いは上記発現カセットを含む植物または植物細胞を提供すること(上記カセットのプロモーターは、選択したコード配列に機能可能に結合させる)；および(ii)機械的ストレスを植物に加えて所望の前記コード配列の発現を誘導させることを含む。
【００６４】
また、セルロースシンターゼプロモーター中の正の機械的ストレス応答性要素(MSRE)を測定する方法も、本発明の範囲に属し、(i)例えば配列番号:3のようなセルロースシンターゼプロモーター中の系列的欠失体を調製すること；(ii)レポーター配列をコードするポリヌクレオチドに結合させたこの欠失体を植物細胞中に導入すること；および(iii)ストレスを植物に誘導させた後、この植物中の前記レポーターの減少量を検出することを含む。同様に、セルロースシンターゼプロモーター中の負のMSREの測定方法も提供される。その方法は、(i)例えば配列番号:3のようなセルロースシンターゼプロモーター中の系列的欠失体を調製すること；(ii)レポーター配列をコードするポリヌクレオチドに結合させたこの欠失体を植物細胞中に導入すること；および(iii)ストレスを植物に誘導した後に、この植物中の前記レポーターの増大量を検出することを含む。
【００６５】
下記の各方法も本発明の範囲に属する：セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドに機能可能に結合させた組織特異性プロモーターで植物を形質転換させることを含む組織特異性様式でセルロースシンターゼを発現させる方法；植物中に、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコードするcDNAを導入し、それによってこの植物中にセルロース発現の増大をもたらすことを含み、前記正のMSREへの結合がセルロースシンターゼの発現を生じさせるものである、植物においてセルロースシンターゼ発現を誘導する方法；植物中にアンチセンス配向のcDNAを導入することを含み、センス配向の前記cDNAは正のMSREに結合するタンパク質をコードし且つセルロースシンターゼの発現を生じさせるものである、セルロースシンターゼ発現を低減させる方法；植物中に、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコードするcDNAを導入することを含み、この正のMSREへのタンパク質結合がセルロースシンターゼ発現を生じさせるものである、植物においてセルロース生合成を増大させる方法；および植物中にアンチセンス配向のcDNAを導入することを含み、センス配向の前記cDNAはセルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコードするもおんである、植物においてセルロース生合成を低減させる方法。
【００６６】
実施例
セルロースシンターゼの分子クローニング
本実施例は、RSW1 cDNAを用いてポプラス属(aspen)の木の発達中の二次木質部からクローン化した最初の樹木セルロースシンターゼcDNA (PtCelA、GenBank No. AF072131)を記載する。
本発明前には、作物由来のセルロースシンターゼの部分クローンおよび綿GhCelAが見出されているのみであり、これらは互いに有意の相同性を有している。本発明者等は、アラビドプシス(Arabidopsis)1次ライブラリー由来の新規な全長セルロースシンターゼcDNAであるAraxCelA(ジーンバンクNo. AF062485) (図7、[配列番号:4])を見出し、クローン化した。AraxCelAは、セルロースシンターゼの新規な1員であり、他のアラビドプシスCelAメンバーとアミノ酸配列において63〜85％の同一性と72〜90％の類似性を有する。
別のセルロースシンターゼを、ポプラス属植物中で、中心位置にUDPグルコース結合ドメインをコードするアラビドプシスCelA cDNAの32P標識した1651bp鎖長EcoRI断片を用いてクローン化し、ポプラス属植物 (Populus tremuloides（ヤマナラシ）)由来の約500,000 pfuの発達中の木質部cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した(Ge and Chiang, 1996)。4つの陽性クローンが3回のプラーク精製後に得られた。これら４つのcDNAの3'末端のシーケンシングは、これらが同一のクローンであることを示した。最長のcDNAクローンを十分にシーケンシングして3232 bpのヌクレオチド配列を有する全長cDNAであることを決定した(図1)[配列番号:1]；このクローンは、978個のアミノ酸のタンパク質をコードしている[配列番号:2]。
