JPH11196879A - 植物プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ワタの繊維特性を改善あるいは生産性を向上
させるのに有用な植物プロモーターなどを提供するこ
と。 【解決手段】 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、
配列番号１の塩基配列において１もしくは複数の塩基が
欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ
植物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ、
または、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロ
モーターとして作用する能力を有するＤＮＡを含む植物
プロモーター、それを含有する組換えベクター、それを
含む形質転換体など。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物においてプロ
モーター機能を有するＤＮＡ、いわゆる植物プロモータ
ーに関する。さらに詳しくは、本発明は、ワタ植物にお
いてワタ繊維などの発現を調節する植物プロモーターに
関する。本発明の植物プロモーターは、真核生物または
原核生物のいずれにおいても、外来遺伝子の発現を調節
することが可能である。

【０００２】

【従来の技術】プロモーターとは、ＤＮＡを鋳型として
ｍＲＮＡ合成を開始するＤＮＡ上のシグナルであり、特
徴的な塩基の共通配列を有する。特に、真核生物におい
ては、転写開始点の２０塩基前後上流に、「ＴＡＴＡボ
ックス」と呼ばれる共通配列があり、転写開始に必要な
部位であると考えられている。そして、目的のタンパク
を大量に産生させるためには、より強力なプロモーター
を用いることが有利であると考えられている。一般に、
植物ではその活性が強いことから、カリフラワーモザイ
クウイルス(ＣａＭＶ)の３５Ｓプロモーターがよく利用
されており、実際、除草剤耐性植物やウイルス抵抗性植
物の作出に用いられている。しかし、３５Ｓプロモータ
ーは、組織特異性が低いので、組織特異性が要求される
用途には適していない。これまで、組織特異性を有する
植物プロモーターとして、シス因子、トランス因子の研
究が行われているが、組織特異性を有する植物プロモー
ターを用いると、所望の植物器官において、導入した遺
伝子の発現を調節することが可能な形質転換植物体を作
出することができる。

【０００３】現在、ワタ繊維はゴシピウム(Gossypium)
属に属するワタ植物を栽培し、得られたさく果(コット
ンボール)から採取することにより生産されている。ワ
タ繊維は、様々な物性(以下「繊維特性」という)によっ
て特徴付けられるが、その中でも特に重要なものとし
て、繊維長、繊度、強度などが挙げられる。従来から、
ワタの繊維特性を改善するために多大な努力がなされて
きた。今日、遺伝子工学の発展により、ワタ植物を形質
転換して、その繊維特性を変化させることが可能となっ
てきている。その際、目的遺伝子を所望の組織および時
期に発現させることは非常に重要なことである。しか
し、ワタ繊維の形成および伸長機構は充分に解明されて
おらず、関与する遺伝子やプロモーターについても充分
に知られていないのが現状である。目的遺伝子を所望の
組織または時期に発現させるには、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターのように常に発現しているものではなく、より
組織特異的または時期特異的なプロモーターを用いるこ
とが望ましい。特にワタ繊維の改良には、こうしたプロ
モーターが必要不可欠である。

【０００４】ワタ繊維は胚珠の表皮細胞が各々伸長した
ものであり、一本の繊維は一個の細胞から構成されてい
る。ワタ繊維は、成長開始、伸長、二次壁沈着、成熟の
段階を経て形成される。これまでにいくつかのワタ由来
のプロモーターが発見され、繊維特性を改善するのに有
用であると報告され(国際出願公開第WO94/12014号)、例
えば、Ｅ６プロモーターまたはＢ８プロモーターが開示
されている。特に、Ｅ６構造遺伝子について詳しく研究
されており、Ｅ６ｍＲＮＡは、開花後１５日目以降に繊
維で強く発現していることが示されている。また、様々
な組織のｍＲＮＡにＥ６ｃＤＮＡ由来のプローブを用い
て、ノーザンブロティングをロングエクスポーズする
と、花や胚珠、葉において弱いシグナルが得られている
[プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・オブ・ユー・エス・エイ(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA)89,5769-5773,1992の図１参
照]。さらに、ＦｂＬ２Ａプロモーターは、開花後２５
〜３０日目に繊維で強く発現することが示されている
[プラント・フィジオロジー(Plant Physiol.)(1996)11
2:1331-1341]。また、プロモーターの強さや作用する時
期などは、各々のプロモーターによって、様々に異なっ
ていることが知られている。しかし、開花後１５日目以
降はワタの繊維形成において伸長の後半期にあたり、繊
維特性の改善には、これらのプロモーターだけでは充分
ではなく、開花直後から１５日目までに作用するプロモ
ーターも必要である。また、繊維以外の組織でも作用す
る、いわゆる組織特異性の低いプロモーターであって
も、有用なものになると考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明のある目的は、
ワタの繊維特性を改善するのに有用なプロモーター、該
プロモーターを含有する組換えベクター、該組換えベク
ターを含む形質転換体などを提供することにある。さら
なる目的は、ワタ以外の植物においても、目的遺伝子を
所望の組織または器官で発現させて、形質転換植物体を
提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、すでに、
ワタの繊維特性を改善あるいは生産性を向上させるため
に鋭意研究して、ワタ繊維よりいくつかのｃＤＮＡを単
離した(米国特許出願第08/391,696号、第08/580,545
号、特願平8-31987号)。これらの単離したｃＤＮＡの組
織特異的および時期特異的な発現を調べ、さらに、特に
遺伝子Ｇｈ３の上流配列をクローニングし、解析した結
果、ワタの繊維特性を改善あるいは生産性を向上させる
のに有用な植物プロモーターを見い出し、本発明を完成
するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の(ａ)、(ｂ)ま
たは(ｃ)のＤＮＡを含む植物プロモーターを提供する。 (ａ)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ (ｂ)(ａ)の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠
失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植
物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ (ｃ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターと
して作用する能力を有するＤＮＡ

