JP4441959B2 - 植物プロモーターおよびターミネーター - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物プロモーターおよび植物ターミネーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の細胞へ遺伝子を導入し発現させることによって、有用形質を付与した種々の形質転換植物の作出が試みられ、一部で実用化されるに至っている。このような形質転換植物を作出するには、植物の細胞内に導入した遺伝子を効率よく発現させることが重要である。プロモーターは細胞内での遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一般に目的遺伝子を転写活性の強いプロモーターの制御下におくことにより該遺伝子の発現量を高めることができる。また、ターミネーターは転写終結を指令する役割に加えて、転写により生じたＲＮＡ鎖のプロセシングや分解に対しても重大な影響を示すことから、目的遺伝子の翻訳領域の３’末端直後にターミネーターを挿入しておくと該遺伝子の発現量増大に効果的である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような遺伝子導入による植物育種に使用し得る植物プロモーターおよびターミネーターはその種類が未だ十分とは言い難く、遺伝子を植物の細胞内で効率よく発現させることの可能な新たなプロモーターおよびターミネーターの開発が強く望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは植物の細胞内で機能可能なプロモーターおよびターミネーターについて鋭意検討を行った結果、特定の塩基配列を有するＤＮＡを使用することにより、植物の葉、根などの組織において目的遺伝子を効率よく発現させることができることを見い出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
１）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む植物プロモーター；
（ａ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてプロモーター機能を有するＤＮＡ（以下、本発明プロモーターと記す。）、
２）該プロモーター、所望の遺伝子および植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるキメラ遺伝子、
３）該プロモーターを有するベクター、
４）該プロモーターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体、
５）形質転換植物の製造過程において、該プロモーターを植物細胞に導入し該プロモーターの制御下に遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とする形質転換植物の作製方法、
６）（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを含む植物ターミネーター；
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号２で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてターミネーター機能を有するＤＮＡ（以下、本発明ターミネーターと記す。）を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、たとえば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラークローニング第 2 版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）、1989年及び D.,M.,Glover著、DNA クローニング（DNA Cloning）、IRL発行、1985年などに記載されている通常の方法に準じて行うことができる。
【０００６】
本発明において、「プロモーター機能」とは、プロモーターとして作用する能力、すなわち、遺伝子の転写を開始する作用を意味し、「植物プロモーター」とは、植物においてプロモーター機能を有するＤＮＡをいう。
本発明プロモーターは、具体的には、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ（以下、本プロモーターＤＮＡと記す。）を含む。
（ａ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてプロモーター機能を有するＤＮＡ
前記の塩基の欠失、置換または付加には、ＤＮＡの取得源に用いられた生物の種差、系統差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、ＤＮＡに人為的に導入された変異等が含まれる。本プロモーターＤＮＡには、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、植物細胞におけるプロモーター機能を有するかぎりその一部の塩基が欠失された塩基配列からなるＤＮＡも含まれる。かかるＤＮＡは、自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が導入されたＤＮＡであっても、人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
【０００７】
本プロモーターＤＮＡは、例えば、Daucus carotaなどのニンジンのゲノムＤＮＡ等からＰＣＲ法を利用して単離することができる。
例えば、Daucus carota等のニンジンの葉などの組織を採取し、得られた組織を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などにより物理的に磨砕することにより細かい粉末状の組織片とする。該組織片から通常の方法によりゲノムDNAを抽出する。該抽出操作は、例えば、M.Shure et al, Cell, 35:225(1983)等に記載されているCTAB法、S.O.Rogers and A.J.Bendich, Plant.Mol.Biol., 5:69(1985)等に記載されている尿素−フェノール法などにより行なうことができる。得られたゲノムDNAを鋳型として、例えば、配列番号１または配列番号７の塩基番号１から２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１または配列番号７の塩基番号２０２９から２０５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、1回〜数回のPCRを行うことにより、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを増幅することができる。尚、このようなプライマーに用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列に基いて適宜設計することができ、また、その5'末端側に、制限酵素認識配列等を付加してもよい。
上記のようにして増幅されたDNAは、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には、例えばInvitrogen社のTAクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやStratagene社のpBluescriptIIなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。クローニングされたDNAの塩基配列は、F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A．(1977), 74, 5463頁-5467頁等に記載されるダイデオキシターミネーティング法などにより分析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitなどの市販の試薬を用いてもよい。
上述のようにして得られるＤＮＡの下流にレポーター遺伝子、例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子を連結し、これを必要に応じてベクターにクローニングして、後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌感染法などの方法を用いて、例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２などの植物培養細胞に導入する。次いで、該培養細胞の細胞抽出液を調製してそのβ−グルクロニダーゼ活性を酵素学的手法により測定し該活性値を指標にするか、または、該培養細胞を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察し色素の沈着度を指標にすることにより、上記ＤＮＡのプロモ−ター機能の有無を確認し、本プロモーターＤＮＡを得ることができる。また、同様にして、レポーター遺伝子に連結されてなる上記ＤＮＡを、例えばタバコ野性株細胞などの植物細胞に導入してこの細胞から植物体を再生させ、該植物体もしくはその子孫の各組織におけるβ−グルクロニダーゼ活性を測定するか、または、該植物体もしくはその子孫の各組織もしくはその切片を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察することにより、上記ＤＮＡのプロモーター機能を調べ、本プロモーターＤＮＡを得ることもできる。尚、レポーター遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ遺伝子に限らず、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレセイントプロテイン遺伝子等を使用することもできる。
【０００８】
また、本プロモーターＤＮＡは、例えば、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡを標識し、これをプローブに用いて植物等由来のＤＮＡにハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合したＤＮＡを検出しクローニングすることにより取得することもできる。
ここで、前記プローブをハイブリダイズさせるＤＮＡとしては、例えば、ニンジンなどの植物由来のゲノムDNAライブラリー等を使用することができる。該DNAライブラリーには、市販のゲノムDNAライブラリーを用いることもできるし、また「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Pressや「Current Protocols In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常のライブラリー作製法に従い、例えば、STRATAGENE社のλ FIX II、λ EMBL3、λ EMBL4、λ DASH II等のλベクターを用い、STRATAGENE社のGigapack packaging Extracts等をin vitroパッケージングに用いてゲノムDNAライブラリーを作製し、これを用いることもできる。
このようなＤＮＡにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションをあげることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるライブラリーがプラスミドベクターで構築されたライブラリーである場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行なう。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで37℃で培養を行う。また、使用されるライブラリーがファージベクターで構築されたライブラリーである場合には、プラークハイブリダイゼーションを行なう。具体的にはまず、宿主微生物とライブラリーのファージを感染可能な条件下で混合した後さらに軟寒天培地と混合し、これを寒天培地上にまく。その後プラークが現れるまで37℃で培養を行う。より具体的には、例えば、 Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.65等に記載されている方法に準じて、NZY寒天培地に寒天培地1mm2当り0.1〜1.0pfuの密度で、約9.0×105pfuのファージライブラリーを広げ、37℃で6〜10時間培養する。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーション法の場合も、前述の培養を行なった寒天培地の表面にメンブレンフィルターをのせ、プラスミドを保有する形質転換体やファージを該メンブレンフィルターに転写する。このメンブレンフィルターをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、DNAを該フィルターに固定する処理を行なう。より具体的には例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）等に記載の通常の方法に準じて、前記寒天培地の上にニトロセルロースフィルター又はナイロンフィルター等、例えば、Hybond-N+（アマシャム社製）を置き、約1分間静置してファージ粒子をメンブレンフィルターに吸着させる。次に、該フィルターをアルカリ溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5N NaOH）に約3分間浸してファージ粒子を溶解させてファージDNAをフィルター上に溶出させた後、中和溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5M トリス-塩酸緩衝液、pH7.5）に約5分間浸す処理を行う。該フィルターを洗浄溶液（300mM 塩化ナトリウム、30mM クエン酸ナトリウム、200mM トリス-塩酸緩衝液）で約5分間洗った後、例えば、約80℃で約90分間ベーキングすることによりファージDNAをフィルターに固定する。
このように調製されたフィルターを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、D.M.Glover編「DNA cloning, a practical approach」 IRL PRESS （1985） ISBN 0-947946-18-7、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）、または、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）等の記載に準じて行なうことができる。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー社、宝酒造社製のRandom Labelling Kit等を用いることができ、通常のPCR反応組成中のdCTPを［α−32Ｐ］dCTPに替えて、プローブに用いるDNAを鋳型にしてPCR反応を行うことにより、標識を行うこともできる。また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、アマシャム社製のECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection System等を用いることができる。ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例えば、450〜900mMの塩化ナトリウム、45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を0.1〜1.0％の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1%のSDS、100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むプレハイブリダイゼーション溶液を、上記のようにして作製したフィルター1cm2当り50〜200μlの割合で準備し、該溶液に前記フィルターを浸して42〜68℃で1〜4時間、好ましくは、45℃で2時間保温する。次いで、例えば、450〜900mMの塩化ナトリウム、45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、SDSを0.1〜1.0％の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1%のSDS、100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（フィルター1cm2当り1.0×104〜2.0×106cpm相当量）とを混合した溶液をフィルター1cm2当り50〜200μlの割合で準備し、該溶液にフィルターを浸し42〜68℃で4〜20時間、好ましくは、45℃で16時間保温しハイブリダイゼーション反応を行う。該ハイブリダイゼーション反応後、フィルターを取り出し、15〜300mMの塩化ナトリウム、1.5〜30mMのクエン酸ナトリウム、0.1〜1.0%のSDS等を含む42〜68℃の洗浄溶液等、好ましくは、300mMの塩化ナトリウム、30mMのクエン酸ナトリウム、1%のSDSを含む55℃の洗浄溶液で、10〜60分間のフィルター洗浄を1〜4回、好ましくは15分間の洗浄を2回行う。さらに、フィルターを2×SSC溶液（300mM 塩化ナトリウム、30mM クエン酸ナトリウム）で軽くすすいだのち乾燥させる。このフィルターを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してフィルター上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするDNAのフィルター上の位置を検出する。検出されたDNAのフィルター上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該DNAを有するクローンを単離することができる。具体的には例えば、フィルターをイメージングプレート（富士フィルム）に4時間露光させ、次いで該プレートをBAS2000（富士フィルム）を用いて解析し、シグナルを検出する。フィルターの作製に用いた寒天培地のうち、シグナルが検出された位置に相当する部分を約5mm角にくり抜き、これを約500μlのSMバッファー（50mM トリス-塩酸緩衝液 pH7.5、0.1M 塩化ナトリウム、7mM硫酸マグネシウム、0.01%ゼラチン）に2〜16時間、好ましくは3時間浸してファージ粒子を溶出させる。得られたファージ粒子溶出液をMolecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.65に記載の方法に準じて寒天培地に広げ、37℃で6〜10時間培養する。この寒天培地を用いて前述の方法と同様の方法でファージDNAをフィルターに固定し、このフィルターと前述のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。フィルターの作製に用いた寒天培地のうちの、シグナルが検出された位置に相当する部分からファージ粒子を溶出し、これを寒天培地に広げ、前述の方法と同様にフィルターを作製し、ハイブリダイゼーションを行う。このようなファージクローンの特定と純化を繰り返すことにより、用いたプローブとハイブリダイズする塩基配列を有するDNAを含むファージクローンが得られる。
前述のようなハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行うことにより得られたクローンの保有するＤＮＡは、DNA 調製や解析が容易なプラスミドベクター、例えば市販のpUC18、pUC19、pBLUESCRIPT KS+、pBLUESCRIPT KS- 等にサブクローニングして、プラスミドDNAを調製し、F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A． (1977),74,5463頁-5467頁等に記載されるダイデオキシターミネーティング法を用いてその塩基配列を決定することができる。塩基配列分析に用いる試料の調製は、例えば、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）13.15等に記載されているプライマーエクステンション法に準じて行うことができる。また、ファージクローンをMolecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.65等に記載の方法に準じてNZYM液体培地で増幅し、ファージ液を調製して、これから例えば、Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit（Clontech社製）等を用いてファージクローンDNAを抽出し、該DNAを鋳型として、例えば、前述のプライマーエクステンション法により塩基配列分析用の試料を調製し、塩基配列を分析することもできる。
このようにして得られるＤＮＡのプロモーター機能を上述のようにして調べることにより、本プロモーターＤＮＡが得られる。
【０００９】