【００６７】
ポプラス属植物由来のセルロースシンターゼの特性決定
PtCelAの最初のAUGコドンは、Joshi(1987a)およびJoshi等(1997)によって開示された最適状況配列に基づき、転写開始について最適状況にあった。推定のポリアデニル化シグナル(AATACA)は、28 bpのポリアデニル化尾部上流の16 bpで見出され、これは、提案された植物構造(Joshi, 1987b)に類似している。5'の翻訳されていない先導部は、68 bpを有することが測定され、3'の翻訳されていない後続部は227 bpであった。これら領域は、共に多くの植物遺伝子において観察される典型的な長さを有する(Joshi, 1987aおよびJoshi, 1987b)。このcDNAクローンは、綿由来のセルロースシンターゼ(GhCelA)との90％のアミノ酸配列類似性、およびアラビドプシス由来のセルロースシンターゼ(RSW1)との71％類似性を示し、この特定の樹木ホモログもセルロースシンターゼをコードしていることを示唆した。
【００６８】
上記全長cDNAは、PtCelAと表示され、6.58の等電点(pI)および8個の荷電分子を有する110,278 Daのポリペプチドをコードしている。そのヒ疎水性曲線は、この特定のセルロースシンターゼが８個の膜貫通結合性ドメインを有することを示した；HoffmanおよびStoffelの方法(1993)を用いて、アミノ末端に2個、カルボキシル末端に6個。このタンパク質構造は、RSWlおよびGhCelAの構造と類似である。QVLRWおよび保存Ｄ残基のようなUDPグルコース結合のための保存ドメインのすべてが、本発明のセルロースシンターゼ、例えば、PtCelA中にも存在している(Brown et al., 1996)。即ち、配列および分子解析に基づき、PtCelAは、アラビドプシスにおけるRSWlのように、ポプラス属植物のセルロース生合成組織において不可欠である触媒性サブユニットをコードしているものと結論付けた。
【００６９】
茎の１次および２次成長によって形成された発生勾配に沿うPtCelA mRNA転写物のin situの局在決定は、セルロースシンターゼ発現が２次壁肥大を受ける発達中の木質部細胞に対して専ら確認されることを明らかにした。PtCelA遺伝子発現のこの細胞タイプ特異性は、異種プロモーター-β-グルクロニダーゼ(GUS)融合分析に基づくセルロースシンターゼプロモーター(PtCelAP)の木質部特異活性とも一致していた。結局、この結果は、セルロースシンターゼがポプラス属植物のような樹木の木質部における２次壁形成中のセルロース生合成に主として関与する遺伝子であることの数条の証しを提供するものである。本発明等による以前の結果(Hu et al., 1999)は、セルロースとリグニンが木材中で補償的な形で沈着していることを示していた。ポプラス属植物のような樹木中でのセルロースシンターゼの発見は、セルロース産生を上昇させるタンパク質のアップレギュレーションを可能にする。驚くべきことに、樹木中のCelAの発現は、リグニン生合成を抑制して樹木の木材特性をさらに改善した。
【００７０】
トランスジェニック植物の調製
UDP-グルコース結合性配列をpBI121にサブクローン化し、これを、トランスジェニックタバコ植物を調製するのに用いた(Hu et al., 1998)。異種UDP-グルコース結合性配列の発現は、著しい成長促進効果をもたらした。このことは、植物セルロースシンターゼの機能についての現在の知識においては、セルロースシンターゼがセルロース生合成を開始するためには、UDP-グルコース配列はCelA中の他の機能的ドメイン、例えば、膜貫通ドメインとインタクトのままでなければならないことが教示されていることから、驚くべきことである。トランスジェニックタバコにおいて観察された植物バイオマス中での著しい成長と恐るべき肥大は、セルロースの増大した沈着に基づいているようであり、UPDグルコース単独で植物中のセルロース生合成の遺伝子的増強において十分であることを示していた。
【００７１】
新規なセルロースシンターゼのゲノム機構と発現
