JP2003509009A

JP2003509009A - 植物においてセルロース生合成を増強し、リグニン生合成を改変する方法

Info

Publication number: JP2003509009A
Application number: JP2000620050A
Authority: JP
Inventors: ヴィンセントエルチアン; ルグアンウ; ジョシピーチャンドラシェカール; ダニエルティーキャラウェイ
Original assignee: ボードオブコントロールオブミシガンテクノロジカルユニヴァーシティー
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2003-03-11
Anticipated expiration: 2020-05-18
Also published as: BR0010798A; AU781500B2; WO2000071670A2; CA2371659A1; JP4880819B2; ZA200109427B; EP1203079A4; UY26159A1; NZ515459A; WO2000071670A3; AR024046A1; AU5026200A; EP1203079A2; AU781500C

Abstract

(57)【要約】本発明は、セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド分子、セルロースシンターゼのプロモーターおよびセルロースシンターゼポリペプチド、セルロース及びリグニン生合成を遺伝的に改変する方法および樹木において幼若木質部及び線維の強度特性を改善する方法に関する。本発明は更に、セルロースシンターゼプロモーター中の制御要素およびその様な制御要素に結合する転写因子を同定する方法、および、セルロースシンターゼプロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチドの発現を増強する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連する出願の相互参照本出願は、1999年、５月２１日出願の米国仮出願番号60/135,280の利益を要求
する。

【０００２】発明の分野本発明は、セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド分子、セルロ
ースシンターゼのプロモーターおよびセルロースシンターゼポリペプチド、セル
ロースおよびリグニン生合成を遺伝的に改変する方法、および、樹木の幼若木質
及び線維の強度特性を改善する方法に関する。本発明は更に、セルロースシンタ
ーゼプロモーター中の制御要素およびそのような制御要素に結合する転写因子を
同定する方法、およびセルロースシンターゼプロモーターに機能的に結合したポ
リヌクレオチドの発現を増大させる方法に関する。

【０００３】発明の背景リグニンおよびセルロースは機械的強度および強固さを提供する植物細胞壁の
主要な構築単位である。植物において、特に樹木において、これらの２つの有機
物質は機械的強度、水輸送能および生物的および非生物的環境ストレスからの保
護を与える動的平衡にある。通常、オーブン加熱した木材は30〜50％セルロース
、20〜30％リグニンおよび20〜30％ヘミセルロース（Higuchi、1997）を含んで
いる。リグニンおよびセルロースの割合は天然環境の変動によって変化することが知
られている。例えば、針葉樹の圧縮あて材(compression wood)発達の間に、リグ
ニンのパーセンテージは30から40％に増加し、セルロース含量はそれに応じて40
から30％に低下する（Timmell、1986）。逆に、被子植物の引張あて材（tension
wood）においては、セルロースのパーセンテージは30から40％に増加し、一方
、リグニン含量は30から20％に低下する（Timmell、1986）。

【０００４】近年、リグニン生合成経路の組織特異的なキー酵素、4CLの遺伝的ダウンレギ
ュレーションがトランスジェニックポプラス属(aspen)樹木においてリグニン含
量を45％まで低下させることが発見された（Huら、1999）。このダウンレギュレ
ーションはまた、セルロース含量において15％の増加を伴っていた。この逆が真
であるならば、すなわち、セルロース生合成の遺伝的アップレギュレーションに
よってセルロース含量を増加させることがリグニン含量を低下させるのであれば
、パルプ収率を増加させることができる。これによって、パルプ製造の際に大幅
に化学的およびエネルギー的コストを削減することができるであろう。なぜなら
ば、例えば、リグニンはパルプ製造過程で分解及び除去されなければならないか
らである。セルロースはβ-D-1,4-結合したグルコース残基からなる直線状グルカンであ
る。セルロースはUDP-グルコース単位の集合を触媒するセルロースシンターゼ酵
素によって「パーティクルロゼット」として知られる原形質膜複合体において形
成される（DelmerとAmor、1995）。セルロースシンターゼは８つの膜貫通結合ド
メインによって膜にアンカーされ、植物細胞壁におけるセルロース生合成機構の
基礎を形成すると考えられている（Pearら、1996）。

【０００５】高等植物において、一次および二次細胞壁のセルロース微小繊維中のグルカン
鎖はその重合の程度が異なっている（Brownら、1996）。例えば、二次細胞壁は
高重合度のセルロースを含有していることが知られているが、一次細胞壁では重
合の程度はそれより低い。別の例では、張力ストレスがかかっている木部細胞壁
は、そのストレスに応答して、曲げた被子植物の上部に引っ張りあて材を形成す
る。これらの細胞では、非常に高い結晶性を有するセルロース量が上昇している
。高度に結晶化したセルロースの形成は木部繊維の高い引っ張り強度を得るため
に重要である。同じ幹の下部の木部細胞壁は圧縮ストレスを受けるが、高度に結
晶化したセルロースを生成しない。発達の過程における細胞壁の重合の程度のこ
のような変動は、グルコース単位を異なる擬似結晶配列に整える異なったセルロ
ースシンターゼのためであると考えられている（HaiglerとBlanton、1996）。従
って、トランスジェニック樹木から優れた強度特性を有する木材パルプの高い収
率を得るために、高度に結晶化したセルロースの合成に関する分子的基礎を決定
することは有利であろう。トランスジェニック樹木における高度結晶化セルロー
スの生成はまた、通常の樹木において形成される幼若木部の機械的強度特性を著
しく改善するであろう。幼若材は機械的強度が劣るために一般には固体木材応用
に望ましくないので、このことは工業に大きな利益となるであろう。

【０００６】樹木におけるセルロースおよびリグニンの沈着は補償的様式で制御されている
ため、セルロース生合成の遺伝的増強はリグニン沈着に対して抑制的効果を有す
るかもしれない。重合度および結晶度はセルロース生合成機構に取り込まれてい
るセルロースシンターゼの型に依存することがあるため、異種セルロースシンタ
ーゼまたはそれらのUDP-グルコース結合領域の発現（例えば、テーダマツにおけ
るスイートガムタンパク質）は、トランスジェニック植物においてセルロースの
品質を増加することができるであろう。また、異種セルロースシンターゼの過剰
発現はトランスジェニック植物のセルロース量を増加させるかもしれない。従っ
て、セルロース生合成の遺伝的操作はトランスジェニック植物においてセルロー
ス品質及び量を増強し、一方、リグニン含量を低下させるためのストラテジーを
提供することができる。

【０００７】木質部形成に至る生化学的過程をよりよく理解することにより、パルプおよび
紙工業はより効率的に、減少する生産面積からの木材に対する増大する要求を満
たす道具として遺伝的操作を利用できるであろう。この目的で、大部分のリグニ
ン生合成遺伝子を含む多くの木部特異的遺伝子が樹木種を含む種々の植物の発達
中の木部組織から単離されている（YeとVarner、1993；Fukuda、1996；Whetten
ら、1998）。樹木に対して穀物植物においてセルロース生合成を制御する遺伝子
はすでに単離されている（Pearら、1996およびArioliら、1998）。しかしながら
、セルロース生合成に直接関与する樹木の遺伝子の単離は今だ難題を残している
。

【０００８】 30年以上の間、高等植物のセルロースシンターゼをコードする遺伝子(CelA)は
同定されていない。近年、Pearら(1996)は、活性な二次壁セルロース合成を有す
る綿線維から調製したcDNAライブラリー中で、UDP-グルコース結合配列を探索す
ることにより最初に推定的高等植物CelA cDNA、GhCelA（GenBank No. GHU58283
）を単離した。GhCelは、綿線維中で強く発現しており、二次壁セルロースを盛
んに合成しており、８つの膜貫通ドメインを有し、UDP-グルコースに結合し、植
物に固有の他の２つのドメインを有していたので、セルロースシンターゼ触媒サ
ブユニットをコードすると考えられた。近年、Arioliら(1998)は、CelAホモログ、RSW1（放射方向膨潤）（GenBank No
.AF027172）を、Arabidopsis（アラビドプシス）から温度感受性セルロース欠損
変異株の欠損遺伝子座への染色体ウォーキングによってクローン化した。rsw1変
異株の野生型完全長ゲノムRSW1クローンによる相補は正常な表現型を回復した。
この相補性は、植物CelA遺伝子がセルロースシンターゼの触媒サブユニットをコ
ードし、セルロース微小繊維の生合成において機能することの最初の遺伝子的証
拠を与えるものである。完全長Arabidopsis RSW1は、トランスジェニック系にお
いて更にセルロース生合成を明らかにするために利用できる、現在知られた唯一
の入手可能なセルロースシンターゼcDNAである(Wuら、1998)。

【０００９】 RSW1遺伝子の発見は、セルロースシンターゼの原形質膜への集合は機能的セル
ロース生合成機構および植物細胞壁において結晶セルロース微小線維を生成する
ために必要だという考えを実証した。最も重要なことに、単一のCelA遺伝子、例
えばRSW1は、植物、例えばArabidopsisにおけるセルロース微小繊維の生合成に
充分である。従って、RSW1はトランスジェニック植物においてセルロース形成の
増強を操作するための主要な標的である。社会の線維、化学的およびエネルギー的需要の多くは木材からの工業的規模の
セルロース生産によって満たされているため、樹木のセルロース生合成機構の遺
伝的操作はより高いパルプ収率を生成することができるであろう。このことによ
り、パルプ及び製紙工業による投資に対するより大きな利益還元を可能とするで
あろう。従って、木材の特性を改善するためにセルロース生合成に関与する遺伝
子を樹木から単離し、特性解析することは利益であろう。

【００１０】発明の概略本発明はセルロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌク
レオチド、ストレス誘導性プロモーターを含むセルロースシンターゼの制御配列
、セルロースシンターゼタンパク質またはその機能的ドメイン、および植物にお
いてセルロース生合成を増強する方法に関する。従って、一つの側面において、本発明はセルロースシンターゼをコードする配
列を含むポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチド断片、UDP-グルコース
結合ドメインのようなセルロースシンターゼの機能的ドメインをコードする断片
を提供する。本発明はまた、セルロースシンターゼまたは、UDP-グルコース結合
ドメインおよび８つの膜貫通ドメインの少なくとも一つを含めて、その機能的ド
メイン又は断片を提供する。本発明は更に、セルロースシンターゼプロモーター
または、１以上の機械的ストレス応答要素(MSRE)を含むその機能的断片を提供す
る。

【００１１】別の側面では、本発明は植物細胞のセルロース量を改変し、および、場合によ
り細胞中のリグニンの含量を低下させることによる木材の品質を改善する方法に
関する。本発明はまた、セルロースシンターゼまたはそのUDP-グルコース結合ド
メインをコードする外来性ポリヌクレオチドを植物で発現させることにより植物
の生長およびセルロース含量を改変する方法に関する。本発明は更にストレス誘
導性セルロースシンターゼプロモーターを用いて選択したポリヌクレオチドを発
現させることによる、植物細胞におけるストレス誘導性遺伝子発現を生じさせる
方法を提供する。更に別の側面では、本発明はセルロースシンターゼプロモーター中の機械的ス
トレス応答要素(MSRE)を決定する方法およびおよびMSREに結合する転写因子を同
定する方法に関する。

【００１２】更なる側面において、本発明は、セルロースシンターゼプロモーターの正のMS
REに結合する特性を有する転写因子をコードする外来性ポリヌクレオチドを発現
させる、または、負のMSREに結合する特性を有する転写因子をコードするアンチ
ポリヌクレオチドを発現させてその転写因子の発現を阻害することにより、セル
ロースシンターゼの発現を改変（増加又は減少）、すなわち、制御する方法を提
供する。本発明の他の側面は、本発明の詳細な説明及び、図面および添付の請求の範囲
を考慮することによって理解できるであろう。

【００１３】発明の詳細な説明この明細書で挙げるすべての特許、特許出願及び参照文献は、引用によりその
全体が本明細書に取り込まれるものとする。何らかの不一致がある場合は、本開
示が優先する。（定義）この明細書で使用する用語は、本発明の文脈内で、また各用語が用いられる特
有の文脈で技術的に通常の意味を有する。特定の用語については、以下に或いは
本明細書の他のどこかで説明し、本発明の組成物と方法及びそれらの作り方と用
い方を述べる上で当業者にさらに手引きを提供する。同一の物が１つの方法以外
で言われることがあることは理解されるだろう。その結果として、本明細書で議
論されるいずれの１つ以上の用語についても代替の言葉及び同義語が用いられる
ことがあり、またある１つの用語が本明細書で詳述され、又は議論されるとして
も何らかの特定の意義が置かれるものではない。特定の用語については同義語が
与えられる。１つ以上の同義語は他の同義語を排除するものではない。この明細
書のどこかで例を使用するときは、本明細書で議論されるどの用語の例をも含め
、説明のためだけであり、決して本発明及びどの例示された用語の範囲と意味を
制限するものではない。同様に、本発明は好ましい実施形態によっても制限され
ない。