本プロモーターDNAは、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列に変異を導入することによっても取得され得る。具体的には、例えば、A.Greener, M.Callahan、Strategies、1994年、7巻、32-34頁等に記載される方法により、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡにランダムに変異を導入してもよいし、W.Kramer,et al.、Nucleic Acids Research、1984年、12巻、9441頁もしくはW. Kramer,H.J.Frits、Methods in Enzymology、1987年、154巻、350頁等に記載のギャップド・デュープレックス（gapped duplex）法、または、T.A.Kunkel、Proc. of Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1985年、82巻、488頁もしくはT.A.Kunkel,et al.、Methods in Enzymology、1987年、154巻、367頁等に記載のクンケル（Kunkel）法等に準じて、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡに部位特異的に変異を導入してもよく、あるいは、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列の一部において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行ない、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを増幅することもできる。また、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列のうち1ヶ所ないし数カ所の部分塩基配列を、他のプロモーターの塩基配列の一部と入れ換えたキメラＤＮＡを作製してもよく、例えば、S.Ｈenikoff,et al.、Gene、1984年、28巻、351頁、C.Yanisch-Perron,et al.、Gene、1985年、33巻、103頁等に記載された方法により、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列の一部を欠失した塩基配列を有するＤＮＡを調製してもよい。このようにして得られるＤＮＡのプロモーター機能を上述のようにして調べることにより、本プロモーターＤＮＡが取得され得る。
【００１０】
本発明プロモーターは、前述のようにして得られる本プロモーターＤＮＡのうち前記（ａ）、（ｂ）のＤＮＡのいずれか一方を含んでいてもよいし、（ａ）、（ｂ）を共に含んでいてもよく、また、これらを反復して含んでいてもよい。
さらに、本発明プロモーターは、植物において遺伝子の転写効率を増大させる効果を有する塩基配列を含んでいてもよい。該塩基配列としては、植物において、例えば、種特異的、組織特異的または時期特異的にその転写効率増大効果を示す配列であってもよく、病原微生物の感染や、光、熱、乾燥、塩または傷害などのストレス等によりその転写効率増大効果が誘導される配列であってもよい。植物において遺伝子を転写する効率を増大させる効果を有する塩基配列の具体例としては、例えば、アグロバクテリウムのオクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流333番目の塩基から同じく116番目の塩基までの領域の下流に、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流318番目の塩基から同じく138番目の塩基までの領域が連結されてなる転写翻訳活性化配列、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流318番目の塩基から同じく213番目の塩基までの領域の下流に、オクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流333番目の塩基から同じく116番目の塩基までの領域が連結されてなる転写翻訳活性化配列（The Plant Journal, 7(4):661-676(1995)）、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの転写開始点の上流343番目の塩基から同じく91番目の塩基までを含む塩基配列（Nature, 313:810-812(1985)）、トマトのリブロースー１，５―二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子（rbc-3A）の転写開始点の上流1099番目の塩基から同じく205番目の塩基までを含む塩基配列（Plant Cell, 1:217-227(1990)）、タバコのPR1a遺伝子の転写開始点の上流902番目の塩基から同じく287番目の塩基までを含む塩基配列（Plant Cell, 2:357-366(1990)）、ジャガイモのプロテアーゼインヒビター遺伝子（PI-II）の転写開始点の上流1300番目の塩基から同じく195番目の塩基までを含む塩基配列（Plant Cell, 2:61-70(1990)）等があげられる。
【００１１】
また、本発明プロモーターは、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列に含まれる植物において転写効率増大効果を有する塩基配列も含み得る。さらに、かかる塩基配列を同定し、例えば、該塩基配列を反復して含む本発明プロモーターを作製することもできるし、植物細胞においてプロモーター機能を有する他のＤＮＡと該塩基配列とを連結することにより、新たな植物プロモーターを作出することもできる。該塩基配列を同定するには、例えば、植物細胞において種々の本プロモーターＤＮＡの制御下にレポーター遺伝子を発現させ、その発現量を比較することにより、転写効率増大効果に寄与する塩基配列を解析するとよい。より具体的には、例えば、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失もしくは置換された塩基配列からなるＤＮＡを複数調製し、それぞれの下流にレポーター遺伝子、例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子を連結し、これらを後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌感染法などの方法を用いて、例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２などの植物培養細胞に導入する。次いで、該培養細胞の細胞抽出液を調製してそのβ−グルクロニダーゼ活性を酵素学的手法により測定し該活性値を指標にするか、または、該培養細胞を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察し色素の沈着度を指標にして、各細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を比較し、その結果をレポーター遺伝子と連結された上記ＤＮＡの塩基配列と対比することにより、転写効率増大効果に寄与する塩基配列を明らかにすることができる。また、同様にして、レポーター遺伝子に連結されてなる上記ＤＮＡを、例えばタバコ野性株細胞などの植物細胞に導入してこの細胞から植物体を再生させ、該植物体またはその子孫の各組織におけるβ−グルクロニダーゼ活性を測定するか、または、該植物体またはその子孫の各組織またはその切片を、５−ブロモ−４―クロロ−３―インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察することにより、上記各ＤＮＡにより制御されたレポーター遺伝子の発現量を比較し、転写効率増大効果に寄与する塩基配列を明らかにすることもできる。
【００１２】
本発明において、「ターミネーター機能」とは、ターミネーターとして作用する能力、すなわち、遺伝子の転写の終結を指令する作用を意味し、「植物細胞内で機能可能なターミネーター」とは、植物においてターミネーター機能を有するＤＮＡをいう。本発明ターミネーターは、具体的には、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ（以下、本ターミネーターＤＮＡと記す。）を含む。
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号２で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてターミネーター機能を有するＤＮＡこのような塩基の欠失、置換または付加には、ＤＮＡの取得源に用いられた生物の種差、系統差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、ＤＮＡに人為的に導入された変異等が含まれる。かかるＤＮＡは、自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が導入されたＤＮＡであっても、人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
【００１３】
本ターミネーターＤＮＡは、配列番号２で示される塩基配列に基いて、上述の本プロモーターＤＮＡの取得方法に準じて取得することができる。具体的には、例えば、ニンジン等の植物由来のゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号２の塩基番号１から２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基番号８２７から８５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、1回〜数回のPCRを行う方法をあげることができる。
尚、本ターミネーターＤＮＡの植物細胞におけるターミネーター機能を確認するには、例えば、植物細胞内で機能可能なプロモーター、レポーター遺伝子、例えばβ−グルクロニダーゼ遺伝子および本ターミネーターＤＮＡをβ−グルクロニダーゼ遺伝子が発現可能な形で連結し、一方、対照として、前記プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を同様に連結し、これらをそれぞれ、後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌法などを用いて、例えばタバコ培養細胞ＢＹ−２などの植物培養細胞に導入する。次いで、それぞれの細胞の細胞抽出液を調製してそのβ−グルクロニダーゼ活性を測定し該活性値を指標にするか、または、該細胞を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察し色素の沈着度を指標にすることにより、プロモーター、β−グルクロニダーゼ遺伝子および本ターミネーターＤＮＡを連結して導入した植物細胞において、対照よりβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現量が高いことを確認する。また、同様にして、植物細胞内で機能可能なプロモーター、β−グルクロニダーゼ遺伝子および本ターミネーターＤＮＡを連結し、一方、対照として、前記プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を同様に連結し、これらをそれぞれ、タバコ野生株細胞などの植物細胞に導入して該細胞から植物体を再生させる。再生した植物体またはその子孫の各組織におけるβ−グルクロニダーゼ活性を測定するか、または、該植物体またはその子孫の各組織またはその切片を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察することにより、本ターミネーターＤＮＡの機能を調べることができる。
【００１４】
本発明プロモーターを用いて所望の遺伝子を植物細胞内で発現させるには、本発明プロモーター、所望の遺伝子および植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなる遺伝子（以下、本発明キメラ遺伝子と記す。）を利用するとよい。ここで、所望の遺伝子とは、植物で発現させようとする遺伝子であって、例えば、酵素、貯蔵タンパク質、受容体、転写調節因子、シグナル伝達因子などのタンパク質をコードする遺伝子があげられ、これらの遺伝子は本発明プロモーターの下流に目的に応じてセンスまたはアンチセンス方向に結合するとよい。植物ターミネーターとしては、例えば、アグロバクテリウム属細菌のTi-プラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（NOS)、ニンニクウイルスGV1,GV2等の植物ウイルス由来のターミネーターなどを挙げることができ、本発明ターミネーターを用いることもできる。また、本発明キメラ遺伝子は、本発明プロモーターの塩基配列、またはその一部を反復した形で含んでいてもよい。尚、「機能可能な形で」とは、本発明キメラ遺伝子を導入し植物細胞を形質転換させたときに、該キメラ遺伝子に含まれる目的の遺伝子が、本発明プロモーターおよび植物ターミネーターの制御下に発現するように、これらのプロモーターおよびターミネーターと結合された状態にあることを意味する。
【００１５】
本発明プロモーターを有するベクターにおいて、ベクターとは、細胞内で増殖可能なDNAであって、大腸菌、酵母、植物細胞、動物細胞等の細胞内で増幅可能なプラスミド、ファージ、ファージミッド等があげられ、宿主細胞や用途に応じて選択する。具体的には、例えば、pUC系プラスミド[pUC118,pUC119（宝酒造社）など]、pSC101系プラスミド、Ti-プラスミド[pBI101,pBI121（CLONTECH社）など]、ブルースクリプト系ファージミッド[pBluescript SK(+/-)(STRATAGENE社)など]、M13系ファージ[mp10,mp11(Amersham社)など]、λ系ファージ[λgt10,gt11(Amersham社)など]、コスミッド類[SuperCosI(STRATAGENE社)など]等が挙げられ、この様なベクターに本発明プロモーターを組み込むことにより、本発明プロモーターを有するベクターを構築することができる。
前記のような本発明プロモーターを有するベクターにおいて、該プロモーターの下流に遺伝子挿入部位および植物ターミネーターがさらに有ると、所望の遺伝子を植物細胞内で発現させるためのベクターの構築等に好ましく利用できる。ここで遺伝子挿入部位とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、本発明プロモーターおよび植物ターミネーターを有するベクター上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましい。この様な遺伝子挿入部位、本発明プロモーターおよび植物ターミネーターは、該遺伝子挿入部位へ所望の遺伝子が挿入された際に、ベクター上で本発明プロモーター、所望の遺伝子および植物ターミネーターが機能可能な形で連結されるような位置にあることが好ましい。かかるベクターは、例えば、遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを含むプラスミド、具体的には、pBI101.3（CLONTECH社製）等のマルチクローニング部位（遺伝子挿入部位）に、本発明プロモーターのＤＮＡを挿入することにより構築することができる。また、遺伝子挿入部位を有するベクター、具体的には、pBIN19(Nucl.Acid Res. 12:8711-8721(1984))等のマルチクローニング部位（遺伝子挿入部位）に本発明プロモーターと植物ターミネーターを挿入することによっても構築することができる。
本発明キメラ遺伝子を有するベクターは、該キメラ遺伝子の宿主細胞への導入に好ましく使用することができ、例えば、該キメラ遺伝子を上記のようなベクターにクローニングするか、または、本発明プロモーター、遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを有する上記のようなベクターの遺伝子挿入部位に所望の遺伝子をクローニングすることにより調製することができる。例えば、pBI101.3(CLONTECH社製)を用いて作製した上記のようなベクターを制限酵素を用いて切断することにより該ベクター上に存在するレポーター遺伝子（β-グルクロニダーゼ遺伝子）を除去し、該レポーター遺伝子に換えて所望の遺伝子を挿入することによって、本発明キメラ遺伝子を有するベクターを調製することができる。
上述のような本発明のベクターは、本発明プロモーター、発現させようとする所望の遺伝子や植物ターミネーターの他に、該ベクターが導入された宿主細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、植物に除草剤耐性を付与し得る遺伝子等）を含んでいてもよい。また、該ベクターは、本発明プロモーターの塩基配列を反復した形で含んでいてもよい。
【００１６】
本発明のベクターは、例えば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラー・クローニング第２版（１９８９）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）等に記載の塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法等により大腸菌やアグロバクテリウム菌に導入することができ、本発明ベクターの導入されたかかる微生物細胞（形質転換体）は、本発明キメラ遺伝子ＤＮＡの調製や該キメラ遺伝子の植物細胞への導入等に有用である。
また、本発明プロモーターをコードするＤＮＡや本発明キメラ遺伝子のＤＮＡは、パーティクルガン法（パーティクルガンによる植物組織または培養細胞への直接導入法）等により、植物細胞に導入することができる。また、本発明のベクターは、例えば、アグロバクテリウム菌感染法（アグロバクテリウム菌を植物組織に感染させる方法）、電気的導入法（エレクトロポーレーション法やプロトプラストへの電気的導入法）、またはパーティクルガン法等の公知の方法により植物細胞に導入することができる。
【００１７】
本発明プロモーター、本発明キメラ遺伝子や本発明ベクターを導入し、本発明プロモーターの制御下に遺伝子を発現させることができる植物種としては、例えば、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等の単子葉植物、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等のマメ科植物、タバコ、トマト、ジャガイモ等のナス科植物、キャベツ、ナタネ、カラシナ等のアブラナ科植物、メロン、カボチャ、キュウリ等のウリ科植物、ニンジン、セロリ等のセリ科植物、レタス等のキク科植物等の双子葉植物を挙げることができる。
本発明プロモーター、本発明キメラ遺伝子または本発明のベクターを上記のように植物の細胞へ導入し形質転換体を得ることにより、例えば、本発明プロモーターがゲノムＤＮＡ上の所望の遺伝子の上流に挿入され該遺伝子を本発明プロモーターの制御下に発現する植物細胞、本発明キメラ遺伝子がゲノムＤＮＡ上に挿入され該キメラ遺伝子に含まれる遺伝子を本発明プロモーターの制御下に発現する植物細胞、本発明キメラ遺伝子を有するベクターを細胞内に有し該キメラ遺伝子に含まれる遺伝子を本発明プロモーターの制御下に発現する植物細胞などが得られる。
上記のような形質転換された植物細胞は、例えば、S.B.Gelvin, R.A.Schilperoot and D.P.S.Verma著：プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル（Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers press (1988)）、島本功、岡田清孝監修：モデル植物の実験プロトコール（イネ、シロイヌナズナ編）（秀潤社）(ISBN4-87962-157-9 C3345,1996)78-143頁あるいは内宮博文著（植物遺伝子操作マニュアル、トランスジェニック植物の作り方（講談社サイエンティフィック））1990, ISBN4-06-153513-7 C3045)28-33頁に記載されている通常の植物組織培養技術において用いられる方法に準じて再分化することによって、該植物細胞由来の形質転換された植物体またはその一部を得ることができる。さらに、前記のようにして得られる植物体を栽培し自殖させることにより、該植物体の子孫が得られる。
尚、上述のような形質転換された植物細胞や植物体より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを制限酵素で切断し、宿主細胞の形質転換に用いたDNAまたはその一部をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、遺伝子導入の有無を確認することができる。また、かかる植物細胞や植物体より、常法に従ってRNAを抽出し、本発明プロモーターの制御下に発現させようとする目的の遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡをプローブに用いてノザンハイブリダイゼーションを行うことにより、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。
【００１８】