【０００８】また、本発明は、上記植物プロモーターを
ベクターに挿入した植物発現ベクター、該植物発現ベク
ターを宿主植物細胞に導入した形質転換植物細胞、該形
質転換植物細胞から再生された形質転換植物体、該形質
転換植物体から得られた植物種子、上記植物プロモータ
ーを挿入した植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入し
て形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形
質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植
物種子を得て、該種子から植物体を生産することを特徴
とする植物体の製造法を提供する。

【０００９】さらに、本発明は、配列番号１の塩基配列
からなるＤＮＡを含む植物プロモーターを挿入した植物
発現ベクターを宿主ワタ植物細胞に導入して形質転換ワ
タ植物細胞を得て、該形質転換ワタ植物細胞から形質転
換ワタ植物体を再生し、得られた形質転換ワタ植物体か
らワタ植物種子を得て、該ワタ植物種子からワタ植物体
を生産することを特徴とするワタ植物体の製造法を提供
する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の「植物プロモーター」と
は、植物においてプロモーターとして作用する能力(プ
ロモーター機能)を有するＤＮＡのことである。「プロ
モーター」とは、ＤＮＡを鋳型としてｍＲＮＡ合成(転
写)を開始するＤＮＡ上の特定塩基配列を意味し、塩基
の共通配列を有し、これを認識してｍＲＮＡを合成する
酵素(ＲＮＡポリメラーゼ)がｍＲＮＡを合成する。ここ
で、「プロモーター機能」とは、ＲＮＡポリメラーゼが
ＤＮＡ上の特異的な領域に結合し、転写開始する作用を
いう。

【００１１】本発明の植物プロモーターは、具体的に
は、以下の(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のＤＮＡを含む。 (ａ)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ (ｂ)(ａ)の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠
失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植
物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ (ｃ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターと
して作用する能力を有するＤＮＡ

【００１２】本発明者らは、本発明の植物プロモーター
を得るために、アシルキャリアープロテイン遺伝子に対
し相同性を有するワタ繊維で発現する遺伝子Ｇｈ３の上
流領域をクローニングした。様々な組織のｍＲＮＡにＧ
ｈ３ｃＤＮＡ由来のプローブを用いてノーザンブロッテ
ィングしたところ、Ｇｈ３は、開花後２日目から胚珠で
シグナル(転写産物)が認められ、開花後６〜８日目にピ
ークとなった。繊維と比べて、子葉、根、茎、葉、繊維
を取り除いた胚珠では、ほとんどシグナル(転写産物)が
認められなかった。しかし、Ｇｈ３遺伝子の上流領域を
レポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子と連結したキメラ
遺伝子構築物を作成し、それを導入した形質転換ワタで
は、繊維でＧＵＳ活性が認められたほか、花柱、葯、花
弁、葉でもＧＵＳ活性が認められた。ノーザンブロッテ
ィングとプロモーター：ＧＵＳ遺伝子構築物を導入した
形質転換体での発現パターンとの違いは、Ｇｈ３遺伝子
の転写後の修飾が考えられる。また、組織特異性を調節
する領域が、さらに上流に存在する可能性も考えられ
る。

【００１３】このように、ゴシピウム(Gossypium)属に
属するワタ植物由来の遺伝子Ｇｈ３の上流領域は、繊維
形成・伸長時のワタ繊維組織だけでなく、花柱や葯など
の初期成長(ヤングディヴェロッピング)組織でもプロモ
ーター機能を示す植物プロモーターであり、その塩基配
列を決定したところ、配列番号１の塩基配列を有するこ
とが判明した。以下、この植物プロモーターを、特に
「Ｇｈ１０」と呼ぶことがある。

【００１４】本発明の植物プロモーターは、配列番号１
の塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、配列番号１の塩
基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換もし
くは付加された塩基配列からなり、かつ植物プロモータ
ーとして作用する能力を有するＤＮＡ、また、配列番号
１の塩基配列において、その３'末端に翻訳効率を上げ
る塩基配列などを付加したものや、プロモーター活性を
失うことなく、その５'末端を欠失したものを含む。