【００１４】用語「植物」は、植物全体及び植物器官（例えば、根、茎、葉等）を含む植物
の部分を含む。用語「被子植物」は、子房に包まれた種子を生成する植物を意味する。被子植
物の特定の例はLiquidambar styraciflua（Ｌ．）[モミジバフウ]である。用語「裸子植物」は、裸の種子、すなわち子房に包まれていない種子を生成す
る植物を意味する。裸子植物の特定の例としては、Pinus taeda（Ｌ．）[テーダ
マツ]が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、一本又は二本鎖ゲノム、cDNA
、ＲＮＡ、何らかの合成的及び遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、及び一緒
に若しくは個々にセンスとアンチセンス鎖の両方を包含するものである（ここで
は、センス又はアンチセンス鎖のみが提示されるかもしれないが）。これは、一
本鎖及び二本鎖分子、すなわちDNA−DNA、DNA−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイ
ブリッドのみならず、塩基をアミノ酸骨格に結合することによって形成される「
タンパク質核酸」（ＰＮＡ）をも包含する。これは、例えばチオ−ウラシル、チ
オ−グアニン及びフルオロ−ウラシルのような修飾された塩基を含有する核酸を
も包含する。

【００１５】「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その元の環境（例えば、そ
れが天然に存在する場合はその自然環境）から離されている成分を意味する。単
離された核酸又はポリペプチドは、それが最初に結合されていた細胞成分を、約
50％未満、好ましくは約75％未満、最も好ましくは約90％未満含むことがある。
ＰＣＲによって増幅され、その細胞成分の残りから十分かつ容易に区別できる（
例えば、ゲル上で）ポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされる。本発明
のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、「実質的に純粋」、すなわち技術的に
公知の精製法を用いて達成できる最高度の純度を有する。

【００１６】用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基の対合によって相補鎖と
結合するプロセスを意味する。あるポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖が所
定のストリンジェンシー条件下で別のポリヌクレオチドの鎖にアニールできる場
合、ポリヌクレオチドは相互に「ハイブリッド可能」である。ハイブリダイゼー
ションは、２つのポリヌクレオチドが実質的に相補的配列を含む必要があり、ハ
イブリダイゼーションのストリンジェンシーによって決まるが、ミスマッチは許
容されうる。典型的には、高いストリンジェンシー（例えば、65℃の0.5ＸＳＳ
Ｃの水溶液中におけるような）での２つの配列のハイブリダイゼーションは、そ
れら配列がその全配列に渡ってかなり高度の相補性を示す必要がある。中間のス
トリンジェンシー（例えば、65℃の２ＸＳＳＣの水溶液のような）及び低い厳
密性（例えば、55℃の２ＸＳＳＣの水溶液のような）の条件は、そのハイブリ
ダイズする配列間で全体的に対応して相補的である必要性は少ない。（１ＸＳ
ＳＣは、0.15ＭＮａＣｌ、0.015ＭＮａシトレート。）ここで使用する場合、
上記溶液及び温度はハイブリダイゼーション手順のプローブ洗浄段階を指す。用
語「ストリンジェントな（低い、中間の）条件下でハイブリダイズするポリヌク
レオチド」は、一本鎖のみが別のポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズす
るとはいえ、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの両方を包含するものである。

【００１７】「配列保存的変異体」は、別のポリヌクレオチドと比較して与えられたコドン
位置で１つ以上のヌクレオチドが変化しているが、その変化は当該位置でコード
されるアミノ酸にいかなる変化もきたさないようなポリヌクレオチドである。「機能保存的変異体」は、限定するものではないが、同様の物理化学的性質（
例えば、酸性、塩基性、疎水性等のような）を有するものとアミノ酸の置換を含
む、ポリペプチドの全体的なコンホメーション及び機能を変えることなく、変化
させられた与えられたアミノ酸残基を有するポリペプチド（又は該ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド）である。同様の物理化学的性質を有するアミノ
酸は技術的に周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性
の塩基性アミノ酸であり、相互交換可能である。同様に、疎水性のアミノ酸であ
るイソロイシンは、ロイシン、メチオニン又はバリンと置換できる。配列−及び
機能保存的変異体については、遺伝コードの縮重に関連してさらに詳しく後述す
る。

【００１８】「機能的ドメイン」又は「機能的断片」は、タンパク質又はポリペプチド又は
ポリヌクレオチドのいずれかの領域又は部分を意味し、より大きいタンパク質又
はポリヌクレオチドの領域又は部分であり、その領域又は部分は、より大きいタ
ンパク質又はポリヌクレオチドに起因しうる特有の活性又は特有の機能を有して
おり、例えば、セルロースシンターゼの機能的ドメインはUDP−グルコース結合
ドメインである。用語「％同一性」は、Genetics Computer Group Wisconsin（ＧＣＧ）パッケ
ージのプログラムＧＡＰ（バージョン9.0）（マジソン，WI）によって同定され
るような、ポリヌクレオチド／ポリペプチドが別の配列のヌクレオチド／アミノ
酸と同一であるポリヌクレオチド／ポリペプチドのヌクレオチド／アミノ酸のパ
ーセンテージを意味する。ＧＡＰは、Needleman及びWunsch（J.Mol.Biol 48:443
-453,1970）のアルゴリズムを使用して、好一対の数を最大にし、かつギャップ
数を最少にする、２本の完全配列のアラインメントを見つける。上記アルゴリズ
ムを実行するのに必要なパラメータが特定されないときは、プログラムによって
提供されるデフォルト値が考慮される。デフォルト値として（ポリヌクレオチド
に対して）次のパラメータがＧＣＧプログラムＧＡＰで使用される：ギャップ創
造ペナルティ：50；ギャップ拡張ペナルティ：３；スコアリングマトリックス：
nwsgapdna.cpm（ローカルデータファイル）。

【００１９】２本のポリペプチド配列間の「％類似性」又は「％相同性」は、２本の配列で
共有される類似位置の数の関数であり、使用するスコアリングマトリックスを基
準として比較される位置の数で除してから100が掛けられる。この比較は、２本
の配列が整列され（必要な場合ギャップを導入して）、最大の相同性を決定する
ときに行われる。米国国立バイオテクノロジー情報センターによって実施される
PowerBlastプログラムを使用して最適なギャップドアラインメントを計算できる
。Genetics Computer Group WisconsinパッケージのＧＡＰプログラム（バージ
ョン9.0）（マジソン,WI）も使用できる。ＧＡＰは、Needleman及びWunsch（J.M
ol.Biol 48:443-453,1970）のアルゴリズムを使用して、好一対の数を最大にし
、かつギャップ数を最少にする、２本の完全配列のアラインメントを見つける。
上記アルゴリズムを実行するのに必要なパラメータが特定されないときは、プロ
グラムによって提供されるデフォルト値が考慮される。デフォルト値として（ポ
リペプチドに対して）次のパラメータがＧＣＧプログラムＧＡＰで使用される：
ギャップ創造ペナルティ：12；ギャップ拡張ペナルティ：４；スコアリングマト
リックス：Blosum62.cpm（ローカルデータファイル）。

【００２０】用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に少なくとも10、好ましくは少なくと
も15、さらに好ましくは少なくとも20ヌクレオチドの核酸であり、遺伝子、mRNA
、cDNA、又は関心のある核酸とは別の核酸をコードするゲノムDNA分子、cDNA分
子、又はmRNA分子にハイブリダイズ可能な核酸を意味する。オリゴヌクレオチド
は、例えば³²Ｐ−ヌクレオチド又はビオチンのような標識が共有結合されている
ヌクレオチドによって標識することができる。一実施形態では、標識されたオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用いて、核酸の存在を検出することができる。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチド（標識されうる１つ又は両方）をＰＣＲ
プライマーとして使用して、全長若しくはCelAの断片をクローニングし、又はCe
lAをコードする核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、本発明
のオリゴヌクレオチドは、CelA DNA分子と三重らせんを形成できる。さらに別の
実施形態では、シリコンウエハ又はチップのような固体支持体上に配置されるオ
リゴヌクレオチドのライブラリを用いて、関心のある種々の多型性を検出できる
。一般的に、オリゴヌクレオチドは合成によって、好ましくは核酸シンセサイザ
ーで調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合等のような
天然に存在しないリン酸エステル類似体結合で調製されうる。

【００２１】用語「コード配列」は、ポリペプチドをコードするための情報を含む、遺伝子
の当該部分を意味する。コード配列の境界は、５'（アミノ）末端における開始
コドンと、３'（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって決定され
る。コード配列としては、限定するものではないが、原核生物の配列、原核生物
のmRNA由来のcDNA、原核生物の（例えば、哺乳類の）DNA由来のゲノムDNA配列、
及び均一合成のDNA配列が挙げられる。

【００２２】「プロモーター」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合でき、かつ下流（３
'方向）のコード配列の転写を開始できる要素（例えば、ＴＡＴＡボックス）を
含むポリヌクレオチドである。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列
は、その３'末端で転写開始部位によって制限され、かつ上流（５'方向）に伸長
して、バックグラウンドを越えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な
塩基又は要素の最小数を包含する。プロモーター配列内で、転写開始部位（例え
ばヌクレアーゼS1でマッピングすることによって好都合に定義される）、及びＲ
ＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列
）が見つけられる。本発明で使用できるプロモーターの例としては、PtCelAP、4
CL-1及び35Sが挙げられる。

【００２３】用語「構成的プロモーター」は、典型的には、結合したコード配列の発現を活
性化するために正の制御タンパク質を必要としないプロモーターを意味し、すな
わち構成的プロモーターは発現のいくらかの基礎的レベルを維持している。一般
に、構成的プロモーターは発現カセットの創造に使用される。構成的プロモータ
ーの例は、Clonetech,Palo Alto,CAから入手可能な35S CaMV（カリフラワーモザ
イクウイルス）である。用語「誘導性プロモーター」は、関連コード配列の発現を活性化するために正
の制御を必要とするプロモーターを意味する。このようなプロモーターの例は、
本明細書で述べられるポプラス属植物由来のストレス誘発性のセルロースシンタ
ーゼプロモーターである。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写するときに、細
胞内で転写及び翻訳制御配列の「制御下」にあり、それからトランス−ＲＮＡス
プライシングされて、そのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳さ
れる。

【００２４】「ベクター」は、本発明のポリヌクレオチドが結合されうるプラスミド、ファ
ージゲノム、ウイルスゲノム、コスミド、又は人工染色体のような組換え核酸構
築物である。特有の実施形態では、ベクターは、例えばクローニングベクターの
場合、結合されているセグメントの複製を惹起しうる。用語「発現カセット」は、該発現カセットを細胞中に挿入すると、与えられた
タンパク質の発現が達成されるようなプロモーター及びタンパク質コード配列の
両方を含むポリヌクレオチドを意味する。細胞は、外来性又は異種ポリヌクレオチドによって、このようなポリヌクレオ
チドが細胞の内側に導入されたとき「トランスフェクション」される。細胞は、
このトランスフェクションされたポリヌクレオチドが表現型変化を生じた場合に
、外来性又は異種ポリヌクレオチドによって「形質転換」される。好ましくは、
この形質転換するポリヌクレオチドは、該細胞のゲノムを構成している染色体DN
A中に組み込まれる（共有結合される）べきである。

【００２５】「外来性」とは、細胞から単離されていて、その後同一又は異なる細胞中に導
入される、ポリヌクレオチド又はタンパク質のような生体物質を指す。例えば、
本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、特定種の樹木
の木部細胞からクローン化され、プラスミド中に挿入され、かつ同種又は異種の
木部細胞中に再導入されうる。従って、この種は外来性のセルロースシンターゼ
ポリヌクレオチドを含有する。「異種ポリヌクレオチド」とは、それが導入される細胞内には天然に存在しな
い外来性のポリヌクレオチドを意味する。「同種ポリヌクレオチド」とは、それが導入される細胞内に天然に存在する外
来性のポリヌクレオチドを意味する。

【００２６】本発明は、植物、特に樹木由来のセルロースシンターゼをコードするポリヌク
レオチドの単離及び特徴づけに関し、セルロースシンターゼの全長又は天然に存
在する形態、機能的ドメイン、プロモーター及び制御要素を包含する。従って、
本発明により、本技術のスキル内で従来の分子生物学、微生物学、及び組換えDN
A技術を利用できる。このような技術は文献で完全に説明されている。例えば、S
ambrook,Frisch＆Maniatis,分子クローニング：実験室マニュアル、第２版(1989
)Cold Spring Harabor Laboratory Press,Cold Spring Harabor New York（本明
細書では“Sambrookら,1989”）；DNAクローニング：実用的アプローチ,Ｉ及びI
I巻（D.N.Glover版1985）；オリゴヌクレオチド合成（M.J.Gait版1984）；核酸
ハイブリダイゼーション[B.D.Hames＆S.J.Higgins版(1985)]；転写と翻訳[B.D.H
ames＆S.J.Higgins版(1984)]；動物細胞培養[R.I.Freshney版(1986)]；固定化細
胞及び酵素[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,分子クローニングへの実用ガイド(19
84)；F.M.Ausubelら(版),分子生物学における現在のプロトコル,John Wiley＆So
ns,Inc.(1994)を参照せよ。