本発明プロモーターの制御下に特定の遺伝子をセンス方向に連結し植物で発現させることにより、植物に有用な形質を付与することができる。例えば、フェニールアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子（PAL）、カルコンシンターゼ遺伝子（CHS）、キチナーゼ遺伝子（CHT）、リゾチーム遺伝子もしくはPRタンパク質遺伝子等の植物防御遺伝子、Pto遺伝子等の病害抵抗性遺伝子、ウイルスコートタンパク質遺伝子またはBT(Bacillus thuringiensis )殺虫タンパク質遺伝子等を発現させることにより、植物組織において細菌、カビ、ウイルス、昆虫等に対する抵抗性を増強することができる。また、例えば、ダイズのグリシニン遺伝子、β-コングリシニン遺伝子等の貯蔵タンパク質遺伝子を発現させることにより、飼料作物における種々のタンパク質含量や必須アミノ酸含量を増加させることができ、ブラジルナッツの2Sアルブミン遺伝子、トウモロコシやイネの10kDa及び15kDaタンパク質遺伝子等を発現させることにより、飼料作物のメチオニン含量あるいはリジン含量を増加さることができ、大腸菌等の微生物由来のbioA、bioB、bioC、bioD、bioF、bioH 酵素遺伝子等のビオチン生合成関連酵素遺伝子を発現させることにより、飼料作物におけるビオチン含量を増加させることができ、さらにステアロイル-ACP-デサチュレース、アシル-ACP-チオエステラーゼ、3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼ遺伝子等を発現させることにより、脂質の酸化安定性の向上、リン脂質の減少及びオレイン酸とリノレン酸の増加による脂質の改良が可能となり、アシルトランスフェラーゼ遺伝子等を発現させることにより、不飽和脂肪酸の割合を増加させ低温に対する抵抗性を増大させることができる。また、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性に関与する遺伝子を発現させることにより、形質転換体の選択に有用な抗生物質耐性を付与することもできる。さらに、例えば、L-ホスフォノスリシンアセチル化酵素(PAT)もしくはプロトポルフィリノーゲン酸化酵素（PPO）遺伝子等の除草剤抵抗性に関与する遺伝子を発現させることにより、除草剤抵抗性作物を作出することもできる。
一方、本発明プロモーターの制御下に特定の遺伝子をアンチセンス方向に連結し植物細胞内で発現させることにより、植物に有用な形質を付与することもできる。例えば、イネのイソメラーゼ（Isomerase）などのアミロペクチン分解酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現させることによりイネ種子中のデンプン成分を改良することができ、カボチャ等の1-アミノシクロプロパン-1-カルボキシレート（ACC）合成酵素などのエチレン合成酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現させることにより果物、花などの保存性を向上することができ、また、トマトのポリガラクチュロナーゼ遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現させることにより果物の保存性を向上することができる。
さらに、植物の自家不和合性に関与しているS-ローカス型特異的RNase遺伝子等の雄性不稔関連遺伝子のセンスまたはアンチセンス遺伝子を発現させることにより、植物の稔性を制御することもできる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1 （本発明プロモーター、本発明ターミネーターの単離）
ニンジン葉部より調製したゲノムDNAを用いてインバース・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（インバースＰＣＲ）を行い、本発明プロモーター、本発明ターミネーターを取得した。以下にその方法について説明する。
（1）ニンジンゲノムDNAの調製
播種後6週目のニンジン葉部10gを液体窒素中で磨砕し、5mlの2xCTAB液（2% Cetyltrimethyl ammonium bromide、100mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、20mM EDTA pH8.0、1.4M 塩化ナトリウム、1% ポリビニルピロリドン）に懸濁後、55℃で10分間保温した。これに等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（24:1）を加え、室温で30分間穏やかに混合した後遠心分離し、上層と下層とを分取した。▲１▼上層には等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（24:1）を加え、▲２▼下層には等量の1xCTAB液（2xCTAB液を滅菌蒸留水で2倍に希釈した液）を加え、それぞれ室温で10分間穏やかに混合した後、再度遠心分離し、▲１▼、▲２▼それぞれより上層を分取してこれらを混合した。これに1/10量の10％CTAB液（10% Cetyltrimethyl ammonium bromide、0.7M 塩化ナトリウム）および等量の沈澱バッファー（2% Cetyltrimethyl ammonium bromide、50mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、10mM EDTA pH8.0）を加え、穏やかに混合した後遠心分離した。沈殿物を回収しこれを1M塩化ナトリウム-TE（1M 塩化ナトリウム、10mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁し、さらに等量のイソプロパノールを加えて穏やかに混合した後、遠心分離し、得られた沈殿物を70%エタノールでリンスして軽く乾かし、これをTEに懸濁した。該懸濁液に最終濃度10μg/mlになるようにRNaseを加え、37℃で30分間保温した後、1/4量の4M酢酸アンモニウムと2倍量の100％エタノールとを加えて混合し静置した。析出したDNAをパスツールピペットで巻き取って回収後、70%エタノールでリンスして軽く乾かしTE（10mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁した。このDNA液を適当に希釈し、吸光度測定、アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、約 350μgのゲノムDNAが得られたことが確認された。
【００２０】
(2)本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含むDNAのPCRによる増幅
(1)で得られたゲノムDNA10μgにPvuII 100Uを作用させてこれを完全消化した後、1/10量の3M酢酸ナトリウムと2倍量の100％エタノールとを加えて混合し、15000rpm、10分間、4℃で遠心分離して、沈澱したDNAを回収した。これを70％エタノールでリンスし、最終濃度が20ng/μlになるようにTEに懸濁した。このDNA溶液とライゲーションキット（宝酒造製）を用いて最終濃度が1ng/μlになるように、反応体積400μlでライゲーション反応させた後、該反応液を鋳型にして、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＡおよびＢ、
オリゴヌクレオチドＡ； 5'- GGGTT TCAAT GGATT CGATG -3' （20mer）
オリゴヌクレオチドＢ； 5'- GCAGA TGCTC AGAAC ACTGC -3' （20mer）
を用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。さらにこのPCR反応液の一部と、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＣおよびＤ、
オリゴヌクレオチドＣ； 5'- GGCAG CTGGC ACCCA TGATA TTTAG AATG -3' (29mer)オリゴヌクレオチドＤ； 5'- GGCAG CTGTT CATAA TTTAC AGAGT GAGTG ACAGT CAG -3' （38mer）
を用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。反応後の溶液の一部を0.8％アガロースゲル電気泳動に供して分析したところ、約3kbのDNA断片が増幅していることが確認された。
【００２１】
（3）本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターのクローニングとシークエンス
(2)で得られたPCR反応液にTEを添加して200μlに調整し、これに等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（24：23：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを回収した。該DNAを70％エタノールでリンスした後TEに懸濁し、PvuII 30Uを作用させて完全消化した。該反応後、上記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行い、回収したDNAを50μlのTEに懸濁し、スピンカラムS-400（ファルマシア社製）に供して精製した。該カラムからの溶出液1μlを0.8％アガロースゲルで分析した結果、約2kbと約1kbのサイズのDNA断片が存在することが判った。pUC18ベクター2μgにSmaI 10Uを作用させて完全消化した後、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液について上記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行ってベクターＤＮＡを回収しこれをTEに懸濁した。このベクターＤＮＡ50ngと上記のインサート50ngとをライゲーションキット（宝酒造製）を用いてライゲーション反応に付した後、大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造製）に導入した。該導入処理を行なった菌株をアンピシリン100μg/mlを含むLB培地上で培養し、生育してきたクローンからプラスミドDNAを調製した。このDNAを制限酵素で切断してアガロースゲル電気泳動することにより、目的とする約2kbまたは約1kbのサイズのDNA断片を含有するプラスミドをそれぞれ選抜した。これらのプラスミドの塩基配列を、pUC18ベクターに存在する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＥおよびＦ、
オリゴヌクレオチドＥ；5'- AACAA TTTCA CACAG GAAAC AGCTA TGACC -3' (30mer)
オリゴヌクレオチドＦ；5'- CAGTC ACGAC GTTGT AAAAC GACGG CCAGT -3'（30mer）
をプライマーに用い、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI）、蛍光シークエンサー（ABI）を用いて分析した。さらに、明らかとなった塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーに用いて前述と同様に塩基配列を分析した。その結果、前記約2kbのサイズのDNA断片は、配列番号１で示される塩基配列を有することが判明した。このDNA断片を含有する前記プラスミドをpCR16G6Pと名付けた（図１）。また、前記約1kbのサイズのDNA断片は配列番号２で示される塩基配列を有することが判明した。このDNA断片を含有する前記プラスミドをpCR16G6T（図２）と名付けた。
【００２２】
実施例2 （本発明プロモーターを導入したトランスジェニックタバコの作製）
Tiプラスミド発現ベクターの構築
実施例1で得られた配列番号１で示される塩基配列を有するプラスミドを鋳型にして、クローニング用の制限酵素認識配列を有する下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
を合成し、これをプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。増幅したDNA断片にHindIII 10U、XbaI 10Uを作用させて完全消化した後、一部を0.8％アガロースゲルで分画し、約1.7kbのサイズのＤＮＡバンドを切り出してこれに含まれるDNAをガラスビーズ（バイオラッド社製）を用いて精製した。同様に残りの溶液を4％Nusieve Agarose ゲルで分画し、約250bpのサイズのバンドを切り出してこれに含まれるDNAを精製した。ｐBIN19由来のベクターｐIG121HM 2μgをHindIII 10U、XbaI 10Uで消化し、さらにアルカリフォスファターゼを作用させて脱リン酸化反応を行った後、前記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行ってベクターDNAを回収した。該ベクターDNAと上記の2種のDNA断片（約1.7kb、約250bp）とをライゲーションキットを用いてライゲーション反応に供した後、大腸菌HB101株のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、該導入処理を行なった菌株をカナマイシン50μg/mlを含むLB培地上で培養した。生育してきたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素HindIII、XbaIで切断してアガロースゲル電気泳動で分析することにより、上記の約1.7kbのDNA断片と約250bpのDNA断片の両方を含むプラスミドを選抜した。さらに選抜したプラスミドDNAを鋳型にして、前述のオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行い、約2kbのDNA断片が増幅されることを確認した。このようにして調製されたβ−グルクロニダーゼ遺伝子の上流に本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターをｐBICR16G6P（図３）と名付けた。
【００２３】
（2）トランスジェニックタバコの作製
以下のトランスジェニック植物の作製は、S.B.Gelvin、R.A.Schilperoort and D.P.S.Verma著；Plant Molecular Biology/Manual（1988）（Kliwer Academic Publishers発行、Valvekens et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5536-5540（1988）に記載の方法に準じて行った。
アグロバクテリウム菌C58C1をYEB培地中で、30℃にて一晩振とう培養した後、新たなYEB培地に植え継ぎ、培養液の濁度がOD600=0.6に達するまで培養した。以下の操作は、低温室にて行った。この培養液を遠心分離して菌体を集め、これを冷やしておいた滅菌蒸留水に懸濁した後、再度遠心分離して集菌した。この菌体の洗いを2回繰り返し、さらに滅菌蒸留水を10%グリセロール溶液に変えて同様の操作を行った。こうして得られた菌体を培養液の400倍濃縮になるように10%グリセロール溶液に懸濁した。このようにして調製した菌体懸濁液に、上記のようにして構築した本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6Pまたは対照としてpIG121HMベクターを、エレクトロポレーション法を用いて導入し、導入処理を行なった菌株をカナマイシン50μg/mlを含むYEBプレート上で培養した。生育してきたカナマイシン耐性クローンからアルカリ-SDS法によりプラスミドDNAを調製し、該DNAを0.8%アガロースゲル電気泳動で分析し、ゲルをエチジウムブロマイド染色してDNAバンドを検出することにより、Tiプラスミド発現ベクターが導入されていることを確認した。さらにこのプラスミドDNAを鋳型にして、前述のオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行い、約2kbのDNA断片が増幅することを確認し、目的の発現ベクターが導入されていることを確認した。
無菌培養したタバコの葉部切片（0.7cm角）を、カナマイシン50μg/mを含むYEB液体培地で30℃にて1晩培養したアグロバクテリウム菌培養液に２分間浸し、滅菌したろ紙で余分な水気を除いた後、MS-NB培地上に置いた。16時間明所、8時間暗所の条件下で25℃にて5日間共存培養後、切片をMS液体培地で洗浄し、MS-NBC培地上に置いた。さらに5日間培養後、選択薬剤を含むMS-NBCK培地に切片を移し、約1カ月程度静置培養し、再生したシュートを葉部切片本体より切断して、MS-CK培地に植え継いだ。約1カ月後、発根した個体を土壌に植え替え自殖種子を得た。
【００２４】
（3）トランスジェニックタバコにおける導入遺伝子の確認
トランスジェニックタバコの種子を2.5% 次亜塩素酸/0.002% Triton X-100に5分間浸し、次いで、滅菌水で4-5回洗浄後、カナマイシン100μg/mlを含むMS培地で培養し無菌発芽させた。カナマイシン耐性を示した個体からCTAB法によりゲノムDNAを調製し、このDNA 50ngを鋳型に、レポーター遺伝子であるGUS遺伝子の塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＩと、配列番号７で示される塩基配列からなるDNAを含む本発明プロモーターの塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＪ、
オリゴヌクレオチドＩ；5'- ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC -3' (30mer)
オリゴヌクレオチドＪ；5'- TCTGC ATCGG CGAAC TGATC -3' （20mer）
との組み合わせをプライマーに用いるか、またはレポーター遺伝子であるGUS遺伝子の塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＫと、NOSターミネーターの塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＬ、
オリゴヌクレオチドＫ；5'- ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C -3'（21mer）
オリゴヌクレオチドＬ；5'- GATAA TCATC GCAAG ACCGG -3' （20mer）
との組み合わせをプライマーに用いてそれぞれPCR反応を行い（94℃1分間次いで55℃2分間72℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）、PCR産物の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動で分画した。その結果、目的とする約310bp、約400bpの長さのDNA断片の増幅を確認した。
【００２５】
実施例３ （トランスジェニックタバコにおける本発明プロモーターの発現活性測定）
実施例２で得られたトランスジェニックタバコの実生の葉と根におけるGUS活性の測定とGUS染色をJefferson Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405(1987)に記載の方法に準じて行った。GUS活性は、4-methylumberlifer-β-D-glucuronideを基質とした蛍光法で測定し、活性染色は 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロン酸（X-Gluc）を基質として行い青色色素（インジゴチン）の沈着量を測定した。
（1）GUS染色
上記トランスジェニックタバコの種子を、カナマイシン100μg/mlを含むMS培地で培養して無菌発芽させ、1週間後、3週間後、1カ月後に、カナマイシン耐性の植物体を引き抜き、GUS染色液（1 mM X-Gluc、0.5 mM K3Fe(CN)6、0.5 mM Fe4Fe(CN)6、0.3% Triton X-100）に浸して37℃で1晩反応させた。反応後、100%エタノールを用いて脱色し、その染色パターンを観察した。その結果、本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6P導入したトランスジェニックタバコにおいて、該発現プラスミド上で本発明プロモーターの下流に接続されているβ−グルクロナーゼ遺伝子が葉部、根部、茎部で高発現していることが確認された。
【００２６】
（2）GUS活性測定
上記トランスジェニックタバコ種子をカナマイシン100μg/mlを含む培地で培養して無菌発芽させ、25℃で培養した。播種後1週間、3週間、1ヶ月後に、カナマイシン耐性の植物体の根部0.8g、葉部0.5gを採取して乳鉢にとり、それぞれ1ml、0.5mlの抽出バッファー（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール）を添加し、海砂を適当量加え摩砕した。この摩砕液をエッペンドルフチューブに移して遠心分離し、上清を分取した。得られた上清液のタンパク質濃度の定量はBIO-RAD社のProtein assay reagent を用いた方法で行った。この液10〜70μlを500μlの反応基質液（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール、1mM 4-methylumberlifer-β-D-glucuronide ）に添加し、37℃で保温した。一定時間おきに反応液100μlをサンプリングし、直ちに900μlの反応停止液（0.2M 炭酸ナトリウム溶液）を添加して混合した。このように調製したサンプルの蛍光を分光蛍光光度計（日立製作所 F-2000）で測定した（励起光波長365nm、発光波長455nm）。この測定値と測定に用いた上記上清液のタンパク質濃度の値からGUS活性を算出した。結果を表１（播種後1週間）、表２（播種後３週間）および表３（播種後１ヶ月）に示す。表１〜３において、本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6Pを導入したタバコ個体がIP-8〜１４、pIG121HMベクターを導入したタバコ個体がPIG-1〜２である。相対比は、各生育段階における葉部、根部でのGUS活性値を、pIG121HMベクター導入タバコ（PIG-２）の該活性値を1として表した値である。本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6P（本発明プロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入したトランスジェニックタバコでは葉部、根部の試料から高いGUS活性が検出され、最も高いものではpIG121HMベクター（35Sプロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入した場合の8倍高い活性を示した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