図1のcDNAクローン[配列番号:1]がセルロースシンターゼであることを確認するため、ゲノムサザンブロット分析を、このcDNAを用いての高および低ストリンジェンシーの両条件下で行った。ポプラス属植物由来のゲノムDNAをPstI(レーンＰ)、HindIII(レーンＨ)およびEcoRI(レーンＥ)で消化し、図１のセルロースシンターゼの5'末端由来の1kb 32P-標識断片を用いてプロービングした。このサザンブロットは、ポプラス属植物ゲノム内の小群のセルロースシンターゼ遺伝子の小さなファミリーの存在を示唆した(図2、パネルaおよびｂ)。ポプラス属植物木質部cDNAライブラリーの各種植物CelA関連プローブによる繰り返しのスクリーニングは、同じセルロースシンターゼcDNAクローンの分離を常にもたらした。このことは、クローン化されたセルロースシンターゼcDNA(図１)[配列番号:1]が、活性なセルロース沈着が生ずる場合に、ポプラス属植物のような樹木の木質部発達において主要な、最も豊富なセルロースシンターゼコード遺伝子を表すことを示唆していた。また、セルロースシンターゼ遺伝子発現操作が樹木におけるセルロース生合成に深い影響を及ぼすことも示している。
【００７２】
in situ ハイブリダイゼーション
標識プローブ(上述したような)を用いたポプラス属植物の実生茎の節間からの総RNAのノーザンブロット分析(図2、パネルc)は、１次成長を受けた組織においてセルロースシンターゼ転写物が殆ど存在しないこと(節間1〜4)、およびセルロースシンターゼ転写物の存在は茎組織の2次成長中に生じていること(節間5〜11)を明らかにした。しかしながら、1次成長中の弱いノーザンシグナルは、セルロースシンターゼ遺伝子発現が１次成長組織においては殆ど存在しない木質部に特異性であることを示唆しているだけかもしれない。
高等植物における木部形成(xylogenesis)は、形成組織細胞分裂の順次的実行、木質部細胞分化へのコミットメント、および木質部細胞死の最盛期を含む、特有のモデルを提供する(Fukuda, 1996)。１次および2次木質部細胞は異なるタイプの形成組織、即ち、前形成層および束索間/束索内形成組織に由来しているけれども、両組織は、大量のセルロースおよびリグニン沈着を伴う顕著な２次壁発生を示す(Esau, 1965)。細胞レベルでの空間的および一時的セルロースシンターゼ遺伝子発現パターンをさらに試験するため、in situハイブリダイゼーションを用いてセルロースシンターゼmRNAを茎の１次および2次成長によって形成された発生勾配に沿って局在化させた。
【００７３】
種々の成長段階での茎中のセルロースシンターゼ遺伝子転写物(RNA)の局在化も観察された。図3は、説明したようなジゴキシゲニン(DIG)ラベル化セルロースシンターゼアンチセンスまたはセンス(対照)RNAプローブでハイブリッド化した第2、第4および第6節間からの横断面を示す。
PtCelA転写物を、PtCelA cDNAの高可変性5'領域(PstIおよびSacIから産生させた771 bp長鎖断片)の転写物によるin situハイブリダイゼーションによって若いポプラス属植物茎切片において検出した。この領域を、先ず、T7(アンチセンス転写物用)およびSP6(センス転写物用)RNAポリメラーゼ(DIG系；Boehringer Mannheim社)を用い、ジゴキシゲニン(DIG)ラベル化転写物を生成させるために、プラスミドベクター、pGEM,-3Zf (+) (Promega社)中にサブクローン化した。各プローブは、100 mM NaHCO3、pH 10.2中で60℃でのインキュベーションによる穏やかなアルカリ性加水分解に供し、約200 bpの断片を産生させた。
【００７４】
ポプラス属植物幼若茎を用い、100 mMリン酸塩緩衝液(pH 7.0)中の4％(w/v)パラホルムアルデヒド中で60℃で一夜固定化することによって切片化し、氷上のエタノール系で脱水し、パラプラスト(Paraplast)培地(Sigma社)中に埋め込んだ。10μm切片をスーパーフロスト/プラス(Superfrost/plus) (Fisher社)スライド上に42℃で一夜取付け、脱ワックスし、次いで勾配エタノール系で再水和させた。各切片をプロティナーゼＫ(100 mM Tris-HCl、50 mM EDTA、pH 7.5中10μg/ml)と一緒に30分間インキュベートし、FAAで後固定させた。各切片を、ハイブリダイゼーション前に、0.1 Mトリエタノールアミン-HCl(pH 8.0)中の0.33％(v/v)無水酢酸でアセチル化した。