【００１５】さらに、本発明の植物プロモーターは、配
列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターと
して作用する能力を有するＤＮＡを含む。ここで、スト
リンジェントな条件とは、２ｘＳＳＣ(３００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、３０ｍＭクエン酸)、４２℃である。

【００１６】本発明の「植物発現ベクター」とは、上記
植物プロモーターをベクターに挿入したものである。ベ
クターとしては、大腸菌由来のベクター、例えば、ｐＧ
ＥＭ−Ｔベクター、β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)遺伝
子を含むプラスミド、ｐＢＩ１０１−Ｈｍ２、シャトル
ベクター、ヘルパープラスミド、ｐＲＫ２０１３などが
挙げられる。また、植物ウイルス、例えば、カリフラワ
ーモザイクウイルスを利用することもできる。ベクター
は、各々の宿主細胞に応じて選択する。なお、植物プロ
モーターをベクターに挿入する方法は、通常の遺伝子を
ベクターに挿入する方法に従う。

【００１７】本発明の「形質転換植物細胞」とは、上記
植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入した形質転換植
物細胞である。宿主植物細胞としては、シロイヌナズ
ナ、トマト、タバコ、ペチュニア、コムギ、イネ、トウ
モロコシ、カボチャ、キュウリ、ワタなどが挙げられ
る。植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入する形質転
換法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラ
スト融合法、マイクロインジェクション法、ポリエチレ
ングリコール法、パーティクルガン法などが挙げられ
る。

【００１８】本発明の「形質転換植物体」とは、上記形
質転換植物細胞から再生された形質転換植物体である。
再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモン
の種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形
成させ、完全な植物体を得る方法がある。使用する培地
としては、ワタでは、ＭＳＩＣ培地(ＭＳ塩、０.７５％
ＭｇＣｌ₂、１.９ｇ/ｌ ＫＮＯ₃、３０ｇ/ｌグルコー
ス、２.０ｇ/ｌジェランガム、ｐＨ５.８)、ニンジンで
は、カマダ・アンド・ハラダ（Ｋａｍａｄａ ＆ Ｈａ
ｒａｄａ）培地などが例示される。

【００１９】本発明の「植物体を製造する方法」は、上
記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主
細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植
物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換
植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生
産する工程を含む。

【００２０】形質転換植物体から植物種子を得る工程と
は、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水
を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育
させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる工程
という。また、種子から植物体を生産する工程とは、例
えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したと
ころで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、
照度下で生育させることにより、植物体を生産する工程
をいう。

【００２１】本発明の植物プロモーターは、例えば、以
下のようにして製造し、利用することができる。

【００２２】（１)ワタ繊維形成および伸長に関与する
遺伝子のプロモーター領域の単離 ワタ繊維から得られた組織特異的遺伝子Ｇｈ３の塩基配
列から合成オリゴヌクレオチドを調製し、インバースＰ
ＣＲ法を行う。ワタ繊維からゲノムＤＮＡを抽出した
後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、自己連結させた後、
ＰＣＲの鋳型として用いる。第一プライマー群を用いて
ＰＣＲを行った後、反応産物をさらに第二プライマー群
を用いてＰＣＲを行い、上流領域をクローニングする。

【００２３】アガロースゲル電気泳動で目的の長さのク
ローンを得た後、ＴＡクローニングベクターにサブクロ
ーニングして、配列決定を行う。得られたＰＣＲ断片の
塩基配列の一部がＧｈ３の塩基配列と完全に一致するこ
とから、Ｇｈ３の上流の存在する植物プロモーターと判
断する。

【００２４】(２)ワタ繊維形成および伸長に関する遺伝
子のプロモーター領域の利用 上記方法で得た植物プロモーターを、ワタ植物またはそ
の他の植物において、キメラ遺伝子構築物を作成し、繊
維形成および伸長に関与するタンパクの発現制御に利用
することができる。さらに、シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ配列と組み合わせると、細胞壁での各種タン
パクの発現による細胞壁成分の改変が可能となり、耐病
性などを付与した新規植物の育種にも応用できる。

【００２５】例えば、繊維形成および伸長に関与する遺
伝子を本発明の植物プロモーターに接続して、ワタ植物
またはその他の植物に導入すると、目的タンパクの含量
を増大させることができる。これに対し、マイナス鎖
(コード配列に相補的な配列)の少なくとも一部を逆向き
に植物プロモーターに接続したものを植物に導入し、い
わゆるアンチセンスＲＮＡを発現させると、目的タンパ
クの含量を低下させることができる。

【００２６】(３)植物プロモーターのベクターへの導入
と宿主植物細胞の形質転換 植物細胞の形質転換方法としては、プロトプラストに電
気パルス処理してプラスミドを植物細胞へ導入するエレ
クトロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソームな
どとプロトプラストとの融合法、マイクロインジェクシ
ョン法、ポリエチレングリコール法、あるいは、パーテ
ィクルガン法などの方法が挙げられる。