実施例４（トランスジェニックアラビドプシスにおける本発明プロモーターの発現活性測定）
（１）トランスジェニックアラビドプシスの作製
Tiプラスミド発現ベクターpBICR16G6Pを導入したアグロバクテリウムC58C1を用いてアラビドプシスへの遺伝子導入を行った。
無菌播種後、23℃で2-3週間生育させたアラビドプシスの根を1cm程度に切断し、CIMプレートで2日間培養した後、これを、30℃で2晩振とう培養したアグロバクテリウム培養液に浸し、再びCIMプレート上で培養した。2日後、該根部切片をSIMC培地に移し、さらに2日後、SIMCH培地に植え継いだ。約1カ月経って再生してきたシュートを切断してMS培地に植え替え、発根させた。発根した個体を土壌、またはロックウールに植え、人工気象器で育てて自殖種子を得た。
【００３１】
（２）トランスジェニックアラビドプシスにおける導入遺伝子の確認
（１）で得られた自殖種子を1%次亜塩素酸に5分間浸し、滅菌蒸留水で3-5回洗浄した後、ハイグロマイシン20μg/mlを含むMS培地で培養して無菌発芽させた。ハイグロマイシン耐性を示した個体からアラビドプシスはロゼット葉を4-5枚をとって、CTAB法によりゲノムDNAを調製した。このゲノムDNA50ngを鋳型にしてPCRを行い（94℃1分間次いで55℃2分間さらに72℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）、PCR産物の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動で分画した。プライマーには、オリゴヌクレオチドIおよびJの組合せ、またはオリゴヌクレオチドKおよびLの組合せを用いた。
オリゴヌクレオチドＩ；5'- ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC -3' (30mer)
オリゴヌクレオチドＪ；5'- TCTGC ATCGG CGAAC TGATC -3' （20mer）
オリゴヌクレオチドＫ；5'- ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C -3'（21mer）
オリゴヌクレオチドＬ；5'- GATAA TCATC GCAAG ACCGG -3' （20mer）
その結果、それぞれ目的とする約310bp、約400bpの長さのDNA断片の増幅が確認された。
【００３２】
（３）発現活性測定
（3-1）GUS染色
実施例４（２）で遺伝子の導入が確認されたトランスジェニックアラビドプシスの種子を、上記と同様にハイグロマイシン20μg/mlを含むMS培地で培養して無菌発芽させ、ハイグロマイシン耐性を示した個体を3週間生育させた。植物体を生育培地から抜き、GUS染色液（1 mM X-Gluc、0.5 mM K3Fe(CN)6、0.5 mM Fe4Fe(CN)6、0.3% Triton X-100）に浸して37℃で1晩保温した。次いで、100%エタノールで数回洗浄して脱色し、青色色素の沈着を観察した。その結果、本発明プロモーターの下流に接続されているβ−グルクロニダーゼ遺伝子が葉部、根部、茎部で高発現していることが確認された。
【００３３】
（3-2）GUS活性測定
実施例４（２）で遺伝子の導入が確認されたトランスジェニックアラビドプシスの種子をハイグロマイシン20μg/mlを含む培地で培養して無菌発芽させ、23℃で3週間培養した。根部、葉部、それぞれ3個体分を乳鉢にとり、それぞれに抽出バッファー（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール）を添加し、海砂を加えて摩砕した。この摩砕液をエッペンドルフチューブに移して遠心分離し、上清を分取した。該上清10-70μl分を500μlの反応基質液（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール、1mM 4-methylumberlifer-β-D-glucuronide ）に添加して37℃で保温し、一定時間おきに100μlをサンプリングし、直ちに900μlの反応停止液（0.2M 炭酸ナトリウム溶液）と混合した。このように調製したサンプルを分光蛍光光度計（日立製作所 F-2000）で測定した（励起光波長365nm、発光波長455nm）。また、該上清のタンパク質濃度をバイオラッド社のProtein assay reagent を用いた方法で定量した。前記の蛍光値と前記上清のタンパク質濃度からGUS活性を算出した。その結果、本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6P（本発明プロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入したトランスジェニックアラビドプシスでは葉部、根部の試料から高いGUS活性が検出され、最も高いものではpIG121HMベクター（35Sプロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入した場合の8倍高い活性を示した。
【００３４】
実施例５（ダイズにおける本発明プロモーターの発現活性測定）
実施例２（１）のように取得したプラスミドpBICR16G6Pを含有する組換え大腸菌クローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製した。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlに添加し、37℃、1晩振とう培養した。得られた培養液を培養後8000rpmで10分間遠心分離を行うことにより菌体を回収し、QIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製した。
該プラスミドDNAを、森川らの遺伝子銃（C.M.Particle Gun System, Rhebock shoko Co.）を用いた直接導入法（Yang N−S，Christou P編、Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，W．H．Freeman and Co．Publishers，New York, pp.52-59）、パーティクルガン法（植物細胞工学,2,631-637,1990）、および特開平03-291501に記載の方法により、Finer J. and Nagasawa A.（Plant Cell, Tissue and Organ Culture,15,125-136,1988）に記載の方法に準じて誘導・増殖したダイズ不定胚またはダイズ展開葉に導入した。0.5〜1μmの金粒子（徳力本店製）をエタノールで数回洗浄し、60mg/mlとなるように滅菌水に懸濁した。プラスミドpBICR16G6Pの精製DNAを0.5μg DNA/mlとなるように滅菌水に溶解させたDNA溶液20μlに、50μlの前記金粒子懸濁液、50μlの2.5M CaCl2、20μlの0．1Mスペルミジンを加え、攪拌した。室温に30分間静置し、9000rpmで10秒間遠心した後、上清を除去し、沈澱に60μlの75%エタノールを添加して懸濁した。9000rpmで10秒間遠心した後、上清を除去し、沈澱を300μlの100%エタノールに懸濁し、ハンディータイプの超音波破砕機（トミー精工製）を用いて1秒間ずつ3回の超音波処理を行った。このような処理を行った金粒子懸濁液10μlをプロジェクタイル（レーボック商工製）に供試して乾燥させた後、これにさらに10μlの金粒子懸濁液を供試し、同様に乾燥させた。このプロジェクタイルを遺伝子銃にセットし、110mmHg真空下、335m/secの速度でMS寒天培地上に置いたダイズ不定胚およびダイズ展開葉に２回撃ち込んだ。対照として、pBI121（クロンテック社製）およびpBI221（クロンテック社製）を上記と同様にしてダイズ不定胚およびダイズ展開葉に撃ち込んだ。撃ち込み後、25℃で24時間静置培養し、GUS染色液（1 mM X-Gluc、0.5 mM K3Fe(CN)6、0.5 mM Fe4Fe(CN)6、0.3% Triton X-100）に浸して37℃で1晩保温した後、ダイズ不定胚における染色スポットを観察した。その結果、pBICR16G6Pベクターを導入した不定胚において青色の斑点が認められた。またダイズ展開葉は、前記の保温後に100％エタノールに浸して脱色した後、その染色スポットを観察した。その結果、pBICR16G6Pベクターを導入した展開葉において青色の斑点が認められた。
【００３５】
実施例６（本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターの作製）
（1）T-DNA内部を除去したTiプラスミドの構築
pBI101ベクター（クロンテック社製）5ngを鋳型にして下記のオリゴヌクレオチドP、およびオリゴヌクレオチドQ、
オリゴヌクレオチドP；5’―GGGAA TTCTC AGATT GTCGT TTCCC GCCTT CAG―3’(33mer)
オリゴヌクレオチドQ；5’―CAGAT CTGGG GAACC CTGTG GTTG―3’(24mer)
をプライマーに用いてPCR（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイクル）反応を行った。該PCR反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウム、2倍量のエタノールを添加して混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、DNAを沈殿させた。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE[10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)]20μlに懸濁した。得られたDNAにSphI 30U、EcoRI 30Uを作用させて完全消化した後、該消化液に、前述と同様に1/10量の3M酢酸ナトリウム、2倍量のエタノールを添加して混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離した後、沈澱したDNAを70%エタノールでリンスし、20μlのTEに懸濁した。これを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲルで泳動分画し、186bpのサイズのバンドを含むゲルを切り出し、これに含まれるDNAを精製した。一方、pBI101ベクター（クロンテック社製）2μgをSphI 10UおよびEcoRI 10Uで消化し、前述と同様にエタノール沈澱を行い、10μlのTEに懸濁した。このベクターDNA 50ngと、切り出したゲルから精製したDNA5ngを含む溶液とをライゲーションキット(宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンからプラスミドDNAを調製し、これを制限酵素SphI、EcoRIで切断してアガロースゲル電気泳動で分析することにより、上記の186bpのDNA断片を含み、T−DNA領域内にEcoRI認識配列のみを含むプラスミドを選抜しこれをpBIΔと名付けた。
【００３６】
(2)本発明プロモーターを含むプラスミドpCR16G6Pの改変
配列番号1で示される塩基配列を有する本発明プロモーターの3’末端側にクローニング用のHindIII認識部位、XbaI認識部位を導入するために、プラスミドpCR16G6P 5ngを鋳型にして下記のオリゴヌクレオチドR、およびオリゴヌクレオチドS、
オリゴヌクレオチドR;5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)
オリゴヌクレオチドS;5’-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3’(30mer)
をプライマーに用いてPCR（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイクル）を行った。該PCR反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加し混合した後、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、DNAを沈殿させた。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE（10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)）20μlに懸濁し、これにXbaI 50Uを添加し37℃で1時間保温した。これに、前述と同様に1/10量の3M酢酸ナトリウム、2倍量のエタノールを添加し混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離後、沈澱したDNAを70%エタノールでリンスし、20μlのTEに懸濁した。これを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約250bpのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、ゲルに含有されているDNAを精製した。さらにプラスミドpCR16G6P 2μgにXbaI 10Uを作用させて完全消化した後、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、20℃にて15000rpm、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製されたDNA50ngと前述のように4% Nusieve Agaroseから回収したDNA断片5ngをライゲーションキット(宝酒造製)を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、該培養液から、8000rpmで2分間遠心を行うことにより菌体を回収し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素XbaIで切断して4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画することにより、上記の約250bpのDNA断片を含むプラスミドを選抜した。また選抜したプラスミドを用いて、下記のオリゴヌクレオチドS、
オリゴヌクレオチドS;5’―AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC―3’(30mer)
をプライマーにして、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI）、蛍光シークエンサー（ABI）を用いて塩基配列を決定し、目的とする約250bpのDNA断片が含まれていることを確認した。このようにして得られたプラスミドをpCR16G6P−2と名付けた。
【００３７】
(3)本発明ターミネーターを含むプラスミドpCR16G6Tの改変
配列番号2で示される塩基配列を有する本発明ターミネーターを含むプラスミドpCR16G6Tを用いて、クローニング用のSacI認識部位、EcoRI認識部位を付加した本発明ターミネーターを含むプラスミドpCR16G6T-２を構築した。すなわち、まず、配列番号6で示される塩基配列を含むpC16プラスミド（Plant Cell Physiology, 38(9):1080-1086(1997),特開平07-188288）のDNA 50μgをDraI 50U、SacI 50Uを作用させて消化し、該消化液に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加して混合した後、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離した。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE[10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)]10μlに懸濁し、4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供した。泳動後、189bpのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、該ゲルに含有されているDNAを精製した。
一方、プラスミドpCR16G6T 5ngを鋳型にして、下記のオリゴヌクレオチドTおよびオリゴヌクレオチドU；
オリゴヌクレオチドT;5’―TTCAT AATTT ACAGA GTGAG TGACA GTCAG―3’(30mer)
オリゴヌクレオチドU;5’―GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC―3’(34mer)
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃1分間さらに74℃2分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイクル）を行った。該PCR反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加して混合した後、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、DNAを沈殿させた。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE[10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)]20μlに懸濁し、DraI 20UおよびEcoRI 20Uを添加して37℃で1時間保温した。次いでこれに、前述と同様に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加して混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離後、沈澱したDNAを70%エタノールでリンスし、20μlのTEに懸濁した。これを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動で分画した後、800bpのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、該ゲルに含有されているDNAを精製した。
pUC18ベクター（宝酒造製）のDNA 2μgをEcoRI 20U、SacI 20Uを作用させて消化し、前述と同様にエタノール沈澱し、TE10μlに懸濁した。該DNA 20ngと上述のように4% Nusieve Agaroseから精製した2種のDNA断片各30ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。培養後、白色を呈したコロニーを形成したクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液を8000rpmで2分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素SacI、EcoRIで切断して4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画することにより、989bpのDNA断片が検出できるプラスミドを選抜した。このプラスミドをpCR16G6T−２と名付けた。
【００３８】
（４）本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターの構築