次いで、ハイブリダイゼーション混合物(約2μg/mlのDIG標識プローブ、50％(v/v)のホルムアミド、2 X SSPE、10％(w/v)硫酸デキストラン、125μg/mlのtRNA、pH 7.5)中で45℃、12〜16時間インキュベートした。ハイブリダイズしていない一本鎖RNAプローブを500 mM NaClを含むTE緩衝液中の20μg/mlのRNase Aによる処理によって除去した。ハイブリダイズしたDIG標識プローブを、製造業者の仕様書(DIG系；Boehringer Mannheim社)に記載されているように、1：1500希釈の抗ジゴキシゲニン抗血清を用いて検出した。各切片をEclipse 400光学顕微鏡(Nikon社)により検査し、写真撮影した。
【００７５】
１次成長段階(図3、パネルaおよびｂ)中に、セルロースシンターゼの強い発現が1次木質部(PX)細胞に専ら局在化して見出された。この段階においては、幼弱節間は、伸びる最中であり、２次壁の形成による1次木質部細胞の肥大化を生ずる(Esau, 1968)。苗条伸長とセルロースシンターゼの高発現の同時発生は、セルロースシンターゼタンパク質と2次細胞壁セルロース合成の相関を強く示唆している。1次成長の後期段階(図3、パネルｂ)は、1次木質部細胞の順序だった配列の出現に特徴を示す。活性なセルロース生合成は、これらの1次木質部細胞中でのセルロースシンターゼの強い発現によって示されるように、細胞伸長誘導性壁肥大化を伴う。
より成長した節間における2次成長の初期においては、セルロースシンターゼの発現は、ここでも、木質部細胞に専ら局在化していることが観察された(図3、パネルｃのSX)。分裂活性に遠位的な節間内の伸びの代りに、この段階での成長は、2次木質部の2次細胞壁の肥大化のために主としてラジカルである。同時に、PtCelA遺伝子の発現は、2次発生木質部細胞に局在化するようになり(図3、パネルｃ)、ここでも、PtCelAが2次細胞壁セルロースシンターゼをコードするという着想と一致している。この段階において、2次木質部細胞は、伸長し分化した1次木質部細胞を覆い、PtCelA遺伝子発現は最早検出できない(図3、パネルｃ)。これらの結果は、PtCelA遺伝子の発現が木質部特異性であり、図1のセルロースシンターゼ[配列番号:1]が木質部細胞の２次壁中でのセルロース生合成に関連するセルロースシンターゼをコードしていることを示唆している。セルロースシンターゼの木質部特異性発現をさらに確認するために、セルロースシンターゼ遺伝子プロモーター配列をクローン化し、制御活性について特性決定した。
【００７６】
セルロースシンターゼプロモーターによって制御された発現の特性解析
図1のセルロースシンターゼ5' 1,200 bp cDNA断片[配列番号:1]をプローブとして用いて新規なセルロースシンターゼ遺伝子、PtCelAの5'制御配列についてポプラス属植物ゲノムライブラリーをスクリーニングした。このライブラリーは、部分消化し蔗糖勾配選択したSau3AI消化物から生成したポプラス属植物ゲノムDNA断片をLambda DASH IIベクター(カリフォルニア州ラホヤのStratagene社)のBamHIサイト中にクローン化することによって構築した。5つの陽性クローンが約150,000 pfuから得られ、Lambda DNAを精製した。約20 kbのDNA挿入サイズを有する1つのクローンを制限マッピングおよび部分シーケンシング用に選択した。これによって、約1 kbのPtCelA遺伝子の5'側方領域の同定が得られた。PtCelAPと表示したこのゲノム断片(図4)[配列番号:3]は、約800 bpのプロモーター配列、68 bpの5'末端未翻訳領域および160 bpのコード配列を含有していた。細胞レベルでの組織特異性セルロースシンターゼ発現の制御を試験するために、プロモーター活性を、GUSタンパク質の組織化学染色によりトランスジェニックタバコ植物中で分析した。PtCelAP-GUS融合バイナリーベクターは、pBI121中でPtCelAP [配列番号:3]で置換した35Sプロモーターにより構築し、Hu等(1998年)に従ってタバコ(Nicotiana tabacum)に導入した。
【００７７】