【００２７】本発明は、新規な全長セルロースシンターゼ遺伝子（CelA）、セルロースシン
ターゼの新規なストレス誘導性プロモーター（CelAP）、及び樹木由来のセルロ
ースシンターゼタンパク質に関し、それらのUDP−グルコース触媒ドメインを含
む。本発明は、セルロース含量が増加され、リグニン含量が低減され、ひいては
木繊維特性が改良されたトランスジェニック樹木の変種開発を可能にする。さら
に、操業可能な生産計画において、商業的に適切なトランスジェニック森林樹木
の色々な種でセルロースの量と質を高める生産が熟考される。さらに、本発明は
、樹木中におけるCelA遺伝子の発現及び機能の研究用の新しい実験システムを提
供する。

【００２８】セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド及びその断片本発明は、本発明のセルロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列又は
その機能的断片を含むポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態では、ポリ
ヌクレオチドは樹木セルロースシンターゼをコードする配列、最も好ましくはポ
プラス属植物由来のセルロースシンターゼをコードする配列を含む。一実施形態
では、本発明のポリヌクレオチドは、完全なセルロースシンターゼコード領域、
例えば配列番号:1のヌクレオチド69〜3,005を含む。本発明の別の局面では、Ara
bidopsisセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドが提供される（配
列番号:4及び配列番号:5の翻訳されたタンパク質を参照せよ）。

【００２９】また、本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの断片も
本発明の範囲内であり、この断片は少なくとも１種の膜貫通ドメイン及び／又は
UDP−グルコース結合ドメインをコードする。例えば、ポプラス属植物セルロー
スシンターゼのUDP−グルコース結合ドメインをコードするヌクレオチド（例え
ば、配列番号:1のヌクレオチド660〜2250）又は配列番号:4の対応するヌクレオ
チドを含むポリヌクレオチドは本発明の範囲内である。UDP−グルコース結合ド
メインをコードするヌクレオチドは、例えば、後述するようなタンパク質配列の
アラインメントによって決定することができる。本発明は、さらに配列番号:1及び4のコードタンパク質の配列保存的変異体に
関する。

【００３０】低い、中間の、及び高いストリンジェンシーの条件下で配列番号:1及び4にハ
イブリダイズするポリヌクレオチド、及びそれらのそれぞれのコード部分も本発
明の範囲内である。好ましくは、配列番号:1及び4、又はそれらのそれぞれのコ
ード部分のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、当該配列とほぼ
同一長さであり、例えば、せいぜい約10〜約20ヌクレオチド長いか或いは短い。
本発明の別の実施形態では、このハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、少
なくとも1500ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも2500ヌクレオチド長、最も
好ましくは少なくとも3000ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、こ
のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、配列番号:1若しくは4に見られる
ようなUDP−グルコース結合ドメイン、又は少なくとも保存領域QVLRWを含む。最
も好ましくは、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、UDP−グルコース結
合活性を有する。

【００３１】本来天然に存在するポリヌクレオチドは、本明細書に記載され或いは技術的に
周知な方法によって、それらを含有する生物体から単離することができる。天然
に存在しないポリヌクレオチドは、組換えDNAの分野で公知の種々の操作によっ
て調製することができる。例えば、クローン化CelAポリヌクレオチドは、Sambro
okら,1989に記載された方法に従って改変できる。配列は、試験管内で適切な部
位で制限酵素により切断され、その後所望によりさらに酵素修飾され、単離され
、かつ連結されうる。改変ポリヌクレオチドの生産では、例えば、その改変ポリ
ヌクレオチドが適切な翻訳読取り枠内に確実に留まるように（発現されるべき場
合）、又は翻訳停止信号によって中断されないように注意を払うべきである。さ
らなる実施例として、CelAをコードする核酸配列は、インビトロ又はインビボ変
異されて、翻訳、開始、及び／又は終止配列を創造及び／又は破壊し、或いはコ
ード領域内で変異を引き起こし、及び／又は新しい制限酵素部位を形成し或いは
既存の部位を破壊して、さらにインビトロ改変を促進することができる。好まし
くは、このような変異は、その変異されたCelAポリヌクレオチドの機能活性を高
める。技術的に公知のいずれの突然変異誘発法も使用でき、限定するものではな
いが、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson,C.ら,1978,J.Biol.Chem
. 253:6551；Zoller及びSmith,1984,DNA３:479-488；Oliphantら,1986,遺伝子 4
4:177；Hutchinson,C.ら1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83:710)、ＴＡＢリン
カーの使用（Pharmacia）等が挙げられる。ＰＣＲ法は、部位特異的突然変異誘
発に好ましい（Higuchi,1989,“ＰＣＲを用いてDNAを操作する”,ＰＣＲ技術：D
NA増幅の原理と応用,H.Erlich版,Stockton Press,６章,61〜70ページ参照）。

【００３２】本発明のポリヌクレオチドは、植物又は非植物の複製用に適合する種々のベク
ター中に導入することができる。これらは技術的に周知であり、従ってこのよう
なベクターの選択、構築及び使用は本技術の当業者の十分スキル内である。可能
なベクターとしては、限定するものではないが、植物のプラスミド又は改変ウイ
ルスが挙げられるが、ベクター系は使用する宿主細胞と適合しなければならない
。好適なベクターの例は、Tiプラスミドである。例えば、クローニングベクター
中への挿入は、そのDNA断片を、相補的付着末端を有するクローニングベクター
中に連結させることによって達成される。しかし、DNA断片に使用される相補的
制限部位がクローニングベクター内に存在しない場合、DNA分子の末端は酵素的
に修飾されうる。代わりに、所望のいずれの部位もヌクレオチド配列（リンカー
）をDNA末端上に連結することによって生成することができ；これら連結された
リンカーは、制限酵素認識配列をコードする特異的に化学合成されたオリゴヌク
レオチドを含みうる。セルロースシンターゼ又はその組換え分子を含有する発現
カセットは、炭化ケイ素ウィスカー、形質転換プロトプラスト、形質転換、例え
ばAgrobacterium（アグロバクテリウム）ベクター（後述する）、エレクトロポ
レーション、インフェクション等によって宿主細胞中に導入され、該遺伝子配列
の多くの複製が生成される。好ましくは、このクローン化遺伝子はシャトルベク
タープラスミド上に収容され、クローニング細胞、例えば大腸菌中における増殖
、及び所望によって引き続き適切な発現細胞系中に挿入するために簡易精製に供
される。例えば、１種類より多くの生物体内で複製可能なベクターであるシャト
ルベクターは、大腸菌プラスミド由来の配列を酵母菌２ｍプラスミド由来の配列
と連結することによって、大腸菌と酵母(Saccharomyces cerevisiae)の両方での
複製用に調製される。

【００３３】ここで記載されるポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック植物もまた
本発明の範囲内である。外来性ポリヌクレオチドを植物細胞中に導入し、トラン
スジェニック植物を再生する方法は周知である。いくつかについて、以下に述べ
る。一実施形態では、本発明のCelAコード配列又はプロモーターを含有するプラス
ミドを植物中に導入するため、選択可能なマーカー発現カセット含有プラスミド
DNAと、セルロースシンターゼ発現カセット含有プラスミドDNAとの１：１混合物
を金と共に沈殿させて微小射出物を形成する。この微小射出物を無水エタノール
中ですすぎ、アリコートをHercules,CAのBioRadから入手可能なマクロキャリヤ
ーのようなマクロキャリヤー上で乾燥させる。照射前に、胚性組織は、好ましく
は無菌の層流フード下乾燥される。この乾燥された組織が半固体の増殖培地に移
される。調製された微小射出物が、BioRad PDS-1000/HE粒子銃のような適宜の装
置を用いて、マクロキャリヤーから乾燥標的細胞中に加速される。好ましい方法
では、各プレートは一度照射されると180度回転され、２度めの照射をされる。
好ましい照射パラメータは、9.31×10⁶Pa(1350psi)の破裂板圧、破裂板とマクロ
キャリヤーとの距離（ギャップ距離）が６mm、１cmのマクロキャリヤー移動距離
、及びマクロキャリヤー停止スクリーンと培養プレートとの距離（ミクロキャリ
ヤー移動距離）が10cmである。そして、照射後、ハイグロマイシンＢのような選
択薬剤を含有する半固体の増殖培地に２日間移される。

【００３４】セルロースシンターゼタンパク質及びその断片本発明のセルロースシンターゼは、グルコースからグルカンを合成するための
UDP−グルコース結合活性を有する触媒的サブユニットと、セルロースシンター
ゼを細胞膜に局在化させるための８個の膜貫通ドメインとを含む植物タンパク質
である。本発明のセルロースシンターゼは、８個の膜貫通結合ドメインを有して
おり；２個はアミノ末端に、６個はカルボキシル末端にある。UDP−グルコース
結合ドメインは、膜貫通ドメイン２と３の間に位置する。このタンパク質構造の
例は、ポプラス属植物のセルロースシンターゼのみならず、RSW1及びGhCelAのセ
ルロースシンターゼにも見られる。膜貫通ドメインの位置は後述され、かつ実施
例で例示されるように同定することができる。好ましくは、本発明のセルロース
シンターゼは樹木のセルロースシンターゼのアミノ酸配列を有する。

【００３５】一実施形態では、本発明のセルロースシンターゼタンパク質はポプラス属植物
(aspen)から単離される。このポプラス属植物のセルロースシンターゼは、約978
個のアミノ酸を含み、かつ約110kDaの分子量と約6.58のpIを有する。一実施形態
では、このポプラス属植物のセルロースシンターゼは、図１に示されるように配
列番号:2のアミノ酸配列を有する。別の局面では、本発明は配列番号:5のセルロ
ースシンターゼに関する。さらに、本発明は、少なくとも１種の膜貫通領域及び／又はUDP−グルコース
結合ドメインを含有する断片のような、植物セルロースシンターゼの断片に関す
る。膜貫通領域は、Hoffmann及びStoffelの方法（1993）を用いることによって
、実施例で述べるように同定することができる。

【００３６】 UDP−グルコース結合ドメインを含有するセルロースシンターゼ断片は、該タ
ンパク質の残り部分がなくても機能的する。この分離可能な活性は実施例に示さ
れるとおりである。この結果は、以前に同定されたUDP−グルコース結合ドメイ
ンは、そのタンパク質の他の部分から単離された場合に機能するとは知られてい
なかったので驚くべきことであり、かつ予想外だった。従って、UDP−グルコー
ス結合ドメインを含み、かつ独立して機能的である（PtCelA、RSW1、GhCelA及び
配列番号:5のような）いずれのセルロースシンターゼの断片も本発明の範囲内で
ある。UDP−グルコース結合ドメインの機能は、実施例で述べる分析によって決
定できる。本発明のUDP−グルコース結合ドメインは、セルロースシンターゼの
第２及び第３の膜貫通領域間に位置し、配列QVLRW及び保存Ｄ残基のようなUDP−
グルコース結合のためのアミノ酸配列を保存していた。このUDP−グルコース結
合ドメインとここに保存されている領域は、本明細書の指導及び本技術の一般知
識、例えばBrown,1996を使用して、セルロースシンターゼ内に配置することがで
きる。一実施形態では、UDP−グルコース結合ドメイン及びここに保存されてい
る領域は、本明細書に記載され或いは本技術で一般的に公知のアルゴリズムを用
いて、問題のセルロースシンターゼのアミノ酸配列と、ポプラス属植物のセルロ
ースシンターゼのアミノ酸配列とを比較することによって同定することができる
。例えば、配列番号:2のUDP−グルコース結合ドメインは、アミノ酸220〜749の
位置にある。保存QVLRW配列は、配列番号:2の715〜719位に位置する。

【００３７】上述のPower Blast又はＧＡＰアルゴリズムを用いて、配列番号:2、配列番号:
2のアミノ酸220-749、配列番号:5又はそのUDP−グルコース結合ドメインのアミ
ノ酸配列に対して少なくとも75％、好ましくは少なくとも85％、最も好ましくは
少なくとも95％の類似性を有するポリペプチド。好ましい実施形態では、これら
ポリペプチドは、配列番号:2又は配列番号:2のアミノ酸220〜749のポリペプチド
とほど同一長さである。例えば、このポリペプチドは約２〜３乃至約５〜７及び
約10〜15アミノ酸分長いか或いは短い。別の実施形態では、このパラグラフで述
べているポリペプチドは、Arabidopsis又はワタには本来見られ（すなわち、天
然に存在し）ない。これらポリペプチドは、例えば、技術的に周知の方法で配列
番号:2又は配列番号:5のタンパク質をコードするクローン化ポリヌクレオチドの
核酸配列を変えることによって調製できる。

【００３８】また、セルロースシンターゼの機能保存的変異体も本発明の範囲内であり、か
つセルロースシンターゼ又はその断片をコードするクローン化ポリヌクレオチド
の配列を変えることによって調製できる。本技術で使用されている従来法を用い
て１種以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を行って、機能的に等価の分子を与
えることができる。例えば、UDP−グルコース結合ドメインの外側で、該タンパ
ク質のアミノ及び／又はカルボキシル末端に置換、欠失及び／又は付加のある機
能保存的変異体は、本発明の範囲内である。好ましくは、未変性のセルロースシ
ンターゼに対して機能活性が高められ、つまり改良された変異体が作られる。こ
の目的に定方向進化の方法を使用できる。