実施例６（２）のようにして作製されたプラスミドpCR16G6P−2のDNA 2μgをEcoRI 20U、SalI 20Uを作用させて消化し、0.8% アガロースゲル（同仁製）電気泳動で分画した後、約2kbのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理し、該ゲルに含有されているDNA断片（以下、DNA断片Gと記す。）を精製した。同様に実施例６（３）のようにして作製されたプラスミドpCR16G6T−2のDNA 2μgをEcoRI 20U、SalI 20Uを作用させて消化し、4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画した後、約1kbのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理し、該ゲルに含有されているDNA断片（以下、DNA断片Hと記す。）を精製した。一方、pBluescriptKS−ベクター（クロンテック社製）のDNA 2μgをEcoRI 20Uで完全消化し、これにさらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。次いでこれに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製したベクターDNA 50ng、前述のDNA断片G 50ngおよびDNA断片H 25ngを混合してライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加してトランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。培養後、白色を呈したコロニーを形成したクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液を8000rpmで2分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素EcoRIで切断して0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画することにより、約3kbのDNA断片が検出できるプラスミドを選抜した。さらに該プラスミドのDNA 2μgをEcoRI 20Uで完全消化し、1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。一方、上述のプラスミドpBIΔのDNA 2μgをEcoRI 20Uで完全消化し、これにさらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液を前記のようにフェノール処理し、エタノール沈澱した後、得られたDNAをTE 10μlに懸濁した。このように調製したDNA 50ngと上記のEcoRI消化したプラスミドDNAをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液を8000rpmで2分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素EcoRI、または、EcoRIおよびSalIで切断して0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画することにより、EcoRI消化物から約3kbのDNA断片が検出され、EcoRIとSalIとによる消化物から約2kbおよび約1kbのDNA断片が検出されるプラスミドを選抜した。このプラスミドをpBICR16G6PTと名付けた。
【００３９】
(5)ターミネーターの改変
実施例６（４）で作製されたpBICR16G6PTのDNA1μgを制限酵素HindIIIで消化し、1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁した。該DNAにさらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該ポリメラーゼ反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製したDNA50ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。この反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/ml を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液から、前述のようにして菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。このDNAに制限酵素HindIIIを作用させ、0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画することにより、HindIIIの切断認識サイトを欠失しているプラスミドを選抜した。このプラスミドをpBICR16G6PTΔと名付けた。
【００４０】
実施例７（本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターの発現活性測定）
（1）β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子の発現ベクターへの導入
プラスミドpBI221（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20U、SacI 20Uで消化し、消化液の1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁した。該DNAにさらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。これをれを0.8%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動で分画した後、約1.7kbのGUS遺伝子を含むDNA断片を含むゲルを切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりDNAを精製した。一方、pBluescriptKS−（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製したDNA 50ngと前述のGUS遺伝子を含むDNA断片100ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。白色を呈したコロニーの一部を、ベクターの配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、およびGUS遺伝子の配列に基き合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドM；5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドK；5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。該PCR反応液を4% Nusieve Agarose（FMC社製）で分画後、410bpのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜した。該プラスミドを有するクローンの培養菌体を、前述と同様にQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。このプラスミドDNA2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで消化した後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画し、約1.7kbのDNA断片が含まれるゲルを切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりプラスミドDNAを精製した。一方、前述のプラスミドpBICR16G6PTΔのDNA 2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液をフェノール処理、エタノール沈澱後、TE10μlに懸濁した。このように調製したDNA 50ngと前述のように精製した約1.7kbのDNA断片20ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。白色を呈したコロニーの一部を、オリゴヌクレオチドUおよびGUS遺伝子の配列に基き合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドU；5’―GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC―3’(34mer)
オリゴヌクレオチドK；5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。該PCR反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画した後、約1.1kbのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜した。選抜されたプラスミドをpBICR16G6PTΔGと名付けた。該プラスミドを有するクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製した。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlに添加し、37℃、1晩振とう培養した。得られた培養液を8000rpmで10分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製した。
【００４１】
（２）ダイズにおける発現活性測定
（１）で作製したプラスミドpBICR16G6PTΔGのDNAを、実施例5に準じて、森川らの遺伝子銃（C.M.Particle Gun System,レーボック商工製）を用いることによりダイズの不定胚に撃ち込んだ。対照として、pBI221（クロンテック社製）を同様に撃ち込んだ。撃ち込み後の不定胚を、25℃で24時間静置培養し、次いでGUS染色液に浸して37℃で1晩保温した。保温後、その染色スポットを観察した結果、pBICR16G6PTΔGを導入したダイズ不定胚において青色の斑点が認められた。
【００４２】
実施例８（プロモーターの改変）
（１）改変プロモーターの作製
（1-1）4塩基付加
配列番号1で示される塩基配列を含むプラスミドpCR16G6PのDNA 2μgをSacI 20Uで消化し、さらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取する。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁する。これを1.0%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約3.9kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Aと記す。）または約880bpのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Bと記す。）を含むゲルをそれぞれ切り出し、該ゲルからプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。得られたDNA断片A 50ng、DNA断片B 100ngを混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、ライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。ベクターの配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、配列番号１に基き合成したオリゴヌクレオチドG、
オリゴヌクレオチドM；5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドG;5’―GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA―3’(28mer)
を含むPCR反応液に、生育してきたコロニーの一部を懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。この反応液の一部を0.8%アガロース電気泳動に供して分画し、約2kbのDNA断片が増幅されているプラスミドを複数選抜する。選抜されたプラスミドを含むクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB2mlに植え、37℃で1晩培養する。この培養液を遠心分離することにより集菌し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。該プラスミドDNAを制限酵素SacIで消化し、1.0%アガロース電気泳動に供し、SacIの認識サイトを欠失したプラスミドを選抜する。このようなプラスミドが含有する本発明プロモーターの塩基配列として配列番号3で示される塩基配列を挙げることができる。該塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列と比較して、４塩基が付加されている。
【００４３】
（1-2）4塩基付加
実施例８(1-1)と同様の方法で、配列番号1で示される塩基配列中のSphIを欠失させることができる。配列番号１で示される塩基配列を含むプラスミドpCR16G6PのDNA 2μgをSphI 20Uで消化し、さらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、前述と同様にフェノールクロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、沈澱をTE10μlに懸濁する。これを0.8%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約3kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Cと記す。）または約1.6kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Dと記す。）を含むゲルをそれぞれ切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりゲルに含まれるDNA断片を精製する。得られたDNA断片C 50ngおよびDNA断片D 100ngを混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、ライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。ベクターの配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、配列番号１で示される塩基配列に基き合成したオリゴヌクレオチドN、
オリゴヌクレオチドM;5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドN;5’―AGGAC GACTT AGGTG AATAC―3’(20mer)
を含むPCR反応液に、生育してきたコロニーの一部を懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。この反応液の一部を0.8%アガロース電気泳動に供して分画し、約1.6kbのDNA断片が増幅されているプラスミドを複数選抜する。選抜されたプラスミドを含有するクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB2mlに植え、37℃で1晩培養する。この培養液を遠心分離することにより集菌し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。該プラスミドDNAを制限酵素SphIで消化し、1.0%アガロース電気泳動に供して分画することにより、SphIの認識サイトを欠失したプラスミドを選抜する。このようなプラスミドが含有する本発明プロモーターの塩基配列として配列番号4で示される塩基配列を挙げることができる。該塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列と比較して、４塩基が付加されている。
また、上記のように調製された配列番号4で示される塩基配列からなる本発明プロモーターのDNAを用いて、実施例８（1-1）と同様の操作を行なうことによりさらにSacI認識サイトを欠失させた本発明プロモーターのDNAを調製することができる。
【００４４】
（1-3）4塩基欠失
実施例８（1-1）（1-2）と同様の方法で、配列番号1で示される塩基配列を含むプラスミドpCR16G6PのDNA 2μgをXbaI 20Uで消化し、さらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取する。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁する。このDNA溶液の一部を0.8%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約4.7kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Eと記す。）を含むゲルを切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりDNAを精製した。また、上記のDNA溶液の残りを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供して分画し、約250bpのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Fと記す。）を含むゲルを切り出し、該ゲルから前述と同様にプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。このようにして調製されたDNA断片E 50ng分、およびDNa断片F 20ngを混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、該ライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。生育してきたコロニーの一部を、ベクター上の配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、配列番号１で示される塩基配列に基き合成したオリゴヌクレオチドO、
オリゴヌクレオチドM；5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドO；5’―ATACA TCTTT TCAAA TTTCA―3’(20mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。この反応液の一部を4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画し、約250bpのDNA断片が検出されるクローンを複数選抜する。さらに選抜クローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB2mlに植え、37℃で1晩培養する。この培養液を遠心分離することにより集菌し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。該プラスミドDNAを制限酵素XbaIで消化し、4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供することにより、XbaIの認識サイトを欠失したプラスミドを取得する。このようなプラスミドが含有する本発明プロモーターの塩基配列として配列番号5で示される塩基配列を挙げることができる。該塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列と比較して、４塩基が欠失している。
上記のように調製された配列番号4で示される塩基配列からなる本発明プロモーターのDNAを用いて、実施例８（1-1）または（1-2）と同様の操作を行なうことにより、さらにSacI認識サイトまたはSacI認識サイトを欠失させることができる。
【００４５】
（２）発現ベクターの構築
発現ベクターの構築は実施例2と同様の方法で行なうことができる。実施例８（1-1）、（1-2）または（1-3）で得られる本発明プロモーターを含有するプラスミドをそれぞれ鋳型にして、クローニング用の制限酵素認識配列を有する下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TATTT AGAAT GTTAT TGCTG -3'（30mer）
を合成し、これをプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。増幅したDNA断片にHindIII 10U、XbaI 10Uを作用させて完全消化した後、0.8％アガロースゲル電気泳動に供して分画し、実施例８（1-1）または（1-2）で得られる本発明プロモーター含有プラスミドを鋳型に得られたDNA断片の場合は約1.7kbのサイズのDNA断片を含むゲルと約250bpのサイズのDNA断片を含むゲルとを切り出し、また、実施例８（1-3）で得られる本発明プロモーター含有プラスミドを鋳型に得られたDNA断片の場合は約2kbのサイズのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出して、これらに含まれるDNAをガラスビーズ（バイオラッド社製）を用いて精製する。ｐBIN19由来のベクターｐIG121HMのDNA2μgをHindIII 10U、XbaI 10Uで消化し、さらにアルカリフォスファターゼを作用させて脱リン酸化反応を行った後、前記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行ってDNAを回収する。該DNAと上記のゲルから回収されたDNA断片（約1.7kbおよび約250bp、または約2kb）とをライゲーションキット（宝酒造製）を用いてそれぞれライゲーション反応に供した後、大腸菌HB101株のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、該導入処理を行なった菌株をカナマイシン50μg/mlを含むLB培地上で培養する。生育してきたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素HindIII、XbaIで切断して0.8％アガロースゲル電気泳動に供して分析することにより、約2kbのDNA断片を含むプラスミドを選抜する。さらに選抜したプラスミドDNAを鋳型にして、前述のオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行い、約2kbのDNA断片が増幅されることを確認する。このようにして、β−グルクロニダーゼ遺伝子の上流に配列番号３、４または５で示される塩基配列を有するTiプラスミド発現ベクターを調製することができる。またさらに、該発現ベクターからノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（NOS-t）を切り出して、pBICR16G6PTまたはpBICR16G6PTΔに含有される本発明ターミネーターと入れ替えることにより、本発明ターミネーターを含む発現ベクターを構築することができる。前述のようにして作製される発現ベクターを含有するクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製する。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlを入れ、37℃、1晩振とう培養する。培養液を8000rpmで10分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製する。