CelAP-GUS融合を保持する11個の独立のトランスジェニック系を作製した。図5は、トランスジェニックタバコ植物中で本発明のセルロースシンターゼプロモーターにより駆動されたGUS発現の組織化学分析を示す。第3(パネルa)、第5(パネルｂ)、第7(パネルｃ)および第8(パネルｄおよびｆ)節間からの横断面をGUS活性により染色し、蛍光顕微鏡検査を用いてUV照射下に発現を可視化した。
GUS染色は、茎、根および葉柄の木質部組織において専ら検出された。茎においては、強いGUS活性が1次(図5、パネルa)および2次成長(図5、パネルｂ〜ｄおよびｆ)を受ける木質部細胞に局在化しているのが見出された。GUS発現は、1次成長段階においては木質部細胞に検定され、2次成長中の2次木質部細胞の発生においてより局在化するようになった。第8節間からの切片は、全体がGUS活性に対して染色した(図5、パネルｆ)。これらの結果は、ポプラス属植物茎中のセルロースシンターゼのインビボ発現パターンと一致している。リグニン自己蛍光はUV照射後に可視化した。師部繊維は、これもセルロースおよびリグニン生合成において活性である(図5、パネルｄおよびe)が、GUS活性を示さず、セルロースシンターゼ遺伝子発現は木質部以外のタイプの細胞中でのセルロース生合成とは関連しないことを示唆していた。根、茎、葉、葯および果実中のGUS活性試験も、これら器官全部の木質部組織中でGUS発現を示し、本発明のセルロースシンターゼが木質部特異性セルロースであり、植物器官全部において発現することを示唆していた。
【００７８】
1つの特定の源(ヤマナラシ)由来の本発明のセルロースシンターゼのプロモーター活性および細胞性発現の特性決定は、その発現が2次細胞壁特異性セルロースシンターゼをコードし、発達中の木質部細胞に特異的に区画化されるタンパク質を産生させることを示していた。セルロースシンターゼ遺伝子プロモーター配列の特性決定は、セルロースシンターゼの細胞タイプ特異的発現を確認することのみならず、セルロースシンターゼを組織特異な形で過剰発現させて木質部におけるセルロース産生を増強する方法も提供する。
【００７９】
引張りストレス下でのセルロースシンターゼの発現
前述したように、本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、セルロースシンターゼの新規な遺伝子制御現象に関連している。本発明のセルロースシンターゼをさらに特性決定するために、ポプラス属植物セルロースシンターゼプロモーター(PtCelAP)により誘導されたGUS発現を、トランスジェニックタバコ植物において引張りストレスなし、または引張りストレス下で観察した。そのストレスは、植物を曲げて押え、その曲げ位置にて40時間以上維持する(例えば、結ぶ)ことによって誘導した。接戦方向および縦(軸)方向切片を、曲げる前、および曲げた後の4時間、20時間および40時間で採取した(それぞれ、パネルa〜d)。
上記セルロースシンターゼプロモーターGUS融合バイナリー構築物は、引張りストレスなしでGUSの排他的木質部特異的発現を示した(図6、パネルa)。しかしながら、本来的に被子植物が耐える引張りストレス条件下では、上記トランスジェニックタバコ植物は、応力の最初の4時間以内で茎の上部に木質部および師部特異的発現を誘導した(図6、パネルｂ)。
【００８０】
これは、引張り中に木質部発達繊維が高結晶性のセルロースを産生して、曲っている茎に本質的機械強度を与えたので、驚くべき観察であった。本観察は、樹木中の高結晶性セルロース発生に直接関与するセルロースシンターゼプロモーターを介したセルロースシンターゼの転写アップレギュレーションの最初の提示であった。さらにまた、引張りストレス20時間後では、木質部と師部は共にGUS発現を示したが、引張りストレス下にある茎の上側のみであった；即ち、下側のGUS発現は抑制された(図6、パネルｃ)。延長されたストレス(40時間まで)においては、GUS発現は、最高の引張りストレスが存在する茎の上側上の1つの小領域のみに限られた(図6、パネルｄ)。引張りストレス下での木質部細胞中でのGUSシグナルの観察および圧縮下またはストレスなしでのGUSの不存在に基づき、本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、茎へのストレスの存在およびタイプによってセルロースシンターゼ遺伝子を刺激または抑制する機械的ストレス応答要素(MSRE)を有するものと結論付けた。
【００８１】