【００３９】本発明は、機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基と置換されて保存的な
アミノ酸置換となる、変更された配列を含む機能保存的変異体をも包含する。例
えば、配列内の１種以上のアミノ酸残基は、機能的な等価物として作用する、類
似極性の別のアミノ酸によって置換され、その結果サイレント変化となりうる。
配列内におけるアミノ酸の置換は、該アミノ酸が属する分類の他のメンバーから
選択できる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオ
ニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプ
トファン、及びチロシンである。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、
スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる
。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが
含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン
酸が含まれる。このような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又は等
電点によって決定されるような見掛けの分子量に影響しないと考えられる。特に
好ましい置換は以下である：（ｉ）Argに対してLys及びその逆で、正電荷を維持
できる；（ii）Aspに対してGlu及びその逆で、負電荷を維持できる；（iii）Thr
に対してSerで、遊離の-ＯＨを維持できる；及び（iv）Asnに対してGlnで、遊離
のＣＯＮＨ₂を維持できる。また、アミノ酸置換を導入して、特に好ましい特性
を有するアミノ酸を置換することができる。例えば、Cysは、別のCysとのジスル
フィド架橋の可能性部位として導入できる。Hisは、特定の「触媒作用」部位と
して導入できる（すなわち、Hisは酸又は塩基として作用でき、かつ生化学触媒
作用で最も一般的なアミノ酸である）。Proを導入することができ、その特有の
平面構造のため該タンパク質の構造内でｂ−ターンを生じさせる。本発明のセルロースシンターゼは、セルロースシンターゼをコードするクロー
ン化ポリヌクレオチドを発現させることによってのみならず、直接的なタンパク
質精製法を用いても単離できる。これら方法は、当業者には明かだろう。

【００４０】セルロースシンターゼプロモーターを含有するポリヌクレオチド本発明は、さらにセルロースシンターゼプロモーターに関する。このプロモー
ターはストレス誘導性プロモーターであり、かつ植物、好ましくは樹木の高結晶
性セルロースを多量に合成するのに使用できる。これにより、トランスジェニッ
ク植物中のセルロースの比率を高め、幼若の木部及び繊維の強度を高め、かつ全
体的な成長速度を促進することができる。

【００４１】一実施形態では、本発明のプロモーターはポプラス属植物由来であり、図４に
提示されている。このプロモーター配列は、配列番号:3のヌクレオチド１〜840
の領域内に位置している。当業者には、プロモーターの機能のためには全配列は
必要でなく、かつ保存ボックスを探索し、また通常の欠失解析を行うことによっ
て、容易に臨界領域を同定できることが判るだろう。従って、配列番号:1の機能
的断片は、本発明の範囲内である。低い、中間の、及び高いストリンジェンシーの条件下で配列番号:3にハイブリ
ダイズするポリヌクレオチド、及びその非コードタンパク質も本発明の範囲内で
ある。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズする配
列とほぼ同一長さであり、例えば、せいぜい約10〜約20ヌクレオチド長いか或い
は短い。別の実施形態では、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、少なく
とも約200ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約400ヌクレオチド長、最も好
ましくは少なくとも500ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、ハイ
ブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、後述する方法で同定される少なくとも１
つのMSRE要素を含む。

【００４２】本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、典型的には木部における組織
特異的な遺伝子制御を与えるのみならず、他の組織内、例えば引張ストレス下の
師部でも遺伝子発現のアップレギュレーションを可能にする。さらに、セルロー
スシンターゼの発現は、植物のストレス下の領域に局在化される。このストレス誘発性の現象は、正及び負の機械的ストレス応答要素（MSREs）
によって制御される。これらMSREは、ストレス条件下、転写因子の結合を通じて
セルロースシンターゼポリヌクレオチドの発現をアップレギュレーション（正）
又はダウンレギュレーション（負）する。MSRE−制御されるセルロースシンター
ゼの発現は、高い結晶性のセルロースの合成を可能にする。

【００４３】セルロースシンターゼのMSREは改変することができ、又は他のやり方で、トラ
ンスジェニック植物に対する機械的ストレス（例えば、引張又は圧縮）に応じて
、MSREを含有するプロモーターに機能可能に連結したセルロースシンターゼを含
む、ポリヌクレオチドの発現を制御する方法に使用することができる。セルロースシンターゼプロモーターの負のMSREを改変し、除去又は遮断してセ
ルロースシンターゼの発現を改良し、ひいてはセルロースの生産を増やし、かつ
木の品質を改良することができる。代わりに、正のMSREを除去又は遮断して、セ
ルロースシンターゼの発現を減らし、セルロースの生産を減少させ、かつリグニ
ンの析出を増やすことができる。これは、リグニンがセルロースより高いBTU値
を有するので、木材の燃料価値を高めるのに有用である。さらに、改変されたセ
ルロースシンターゼプロモーターを関心のあるポリヌクレオチドに機能可能に連
結して、それを保持する植物に対する機械的ストレスによる発現をコントロール
することができる。

【００４４】配列番号:3内のMSRE要素の位置は、例えば、プロモーター欠失解析、DNAseフ
ットプリント解析、及びMSRE用発現ライブラリのサウスウェスタンスクリーニン
グによって同定できる。一実施形態では、１個以上のタンパク質が欠失され、か
つレポーター配列に機能可能に連結されているセルロースシンターゼプロモータ
ーが、植物又は植物細胞中に導入される。正のMSREは、植物にストレスを誘発後
トランスジェニック植物又は組織、例えば師部内でリポーターの量が相対的に変
化しないか或いは増加するのを観測することで検出され、かつ負のMSREは、植物
に対して何らストレスがない場合に植物内のレポーターの量が増加するのを観測
することによって検出される。正の要素は、それを除去することによってGUS発
現が下がり、それを加えることによって同レベル以上で維持されるときに検出さ
れる。負の要素はGUSの発現を援助或いは抑制せず、かつ、それを除去すること
によって、負の要素が存在するときに比し、通常の又は増強されたGUS発現が観
察される。

【００４５】 MSRE結合部位の操作及び／又はその部位に結合する転写因子を供給することが
、トランスジェニック植物の木質の植物細胞壁内で高い結晶性セルロースを連続
的に生成するための機序を与える。例えば、当業者は負のMSRE要素を欠失させ或
いは阻害し、又は正のMSREを結合するタンパク質をコードするcDNAを供給して、
機械的ストレスを必要とせずにセルロースシンターゼの構成的発現をさせること
ができる。セルロースシンターゼが増加され、ひいてはセルロース含量が高めら
れ、幼若の木質部及び繊維の強度特性を改良することができる。また、正のMSRE
を欠失させ或いは遮断し、又はセンス方向では正のMSREを結合するタンパク質を
コードするアンチセンス方向のcDNAを供給して、セルロースシンターゼ活性を減
少させ、セルロース生産を減らすことができる。

【００４６】セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドの単離方法本発明は、さらに、植物、例えば樹木のセルロースシンターゼをコードするポ
リヌクレオチドを同定かつ単離することに関する（実施例で提供され、かつ図１
及び図７に示されているポリヌクレオチドに加えて）。これらポリヌクレオチド
は、木材のセルロース含量と特性を改善するという目的でセルロースシンターゼ
の発現を操作するために使用できる。本方法は、プローブ又はプライマーとして配列番号:1又は4の断片を用いて、
セルロースシンターゼ又はその一部をコードする配列を含有する核酸断片を同定
することを含む。同定されると、セルロースシンターゼ又はその一部をコードす
る配列を含有する核酸断片が単離される。本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムDNA
、cDNA、又はそれらの断片であろうと、多くの供給源、特に植物、好ましくは樹
木（例えば、ポプラ、モミジバフウ、テーダマツ、ユーカリ、及び他の被子植物
及び裸子植物）由来のcDNA又はゲノムライブラリから単離することができる。セ
ルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを得る分子生物学的方法は、
上述したように技術的に周知である（例えば、前出のSambrookら,1989参照）。

【００４７】従って、どの種の植物由来の細胞も、本発明のセルロースシンターゼをコード
するポリヌクレオチドの分子クローニング用の核酸源として役立つ可能性がある
。DNAは技術的に公知の標準的な手順でクローン化DNA（例えば、DNA“ライブラ
リ”）から得ることができ、好ましくはセルロースシンターゼを高レベルで発現
する組織（例えば、木部組織の細胞は非常に高レベルのCelAの発現を証明してい
るので、木部組織）から調製されたcDNAライブラリから、化学合成によって、又
はcDNAクローニングによって、又は所望の細胞から精製されたゲノムDNA、若し
くはその断片のクローニングによって得られる（例えば、Sambrookら,1989,前出
；Glover,D.M.(ed.),DNAクローニング：実用的アプローチ,MRL Press,Ltd.,Oxfo
rd,U.K.Ｉ,II巻を参照せよ）。ゲノムDNAに由来するクローンは、コード領域に
加えて制御及びイントロンDNA領域を含みうる；cDNAに由来するクローンはイン
トロン配列を含まない。供給源が何であれ、ポリヌクレオチドは、その増殖用に
適したベクター中に分子的にクローン化されるべきである。

【００４８】ゲノムDNAから本発明のセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド
を分子クローニングするための他の実施形態では、DNA断片は、植物由来のよう
な関心のあるゲノム、又はさらに具体的には樹木ゲノムで、その一部が所望のポ
リヌクレオチドに対応しているゲノムから生成される。DNAは、種々の制限酵素
を用いて特異的部位で切断することができる。代わりに、マンガンの存在下で該
DNAを断片化するためにDNAseを使用することができ、又は例えば超音波処理によ
ってのように物理的にDNAをせん断することができる。そして、サイズによって
、アガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びカラムクロマトグラフ
ィー（これらに限定されない）を含む標準的な方法で、直鎖状DNA断片を分離で
きる。

【００４９】 DNA断片が生成されると、所望のCelA配列を含有する特異的なDNA断片の同定は
、多くの手段で達成することができる。例えば、ある量のCelA配列若しくはその
特異的ＲＮＡの一部、又はそれらの断片を利用でき、かつ精製して標識化できる
場合、その生成されたDNA断片は、標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼー
ションによってスクリーニングされうる（Benton及びDavis,1977,Science 196:1
80；Grunstein及びHogness,1975,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 72:3961）。例え
ば、樹木由来のCelAタンパク質に対して得られた部分的なアミノ酸配列の情報に
対応する１組のオリゴヌクレオチドを調製し、かつセルロースシンターゼをコー
ドするDNA用のプローブとして、又はcDNA若しくはmRNA用のプライマーとして（
例えば、RT-PCR用のpoly-Tプライマーと組み合わせて）使用できる。好ましくは
、UDP−グルコース結合領域のような、本発明のセルロースシンターゼに高度に
特異的な断片が選択される。該プローブに対して実質的に相同性であるそれらDN
A断片がハイブリダイズする。上述したように、相同性の度合が増すほど、より
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用できる。より具体的な実
施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて、樹木又
は他の植物由来のCelA相同配列を同定できる。

【００５０】従って、一実施形態では、例えば、Populus tremuloides（ヤマナラシ）由来
の標識化セルロースシンターゼcDNA（PtCelA）を用いて、植物、特に被子植物及
び裸子植物のいろいろな種由来の遺伝子又はDNA断片のライブラリを探査し、何
れかが本発明のCelAに結合しているかどうかを決定することができる。遺伝子又
は断片が同定さると、それらを標準的なＰＣＲ法で増幅し、ベクター、例えばpB
luescriptベクター（Lajolla,CAのStrataGene）中でクローン化し、また細菌、
例えばDH5α大腸菌株（Gaithersburg,MDのGibco BRL）へ形質転換することがで
きる。典型的には、細菌コロニーを試験して、何れかがセルロースシンターゼを
コードする核酸を含むかどうかを決定する。結合性を通じて陽性クローンが同定
されると、それは末端、好ましくは３'末端から配列決定される。

【００５１】 Stratagene,Lajolla,CAから入手可能なlambda ZAPIIのような種々の宿主内で
、ポプラス属植物の師部から単離されたpoly(A)＋ＲＮＡを用いて、Bugosらによ
って記載された方法（Biotechnique 19:734-737,1995）に従い、cDNAライブラリ
を構築することができる。上述のプローブを用いてポプラス属植物のcDNAライブ
ラリを検定し、セルロースシンターゼの産生に関与する酵素についてコードする
cDNAを位置づけることができる。セルロースシンターゼ配列が位置づけられると
、それは技術的に公知の方法でクローン化されて配列決定される。

【００５２】遺伝子の特性に基づいて、例えば、該遺伝子が上述したような本発明のセルロ
ースシンターゼタンパク質の等電点、電気泳動、ヒドロパシープロット、アミノ
酸組成、又は部分的なアミノ酸配列を有するタンパク質生成物をコードする場合
、さらに選択を実行することができる。従って、該遺伝子の存在は、その発現さ
れた生成物の物理的、化学的、又は免疫学的特性に基づいた分析によって検出す
ることができる。例えば、適切なmRNAをハイブリッド選択するcDNAクローン又は
DNAクローンを用いて、本発明のセルロースシンターゼについて知られるのと同
様の特性を有するタンパク質を生成することができる。このような特性としては
、例えば、同様な又は同一の電気泳動的移動パターン、等電点電気泳動若しくは
非平衡ｐＨゲル電気泳動の挙動、タンパク質消化マップ、ヒドロパシープロット
、又は機能特性（単離された機能的なUDP−グルコース結合ドメインのような）
が挙げられる。