【００４６】
実施例９（本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターへのGUS遺伝子の導入）
実施例7（１）と同様の方法で発現ベクターへのGUS遺伝子のクローニングを行なう。プラスミドpBI221（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20U、SacI 20Uで消化し、1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁する。該DNAにさらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、これに等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取する。この溶液から前述と同様にDNAをエタノール沈澱し、TE10μlに懸濁する。これを0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画した後、約1.7kbのサイズのGUS遺伝子を含むDNA断片を含むゲルを切り出し、該ゲルからプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。一方、pBluescriptKS−（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行う。該反応液を前述と同様にフェノール処理、エタノール沈澱した後、得られたDNAをTE10μlに懸濁する。このように調製したDNA50ngと前述のGUS遺伝子を含むDNA断片100ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させる。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。白色を呈したコロニーの一部を、ベクターの配列に基いて合成したオリゴヌクレオチドMおよびGUS遺伝子の配列に基いて合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドM;5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドK;5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。該PCR反応液を4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画した後、410bpのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜する。該プラスミドを含有するクローンの培養菌体を前述と同様にQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。このプラスミドDNA2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで消化した後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画し、約1.7kbのDNA断片が含まれるゲルを切り出し、該ゲルからプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。実施例6（４）記載のpBICR16G6PTのDNA 2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行う。該反応液を前述と同様の方法でフェノール処理、エタノール沈澱後、沈殿したDNAをTE10μlに懸濁した。このように調製したDNA50ngと前述のように精製した約1.7kbのDNA断片20ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させる。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。白色を呈したコロニーの一部を、オリゴヌクレオチドU、およびGUS遺伝子の配列に基いて合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドU；5’―GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC―3’(34mer)
オリゴヌクレオチドK；5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。該PCR反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画した後、約1.1kbのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜する。選抜されたプラスミドをpBICR16G6PTGと名付けた。該プラスミドを含有するクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製する。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlに添加し、37℃、1晩振とう培養する。培養液を8000rpmで10分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製する。
このようにして調製されるプラスミドpCR16G6PTGまたは実施例７（１）のように構築されたプラスミドpCR16G6PTΔGから、配列番号１で示される塩基配列を有する本発明プロモーターを切り出して、該プロモーターの替りに、実施例８記載の本発明プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Nature, 313:810-812）またはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Nucleic Acid Research,11(2):369-385(1983)）を挿入することもできる。
【００４７】
実施例１０（発現活性測定）
（１）トランスジェニック植物を用いた発現活性測定
実施例２（２）に準じて、タバコ葉切片に実施例８または９のように構築された発現プラスミドを導入したアグロバクテリウム菌を感染させ、植物体を再生させることにより、トランスジェニックタバコを作製することができる。得られたトランスジェニックタバコから、実施例3に準じてゲノムDNAを抽出し、該ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応を行うことにより、GUS遺伝子の導入を確認することができる。該遺伝子の導入が確認できたクローンを用いて、実施例4に準じてGUS染色、GUS活性測定を行なうことにより、実施例８または９で構築された発現ベクターに含まれるプロモーターおよびターミネーターの活性を確認することができる。
【００４８】
（２）パーティクルガンによる導入遺伝子の発現測定
実施例８または９のように調製されたプラスミドを、実施例5に準じて、森川らの遺伝子銃（C.M.Particle Gun System、レーボック商工製）を用いることによりダイズの不定胚または未熟種子または展開葉またはニンジンの根部等の植物組織に撃ち込むことができる。対照としては、pBI221（クロンテック社製）またはpBI121（クロンテック社製）を用いることができる。上記のプラスミドを撃ち込んだ後、25℃で24時間静置培養し、GUS染色液に浸して37℃で1晩保温する。次いで、その染色スポットを観察することにより、実施例８または９で構築された発現ベクターに含まれるプロモーターおよびターミネーターの活性を確認することができる。尚、ダイズ展開葉を用いた場合は、保温後の展開葉を100％エタノールに浸し、脱色を行った後、上記と同様にその染色スポットを観察することにより、実施例８および2で構築した発現ベクターに含まれるプロモーターおよびターミネーターの活性を確認することができる。
【００４９】
実施例において用いられた培地の組成を以下に示す。
（1）タバコ用培地
▲１▼MS 寒天培地
MURASHIGE AND SKOOG BASAL MEDIUM(SIGMA社製)4.4g、ショ糖30gを蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOH で pH 5.8 に調製し、アガー（和光純薬）を8g 添加した後、オートクレーブ滅菌した。
▲２▼MS-NB寒天培地
MS寒天培地に、1-ナフタリン酢酸（NAA）0.1 μg/ml 、6-ベンジルアミノプリン（BA）1.0 μg/mlを添加した培地である。
▲３▼MS-NBC寒天培地
MS-NB寒天培地に、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
▲４▼MS-NBCK寒天培地
MS-NB寒天培地に、カナマイシン100μg/ml、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
▲５▼MS-CK寒天培地
MS寒天培地にカナマイシン100μg/ml、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
（2）アラビドプシス用培地
▲１▼MS 寒天培地
MURASHIGE AND SKOOG BASAl MEDIUM(SIGMA社製)4.4g、ショ糖20gを蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOH で pH 6.3 に調製し、ジェランガム（和光純薬製）を2g 添加した後、オートクレーブ滅菌した。
▲２▼CIM寒天培地
MS 寒天培地に、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）0.5μg/ml、カイネチン0.05μg/mlを添加した培地である。
▲３▼SIMC寒天培地
MS 寒天培地にN6-［２-イソペンテニル］アデニン（2-iP）5μg/ml、インドール酢酸（IAA）0.15μg/ml、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
▲４▼SIMCH寒天培地
SIMC培地にハイグロマイシン20μg/mlを添加した培地である。
（3）細菌、ファージ用培地
▲１▼L-培地
バクトトリプトン（Difco社製）10g、バクトイーストエキストラクト（Difco社製）5g、NaCl 10gを蒸留水 1 L に溶かし、5M NaOH で pH 7.0 に調製し、オートクレーブ滅菌する。プレートの場合はこれに15gの寒天を添加する。
▲２▼YEB培地
バクトビーフエキストラクト（Difco社製）5g、バクトイーストエキストラクト（Difco社製）1g、ポリペプトン5g、ショ糖5g、10M NaOH 0.2mlを 蒸留水 1 Lに溶かし、オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ後、フィルター滅菌した1M MgSO4を0.2ml添加して用いる。プレートの場合はこれに15gの寒天を添加する。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子を植物の細胞内で効率よく発現させることの可能なプロモーターおよびターミネーターが提供可能となる。
【００５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明プロモーターを含有するプラスミドpCR16G6Pの制限酵素地図を示す図である。Promoterは本発明プロモーターを示す。また、Ampはアンピシリン耐性遺伝子、lacIはラクトースオペロンのリプレッサータンパク質遺伝子、lacZはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ORIは複製開始点を表す。
【図２】本発明ターミネーターを含有するプラスミドpCR16G6Tの制限酵素地図を示す図である。Terminatorは本発明ターミネーターを示す。また、Ampはアンピシリン耐性遺伝子、lacIはラクトースオペロンのリプレッサータンパク質遺伝子、lacZはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ORIは複製開始点を表す。
【図３】本発明プロモーターを挿入した発現ベクターｐBICR16G6Pの制限酵素地図およびその構築過程を示す図である。G6-pは本発明プロモーターを示す。nos-pはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、nos-tはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、35S-pはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子、GUSはβ−グルクロニダーゼ遺伝子、HPTはハイグロマイシン耐性遺伝子を表す。
【図４】本発明プロモーター、本発明ターミネーターを挿入した発現ベクターpBICR16G6PTΔGの制限酵素地図およびその構築過程を示す図である。G6-pは本発明プロモーターを示す。G6-tおよびG6-t'は本発明ターミネーターを示す。RB、LBはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。GUSはβ-グルクロニダーゼ遺伝子を表わす。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物プロモーターおよび植物ターミネーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の細胞へ遺伝子を導入し発現させることによって、有用形質を付与した種々の形質転換植物の作出が試みられ、一部で実用化されるに至っている。このような形質転換植物を作出するには、植物の細胞内に導入した遺伝子を効率よく発現させることが重要である。プロモーターは細胞内での遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一般に目的遺伝子を転写活性の強いプロモーターの制御下におくことにより該遺伝子の発現量を高めることができる。また、ターミネーターは転写終結を指令する役割に加えて、転写により生じたＲＮＡ鎖のプロセシングや分解に対しても重大な影響を示すことから、目的遺伝子の翻訳領域の３’末端直後にターミネーターを挿入しておくと該遺伝子の発現量増大に効果的である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような遺伝子導入による植物育種に使用し得る植物プロモーターおよびターミネーターはその種類が未だ十分とは言い難く、遺伝子を植物の細胞内で効率よく発現させることの可能な新たなプロモーターおよびターミネーターの開発が強く望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは植物の細胞内で機能可能なプロモーターおよびターミネーターについて鋭意検討を行った結果、特定の塩基配列を有するＤＮＡを使用することにより、植物の葉、根などの組織において目的遺伝子を効率よく発現させることができることを見い出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
１）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含む植物プロモーター；
（ａ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてプロモーター機能を有するＤＮＡ（以下、本発明プロモーターと記す。）、
２）該プロモーター、所望の遺伝子および植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるキメラ遺伝子、
３）該プロモーターを有するベクター、
４）該プロモーターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体、
５）形質転換植物の製造過程において、該プロモーターを植物細胞に導入し該プロモーターの制御下に遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とする形質転換植物の作製方法、
６）（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを含む植物ターミネーター；
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号２で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてターミネーター機能を有するＤＮＡ（以下、本発明ターミネーターと記す。）を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、さらに詳細に本発明を説明する。
本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、たとえば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラークローニング第 2 版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）、1989年及び D.,M.,Glover著、DNA クローニング（DNA Cloning）、IRL発行、1985年などに記載されている通常の方法に準じて行うことができる。
【０００６】
本発明において、「プロモーター機能」とは、プロモーターとして作用する能力、すなわち、遺伝子の転写を開始する作用を意味し、「植物プロモーター」とは、植物においてプロモーター機能を有するＤＮＡをいう。
本発明プロモーターは、具体的には、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ（以下、本プロモーターＤＮＡと記す。）を含む。
（ａ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてプロモーター機能を有するＤＮＡ
前記の塩基の欠失、置換または付加には、ＤＮＡの取得源に用いられた生物の種差、系統差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、ＤＮＡに人為的に導入された変異等が含まれる。本プロモーターＤＮＡには、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、植物細胞におけるプロモーター機能を有するかぎりその一部の塩基が欠失された塩基配列からなるＤＮＡも含まれる。かかるＤＮＡは、自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が導入されたＤＮＡであっても、人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
【０００７】
本プロモーターＤＮＡは、例えば、Daucus carotaなどのニンジンのゲノムＤＮＡ等からＰＣＲ法を利用して単離することができる。
例えば、Daucus carota等のニンジンの葉などの組織を採取し、得られた組織を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などにより物理的に磨砕することにより細かい粉末状の組織片とする。該組織片から通常の方法によりゲノムDNAを抽出する。該抽出操作は、例えば、M.Shure et al, Cell, 35:225(1983)等に記載されているCTAB法、S.O.Rogers and A.J.Bendich, Plant.Mol.Biol., 5:69(1985)等に記載されている尿素−フェノール法などにより行なうことができる。得られたゲノムDNAを鋳型として、例えば、配列番号１または配列番号７の塩基番号１から２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１または配列番号７の塩基番号２０２９から２０５２で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、1回〜数回のPCRを行うことにより、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを増幅することができる。尚、このようなプライマーに用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列に基いて適宜設計することができ、また、その5'末端側に、制限酵素認識配列等を付加してもよい。