【００２７】また、植物ウイルスをベクターとして利用
することによって、目的遺伝子を植物体に導入すること
ができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、
カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわ
ち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなど
に挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中
に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修
飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体
から切り出し、植物体に接種することによって、これら
の目的遺伝子を植物体に導入することができる[ホーン
(Hohn)ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラン
ト・チューモアーズ(Molecular Biology of Plant Tumo
rs)、アカデミック・プレス、ニューヨーク、549-560(1
982)、米国特許第4,407,956号]。

【００２８】さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラス
ミドを利用する方法がある。アグロバクテリウム(Agrob
acterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが
有するプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行さ
せるという性質を利用して、目的遺伝子を植物体に導入
することができる。アグロバクテリウム属に属する細菌
のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobac
terium tumefaciens)は植物に感染してクラウンゴール
と呼ばれる腫瘍を形成し、アグロバクテリウム・リゾゲ
ネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は植物に感染して毛
状根を発生させる。これらは、感染の際にＴｉプラスミ
ドまたはＲｉプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在
するプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域(Transferred DNA)
と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組
み込まれることに起因する。さらに、ＴｉまたはＲｉプ
ラスミド上には、ｖｉｒ領域と呼ばれる領域があり、Ｔ
−ＤＮＡ領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み
込まれるのに必須である。ｖｉｒ領域自体は、植物中に
移行することはなく、また、Ｔ−ＤＮＡ領域が存在する
プラスミドとは別のプラスミド上にあっても機能しうる
[ネイチャー(Nature)303,179(1983)]。

【００２９】ＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ
領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいＤＮＡを挿入し
ておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物体に感染
する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組込むこと
ができる。ここで、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−Ｄ
ＮＡ中のクラウンゴールまたは毛状根を発生させる部分
を、目的とする移行機能を損なうことなく取り除き、得
られたものをベクターとして使用することもできる。

【００３０】このように、本発明においては、様々なベ
クターを用いることができる。例えば、バイナリーベク
ターと呼ばれるｐＢＩ１０１(クロンテック社)などのベ
クターに、本発明の植物プロモーターに繊維形成および
伸長に関与する遺伝子をセンスまたはアンチセンス方向
で接続したものを挿入して、これらを植物細胞に導入す
ることができる。なお、これらのベクターは、上記のｖ
ｉｒ領域を有していないので、該ベクターを導入して用
いるアグロバクテリウム属の細菌は、ｖｉｒ領域を含む
他のプラスミドを有する必要がある。

【００３１】また、これらのベクターは、アグロバクテ
リウム属の細菌だけではなく、大腸菌においても増幅す
ることができるシャトルベクターである。従って、Ｔｉ
プラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことが
できる。また、これらのベクターは、抗生物質耐性遺伝
子を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌
または植物細胞などを形質転換する際に、形質転換体を
容易に選別することができる。さらに、これらのベクタ
ーには、カリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)の３
５Ｓプロモーターが存在しており、これらのベクターに
目的遺伝子を挿入して植物ゲノム中に組み込んだ後、非
調節的に発現させることが可能となる。

【００３２】(４)形質転換植物細胞から植物体の再生 まず、ワタ植物以外の植物、例えば、シロイヌナズナに
ついて、アグロバクテリウムによる目的遺伝子の導入お
よび形質転換植物細胞の植物体への再生法を以下に詳述
する。

【００３３】シロイヌナズナの種子を常法に従って播種
し、無菌的に栽培する。発根した胚軸の切片を用いてカ
ルス培養を行う。本発明の植物プロモーターに目的遺伝
子を接続し、抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドに
より形質転換したアグロバクテリウムを培養し、カルス
化した胚軸の切片と共存培養する。アグロバクテリウム
が肉眼で観察できるまで充分に増殖したら、除菌操作を
行う。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れて
くる。抗生物質で選択しているので、非形質転換切片は
褐変する。形質転換体が５ｃｍ程度の大きさになり、シ
ュートを形成するまで培養する。完全なシュートの形状
を示すようになったら、発根プレートに移植し、発根
後、ロックウール上に定植する。

【００３４】発根した植物体を無機塩類培地に浸した土
に移植して種子を得る。この種子を滅菌処理し、発芽さ
せることにより形質転換体を得る。この形質転換体から
常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限
酵素で切断し、繊維形成および伸長に関与する遺伝子を
プローブに用いてサザーンハイブリダイゼーションを行
い、形質転換の有無を確認する。