【００５３】本発明のセルロースシンターゼポリヌクレオチドは、mRNA選択によって、、す
なわち核酸ハイブリダイゼーション後インビトロ翻訳によっても同定することが
できる。この手順では、ヌクレオチド断片を使用して、ハイブリダイゼーション
によって相補的なmRNAを単離する。このようなDNA断片は、入手可能な精製され
たCelA DNAを意味し、又は部分的なアミノ酸配列の情報から設計された合成オリ
ゴヌクレオチドであってよい。単離されたmRNA生成物のインビトロ翻訳生成物の
機能分析（例えば、UDP−グルコース活性）によって、mRNA、ひいては所望の配
列を含む相補的DNA断片を同定する。放射能標識されたCelA cDNAは、鋳型として任意のmRNAを用いて合成すること
ができる。そして、その放射能標識されたmRNA又はcDNAをプローブとして用いて
、他のゲノムDNA断片の中からCelA DNA相同断片を同定することができる。本発明のCelAに加え、他のポリヌクレオチドをCelAプロモーターに操作的に連
結して、機械的ストレスの適用によるポリヌクレオチドの発現をコントロールで
きることが理解されるだろう。

【００５４】CelAポリペプチドの発現キメラタンパク質を含むCelA、またはその機能的断片、誘導体もしくはアナロ
グをコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、即ち、挿入タンパク
質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入し得る。
好ましくは、発現ベクターは、複製開始点を含む。上記の要素は、本明細書にお
いては総称的に“プロモーター”と称する。即ち、本発明のCelAをコードする核
酸は、本発明の発現ベクター中のプロモーターと機能可能に会合させ得る。cDNA
配列およびゲノム配列は、共にクローン化することができ、そのような制御配列
の制御下に発現させ得る。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、組換え発
現ベクター上に付与でき、或いはCelAおよび/またはその側方領域をコードする
本来の遺伝子によって供給できる。 CelAP以外に、セルロースシンターゼの発現は、当該技術において公知の任意
のプロモーター/エンハンサー要素によって制御できるが、これらの調節要素は
、発現に用いた宿主中で機能しなければならない。CelAポリヌクレオチド発現を
制御するのに使用し得るプロモーターは、構成的、発生特異的および組織特異的
のものがある。これらプロモーターの例としては、35Sカリフラワーモザイクウ
ィルス、頂生花および４CL-1がある。即ち、実施者の求めに応じ、種々のプロモ
ーターを用いて植物の成長を変化させる各種の方法がある。

【００５５】上記ヌクレオチド配列は、実施者の要求に応じてセンスまたはアンチセンス方
向に挿入し得る。例えば、セルロース生合成の増強を所望する場合、例えばセル
ロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター中にセンス方
向に挿入してセルロースシンターゼ産生、即ちセルロース生合成を増大させ得る
。また、セルロース生合成を低減させるか或いはリグニン含有量を増大させるこ
とを所望する場合、例えばセルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチド
は、アンチセンス方向に挿入し、転写時に、アンチセンスmＲＮＡがセンス配向
の他の相補性転写物にハイブリッド化して翻訳を防止するようにすることができ
る。他の実施態様においては、上記ポリヌクレオチドは、UDPグルコース結合性
ドメインをコードし、上述したのと同様な方法で使用される。

【００５６】本発明の組換えCelAタンパク質、またはその機能的断片、誘導体、キメラ構造
体もしくはアナログは、組換えによるコード配列の組込み後に、染色体的に発現
させ得る。この点については、上述したように、植物用の任意の多くの増幅系を
用いて高レベルの安定遺伝子発現を達成できる。DNA断片のクローニングベクタ
ーへの挿入に関して前述した方法のどれかを用いて、適切な転写/翻訳制御シグ
ナルおよび上記タンパク質コード配列からなる遺伝子を含有する発現ベクターを
構築できる。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成方法、およびイ
ンビボ組換え(遺伝子組換え)を含む。

【００５７】本発明のCelAをコードする核酸を含有する発現ベクターは、4つの一般的方法
によって同定できる：(a)所望プラスミドDNAまたは特異的mRNAのPCR増幅、(b)核
酸ハイブリダイゼーション、(c)選択マーカー遺伝子機能の存在または不存在、(
d)適切な制限エンドヌクリアーゼによる分析、および(e)挿入配列の発現。第1の
方法においては、核酸をPCRにより増幅させて増幅生成物の検出を行うことがで
きる。第2の方法においては、発現ベクター中に挿入した外来遺伝子の存在を、
挿入マーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼー
ションにより検出できる。第3の方法においては、組換えベクター/宿主系を、ベ
クター中への外来遺伝子の挿入により生じたある種の“選択マーカー”遺伝子機
能(例えば、β-グルクロニダーゼ活性、抗生剤に対する耐性、形質転換表現型等
)の存在または不存在に基づいて同定し、選択できる。別の例においては、CelA
をコードする核酸をベクターの“選択マーカー”遺伝子配列内に挿入した場合、
CelA挿入物含有組換え体を、CelA遺伝子機能の不存在により同定できる。第4の
方法においては、組換え発現ベクターを、適切な制限酵素による消化によって同
定する。第5の方法においては、組換え発現ベクターを、組換体によって発現さ
せた遺伝子産生物の活性、生化学特性または免疫学特性についてアッセイするこ
とによって同定できるが、発現タンパク質は機能的活性コンフォメーションを想
定することを条件とする。

【００５８】特定の組換えDNA分子を同定し分離した後、当該技術において公知の幾つかの
方法を用いてそのDNA分子を増殖させ得る。適切な宿主および増殖条件を確立さ
せると同時に、組換え発現ベクターを増殖させ、量的に調製できる。前述したよ
うに、使用できる発現ベクターとしては、限定するものではないが、前述したベ
クターまたはその誘導体がある。ベクターは、当該技術において公知の方法、例えば、アグロバクテリウム(Agr
obacterium)介在形質転換(後でさらに詳細に説明する)、トランスフェクション
、エレクトロポーレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合
、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融
合)、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体によって所望の宿主細胞中に導
入する(例えば、Wu et el., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967；Wu and Wu, 1
988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624；1990年3月15日に出願されたHartmut等
のカナダ特許出願第2,013,311号を参照されたい)。 CelAをコードする核酸を含む組換えベクターが入った細胞は、この細胞によっ
てCelAの発現を与える条件で、適切な細胞培地中で培養する。さらに、挿入配列
の発現を調節し、或いは遺伝子産生物を所望する特異的な形で改変し加工する宿
主細胞株を選択できる。種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳時および翻訳後の
加工および改変(例えばシグナル配列のグリコシル化、開裂のような)において特
徴的で且つ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系を選択して
発現させた外来タンパク質の所望の改変および加工を確実にすることができる。

【００５９】アグロバクテリウム介在形質転換および体性胚誘導本発明において使用し、アグロバクテリウムを形質転換するための培地は、有
効量の上述の培地成分(例えば、基本培地、増殖調節剤、炭素源)の各々を含有す
る。本発明を説明するのに使用するとき、ある培地成分の“有効量”とは、説明
した効果を生ずるのに必要な量である。例えば、一次カルス増殖培地中の成長ホ
ルモンの有効量は、他の培地成分と組合せたときにカルス形成を誘導させる成長
ホルモンの量である。ビタミン類およびゲル化剤のような組織培養培地において
有用であることが知られている他の成分も本発明の培地の任意成分として使用で
きる。植物、例えば、樹木由来の細胞の形質転換、並びにその後の当該技術において
公知であり本明細書においてさらに説明するアグロバクテリウム介在形質転換手
法を使用するトランスジェニック植物の作製は、外来遺伝子を樹木に導入する方
法の1例である。トランスジェニック植物は、下記の工程によるような種々の方
法によって作製することができる：(i)アグロバクテリウムを低pH誘導培地中で
低温で培養し予備調製する、即ち、バクテリアを癒傷タバコ葉抽出物と一緒に共
培養して、その生成物がT-DNA転移体中に関与するアグロバクテリウムvir遺伝子
の高レベルの発現を誘導する；(ii) 培養外植体から誘導した接合子性および/ま
たは体細胞性胚性組織のような所望植物組織を刺激したアグロバクテリウムと一
緒に共培養する；(iii)抗生物質を含有する培地で形質転換カルス組織を選択す
る；および(v)上記の胚を苗木に転換する。

【００６０】無害化(disarmed)Tiプラスミドを保持している任意の非腫瘍原性A.ツメファシ
エンス(A. tumefaciens)株を本発明の方法において使用できる。任意のアグロバ
クテリウム系を使用できる。例えば、Tiプラスミド/バイナリーベクター系また
は1個のTiプラスミドを有する共組込みベクター系を使用できる。また、例えば
、疾病に対する耐性を与える遺伝子またはセルロース含有量を改善する遺伝子の
ような、形質転換された細胞、カルス、胚または植物を選択する能力を与える任
意のマーカー遺伝子またはポリヌクレオチド、並びに任意の他の遺伝子も使用で
きる。例えば、本発明のPtCelAPおよび上述したようなプロモーターのような任
意の所望プロモーターも使用できる。当業者であれば、どのマーカーと遺伝子を
特定の求めに応じて使用するのかは決定できることである。本発明の目的において、“形質転換”または“トランスジェニック”とは、選
択性のマーカー特性を与える少なくとも1個のマーカー遺伝子またはポリヌクレ
オチドを植物細胞、カルス、胚または植物のDNAに導入することを意味する。さ
らに、任意の遺伝子が導入されてよい。

【００６１】上記バクテリアの感染性を増大させるためには、アグロバクテリウムを、低pH
誘導培地、即ち、4.5〜6.0、最も好ましくは約5.2に調製したpH値を有する任意
のバクテリア培養培地中で、例えば約19〜30℃、好ましくは約21〜26℃のような
低温で培養する。この低pHおよび低温条件は、アグロバクテリウムに病原性活性
を誘導するための良好に構成された臨界的要因内にある(例えば、Altmorbe et a
l., Mol. Plant-Microbe. Interac. 2: 301,1989；Fullner et al., Science 27
3: 1107, 1996；Fullner and Nester, J. Bacteriol. 178: 1498, 1996)。上記バクテリアを癒傷タバコ葉抽出物(当該方法において一般に公知の方法に
従って調製した)と一緒に共培養してアグロバクテリウムvir遺伝子の高レベル発
現を誘導することによって予備調製する。植物の体細胞性胚の接種前に、アグロ
バクテリウム細胞は、インビトロ増殖させたタバコ植物の癒傷葉組織から調製し
たタバコ抽出物で処理してもよい。癒傷誘導代謝物および他の細胞因子によるア
グロバクテリウムvir遺伝子の発現の最適刺激を達成させるためには、タバコ葉
を癒傷させて、一夜予備培養してもよい。低pH培地における低温でのバクテリア
の培養は、バクテリアvir遺伝子発現と感染性をさらに高めるのに使用できる。
タバコ葉抽出物による予備調製およびT-DNA輸送課程に関与するvir遺伝子は、当
該技術において一般によく知られたものである。

【００６２】上述のようにして処理したアグロバクテリウムを、その後、例えば接合体性組
織および/または体細胞性胚組織のような植物組織外植体と一緒に共培養する。
非接合体性（即ち、体細胞性）または接合体性組織を使用できる。任意の植物組
織を外植体源として使用できる。例えば、種子からの子葉、若葉組織、根組織、
結節外植体のような茎の1部、および根軸のような1次体性胚からの組織を使用で
きる。一般に、幼若組織が好ましい外植体源である。また、本発明は、結果として植物の成長を変化させる本発明のポリヌクレオチ
ドを発現させることによって植物の成長を改変させる方法にも関する。本発明に
おいて使用するポリヌクレオチドは、同種ポリヌクレオチドでも異種ポリヌクレ
オチドでもよく、上記で詳細に説明した。例えば、全長およびUDPグルコース結
合領域含有断片の両方を発現させ得る。さらに、本発明方法の目的に応じ、上記
ポリヌクレオチドは、植物中にセンス配向またはアンチセンス配向で導入できる
。任意の適切なプロモーターを用いて発現を実施し得る。プロモーターまたはそ
の機能的断片を上記ポリヌクレオチドに機能可能に結合させる。このプロモータ
ーは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生特異的植物プロ
モーターであってよい。適切なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウィ
ルス35S、４CL、セルロースシンターゼプロモーター、PtCelAPおよび頂生花プロ
モーターである。

【００６３】さらに、本発明は、上述したような本発明のポリヌクレオチドを発現させるこ
とによって植物中のセルロース含有量を変化させる方法に関する。本発明方法は
、本発明の外因性ポリヌクレオチドを導入した植物中のリグニンに対するセルロ
ース比を増大させるのに使用できる。さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを植物細胞中に
導入しこのポリヌクレオチドを発現させることによって植物細胞中でのセルロー
スシンターゼの発現を変化させる方法に関する。上述したポリヌクレオチドおよ
びプロモーターを使用できる。植物細胞中にストレス誘導性遺伝子発現を生じさせる方法も本発明の範囲に属
する。この方法は、(i)植物または植物細胞中に、セルロースシンターゼプロモ
ーターまたはその機能的断片を含む発現カセットを導入すること、或いは上記発
現カセットを含む植物または植物細胞を提供すること(上記カセットのプロモー
ターは、選択したコード配列に機能可能に結合させる)；および(ii)機械的スト
レスを植物に加えて所望の前記コード配列の発現を誘導させることを含む。