上記のようにして増幅されたDNAは、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には、例えばInvitrogen社のTAクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやStratagene社のpBluescriptIIなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。クローニングされたDNAの塩基配列は、F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A．(1977), 74, 5463頁-5467頁等に記載されるダイデオキシターミネーティング法などにより分析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitなどの市販の試薬を用いてもよい。
上述のようにして得られるＤＮＡの下流にレポーター遺伝子、例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子を連結し、これを必要に応じてベクターにクローニングして、後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌感染法などの方法を用いて、例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２などの植物培養細胞に導入する。次いで、該培養細胞の細胞抽出液を調製してそのβ−グルクロニダーゼ活性を酵素学的手法により測定し該活性値を指標にするか、または、該培養細胞を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察し色素の沈着度を指標にすることにより、上記ＤＮＡのプロモ−ター機能の有無を確認し、本プロモーターＤＮＡを得ることができる。また、同様にして、レポーター遺伝子に連結されてなる上記ＤＮＡを、例えばタバコ野性株細胞などの植物細胞に導入してこの細胞から植物体を再生させ、該植物体もしくはその子孫の各組織におけるβ−グルクロニダーゼ活性を測定するか、または、該植物体もしくはその子孫の各組織もしくはその切片を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察することにより、上記ＤＮＡのプロモーター機能を調べ、本プロモーターＤＮＡを得ることもできる。尚、レポーター遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ遺伝子に限らず、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレセイントプロテイン遺伝子等を使用することもできる。
【０００８】
また、本プロモーターＤＮＡは、例えば、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡを標識し、これをプローブに用いて植物等由来のＤＮＡにハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合したＤＮＡを検出しクローニングすることにより取得することもできる。
ここで、前記プローブをハイブリダイズさせるＤＮＡとしては、例えば、ニンジンなどの植物由来のゲノムDNAライブラリー等を使用することができる。該DNAライブラリーには、市販のゲノムDNAライブラリーを用いることもできるし、また「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Pressや「Current Protocols In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常のライブラリー作製法に従い、例えば、STRATAGENE社のλ FIX II、λ EMBL3、λ EMBL4、λ DASH II等のλベクターを用い、STRATAGENE社のGigapack packaging Extracts等をin vitroパッケージングに用いてゲノムDNAライブラリーを作製し、これを用いることもできる。
このようなＤＮＡにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションをあげることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるライブラリーがプラスミドベクターで構築されたライブラリーである場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行なう。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで37℃で培養を行う。また、使用されるライブラリーがファージベクターで構築されたライブラリーである場合には、プラークハイブリダイゼーションを行なう。具体的にはまず、宿主微生物とライブラリーのファージを感染可能な条件下で混合した後さらに軟寒天培地と混合し、これを寒天培地上にまく。その後プラークが現れるまで37℃で培養を行う。より具体的には、例えば、 Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.65等に記載されている方法に準じて、NZY寒天培地に寒天培地1mm2当り0.1〜1.0pfuの密度で、約9.0×105pfuのファージライブラリーを広げ、37℃で6〜10時間培養する。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーション法の場合も、前述の培養を行なった寒天培地の表面にメンブレンフィルターをのせ、プラスミドを保有する形質転換体やファージを該メンブレンフィルターに転写する。このメンブレンフィルターをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、DNAを該フィルターに固定する処理を行なう。より具体的には例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）等に記載の通常の方法に準じて、前記寒天培地の上にニトロセルロースフィルター又はナイロンフィルター等、例えば、Hybond-N+（アマシャム社製）を置き、約1分間静置してファージ粒子をメンブレンフィルターに吸着させる。次に、該フィルターをアルカリ溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5N NaOH）に約3分間浸してファージ粒子を溶解させてファージDNAをフィルター上に溶出させた後、中和溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5M トリス-塩酸緩衝液、pH7.5）に約5分間浸す処理を行う。該フィルターを洗浄溶液（300mM 塩化ナトリウム、30mM クエン酸ナトリウム、200mM トリス-塩酸緩衝液）で約5分間洗った後、例えば、約80℃で約90分間ベーキングすることによりファージDNAをフィルターに固定する。
このように調製されたフィルターを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、D.M.Glover編「DNA cloning, a practical approach」 IRL PRESS （1985） ISBN 0-947946-18-7、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）、または、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）等の記載に準じて行なうことができる。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー社、宝酒造社製のRandom Labelling Kit等を用いることができ、通常のPCR反応組成中のdCTPを［α−32Ｐ］dCTPに替えて、プローブに用いるDNAを鋳型にしてPCR反応を行うことにより、標識を行うこともできる。また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、アマシャム社製のECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection System等を用いることができる。ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例えば、450〜900mMの塩化ナトリウム、45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を0.1〜1.0％の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1%のSDS、100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むプレハイブリダイゼーション溶液を、上記のようにして作製したフィルター1cm2当り50〜200μlの割合で準備し、該溶液に前記フィルターを浸して42〜68℃で1〜4時間、好ましくは、45℃で2時間保温する。次いで、例えば、450〜900mMの塩化ナトリウム、45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、SDSを0.1〜1.0％の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1%のSDS、100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（フィルター1cm2当り1.0×104〜2.0×106cpm相当量）とを混合した溶液をフィルター1cm2当り50〜200μlの割合で準備し、該溶液にフィルターを浸し42〜68℃で4〜20時間、好ましくは、45℃で16時間保温しハイブリダイゼーション反応を行う。該ハイブリダイゼーション反応後、フィルターを取り出し、15〜300mMの塩化ナトリウム、1.5〜30mMのクエン酸ナトリウム、0.1〜1.0%のSDS等を含む42〜68℃の洗浄溶液等、好ましくは、300mMの塩化ナトリウム、30mMのクエン酸ナトリウム、1%のSDSを含む55℃の洗浄溶液で、10〜60分間のフィルター洗浄を1〜4回、好ましくは15分間の洗浄を2回行う。さらに、フィルターを2×SSC溶液（300mM 塩化ナトリウム、30mM クエン酸ナトリウム）で軽くすすいだのち乾燥させる。このフィルターを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してフィルター上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするDNAのフィルター上の位置を検出する。検出されたDNAのフィルター上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該DNAを有するクローンを単離することができる。具体的には例えば、フィルターをイメージングプレート（富士フィルム）に4時間露光させ、次いで該プレートをBAS2000（富士フィルム）を用いて解析し、シグナルを検出する。フィルターの作製に用いた寒天培地のうち、シグナルが検出された位置に相当する部分を約5mm角にくり抜き、これを約500μlのSMバッファー（50mM トリス-塩酸緩衝液 pH7.5、0.1M 塩化ナトリウム、7mM硫酸マグネシウム、0.01%ゼラチン）に2〜16時間、好ましくは3時間浸してファージ粒子を溶出させる。得られたファージ粒子溶出液をMolecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.65に記載の方法に準じて寒天培地に広げ、37℃で6〜10時間培養する。この寒天培地を用いて前述の方法と同様の方法でファージDNAをフィルターに固定し、このフィルターと前述のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。フィルターの作製に用いた寒天培地のうちの、シグナルが検出された位置に相当する部分からファージ粒子を溶出し、これを寒天培地に広げ、前述の方法と同様にフィルターを作製し、ハイブリダイゼーションを行う。このようなファージクローンの特定と純化を繰り返すことにより、用いたプローブとハイブリダイズする塩基配列を有するDNAを含むファージクローンが得られる。
前述のようなハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行うことにより得られたクローンの保有するＤＮＡは、DNA 調製や解析が容易なプラスミドベクター、例えば市販のpUC18、pUC19、pBLUESCRIPT KS+、pBLUESCRIPT KS- 等にサブクローニングして、プラスミドDNAを調製し、F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A． (1977),74,5463頁-5467頁等に記載されるダイデオキシターミネーティング法を用いてその塩基配列を決定することができる。塩基配列分析に用いる試料の調製は、例えば、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）13.15等に記載されているプライマーエクステンション法に準じて行うことができる。また、ファージクローンをMolecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）2.60から2.65等に記載の方法に準じてNZYM液体培地で増幅し、ファージ液を調製して、これから例えば、Lambda-TRAP PLUS DNA Isolation Kit（Clontech社製）等を用いてファージクローンDNAを抽出し、該DNAを鋳型として、例えば、前述のプライマーエクステンション法により塩基配列分析用の試料を調製し、塩基配列を分析することもできる。
このようにして得られるＤＮＡのプロモーター機能を上述のようにして調べることにより、本プロモーターＤＮＡが得られる。
【０００９】
本プロモーターDNAは、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡの塩基配列に変異を導入することによっても取得され得る。具体的には、例えば、A.Greener, M.Callahan、Strategies、1994年、7巻、32-34頁等に記載される方法により、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡにランダムに変異を導入してもよいし、W.Kramer,et al.、Nucleic Acids Research、1984年、12巻、9441頁もしくはW. Kramer,H.J.Frits、Methods in Enzymology、1987年、154巻、350頁等に記載のギャップド・デュープレックス（gapped duplex）法、または、T.A.Kunkel、Proc. of Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1985年、82巻、488頁もしくはT.A.Kunkel,et al.、Methods in Enzymology、1987年、154巻、367頁等に記載のクンケル（Kunkel）法等に準じて、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡに部位特異的に変異を導入してもよく、あるいは、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列の一部において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行ない、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを増幅することもできる。また、配列番号1または配列番号７で示される塩基配列のうち1ヶ所ないし数カ所の部分塩基配列を、他のプロモーターの塩基配列の一部と入れ換えたキメラＤＮＡを作製してもよく、例えば、S.Ｈenikoff,et al.、Gene、1984年、28巻、351頁、C.Yanisch-Perron,et al.、Gene、1985年、33巻、103頁等に記載された方法により、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列の一部を欠失した塩基配列を有するＤＮＡを調製してもよい。このようにして得られるＤＮＡのプロモーター機能を上述のようにして調べることにより、本プロモーターＤＮＡが取得され得る。
【００１０】
本発明プロモーターは、前述のようにして得られる本プロモーターＤＮＡのうち前記（ａ）、（ｂ）のＤＮＡのいずれか一方を含んでいてもよいし、（ａ）、（ｂ）を共に含んでいてもよく、また、これらを反復して含んでいてもよい。
さらに、本発明プロモーターは、植物において遺伝子の転写効率を増大させる効果を有する塩基配列を含んでいてもよい。該塩基配列としては、植物において、例えば、種特異的、組織特異的または時期特異的にその転写効率増大効果を示す配列であってもよく、病原微生物の感染や、光、熱、乾燥、塩または傷害などのストレス等によりその転写効率増大効果が誘導される配列であってもよい。植物において遺伝子を転写する効率を増大させる効果を有する塩基配列の具体例としては、例えば、アグロバクテリウムのオクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流333番目の塩基から同じく116番目の塩基までの領域の下流に、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流318番目の塩基から同じく138番目の塩基までの領域が連結されてなる転写翻訳活性化配列、マンノピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流318番目の塩基から同じく213番目の塩基までの領域の下流に、オクトピン合成酵素遺伝子の転写開始点の上流333番目の塩基から同じく116番目の塩基までの領域が連結されてなる転写翻訳活性化配列（The Plant Journal, 7(4):661-676(1995)）、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの転写開始点の上流343番目の塩基から同じく91番目の塩基までを含む塩基配列（Nature, 313:810-812(1985)）、トマトのリブロースー１，５―二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子（rbc-3A）の転写開始点の上流1099番目の塩基から同じく205番目の塩基までを含む塩基配列（Plant Cell, 1:217-227(1990)）、タバコのPR1a遺伝子の転写開始点の上流902番目の塩基から同じく287番目の塩基までを含む塩基配列（Plant Cell, 2:357-366(1990)）、ジャガイモのプロテアーゼインヒビター遺伝子（PI-II）の転写開始点の上流1300番目の塩基から同じく195番目の塩基までを含む塩基配列（Plant Cell, 2:61-70(1990)）等があげられる。
【００１１】
また、本発明プロモーターは、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列に含まれる植物において転写効率増大効果を有する塩基配列も含み得る。さらに、かかる塩基配列を同定し、例えば、該塩基配列を反復して含む本発明プロモーターを作製することもできるし、植物細胞においてプロモーター機能を有する他のＤＮＡと該塩基配列とを連結することにより、新たな植物プロモーターを作出することもできる。該塩基配列を同定するには、例えば、植物細胞において種々の本プロモーターＤＮＡの制御下にレポーター遺伝子を発現させ、その発現量を比較することにより、転写効率増大効果に寄与する塩基配列を解析するとよい。より具体的には、例えば、配列番号１または配列番号７で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失もしくは置換された塩基配列からなるＤＮＡを複数調製し、それぞれの下流にレポーター遺伝子、例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子を連結し、これらを後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌感染法などの方法を用いて、例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２などの植物培養細胞に導入する。次いで、該培養細胞の細胞抽出液を調製してそのβ−グルクロニダーゼ活性を酵素学的手法により測定し該活性値を指標にするか、または、該培養細胞を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察し色素の沈着度を指標にして、各細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を比較し、その結果をレポーター遺伝子と連結された上記ＤＮＡの塩基配列と対比することにより、転写効率増大効果に寄与する塩基配列を明らかにすることができる。また、同様にして、レポーター遺伝子に連結されてなる上記ＤＮＡを、例えばタバコ野性株細胞などの植物細胞に導入してこの細胞から植物体を再生させ、該植物体またはその子孫の各組織におけるβ−グルクロニダーゼ活性を測定するか、または、該植物体またはその子孫の各組織またはその切片を、５−ブロモ−４―クロロ−３―インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察することにより、上記各ＤＮＡにより制御されたレポーター遺伝子の発現量を比較し、転写効率増大効果に寄与する塩基配列を明らかにすることもできる。