【００３５】次に、ワタ植物について、アグロバクテリ
ウムによる目的遺伝子の導入および形質転換植物細胞の
植物体への再生法を以下に詳述する。

【００３６】形質転換は、エヌ・トロリンダー(N. Trol
inder)らの方法[セオレティカル・アンド・アプライド
・ジェネティクス(Theor. Appl. Genet.)(1992)83:645-
649]で行うことができる。具体的には、まず、ワタ種子
を殺菌した後、発芽させる。その胚軸をアグロバクテリ
ウムに感染させ、培養を続ければ、数カ月でカルスが得
られる。さらに生育させて直径１ｃｍ程度になれば、懸
濁培養を行う。胚を約１ｃｍに成熟させた後、培養チュ
ーブで発育させる。ある程度まで生育させた後、土壌に
移植すれば、最終的に複数個の形質転換ワタ植物体が得
られる。得られた形質転換体について、ゲノムＤＮＡを
ＰＣＲ法で確認することで、目的遺伝子が導入されてい
るかどうかを調べることができる。

【００３７】また、常法に従って形質転換体や非形質転
換体からＲＮＡを抽出し、繊維形成および伸長に関与す
る遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列を有する
プローブを作成し、これらのプローブを用いてノーザン
ハイブリザイゼーションを行ない、目的遺伝子の発現の
状態を調べることができる。

【００３８】(５)レポーター遺伝子を用いたプロモータ
ーの強さの評価 本発明の植物プロモーターは、例えば、その３'末端に
レポーター遺伝子、例えば、植物で広く用いられている
ＧＵＳ遺伝子を連結して用いれば、ＧＵＳ活性を調べる
ことでプロモーターの強さを簡単に評価することができ
る。なお、レポーター遺伝子としては、ＧＵＳ遺伝子以
外にも、ルシフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプ
ロテインなども用いることができる。

【００３９】

【発明の効果】繊維形成および伸長に関与する遺伝子
は、ワタ繊維細胞において、ワタ繊維形成過程で発現し
繊維伸長に関与するので、その塩基配列の上流領域など
を用いることで、ワタ繊維の伸長に関与する転写因子な
どが同定される可能性がある。従って、本発明の植物プ
ロモーターは、ワタ繊維形成および伸長に関与するプロ
モーターであり、繊維形成および伸長を誘導する技術の
確立、繊維伸長に関与するシス因子やトランス因子の単
離、繊維形成および伸長のメカニズムの解明またはそれ
を調節する遺伝子の単離に利用することができ、細胞形
成および伸長に関する技術分野において極めて有用であ
る。また、初期成長組織で発現を示すことより、初期成
長組織で目的遺伝子をセンス方向やアンチセンス方向で
発現させることにより、期待する変化を得ることができ
る。

【００４０】さらに、本発明の植物プロモーターは、繊
維形成および伸長に関与するタンパクをコードする塩基
配列と連結したキメラ遺伝子を作成し、特定の組織の植
物細胞壁の構造を変化させることができ、産業分野で用
いられる植物原料の加工に有用である。また、一般にＣ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いることによって、植物
の器官全体に生活環の全過程を通して形態変化をもたら
すことができる。光、熱、傷害などに対する調節性プロ
モーターを用いれば、生育環境に応じて、その形態が変
化しうる植物体を作製することができる。また、器官ま
たは組織に特異的なプロモーターを用いれば、特定の器
官または組織だけに形態変化を生じさせることができ
る。つまり、本発明のプロモーターを用いることによっ
て、繊維の形成を制御し繊維特性の変化をもたらすこと
ができる。また、初期成長組織においても適用できる。

【００４１】本発明の植物プロモーターを用いることに
より、特定の植物組織で特異的に目的遺伝子を発現させ
ることができる。特に植物の初期成長組織やワタ繊維で
目的遺伝子を発現させることができる。例えば、本発明
の植物プロモーターを用い、特定の遺伝子をワタ繊維で
発現させることにより、ワタ繊維の繊維長、繊度、強度
などの繊維特性の改善および生産性の向上を行うことが
可能となる。換言すれば、本発明の植物プロモーターを
利用することにより、より優れた繊維特性を有し、かつ
生産性の高い新規なワタ品種を作出することができる。

【００４２】

【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
する。

【００４３】実施例１ (１)ワタ繊維組織由来の遺伝子Ｇｈ３の上流領域(Ｇｈ
１０)のクローニング ゴシピウム属(Gossypium)に属するワタ植物(コーカー３
１２)を播種した後、１００日目の植物体の葉から、マ
ーレイ(Murray)およびトンプソン(Thompson)の改良法で
ゲノムＤＮＡを抽出し、インバースＰＣＲ法でゲノムＤ
ＮＡのクローニングを行った。

【００４４】まず、１μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断した後、Ｔ４ライゲースで自己連結させ
た。連結したＤＮＡ５００μｇを鋳型にしてＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて、Ｇｈ３遺伝子の上流領域(以
下「Ｇｈ１０」という)を増幅した。この反応は、配列
番号２および３の塩基配列を有する第一プライマー群を
用い、９８℃、３０秒間および６８℃、６分間を３５サ
イクル実施した。次に、このＰＣＲ産物を用いて、配列
番号４および５の塩基配列を有する第二プライマー群を
用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物
を電気泳動に付して量および長さを確認し、得られたＤ
ＮＡ断片をベクターｐＧＥＭ−Ｔ(プロメガ社)に導入
し、大腸菌(Escherichia coli)ＪＭ１０９を形質転換し
てクローニングした。こうして得られたプラスミドクロ
ーンをｐＧｈ１０と命名した。その後、シーケネースシ
ークエンスキット(アマシャム社)を用いて、ｐＧｈ１０
の塩基配列を決定した。この塩基配列はプライマーの配
列よりｃＤＮＡと全て一致し、ｃＤＮＡに対応するゲノ
ム領域であることが確認できた。この塩基配列を配列番
号１に示す。