上記結果は、正のMSREが、引張りストレスに応答して転写因子を結合しセルロースシンターゼの発現を制御し、且つより高結晶性のセルロースの生合成を増大させる本発明のセルロースシンターゼプロモーター中に存在することを示している。このことは、引張りストレスに曝された茎の上側での木質部および師部組織中でのGUSの発現に基づき顕著であるが、下部側上の組織が圧縮に曝されるかまたは応力に曝されない場合にはそうではない。さらにまた、圧縮ストレスに曝された茎の下部側の組織はGUS発現を示さなかった、即ち、発現は抑制された。このことは、転写因子を結合して茎の下部側ではセルロースシンターゼの発現を抑制する負のMSREの存在を示した。負のMSREは、正常な樹木中の高結晶性セルロースの発生を抑制するようである。
【００８２】
これらの結果は、強度特性を向上させるための幼若樹木における高結晶性セルロースの遺伝子工学的合成、および反応樹木中での高割合のセルロースの合成におけるメカニズムを提供する。正のMSREおよびその同族転写因子は、高引張り強度を有する高結晶性セルロースの合成において重要であり、負のMSREおよびその同族転写因子の抑制も同様である。かくして、本発明は、当該技術において公知の方法に従って正および負のMSREに結合する転写因子に対してcDNAをクローニングする出発点を提供する。正のMSRE転写因子に対するcDNAの構成的発現は、トランスジェニック樹木中での高結晶性セルロースの連続産生を可能にし、一方、負のMSRE転写因子に対するアンチセンスcDNAの発現は、セルロースシンターゼが抑制し得ないように転写因子を抑制する。この組み合わせは、樹木中の高結晶性セルロースの連続産生を確約するであろう。
【００８３】
トランスジェニック植物中のセルロースシンターゼの遺伝子操作
上述したように、本発明のセルロースシンターゼのヌクレオチド配列、例えば、ポプラス属植物由来のPtCelA cDNAは、標準セルロースシンターゼクローンと言われているセルロースシンターゼタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと有意の相同性を示す。セルロースシンターゼ活性をさらに特性決定するために、4つの構築物をPBI121プラスミド中で調製した。
1) 構成的植物プロモーターカリフラワーモザイクウィルス35SをPtCelAに機能可能に結合させ(35SP-PtCelA-s)、トランスジェニック植物中で過剰発現させた。このことは、セルロースの過剰産生を生じ、リグニン含有量の低減をもたらす。タバコとポプラス属植物をこの構築物で形質転換させた。
2) カリフラワーモザイクウィルス35SをPtCelA由来のアンチセンスRNAに機能可能に結合させ((35SP-PtCelA-a)、構成的に発現させてトランスジェニック植物中のセルロース産生を低減させリグニン含有量を増大させた。このネガティブコントロール構築物は、セルロースが植物成長と発育に不可欠であるので、健全な植物を生じないことがある。ポプラス属植物植物をこの構築物で形質転換させた。
3) ポプラス属植物4CL-1プロモーター(Hu et al., 1998)をPtCelAに活機能可能に結合させ(Pt4CLP-PtCelA) (PBI121の35Sプロモーターは、この構築物においては除去した)、組織特異的様式で発達中のトランスジェニックポプラス属植物の2次木質部で発現させた。この発現は、被子植物組織の生来のセルロース産生を増強させ、リグニン含有量を低減させる。タバコとポプラス属植物をこの構築物で形質転換させた。
4) セルロース生合成の際にUDP-グルコース結合に関与すると教示されている３つの保存領域を含有するPtCelAの細胞質ドメインを35Sプロモーターに結合させてバイナリー構築物を作製した(35S-PtCelA UDP-グルコース)。このプロモーターによる発現は、トランスジェニック植物においてPtCelAのUDP-グルコース結合性ドメインの構成的発現を可能にする。タバコとポプラス属植物をこの構築物で形質転換させた。
【００８４】
35S-GUS構築物(pBI121、カリフォルニアのClon Tech社)を、各構築物による試験において対照として用いた。トランスジェニックタバコ植物を各構築物で形質転換した。下記の表は、T0タバコ植物の一般的成長測定値を示す。PtCelA構築物を担持する植物は、pBI121(対照)構築物を担持する対照植物よりもはるかに早く成長した。発生特異的4CLと構成的35SのプロモーターのPtCelA発現の制御の比較において、35Sの方がより効果的であり、トランスジェニックタバコ植物のより早い成長を可能にした。最も早い成長は、PtCelA由来の35Sプロモーター駆動UDP-Gドメインを担持するトランスジェニック植物において観察された。