【００６４】また、セルロースシンターゼプロモーター中の正の機械的ストレス応答性要素
(MSRE)を測定する方法も、本発明の範囲に属し、(i)例えば配列番号:3のような
セルロースシンターゼプロモーター中の系列的欠失体を調製すること；(ii)レポ
ーター配列をコードするポリヌクレオチドに結合させたこの欠失体を植物細胞中
に導入すること；および(iii)ストレスを植物に誘導させた後、この植物中の前
記レポーターの減少量を検出することを含む。同様に、セルロースシンターゼプ
ロモーター中の負のMSREの測定方法も提供される。その方法は、(i)例えば配列
番号:3のようなセルロースシンターゼプロモーター中の系列的欠失体を調製する
こと；(ii)レポーター配列をコードするポリヌクレオチドに結合させたこの欠失
体を植物細胞中に導入すること；および(iii)ストレスを植物に誘導した後に、
この植物中の前記レポーターの増大量を検出することを含む。

【００６５】下記の各方法も本発明の範囲に属する：セルロースシンターゼをコードするポ
リヌクレオチドに機能可能に結合させた組織特異性プロモーターで植物を形質転
換させることを含む組織特異性様式でセルロースシンターゼを発現させる方法；
植物中に、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質
をコードするcDNAを導入し、それによってこの植物中にセルロース発現の増大を
もたらすことを含み、前記正のMSREへの結合がセルロースシンターゼの発現を生
じさせるものである、植物においてセルロースシンターゼ発現を誘導する方法；
植物中にアンチセンス配向のcDNAを導入することを含み、センス配向の前記cDNA
は正のMSREに結合するタンパク質をコードし且つセルロースシンターゼの発現を
生じさせるものである、セルロースシンターゼ発現を低減させる方法；植物中に
、セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコード
するcDNAを導入することを含み、この正のMSREへのタンパク質結合がセルロース
シンターゼ発現を生じさせるものである、植物においてセルロース生合成を増大
させる方法；および植物中にアンチセンス配向のcDNAを導入することを含み、セ
ンス配向の前記cDNAはセルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合する
タンパク質をコードするもおんである、植物においてセルロース生合成を低減さ
せる方法。

【００６６】実施例セルロースシンターゼの分子クローニング本実施例は、RSW1 cDNAを用いてポプラス属(aspen)の木の発達中の二次木質部
からクローン化した最初の樹木セルロースシンターゼcDNA (PtCelA、GenBank No
. AF072131)を記載する。本発明前には、作物由来のセルロースシンターゼの部分クローンおよび綿GhCe
lAが見出されているのみであり、これらは互いに有意の相同性を有している。本
発明者等は、アラビドプシス(Arabidopsis)1次ライブラリー由来の新規な全長セ
ルロースシンターゼcDNAであるAraxCelA(ジーンバンクNo. AF062485) (図7、[配
列番号:4])を見出し、クローン化した。AraxCelAは、セルロースシンターゼの新
規な1員であり、他のアラビドプシスCelAメンバーとアミノ酸配列において63〜8
5％の同一性と72〜90％の類似性を有する。別のセルロースシンターゼを、ポプラス属植物中で、中心位置にUDPグルコー
ス結合ドメインをコードするアラビドプシスCelA cDNAの³²P標識した1651bp鎖長
EcoRI断片を用いてクローン化し、ポプラス属植物 (Populus tremuloides（ヤマ
ナラシ）)由来の約500,000 pfuの発達中の木質部cDNAライブラリーをスクリーニ
ングするためのプローブとして使用した(Ge and Chiang, 1996)。4つの陽性クロ
ーンが3回のプラーク精製後に得られた。これら４つのcDNAの3'末端のシーケン
シングは、これらが同一のクローンであることを示した。最長のcDNAクローンを
十分にシーケンシングして3232 bpのヌクレオチド配列を有する全長cDNAである
ことを決定した(図1)[配列番号:1]；このクローンは、978個のアミノ酸のタンパ
ク質をコードしている[配列番号:2]。

【００６７】ポプラス属植物由来のセルロースシンターゼの特性決定 PtCelAの最初のAUGコドンは、Joshi(1987a)およびJoshi等(1997)によって開示
された最適状況配列に基づき、転写開始について最適状況にあった。推定のポリ
アデニル化シグナル(AATACA)は、28 bpのポリアデニル化尾部上流の16 bpで見出
され、これは、提案された植物構造(Joshi, 1987b)に類似している。5'の翻訳さ
れていない先導部は、68 bpを有することが測定され、3'の翻訳されていない後
続部は227 bpであった。これら領域は、共に多くの植物遺伝子において観察され
る典型的な長さを有する(Joshi, 1987aおよびJoshi, 1987b)。このcDNAクローン
は、綿由来のセルロースシンターゼ(GhCelA)との90％のアミノ酸配列類似性、お
よびアラビドプシス由来のセルロースシンターゼ(RSW1)との71％類似性を示し、
この特定の樹木ホモログもセルロースシンターゼをコードしていることを示唆し
た。

【００６８】上記全長cDNAは、PtCelAと表示され、6.58の等電点(pI)および8個の荷電分子
を有する110,278 Daのポリペプチドをコードしている。そのヒ疎水性曲線は、こ
の特定のセルロースシンターゼが８個の膜貫通結合性ドメインを有することを示
した；HoffmanおよびStoffelの方法(1993)を用いて、アミノ末端に2個、カルボ
キシル末端に6個。このタンパク質構造は、RSWlおよびGhCelAの構造と類似であ
る。QVLRWおよび保存Ｄ残基のようなUDPグルコース結合のための保存ドメインの
すべてが、本発明のセルロースシンターゼ、例えば、PtCelA中にも存在している
(Brown et al., 1996)。即ち、配列および分子解析に基づき、PtCelAは、アラビ
ドプシスにおけるRSWlのように、ポプラス属植物のセルロース生合成組織におい
て不可欠である触媒性サブユニットをコードしているものと結論付けた。

【００６９】茎の１次および２次成長によって形成された発生勾配に沿うPtCelA mRNA転写
物のin situの局在決定は、セルロースシンターゼ発現が２次壁肥大を受ける発
達中の木質部細胞に対して専ら確認されることを明らかにした。PtCelA遺伝子発
現のこの細胞タイプ特異性は、異種プロモーター-β-グルクロニダーゼ(GUS)融
合分析に基づくセルロースシンターゼプロモーター(PtCelAP)の木質部特異活性
とも一致していた。結局、この結果は、セルロースシンターゼがポプラス属植物
のような樹木の木質部における２次壁形成中のセルロース生合成に主として関与
する遺伝子であることの数条の証しを提供するものである。本発明等による以前
の結果(Hu et al., 1999)は、セルロースとリグニンが木材中で補償的な形で沈
着していることを示していた。ポプラス属植物のような樹木中でのセルロースシ
ンターゼの発見は、セルロース産生を上昇させるタンパク質のアップレギュレー
ションを可能にする。驚くべきことに、樹木中のCelAの発現は、リグニン生合成
を抑制して樹木の木材特性をさらに改善した。

【００７０】トランスジェニック植物の調製 UDP-グルコース結合性配列をpBI121にサブクローン化し、これを、トランスジ
ェニックタバコ植物を調製するのに用いた(Hu et al., 1998)。異種UDP-グルコ
ース結合性配列の発現は、著しい成長促進効果をもたらした。このことは、植物
セルロースシンターゼの機能についての現在の知識においては、セルロースシン
ターゼがセルロース生合成を開始するためには、UDP-グルコース配列はCelA中の
他の機能的ドメイン、例えば、膜貫通ドメインとインタクトのままでなければな
らないことが教示されていることから、驚くべきことである。トランスジェニッ
クタバコにおいて観察された植物バイオマス中での著しい成長と恐るべき肥大は
、セルロースの増大した沈着に基づいているようであり、UPDグルコース単独で
植物中のセルロース生合成の遺伝子的増強において十分であることを示していた
。

【００７１】新規なセルロースシンターゼのゲノム機構と発現図1のcDNAクローン[配列番号:1]がセルロースシンターゼであることを確認す
るため、ゲノムサザンブロット分析を、このcDNAを用いての高および低ストリン
ジェンシーの両条件下で行った。ポプラス属植物由来のゲノムDNAをPstI(レーン
Ｐ)、HindIII(レーンＨ)およびEcoRI(レーンＥ)で消化し、図１のセルロースシ
ンターゼの5'末端由来の1kb ³²P-標識断片を用いてプロービングした。このサザ
ンブロットは、ポプラス属植物ゲノム内の小群のセルロースシンターゼ遺伝子の
小さなファミリーの存在を示唆した(図2、パネルaおよびｂ)。ポプラス属植物木
質部cDNAライブラリーの各種植物CelA関連プローブによる繰り返しのスクリーニ
ングは、同じセルロースシンターゼcDNAクローンの分離を常にもたらした。この
ことは、クローン化されたセルロースシンターゼcDNA(図１)[配列番号:1]が、活
性なセルロース沈着が生ずる場合に、ポプラス属植物のような樹木の木質部発達
において主要な、最も豊富なセルロースシンターゼコード遺伝子を表すことを示
唆していた。また、セルロースシンターゼ遺伝子発現操作が樹木におけるセルロ
ース生合成に深い影響を及ぼすことも示している。

【００７２】 in situハイブリダイゼーション標識プローブ(上述したような)を用いたポプラス属植物の実生茎の節間からの
総RNAのノーザンブロット分析(図2、パネルc)は、１次成長を受けた組織におい
てセルロースシンターゼ転写物が殆ど存在しないこと(節間1〜4)、およびセルロ
ースシンターゼ転写物の存在は茎組織の2次成長中に生じていること(節間5〜11)
を明らかにした。しかしながら、1次成長中の弱いノーザンシグナルは、セルロ
ースシンターゼ遺伝子発現が１次成長組織においては殆ど存在しない木質部に特
異性であることを示唆しているだけかもしれない。高等植物における木部形成(xylogenesis)は、形成組織細胞分裂の順次的実行
、木質部細胞分化へのコミットメント、および木質部細胞死の最盛期を含む、特
有のモデルを提供する(Fukuda, 1996)。１次および2次木質部細胞は異なるタイ
プの形成組織、即ち、前形成層および束索間/束索内形成組織に由来しているけ
れども、両組織は、大量のセルロースおよびリグニン沈着を伴う顕著な２次壁発
生を示す(Esau, 1965)。細胞レベルでの空間的および一時的セルロースシンター
ゼ遺伝子発現パターンをさらに試験するため、in situハイブリダイゼーション
を用いてセルロースシンターゼmRNAを茎の１次および2次成長によって形成され
た発生勾配に沿って局在化させた。

【００７３】種々の成長段階での茎中のセルロースシンターゼ遺伝子転写物(RNA)の局在化
も観察された。図3は、説明したようなジゴキシゲニン(DIG)ラベル化セルロース
シンターゼアンチセンスまたはセンス(対照)RNAプローブでハイブリッド化した
第2、第4および第6節間からの横断面を示す。 PtCelA転写物を、PtCelA cDNAの高可変性5'領域(PstIおよびSacIから産生させ
た771 bp長鎖断片)の転写物によるin situハイブリダイゼーションによって若い
ポプラス属植物茎切片において検出した。この領域を、先ず、T7(アンチセンス
転写物用)およびSP6(センス転写物用)RNAポリメラーゼ(DIG系；Boehringer Mann
heim社)を用い、ジゴキシゲニン(DIG)ラベル化転写物を生成させるために、プラ
スミドベクター、pGEM,-3Zf (+) (Promega社)中にサブクローン化した。各プロ
ーブは、100 mM NaHCO₃、pH 10.2中で60℃でのインキュベーションによる穏やか
なアルカリ性加水分解に供し、約200 bpの断片を産生させた。

【００７４】ポプラス属植物幼若茎を用い、100 mMリン酸塩緩衝液(pH 7.0)中の4％(w/v)パ
ラホルムアルデヒド中で60℃で一夜固定化することによって切片化し、氷上のエ
タノール系で脱水し、パラプラスト(Paraplast)培地(Sigma社)中に埋め込んだ。
10μm切片をスーパーフロスト/プラス(Superfrost/plus) (Fisher社)スライド上
に42℃で一夜取付け、脱ワックスし、次いで勾配エタノール系で再水和させた。
各切片をプロティナーゼＫ(100 mM Tris-HCl、50 mM EDTA、pH 7.5中10μg/ml)
と一緒に30分間インキュベートし、FAAで後固定させた。各切片を、ハイブリダ
イゼーション前に、0.1 Mトリエタノールアミン-HCl(pH 8.0)中の0.33％(v/v)無
水酢酸でアセチル化した。次いで、ハイブリダイゼーション混合物(約2μg/mlの
DIG標識プローブ、50％(v/v)のホルムアミド、2 X SSPE、10％(w/v)硫酸デキス
トラン、125μg/mlのtRNA、pH 7.5)中で45℃、12〜16時間インキュベートした。
ハイブリダイズしていない一本鎖RNAプローブを500 mM NaClを含むTE緩衝液中の
20μg/mlのRNase Aによる処理によって除去した。ハイブリダイズしたDIG標識プ
ローブを、製造業者の仕様書(DIG系；Boehringer Mannheim社)に記載されている
ように、1：1500希釈の抗ジゴキシゲニン抗血清を用いて検出した。各切片をEcl
ipse 400光学顕微鏡(Nikon社)により検査し、写真撮影した。