【００４５】(２)β−グルクロニダーゼ(ＧＵＳ)遺伝子
との融合 ＮｃｏＩ制限酵素部位を有する３'末端のプライマー
(５'-GCAATAGAAGCCATGGGAGAGAG-３')を合成した。この
プライマーとＴ７プライマーを用いて、１０６９ｂｐの
断片をＰＣＲで増幅した。この断片を制限酵素部位を用
いてｐＧＥＭ−Ｔベクターにサブクローニングした。サ
ブクローニングされたものから制限酵素ＰｓｔＩおよび
ＮｃｏＩで切断して断片を取り出し、ＧＵＳレポーター
遺伝子および３５Ｓターミネーターに連結した。正しく
連結されたプラスミドをｐＧｈ１０：ＧＵＳと命名し
た。

【００４６】さらに、このプラスミドｐＧｈ１０：ＧＵ
Ｓを制限酵素ＰｓｔＩで切断し、電気泳動後、断片をバ
イナリーベクターｐＣＧＮ１５７８のＰｓｔＩ制限酵素
部位に挿入して、新規なプラスミドｐＣＧＮ−Ｇｈ１
０：ＧＵＳを得た。その概略を図１に示す。次に、この
プラスミドｐＣＧＮ−Ｇｈ１０：ＧＵＳで大腸菌ＪＭ１
０９を形質転換して、大腸菌ＪＭ１０９/ｐＣＧＮ−Ｇ
ｈ１０：ＧＵＳを得た。

【００４７】(３)プラスミドのアグロバクテリウムへの
導入 (２)で得られた大腸菌ＪＭ１０９/ｐＣＧＮ−ＧＧｈ１
０：ＧＵＳと、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を有
する大腸菌とを、各々、５０ｍｇ/ｌのカナマイシンを
含むＬＢ培地で、３７℃で一晩培養した。別途、アグロ
バクテリウムＥＨＡ１０１株を５０ｍｇ/ｌのカナマイ
シンを含むＬＢ培地で３７℃で二晩培養した。

【００４８】各培養液１.５ｍｌをエッペンドルフチュ
ーブに取り、集菌した後、ＬＢ培地で洗浄した。これら
の菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、三種の菌を１００
μｌずつ混合し、ＬＢ寒天培地にプレートし、２８℃で
培養して両方のプラスミドをアグロバクテリウムに接合
伝達させた。１〜２日後に一部を白金耳で掻き取り、５
０ｍｇ/ｌカナマイシン、２０ｍｇ/ｌハイグロマイシン
および２５ｍｇ/ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒
天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養後、単一コロ
ニーを選択した。得られた形質転換体をＥＨＡ１０１/
ｐＣＧＮ−ＧＧｈ１０：ＧＵＳと命名した。

【００４９】(４)形質転換ワタ植物体の作出 アグロバクテリウムＥＨＡ１０１/ｐＣＧＮ：ＧＧｈ１
０：ＧＵＳを用いて、ワタ植物(コーカー３１２)を形質
転換した。形質転換法としては、エヌ・トロリンダー
(N. Trolinder)らの方法[セオレティカル・アンド・ア
プライド・ジェネティクス(Theor. Appl. Genet.(1992)
83:645-649)]を用いた。コーカー３１２の種子を３％次
亜塩素酸ナトリウム水溶液で２０分殺菌した後、セファ
トキシム入りの滅菌水で３回洗浄した。次にスチュワー
ト(Stewart)培地で６日間発芽させた。その胚軸を５ｍ
ｍほどに切断し、一晩培養したアグロバクテリウムを約
１０μｌ感染させ、０.８％アガロース培地上に置き、
常温で暗所に３日間放置した。次に、この胚軸をＢ５ビ
タミン、３０ｇ/ｌグルコース、０.１ｍｇ/ｍｌ ２,４
Ｄ、０.５ｍｇ/ｌカイネチン、１.６ｍｇ/ｍｌゲルライ
ト(ケルコ社製)、７５０μｇ/ｍｌ塩化マグネシウムを
含むＭＳ培地で、３０℃、３日間前培養した。抗生物質
は５０μｇ/ｌカナマイシン、５００μｇ/ｌセファタキ
シムを用いた。この後、植え継ぎは４週間毎に行った。