T0世代植物が、その組織培養処理からの効果を持越し得ることに留意されたい。従って、種子を、T1世代におけるこの成長現象を試験するために収集した。トランスジェニックタバコ植物を導入遺伝子の存在について分析し、すべてが各々の遺伝子構築物に対して陽性であった。
【００８５】
【表１】
表
土壌に移植した後の約 1.5 ヶ月間のトランスジェニックタバコ植物測定値 (N=2)
【００８６】
当業者であれば、本発明の実施例および好ましい実施態様が例示的でり、本発明は同じ発明概念を有する種々の実施態様で実施し得ることを理解するであろう。
【００８７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Populus tremuloides（ヤマナラシ）のセルロースシンターゼをコードする核酸配列（配列番号１）およびそのタンパク質配列（配列番号２）を示す。
【図２】 図２a-c（まとめて、図２という）は、図１に示したヤマナラシcDNAの断片をプローブとした、低いストリンジェンシー（パネルａ）および高いストリンジェンシー（パネルｂ）におけるヤマナラシゲノムDNAのサザンブロット解析、および、同じプローブを用いた幹の節間からのヤマナラシ全RNAのノーザンブロット解析を示す。
【図３】 図３a-d（まとめて図３という）は、第２節間（パネルａ）、第４節間（パネルｂ）、第６節間（パネルｃ）および第５節間（パネルｄ）からの横断切片におけるセルロースシンターゼ遺伝子転写物のin situ局在を示す。
【図４】 プロモーター領域およびコード配列の５'部分を含む、ヤマナラシセルロースシンターゼ遺伝子の５'領域の核酸配列を示す（配列番号３）。
【図５】 図５a-f（まとめて図５という）は、トランスジェニックタバコの、本発明のセルロースシンターゼプロモーターによって駆動されるGUS遺伝子発現についての組織化学的解析（パネルａ−ｄおよびｆ）および蛍光顕微鏡写真（パネルｅ）を示す。
【図６】 図６ａ−ｄ（まとめて図６という）は、本発明のヤマナラシセルロースシンターゼプロモーターによって駆動させるGUS遺伝子発現の組織化学的解析を示す；曲げる前（パネルａ）、および曲げた４時間後（パネルｂ）、20時間後（パネルｃ）および40時間後（パネルｄ）に接線方向および軸方向の切片を集めGUS発現について染色した。
【図７】 図７は、Arabidopsisから単離したセルロースシンターゼをコードするcDNAを示す（配列番号４）。
【図８】 図８は、図７に記載したcDNAによってコードされるArabidopsisセルロースシンターゼを示す（配列番号５）。
【配列表】
Claims (8)
- 配列番号２記載の配列の位置220から749のアミノ酸配列からなり、セルロースシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを植物の細胞中で発現させることを含む、植物の生長を変化させる方法であって、前記ポリヌクレオチドがセンス方向にあり、前記ポリヌクレオチドが過剰発現されると前記ポリペプチドが過剰発現され、対照に比較して前記植物の成長速度が促進される、前記方法。
- 植物プロモーターまたは植物プロモーターの転写因子結合ドメインがポリヌクレオチドに機能的に結合している、請求項１記載の方法。
- プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35S、4CL、セルロースシンターゼプロモーター、PtCelAPまたは頂生花プロモーターである、請求項２記載の方法。
- 植物が木質性植物である、請求項１記載の方法。
- 植物が樹木である、請求項１記載の方法。
- ポリヌクレオチドに機能可能に連結した配列番号３記載の配列を含むベクターを植物細胞にデリバリーすることを含む、植物細胞におけるストレス誘導遺伝子発現を生じさせる方法であって、前記ポリヌクレオチドは前記植物に対する機械的ストレスがあると発現する、前記方法。
- 植物が木質性植物である、請求項６記載の方法。
- 植物が樹木である、請求項６記載の方法。
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