【００７５】１次成長段階(図3、パネルaおよびｂ)中に、セルロースシンターゼの強い発現
が1次木質部(PX)細胞に専ら局在化して見出された。この段階においては、幼弱
節間は、伸びる最中であり、２次壁の形成による1次木質部細胞の肥大化を生ず
る(Esau, 1968)。苗条伸長とセルロースシンターゼの高発現の同時発生は、セル
ロースシンターゼタンパク質と2次細胞壁セルロース合成の相関を強く示唆して
いる。1次成長の後期段階(図3、パネルｂ)は、1次木質部細胞の順序だった配列
の出現に特徴を示す。活性なセルロース生合成は、これらの1次木質部細胞中で
のセルロースシンターゼの強い発現によって示されるように、細胞伸長誘導性壁
肥大化を伴う。より成長した節間における2次成長の初期においては、セルロースシンターゼ
の発現は、ここでも、木質部細胞に専ら局在化していることが観察された(図3、
パネルｃのSX)。分裂活性に遠位的な節間内の伸びの代りに、この段階での成長
は、2次木質部の2次細胞壁の肥大化のために主としてラジカルである。同時に、
PtCelA遺伝子の発現は、2次発生木質部細胞に局在化するようになり(図3、パネ
ルｃ)、ここでも、PtCelAが2次細胞壁セルロースシンターゼをコードするという
着想と一致している。この段階において、2次木質部細胞は、伸長し分化した1次
木質部細胞を覆い、PtCelA遺伝子発現は最早検出できない(図3、パネルｃ)。こ
れらの結果は、PtCelA遺伝子の発現が木質部特異性であり、図1のセルロースシ
ンターゼ[配列番号:1]が木質部細胞の２次壁中でのセルロース生合成に関連する
セルロースシンターゼをコードしていることを示唆している。セルロースシンタ
ーゼの木質部特異性発現をさらに確認するために、セルロースシンターゼ遺伝子
プロモーター配列をクローン化し、制御活性について特性決定した。

【００７６】セルロースシンターゼプロモーターによって制御された発現の特性解析図1のセルロースシンターゼ5' 1,200 bp cDNA断片[配列番号:1]をプローブと
して用いて新規なセルロースシンターゼ遺伝子、PtCelAの5'制御配列についてポ
プラス属植物ゲノムライブラリーをスクリーニングした。このライブラリーは、
部分消化し蔗糖勾配選択したSau3AI消化物から生成したポプラス属植物ゲノムDN
A断片をLambda DASH IIベクター(カリフォルニア州ラホヤのStratagene社)のBam
HIサイト中にクローン化することによって構築した。5つの陽性クローンが約150
,000 pfuから得られ、Lambda DNAを精製した。約20 kbのDNA挿入サイズを有する
1つのクローンを制限マッピングおよび部分シーケンシング用に選択した。これ
によって、約1 kbのPtCelA遺伝子の5'側方領域の同定が得られた。PtCelAPと表
示したこのゲノム断片(図4)[配列番号:3]は、約800 bpのプロモーター配列、68
bpの5'末端未翻訳領域および160 bpのコード配列を含有していた。細胞レベルで
の組織特異性セルロースシンターゼ発現の制御を試験するために、プロモーター
活性を、GUSタンパク質の組織化学染色によりトランスジェニックタバコ植物中
で分析した。PtCelAP-GUS融合バイナリーベクターは、pBI121中でPtCelAP [配列
番号:3]で置換した35Sプロモーターにより構築し、Hu等(1998年)に従ってタバコ
(Nicotiana tabacum)に導入した。

【００７７】 CelAP-GUS融合を保持する11個の独立のトランスジェニック系を作製した。図5
は、トランスジェニックタバコ植物中で本発明のセルロースシンターゼプロモー
ターにより駆動されたGUS発現の組織化学分析を示す。第3(パネルa)、第5(パネ
ルｂ)、第7(パネルｃ)および第8(パネルｄおよびｆ)節間からの横断面をGUS活性
により染色し、蛍光顕微鏡検査を用いてUV照射下に発現を可視化した。 GUS染色は、茎、根および葉柄の木質部組織において専ら検出された。茎にお
いては、強いGUS活性が1次(図5、パネルa)および2次成長(図5、パネルｂ〜ｄお
よびｆ)を受ける木質部細胞に局在化しているのが見出された。GUS発現は、1次
成長段階においては木質部細胞に検定され、2次成長中の2次木質部細胞の発生に
おいてより局在化するようになった。第8節間からの切片は、全体がGUS活性に対
して染色した(図5、パネルｆ)。これらの結果は、ポプラス属植物茎中のセルロ
ースシンターゼのインビボ発現パターンと一致している。リグニン自己蛍光はUV
照射後に可視化した。師部繊維は、これもセルロースおよびリグニン生合成にお
いて活性である(図5、パネルｄおよびe)が、GUS活性を示さず、セルロースシン
ターゼ遺伝子発現は木質部以外のタイプの細胞中でのセルロース生合成とは関連
しないことを示唆していた。根、茎、葉、葯および果実中のGUS活性試験も、こ
れら器官全部の木質部組織中でGUS発現を示し、本発明のセルロースシンターゼ
が木質部特異性セルロースであり、植物器官全部において発現することを示唆し
ていた。

【００７８】 1つの特定の源(ヤマナラシ)由来の本発明のセルロースシンターゼのプロモー
ター活性および細胞性発現の特性決定は、その発現が2次細胞壁特異性セルロー
スシンターゼをコードし、発達中の木質部細胞に特異的に区画化されるタンパク
質を産生させることを示していた。セルロースシンターゼ遺伝子プロモーター配
列の特性決定は、セルロースシンターゼの細胞タイプ特異的発現を確認すること
のみならず、セルロースシンターゼを組織特異な形で過剰発現させて木質部にお
けるセルロース産生を増強する方法も提供する。

【００７９】引張りストレス下でのセルロースシンターゼの発現前述したように、本発明のセルロースシンターゼプロモーターは、セルロース
シンターゼの新規な遺伝子制御現象に関連している。本発明のセルロースシンタ
ーゼをさらに特性決定するために、ポプラス属植物セルロースシンターゼプロモ
ーター(PtCelAP)により誘導されたGUS発現を、トランスジェニックタバコ植物に
おいて引張りストレスなし、または引張りストレス下で観察した。そのストレス
は、植物を曲げて押え、その曲げ位置にて40時間以上維持する(例えば、結ぶ)こ
とによって誘導した。接戦方向および縦(軸)方向切片を、曲げる前、および曲げ
た後の4時間、20時間および40時間で採取した(それぞれ、パネルa〜d)。上記セルロースシンターゼプロモーターGUS融合バイナリー構築物は、引張り
ストレスなしでGUSの排他的木質部特異的発現を示した(図6、パネルa)。しかし
ながら、本来的に被子植物が耐える引張りストレス条件下では、上記トランスジ
ェニックタバコ植物は、応力の最初の4時間以内で茎の上部に木質部および師部
特異的発現を誘導した(図6、パネルｂ)。

【００８０】これは、引張り中に木質部発達繊維が高結晶性のセルロースを産生して、曲っ
ている茎に本質的機械強度を与えたので、驚くべき観察であった。本観察は、樹
木中の高結晶性セルロース発生に直接関与するセルロースシンターゼプロモータ
ーを介したセルロースシンターゼの転写アップレギュレーションの最初の提示で
あった。さらにまた、引張りストレス20時間後では、木質部と師部は共にGUS発
現を示したが、引張りストレス下にある茎の上側のみであった；即ち、下側のGU
S発現は抑制された(図6、パネルｃ)。延長されたストレス(40時間まで)において
は、GUS発現は、最高の引張りストレスが存在する茎の上側上の1つの小領域のみ
に限られた(図6、パネルｄ)。引張りストレス下での木質部細胞中でのGUSシグナ
ルの観察および圧縮下またはストレスなしでのGUSの不存在に基づき、本発明の
セルロースシンターゼプロモーターは、茎へのストレスの存在およびタイプによ
ってセルロースシンターゼ遺伝子を刺激または抑制する機械的ストレス応答要素
(MSRE)を有するものと結論付けた。

【００８１】上記結果は、正のMSREが、引張りストレスに応答して転写因子を結合しセルロ
ースシンターゼの発現を制御し、且つより高結晶性のセルロースの生合成を増大
させる本発明のセルロースシンターゼプロモーター中に存在することを示してい
る。このことは、引張りストレスに曝された茎の上側での木質部および師部組織
中でのGUSの発現に基づき顕著であるが、下部側上の組織が圧縮に曝されるかま
たは応力に曝されない場合にはそうではない。さらにまた、圧縮ストレスに曝さ
れた茎の下部側の組織はGUS発現を示さなかった、即ち、発現は抑制された。こ
のことは、転写因子を結合して茎の下部側ではセルロースシンターゼの発現を抑
制する負のMSREの存在を示した。負のMSREは、正常な樹木中の高結晶性セルロー
スの発生を抑制するようである。

【００８２】これらの結果は、強度特性を向上させるための幼若樹木における高結晶性セル
ロースの遺伝子工学的合成、および反応樹木中での高割合のセルロースの合成に
おけるメカニズムを提供する。正のMSREおよびその同族転写因子は、高引張り強
度を有する高結晶性セルロースの合成において重要であり、負のMSREおよびその
同族転写因子の抑制も同様である。かくして、本発明は、当該技術において公知
の方法に従って正および負のMSREに結合する転写因子に対してcDNAをクローニン
グする出発点を提供する。正のMSRE転写因子に対するcDNAの構成的発現は、トラ
ンスジェニック樹木中での高結晶性セルロースの連続産生を可能にし、一方、負
のMSRE転写因子に対するアンチセンスcDNAの発現は、セルロースシンターゼが抑
制し得ないように転写因子を抑制する。この組み合わせは、樹木中の高結晶性セ
ルロースの連続産生を確約するであろう。

【００８３】トランスジェニック植物中のセルロースシンターゼの遺伝子操作上述したように、本発明のセルロースシンターゼのヌクレオチド配列、例えば
、ポプラス属植物由来のPtCelA cDNAは、標準セルロースシンターゼクローンと
言われているセルロースシンターゼタンパク質をコードする他のポリヌクレオチ
ドと有意の相同性を示す。セルロースシンターゼ活性をさらに特性決定するため
に、4つの構築物をPBI121プラスミド中で調製した。 1) 構成的植物プロモーターカリフラワーモザイクウィルス35SをPtCelAに機能
可能に結合させ(35SP-PtCelA-s)、トランスジェニック植物中で過剰発現させた
。このことは、セルロースの過剰産生を生じ、リグニン含有量の低減をもたらす
。タバコとポプラス属植物をこの構築物で形質転換させた。 2) カリフラワーモザイクウィルス35SをPtCelA由来のアンチセンスRNAに機能
可能に結合させ((35SP-PtCelA-a)、構成的に発現させてトランスジェニック植物
中のセルロース産生を低減させリグニン含有量を増大させた。このネガティブコ
ントロール構築物は、セルロースが植物成長と発育に不可欠であるので、健全な
植物を生じないことがある。ポプラス属植物植物をこの構築物で形質転換させた
。 3) ポプラス属植物4CL-1プロモーター(Hu et al., 1998)をPtCelAに活機能可
能に結合させ(Pt4CLP-PtCelA) (PBI121の35Sプロモーターは、この構築物におい
ては除去した)、組織特異的様式で発達中のトランスジェニックポプラス属植物
の2次木質部で発現させた。この発現は、被子植物組織の生来のセルロース産生
を増強させ、リグニン含有量を低減させる。タバコとポプラス属植物をこの構築
物で形質転換させた。 4) セルロース生合成の際にUDP-グルコース結合に関与すると教示されている
３つの保存領域を含有するPtCelAの細胞質ドメインを35Sプロモーターに結合さ
せてバイナリー構築物を作製した(35S-PtCelA UDP-グルコース)。このプロモー
ターによる発現は、トランスジェニック植物においてPtCelAのUDP-グルコース結
合性ドメインの構成的発現を可能にする。タバコとポプラス属植物をこの構築物
で形質転換させた。