【００５０】細胞懸濁培養の開始および維持は、以下の
ように行った。得られたコーカー３１２のカルスが直径
約１ｃｍ程度になった後で懸濁培養液に移した。培地は
カルスイニシエーション培地と同じ組成であるが、ホル
モンとゲル化剤を含まないものを使った。１０ｍｌの懸
濁培養液には約１００ｍｇのカルスを用いた。培養は１
２０ｒｐｍ、３０℃、照明下で行った。植え継ぎは約１
カ月毎に行った。細胞懸濁培養液のプレーティングを行
い、胚の発達は半固体の培地の上で行った。

【００５１】胚の発芽および植物体の再生には１ｃｍ以
上になった成熟した胚を用いて、２５×１５０ｍｍの培
養チューブ内で培養した。培養チューブには、０.１ｍ
ｇ/ｌのＩＡＡ入りスチュワート・アンド・シュー(Stew
art and Hsu)培地を含浸したバーミキュライトを満たし
た。胚は、９０μＥｍ^-2ｇ^-1の光照射下、２８℃で培養
した。発芽およびシュート形成時には、新鮮な培地をバ
ーミキュライトに補給した。最終的に複数個の形質転換
ワタ植物体が得られた。このうち形質転換ワタ植物体＃
３−５、＃４−１、＃４−３、＃４−９、＃４−８につ
いて、遺伝子が導入されているかどうか、ゲノムＤＮＡ
をＰＣＲ法で確認したところ、図２に示すように、明ら
かに導入されていることを示すＤＮＡ断片が得られた。

【００５２】(５)ＧＵＳ活性の測定 得られた形質転換ワタ植物体を栽培し、組織をメスで切
り取り、切片を数ｍｌの固定液(０.０３％ホルマリン、
１０ｍＭ ＭＥＳ(ｐＨ５.６)、０.３Ｍマンニトール)に
室温で４５分間浸した。次に５０ｍＭリン酸バッファー
(ｐＨ７.０)で数回洗浄した。切片をＧＵＳ染色液(５０
ｍＭリン酸バッファー、０.５Ｍフェリシアン化カリウ
ム、０.５Ｍフェロシアン化カリウム、１ｍＭ Ｘ−Ｇｌ
ｕｃ)に浸し、真空装置で吸引して溶液を試料内部まで
よく染み込ませ、３７℃で一晩インキュベートした。ク
ロロフィルを除くため、５％ホルマリンに１０分間浸し
た後、５％酢酸に１０分間、５０％エタノールに１０分
間、１００％エタノールに１０時間浸した。青く染まっ
た組織を顕微鏡で観察したところ、形質転換ワタ植物体
においてプロモーター活性が認められた。図３に示すよ
うに、開花後２日目の繊維(左)は染色されたが、野生型
ワタ(右)は染色されなかった。図４に示すように、開花
後１２日目の繊維(右)も染色されたが、野生型ワタ(左)
は染色されなかった。また、図５に示すように、花柱
(右)も染色されたが、野生型ワタ(左)は染色されなかっ
た。さらに、図６に示すように、葯(左)も染色された
が、野生型ワタ(右)は染色されなかった。

【００５３】また、ＧＵＳ活性を測定したところ、図７
に示すように、形質転換ワタ植物体＃４−８および＃４
−９において発育中の胚珠で強いＧＵＳ活性が認められ
た。次に、様々な組織においてＧＵＳ活性を測定したと
ころ、図８に示すように、花柱や葯に加えて、葉や花弁
でも活性が認められた。

【００５４】これらの結果から、Ｇｈ１０プロモーター
は、ワタ植物の繊維、花弁、葯、花柱および葉において
プロモータ機能を有することが明らかである。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１１３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コ゛シヒ゜ウム ヒルスツム(Gossypium hirusutum) 組織の種類：葉 直接の起源 クローン名：Gh10 配列： CTAAGCTTTC CAAATAACCA ACAAAAAGAG CCCACCCATG CCATAATCTC CTATTTGTCA 60 TGTCTCTTTT TTAAACTCTC TCACAGTTGC AACAACCAAA CAAAGCCTCC TTCAAAATCC 120 CCGAACTGAA CTTAAAAAGT AAGTGCATAA CAGTCCCTTC CTTTTTCCAC AAAATTTACA 180 ACAACGGCTA GTTCTAACTT TCCTTCTCCA CATGTTCAAA TTAGTAGCAA TCGCATTATT 240 ACATGATCTC CACAAAAAAA CTCCTGACCT TAGGTGGAGT CTTCAAATTC CAGTTCACCT 300 TCCATATAGT AGATCGCTGA CAATCCATGT TACTATTACT ATGACCCTCC ATCCTTGCAA 360 CAATGTACCC TGATTTCACC GAGTATTACC CTACACTAAA CAATCATGAC CACCACTAAA 420 ATAAAAAGGT ATCTTCAAAA TAGCATTACA TTGTTCATCA TCATCAAGCC ATTCCTTAAT 480 ACCATCCATA TCAGTAATCT CGGTTATTAT TTGTGGCCTA CCAGACACAT CCTCTTCACC 540 ATTAGCAAAA ACAGAACCTC CTAATCTTGG AATCCATCTA TCTCTCCAAA TATTCATTGA 600 TTCTCCATTC CCTATTTGCC AATGATATCA GATCCCTTCC TGCCAAAAGA CTACTCCAAA 660 TCCATGATGC TTGTGCACCT TTTTGAGCCT CAAAGAACTC AGATTTGGAA ATATCTCCCT 720 TTCAGCACTC TAATCCAAAG GTTATCAGAT CCATTAACAA AACACCAACT TTCTTAATTC 780 TTTAAAACCC AATCCACCAT CACCCTATGT CTTAGTTAAT TTTTCCCAAC ACAACTAATG 840 AATCTTTCTT TTCCCATCCC TTTGTTCCCA AATAAAGTTG CCATATAATT ACATTATTAC 900 GGCACCTTAA ATAGAAATGG CCAAATTTGG TCGTGTGCCG TCCAGGGTCC GCGTAACGCC 960 ATTAATAAAT GAGCAAATAA ACACCCCCCC CCAAAAGGAG AGAAACCTCT CTTTCATTCT 1020 CAATATCACA AATCCTCCTA TAAAAACCAA ACTCCTAAAC CCTCATACTC CACTCCACTC 1080 ATCTTCGGTC TCTCCGCCGT TTCGCATTTC GTCTTTCTCT CTCCAATGGC TTCTATTGC 1139

【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：26 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GTTTGGCAGC ACAGCAGATC TGCAAGCGAG C 31

【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：26 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GCAGAACTTC TTGAGAAGCT GTGCAGTGAG 30

【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：32 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TCAACCCGGA AACACTGCCT TTAGCAAAGG GG 32

【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：31 配列の形：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ＧＴＴＴＡＡＴＣＡＡ ＧＣＴＧＣＡＴＡＴＣ ＴＣＧＧＴＴＧＡＧＧ Ｇ
３１

【図面の簡単な説明】

【図１】 β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ)レポーター
遺伝子がＧｈ１０プロモーターに連結されたｐＧｈ１
０：ＧＵＳキメラ遺伝子構築物の概念図である。この遺
伝子構築物は、アグロバクテリウム感染による遺伝子組
換えワタ植物の作出に用いられた。

【図２】 目的遺伝子の導入を確認するために形質転換
ワタ植物体のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法による分析
の結果を示すバンド図である。

【図３】 開花後２日目のワタ胚珠のＧＵＳ染色を示す
図(生物の形態を表す図面代用写真)である。

【図４】 開花後１２日目のワタ胚珠のＧＵＳ染色を示
す図(生物の形態を表す図面代用写真)である。

【図５】 ワタ花柱のＧＵＳ染色を示す図(生物の形態
を表す図面代用写真)である。

【図６】 ワタ葯のＧＵＳ染色を示す図(生物の形態を
表す図面代用写真)である。

【図７】 ワタ胚珠におけるＧｈ１０/ＧＵＳ発現の蛍
光定量分析の結果を示す棒グラフ図である。ここで、
「ＤＰＡ」という用語は開花後の日数(days post-anthe
sis)の略であり、例えば、「４ＤＰＡ」は開花後４日目
を表す。

【図８】 様々なワタ組織におけるＧｈ１０/ＧＵＳ発
現の蛍光定量分析の結果を示す棒グラフ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 春日部 芳久 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 西口 進 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 前川 宜彦 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内 (72)発明者 ランディ・アレン アメリカ合衆国 テキサス州 ラブボック ホールデンホール 203番地 オフィス オブ リサーチ サービシズ (72)発明者 ソン・ピン アメリカ合衆国 テキサス州 ラブボック ホールデンホール 203番地 オフィス オブ リサーチ サービシズ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(ａ)、(ｂ)または(ｃ)のＤＮＡを
   含む植物プロモーター。 (ａ)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ (ｂ)(ａ)の塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠
   失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつ植
   物プロモーターとして作用する能力を有するＤＮＡ (ｃ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズし、かつ植物プロモーターと
   して作用する能力を有するＤＮＡ
2. 【請求項２】 請求項１記載の植物プロモーターをベク
   ターに挿入した植物発現ベクター。
3. 【請求項３】 請求項２記載の植物発現ベクターを宿主
   植物細胞に導入した形質転換植物細胞。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換植物細胞から再
   生された形質転換植物体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換植物体から得ら
   れた植物種子。
6. 【請求項６】 請求項１記載の植物プロモーターを挿入
   した植物発現ベクターを宿主植物細胞に導入して形質転
   換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植
   物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を
   得て、該植物種子から植物体を生産することを特徴とす
   る植物体の製造法。
7. 【請求項７】 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを
   含む植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿
   主ワタ植物細胞に導入して形質転換ワタ植物細胞を得
   て、該形質転換ワタ植物細胞から形質転換ワタ植物体を
   再生し、得られた形質転換ワタ植物体からワタ植物種子
   を得て、該ワタ植物種子からワタ植物体を生産すること
   を特徴とするワタ植物体の製造法。