【００８４】 35S-GUS構築物(pBI121、カリフォルニアのClon Tech社)を、各構築物による試
験において対照として用いた。トランスジェニックタバコ植物を各構築物で形質
転換した。下記の表は、T0タバコ植物の一般的成長測定値を示す。PtCelA構築物
を担持する植物は、pBI121(対照)構築物を担持する対照植物よりもはるかに早く
成長した。発生特異的4CLと構成的35SのプロモーターのPtCelA発現の制御の比較
において、35Sの方がより効果的であり、トランスジェニックタバコ植物のより
早い成長を可能にした。最も早い成長は、PtCelA由来の35Sプロモーター駆動UDP
-Gドメインを担持するトランスジェニック植物において観察された。 T0世代植物が、その組織培養処理からの効果を持越し得ることに留意されたい
。従って、種子を、T1世代におけるこの成長現象を試験するために収集した。ト
ランスジェニックタバコ植物を導入遺伝子の存在について分析し、すべてが各々
の遺伝子構築物に対して陽性であった。

【００８５】

【表１】表土壌に移植した後の約1.5ヶ月間のトランスジェニックタバコ植物測定値 (N=2)
注：すべての値は、葉の枚数を除いてcmで測定した。

【００８６】当業者であれば、本発明の実施例および好ましい実施態様が例示的でり、本発
明は同じ発明概念を有する種々の実施態様で実施し得ることを理解するであろう
。

【００８７】文献 Hu et al., 1999, Nature Biotechnology, 印刷中 Whetten et al., 1998, Ann Rev PI Physiol PI Mol Biol, 49:585-609 Arioli et al., 1998, Science, 279: 717-720 Wu et al., 1998, PI Physiol, 117: 1125 Hu et al., 1998 PNAS, 95:5407-5412 Joshi et al., 1997, PMB, 35: 993-1001 Fukuda, 1996, Ann Rev PI Physiol PI Mol Biol, 47: 299-325 Pear et al., 1996, PNAS, 93: 12637-12642 Haigler and Blanton, 1996, PNAS, 93: 12082-12085 Ge and Chiang, 1996, PI Physiol, 112: 861 Brown et al., 1996, Trends PI Sci., 1: 149-156 Delmer and Amor, 1995, PI Cell, 7:987-1000 Hoffman and Stoffel, 1993, Biol Chem, Hoppe-Seyler 374: 166 Joshi, 1987, NAR, 15: 6643-6653 Joshi, 1987, NAR, 15: 9627-9640 Timmell, 1986, Compression Wood in Gymnopserms, Springer Verlag Esau, 1967, Plant Anatomy, Wiley and sons, NY Higuchi, 1997, Biochemistry and Molecular Biology of Wood, Springer Verl
ag

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Populus tremuloides（ヤマナラシ）のセルロースシン
ターゼをコードする核酸配列（配列番号１）およびそのタンパク質配列（配列番
号２）を示す。

【図２】図２a-c（まとめて、図２という）は、図１に示したヤマナラシc
DNAの断片をプローブとした、低いストリンジェンシー（パネルａ）および高い
ストリンジェンシー（パネルｂ）におけるヤマナラシゲノムDNAのサザンブロッ
ト解析、および、同じプローブを用いた幹の節間からのヤマナラシ全RNAのノー
ザンブロット解析を示す。

【図３】図３a-d（まとめて図３という）は、第２節間（パネルａ）、第
４節間（パネルｂ）、第６節間（パネルｃ）および第５節間（パネルｄ）からの
横断切片におけるセルロースシンターゼ遺伝子転写物のin situ局在を示す。

【図４】プロモーター領域およびコード配列の５'部分を含む、ヤマナラ
シセルロースシンターゼ遺伝子の５'領域の核酸配列を示す（配列番号３）。

【図５】図５a-f（まとめて図５という）は、トランスジェニックタバコ
の、本発明のセルロースシンターゼプロモーターによって駆動されるGUS遺伝子
発現についての組織化学的解析（パネルａ−ｄおよびｆ）および蛍光顕微鏡写真
（パネルｅ）を示す。

【図６】図６ａ−ｄ（まとめて図６という）は、本発明のヤマナラシセル
ロースシンターゼプロモーターによって駆動させるGUS遺伝子発現の組織化学的
解析を示す；曲げる前（パネルａ）、および曲げた４時間後（パネルｂ）、20時
間後（パネルｃ）および40時間後（パネルｄ）に接線方向および軸方向の切片を
集めGUS発現について染色した。

【図７】図７は、Arabidopsisから単離したセルロースシンターゼをコー
ドするcDNAを示す（配列番号４）。

【図８】図８は、図７に記載したcDNAによってコードされるArabidopsis
セルロースシンターゼを示す（配列番号５）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者チャンドラシェカールジョシピーアメリカ合衆国ミシガン州 49931 ホートンセダーブラフドライヴ 713 (72)発明者キャラウェイダニエルティーアメリカ合衆国ジョージア州 31717 ベインブリッジリッチストリート 1910 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD06 CA06 CA17 CA19 CD03 CD07 CD09 4B024 AA08 BA10 CA04 DA01 EA03 FA02 GA11 HA01 4B050 CC03 DD13 LL05 LL10 4B063 QA01 QQ40 QQ44 QR32 QR55 QS34 4B065 AA88X AB01 AC14 BA02 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド、または、（ｂ）配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
、または（ｃ）セルロースシンターゼの機能的ドメインをコードする（ａ）また
は（ｂ）のポリヌクレオチド断片。
【請求項２】配列番号３のポリヌクレオチドに機能的に結合した請求項１
に記載のポリヌクレオチド、またはその機能的断片。
【請求項３】請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッ
ク植物。
【請求項５】セルロースシンターゼプロモーターまたは、植物細胞におい
て転写因子に結合するその機能的断片。
【請求項６】請求項５に記載のプロモーターまたは断片を含むベクター。
【請求項７】請求項５に記載のプロモーターまたは断片を含むトランスジ
ェニック植物。
【請求項８】配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、
配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、セルロースシンター
ゼの機能的ドメイン配列であるアミノ酸配列。
【請求項９】植物細胞においてセルロースシンターゼをコードする外来性
ポリヌクレオチドを発現させることを含み、前記ポリヌクレオチドは植物の生長
を改変するために効果的な量で発現されるものである、植物の生長を改変する方
法。
【請求項１０】ポリヌクレオチドが同種ポリヌクレオチドを含む、請求項
９に記載の方法。
【請求項１１】ポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドを含む、請求項
９に記載の方法。
【請求項１２】ポリヌクレオチドがセンス方向にある、請求項９に記載の
方法。
【請求項１３】ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある、請求項９に
記載の方法。
【請求項１４】植物プロモーターまたはその転写因子結合ドメインがポリ
ヌクレオチドに機能的に結合している、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】プロモーターが構成的プロモーター、組織特異的プロモー
ターおよび発生特異的植物プロモーターから選ばれる、請求項１４に記載の方法
。
【請求項１６】プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35S、4CL、
セルロースシンターゼプロモーター、PtCelAPまたは頂生花プロモーターである
、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】セルロースシンターゼのUDP-グルコース結合ドメインをコ
ードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】セルロースの生合成を触媒するセルロースシンターゼのUD
P-グルコース触媒ユニットを含むポリペプチド。
【請求項１９】植物ゲノムにUDP-グルコース触媒サブユニットをコードす
るポリヌクレオチドを導入することを含む植物の生長を改変する方法であって、
前記ポリヌクレオチドの発現が植物の生長を改変するものである、前記方法。
【請求項２０】ポリヌクレオチドが同種ポリヌクレオチドを含む、請求項
１９に記載の方法。
【請求項２１】ポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドを含む、請求項
１９に記載の方法。
【請求項２２】ポリヌクレオチドがセンス方向にある、請求項１９に記載
の方法。
【請求項２３】ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある、請求項１９
に記載の方法。
【請求項２４】 UDP-グルコース結合ドメインをコードする外来性ポリヌク
レオチドを植物のゲノム中で発現させて前記植物のセルロース含量を改変するこ
とを含む、植物のセルロース含量を改変する方法。
【請求項２５】セルロースシンターゼをコードする外来性ポリヌクレオチ
ドを含み、前記ポリヌクレオチドが植物のセルロース含量を増大させるために効
果的な量で発現されるようにプロモーターに機能的に結合されている、セルロー
スのリグニンに対する割合が増加しているトランスジェニック植物。
【請求項２６】セルロースシンターゼをコードする外来性ポリヌクレオチ
ドを含む、リグニンのセルロースに対する割合が減少しているトランスジェニッ
ク植物。
【請求項２７】セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドを含
むベクターを植物細胞中にデリバリーすることを含む、植物細胞においてセルロ
ースシンターゼの発現を改変する方法。
【請求項２８】ポリヌクレオチドが同種ポリヌクレオチドを含む、請求項
２７に記載の方法。
【請求項２９】ポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドを含む、請求項
２７に記載の方法。
【請求項３０】ポリヌクレオチドがセンス方向にある請求項２７に記載の
方法。
【請求項３１】ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある請求項２７に
記載の方法。
【請求項３２】遺伝子に機能的に結合したセルロースシンターゼプロモー
ターを含むベクターを植物細胞中にデリバリーすることを含み、前記遺伝子が植
物に対する機械的ストレスにより発現するものである、植物細胞においてストレ
ス誘導性遺伝子発現を生じさせる方法。
【請求項３３】（ｉ）一部が欠失し、レポーターをコードするポリヌクレ
オチドに機能的に結合した、セルロースシンターゼプロモーターを植物に導入す
ること、および、 (ii)前記植物にストレスをかけた後に前記植物における前記レポーターの量の減
少を検出すること、を含む、セルロースシンターゼプロモーター中の正の機械的ストレス応答要素(M
SRE)を決定する方法。
【請求項３４】（ｉ）一部が欠失し、レポーターをコードするポリヌクレ
オチドに機能的に結合した、セルロースシンターゼプロモーターを植物に導入す
ること、および、 (ii)前記植物にストレスをかけた後に前記植物における前記レポーターの量の増
加を検出すること、を含む、セルロースシンターゼプロモーター中の負の機械的ストレス応答要素(M
SRE)を決定する方法。
【請求項３５】セルロースシンターゼをコードするポリヌクレオチドに機
能的に結合した組織特異的プロモーターで植物を形質転換することを含む、組織
特異的様式でセルロースシンターゼを植物において発現させる方法。
【請求項３６】セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合する
タンパク質をコードするcDNAを植物中にデリバリーすることを含む植物における
セルロースシンターゼの発現を増大させる方法であって、前記正のMSREへの前記
結合がセルロースシンターゼの発現を生じさせ、その結果前記植物にセルロース
の発現増加を生じさせるものである、前記方法。
【請求項３７】植物中へアンチセンス方向にcDNAをデリバリーすることを
含む植物においてセルロースシンターゼの発現を減少させる方法であって、セン
ス方向の前記cDNAは、正のMSREへ結合してセルロースシンターゼの発現を生じさ
せるタンパク質をコードするものである、前記方法。
【請求項３８】セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合する
タンパク質をコードするcDNAを植物へデリバリーすることを含む植物におけるセ
ルロース生合成を増加させる方法であって、前記タンパク質の前記正のMSREへの
結合がセルロースシンターゼの発現を生じさせるものである、前記方法。
【請求項３９】アンチセンス方向にcDNAを植物へデリバリーすることを含
む植物におけるセルロース生合成を低下させる方法であって、前記cDNAはセンス
方向でセルロースシンターゼプロモーターの正のMSREに結合するタンパク質をコ
ードするものである、前記方法。
【請求項４０】プロモーターを含みセルロースシンターゼをコードするポ
リヌクレオチドを有し、前記ポリヌクレオチドが発現して前記ポリヌクレオチド
を含まない類似の対照植物に比較して植物の生長が改変される、トランスジェニ
ック植物。
【請求項４１】植物において機能するプロモーター、および、プロモータ
ーに機能的に結合したセルロースシンターゼのコード配列を含み、前記プロモー
ターがセルロースシンターゼの正のMSREをコードするヌクレオチド配列を有する
ものであるベクター。
【請求項４２】植物においてセルロースシンターゼの遺伝的アップレギュ
レーションを含む植物の特性を改変する方法であって、前記特性が促進された生
長、増加したセルロース含量または減少したリグニン含量である、前記方法。
【請求項４３】セルロースシンターゼをコードするヌクレオチド配列を有
するcDNAを植物のゲノムに取り込ませることによって、植物が遺伝的にアップレ
ギュレーションされる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】植物に、（ａ）セルロースシンターゼプロモーターの正のMSREであるポリぺプチドをコー
ドするcDNA、または、（ｂ）(a)のcDNAのアンチセンス方向のcDNA、を、少なくとも植物細胞の一部が前記cDNAを効果的に取り込むことができる量お
よび条件下でデリバリーすることを含む、植物におけるセルロースシンターゼを
制御する方法。
【請求項４５】（ａ）植物細胞中で機能するプロモーターに機能可能に結
合させたセルロースシンターゼをコードするcDNAを含む発現カセットを植物の細
胞中へデリバリーすること、および、（ｂ）前記植物の細胞中のセルロース含量を改変するために効果的な量で前記cD
NAを前記植物の細胞中で発現させること、を含む、植物におけるセルロース含量を改変する方法。
【請求項４６】セルロースシンターゼ活性を有し、配列番号２、配列番号
５またはセルロースシンターゼの機能性ドメインであるアミノ酸配列を含むタン
パク質をコードするDNA。