【００１２】
本発明において、「ターミネーター機能」とは、ターミネーターとして作用する能力、すなわち、遺伝子の転写の終結を指令する作用を意味し、「植物細胞内で機能可能なターミネーター」とは、植物においてターミネーター機能を有するＤＮＡをいう。本発明ターミネーターは、具体的には、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡ（以下、本ターミネーターＤＮＡと記す。）を含む。
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列において1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であって、配列番号２で示される塩基配列のうちの250bp以上からなる任意の領域における塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、植物細胞においてターミネーター機能を有するＤＮＡこのような塩基の欠失、置換または付加には、ＤＮＡの取得源に用いられた生物の種差、系統差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、ＤＮＡに人為的に導入された変異等が含まれる。かかるＤＮＡは、自然界からクローニングされたＤＮＡであっても、自然界からクローニングされたＤＮＡに塩基の欠失、置換または付加が導入されたＤＮＡであっても、人為的に化学合成されたＤＮＡであってもよい。
【００１３】
本ターミネーターＤＮＡは、配列番号２で示される塩基配列に基いて、上述の本プロモーターＤＮＡの取得方法に準じて取得することができる。具体的には、例えば、ニンジン等の植物由来のゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号２の塩基番号１から２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基番号８２７から８５１で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、1回〜数回のPCRを行う方法をあげることができる。
尚、本ターミネーターＤＮＡの植物細胞におけるターミネーター機能を確認するには、例えば、植物細胞内で機能可能なプロモーター、レポーター遺伝子、例えばβ−グルクロニダーゼ遺伝子および本ターミネーターＤＮＡをβ−グルクロニダーゼ遺伝子が発現可能な形で連結し、一方、対照として、前記プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を同様に連結し、これらをそれぞれ、後述するパーティクルガン法、アグロバクテリウム菌法などを用いて、例えばタバコ培養細胞ＢＹ−２などの植物培養細胞に導入する。次いで、それぞれの細胞の細胞抽出液を調製してそのβ−グルクロニダーゼ活性を測定し該活性値を指標にするか、または、該細胞を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察し色素の沈着度を指標にすることにより、プロモーター、β−グルクロニダーゼ遺伝子および本ターミネーターＤＮＡを連結して導入した植物細胞において、対照よりβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現量が高いことを確認する。また、同様にして、植物細胞内で機能可能なプロモーター、β−グルクロニダーゼ遺伝子および本ターミネーターＤＮＡを連結し、一方、対照として、前記プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を同様に連結し、これらをそれぞれ、タバコ野生株細胞などの植物細胞に導入して該細胞から植物体を再生させる。再生した植物体またはその子孫の各組織におけるβ−グルクロニダーゼ活性を測定するか、または、該植物体またはその子孫の各組織またはその切片を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を添加した染色液中に浸して青色色素の沈着を観察することにより、本ターミネーターＤＮＡの機能を調べることができる。
【００１４】
本発明プロモーターを用いて所望の遺伝子を植物細胞内で発現させるには、本発明プロモーター、所望の遺伝子および植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなる遺伝子（以下、本発明キメラ遺伝子と記す。）を利用するとよい。ここで、所望の遺伝子とは、植物で発現させようとする遺伝子であって、例えば、酵素、貯蔵タンパク質、受容体、転写調節因子、シグナル伝達因子などのタンパク質をコードする遺伝子があげられ、これらの遺伝子は本発明プロモーターの下流に目的に応じてセンスまたはアンチセンス方向に結合するとよい。植物ターミネーターとしては、例えば、アグロバクテリウム属細菌のTi-プラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（NOS)、ニンニクウイルスGV1,GV2等の植物ウイルス由来のターミネーターなどを挙げることができ、本発明ターミネーターを用いることもできる。また、本発明キメラ遺伝子は、本発明プロモーターの塩基配列、またはその一部を反復した形で含んでいてもよい。尚、「機能可能な形で」とは、本発明キメラ遺伝子を導入し植物細胞を形質転換させたときに、該キメラ遺伝子に含まれる目的の遺伝子が、本発明プロモーターおよび植物ターミネーターの制御下に発現するように、これらのプロモーターおよびターミネーターと結合された状態にあることを意味する。
【００１５】
本発明プロモーターを有するベクターにおいて、ベクターとは、細胞内で増殖可能なDNAであって、大腸菌、酵母、植物細胞、動物細胞等の細胞内で増幅可能なプラスミド、ファージ、ファージミッド等があげられ、宿主細胞や用途に応じて選択する。具体的には、例えば、pUC系プラスミド[pUC118,pUC119（宝酒造社）など]、pSC101系プラスミド、Ti-プラスミド[pBI101,pBI121（CLONTECH社）など]、ブルースクリプト系ファージミッド[pBluescript SK(+/-)(STRATAGENE社)など]、M13系ファージ[mp10,mp11(Amersham社)など]、λ系ファージ[λgt10,gt11(Amersham社)など]、コスミッド類[SuperCosI(STRATAGENE社)など]等が挙げられ、この様なベクターに本発明プロモーターを組み込むことにより、本発明プロモーターを有するベクターを構築することができる。
前記のような本発明プロモーターを有するベクターにおいて、該プロモーターの下流に遺伝子挿入部位および植物ターミネーターがさらに有ると、所望の遺伝子を植物細胞内で発現させるためのベクターの構築等に好ましく利用できる。ここで遺伝子挿入部位とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、本発明プロモーターおよび植物ターミネーターを有するベクター上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましい。この様な遺伝子挿入部位、本発明プロモーターおよび植物ターミネーターは、該遺伝子挿入部位へ所望の遺伝子が挿入された際に、ベクター上で本発明プロモーター、所望の遺伝子および植物ターミネーターが機能可能な形で連結されるような位置にあることが好ましい。かかるベクターは、例えば、遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを含むプラスミド、具体的には、pBI101.3（CLONTECH社製）等のマルチクローニング部位（遺伝子挿入部位）に、本発明プロモーターのＤＮＡを挿入することにより構築することができる。また、遺伝子挿入部位を有するベクター、具体的には、pBIN19(Nucl.Acid Res. 12:8711-8721(1984))等のマルチクローニング部位（遺伝子挿入部位）に本発明プロモーターと植物ターミネーターを挿入することによっても構築することができる。
本発明キメラ遺伝子を有するベクターは、該キメラ遺伝子の宿主細胞への導入に好ましく使用することができ、例えば、該キメラ遺伝子を上記のようなベクターにクローニングするか、または、本発明プロモーター、遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを有する上記のようなベクターの遺伝子挿入部位に所望の遺伝子をクローニングすることにより調製することができる。例えば、pBI101.3(CLONTECH社製)を用いて作製した上記のようなベクターを制限酵素を用いて切断することにより該ベクター上に存在するレポーター遺伝子（β-グルクロニダーゼ遺伝子）を除去し、該レポーター遺伝子に換えて所望の遺伝子を挿入することによって、本発明キメラ遺伝子を有するベクターを調製することができる。
上述のような本発明のベクターは、本発明プロモーター、発現させようとする所望の遺伝子や植物ターミネーターの他に、該ベクターが導入された宿主細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、植物に除草剤耐性を付与し得る遺伝子等）を含んでいてもよい。また、該ベクターは、本発明プロモーターの塩基配列を反復した形で含んでいてもよい。
【００１６】
本発明のベクターは、例えば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラー・クローニング第２版（１９８９）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）等に記載の塩化カルシウム法、エレクトロポーレーション法等により大腸菌やアグロバクテリウム菌に導入することができ、本発明ベクターの導入されたかかる微生物細胞（形質転換体）は、本発明キメラ遺伝子ＤＮＡの調製や該キメラ遺伝子の植物細胞への導入等に有用である。
また、本発明プロモーターをコードするＤＮＡや本発明キメラ遺伝子のＤＮＡは、パーティクルガン法（パーティクルガンによる植物組織または培養細胞への直接導入法）等により、植物細胞に導入することができる。また、本発明のベクターは、例えば、アグロバクテリウム菌感染法（アグロバクテリウム菌を植物組織に感染させる方法）、電気的導入法（エレクトロポーレーション法やプロトプラストへの電気的導入法）、またはパーティクルガン法等の公知の方法により植物細胞に導入することができる。
【００１７】
本発明プロモーター、本発明キメラ遺伝子や本発明ベクターを導入し、本発明プロモーターの制御下に遺伝子を発現させることができる植物種としては、例えば、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等の単子葉植物、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等のマメ科植物、タバコ、トマト、ジャガイモ等のナス科植物、キャベツ、ナタネ、カラシナ等のアブラナ科植物、メロン、カボチャ、キュウリ等のウリ科植物、ニンジン、セロリ等のセリ科植物、レタス等のキク科植物等の双子葉植物を挙げることができる。
本発明プロモーター、本発明キメラ遺伝子または本発明のベクターを上記のように植物の細胞へ導入し形質転換体を得ることにより、例えば、本発明プロモーターがゲノムＤＮＡ上の所望の遺伝子の上流に挿入され該遺伝子を本発明プロモーターの制御下に発現する植物細胞、本発明キメラ遺伝子がゲノムＤＮＡ上に挿入され該キメラ遺伝子に含まれる遺伝子を本発明プロモーターの制御下に発現する植物細胞、本発明キメラ遺伝子を有するベクターを細胞内に有し該キメラ遺伝子に含まれる遺伝子を本発明プロモーターの制御下に発現する植物細胞などが得られる。
上記のような形質転換された植物細胞は、例えば、S.B.Gelvin, R.A.Schilperoot and D.P.S.Verma著：プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル（Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers press (1988)）、島本功、岡田清孝監修：モデル植物の実験プロトコール（イネ、シロイヌナズナ編）（秀潤社）(ISBN4-87962-157-9 C3345,1996)78-143頁あるいは内宮博文著（植物遺伝子操作マニュアル、トランスジェニック植物の作り方（講談社サイエンティフィック））1990, ISBN4-06-153513-7 C3045)28-33頁に記載されている通常の植物組織培養技術において用いられる方法に準じて再分化することによって、該植物細胞由来の形質転換された植物体またはその一部を得ることができる。さらに、前記のようにして得られる植物体を栽培し自殖させることにより、該植物体の子孫が得られる。
尚、上述のような形質転換された植物細胞や植物体より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを制限酵素で切断し、宿主細胞の形質転換に用いたDNAまたはその一部をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、遺伝子導入の有無を確認することができる。また、かかる植物細胞や植物体より、常法に従ってRNAを抽出し、本発明プロモーターの制御下に発現させようとする目的の遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡをプローブに用いてノザンハイブリダイゼーションを行うことにより、目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。
【００１８】
本発明プロモーターの制御下に特定の遺伝子をセンス方向に連結し植物で発現させることにより、植物に有用な形質を付与することができる。例えば、フェニールアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子（PAL）、カルコンシンターゼ遺伝子（CHS）、キチナーゼ遺伝子（CHT）、リゾチーム遺伝子もしくはPRタンパク質遺伝子等の植物防御遺伝子、Pto遺伝子等の病害抵抗性遺伝子、ウイルスコートタンパク質遺伝子またはBT(Bacillus thuringiensis )殺虫タンパク質遺伝子等を発現させることにより、植物組織において細菌、カビ、ウイルス、昆虫等に対する抵抗性を増強することができる。また、例えば、ダイズのグリシニン遺伝子、β-コングリシニン遺伝子等の貯蔵タンパク質遺伝子を発現させることにより、飼料作物における種々のタンパク質含量や必須アミノ酸含量を増加させることができ、ブラジルナッツの2Sアルブミン遺伝子、トウモロコシやイネの10kDa及び15kDaタンパク質遺伝子等を発現させることにより、飼料作物のメチオニン含量あるいはリジン含量を増加さることができ、大腸菌等の微生物由来のbioA、bioB、bioC、bioD、bioF、bioH 酵素遺伝子等のビオチン生合成関連酵素遺伝子を発現させることにより、飼料作物におけるビオチン含量を増加させることができ、さらにステアロイル-ACP-デサチュレース、アシル-ACP-チオエステラーゼ、3-ホスフェートアシルトランスフェラーゼ遺伝子等を発現させることにより、脂質の酸化安定性の向上、リン脂質の減少及びオレイン酸とリノレン酸の増加による脂質の改良が可能となり、アシルトランスフェラーゼ遺伝子等を発現させることにより、不飽和脂肪酸の割合を増加させ低温に対する抵抗性を増大させることができる。また、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性に関与する遺伝子を発現させることにより、形質転換体の選択に有用な抗生物質耐性を付与することもできる。さらに、例えば、L-ホスフォノスリシンアセチル化酵素(PAT)もしくはプロトポルフィリノーゲン酸化酵素（PPO）遺伝子等の除草剤抵抗性に関与する遺伝子を発現させることにより、除草剤抵抗性作物を作出することもできる。
一方、本発明プロモーターの制御下に特定の遺伝子をアンチセンス方向に連結し植物細胞内で発現させることにより、植物に有用な形質を付与することもできる。例えば、イネのイソメラーゼ（Isomerase）などのアミロペクチン分解酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現させることによりイネ種子中のデンプン成分を改良することができ、カボチャ等の1-アミノシクロプロパン-1-カルボキシレート（ACC）合成酵素などのエチレン合成酵素遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現させることにより果物、花などの保存性を向上することができ、また、トマトのポリガラクチュロナーゼ遺伝子のアンチセンス遺伝子を発現させることにより果物の保存性を向上することができる。
さらに、植物の自家不和合性に関与しているS-ローカス型特異的RNase遺伝子等の雄性不稔関連遺伝子のセンスまたはアンチセンス遺伝子を発現させることにより、植物の稔性を制御することもできる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1 （本発明プロモーター、本発明ターミネーターの単離）
ニンジン葉部より調製したゲノムDNAを用いてインバース・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（インバースＰＣＲ）を行い、本発明プロモーター、本発明ターミネーターを取得した。以下にその方法について説明する。
（1）ニンジンゲノムDNAの調製
播種後6週目のニンジン葉部10gを液体窒素中で磨砕し、5mlの2xCTAB液（2% Cetyltrimethyl ammonium bromide、100mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、20mM EDTA pH8.0、1.4M 塩化ナトリウム、1% ポリビニルピロリドン）に懸濁後、55℃で10分間保温した。これに等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（24:1）を加え、室温で30分間穏やかに混合した後遠心分離し、上層と下層とを分取した。▲１▼上層には等量のクロロホルム/イソアミルアルコール（24:1）を加え、▲２▼下層には等量の1xCTAB液（2xCTAB液を滅菌蒸留水で2倍に希釈した液）を加え、それぞれ室温で10分間穏やかに混合した後、再度遠心分離し、▲１▼、▲２▼それぞれより上層を分取してこれらを混合した。これに1/10量の10％CTAB液（10% Cetyltrimethyl ammonium bromide、0.7M 塩化ナトリウム）および等量の沈澱バッファー（2% Cetyltrimethyl ammonium bromide、50mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、10mM EDTA pH8.0）を加え、穏やかに混合した後遠心分離した。沈殿物を回収しこれを1M塩化ナトリウム-TE（1M 塩化ナトリウム、10mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁し、さらに等量のイソプロパノールを加えて穏やかに混合した後、遠心分離し、得られた沈殿物を70%エタノールでリンスして軽く乾かし、これをTEに懸濁した。該懸濁液に最終濃度10μg/mlになるようにRNaseを加え、37℃で30分間保温した後、1/4量の4M酢酸アンモニウムと2倍量の100％エタノールとを加えて混合し静置した。析出したDNAをパスツールピペットで巻き取って回収後、70%エタノールでリンスして軽く乾かしTE（10mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁した。このDNA液を適当に希釈し、吸光度測定、アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、約 350μgのゲノムDNAが得られたことが確認された。
【００２０】
(2)本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含むDNAのPCRによる増幅
(1)で得られたゲノムDNA10μgにPvuII 100Uを作用させてこれを完全消化した後、1/10量の3M酢酸ナトリウムと2倍量の100％エタノールとを加えて混合し、15000rpm、10分間、4℃で遠心分離して、沈澱したDNAを回収した。これを70％エタノールでリンスし、最終濃度が20ng/μlになるようにTEに懸濁した。このDNA溶液とライゲーションキット（宝酒造製）を用いて最終濃度が1ng/μlになるように、反応体積400μlでライゲーション反応させた後、該反応液を鋳型にして、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＡおよびＢ、
オリゴヌクレオチドＡ； 5'- GGGTT TCAAT GGATT CGATG -3' （20mer）
オリゴヌクレオチドＢ； 5'- GCAGA TGCTC AGAAC ACTGC -3' （20mer）
を用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。さらにこのPCR反応液の一部と、下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＣおよびＤ、
オリゴヌクレオチドＣ； 5'- GGCAG CTGGC ACCCA TGATA TTTAG AATG -3' (29mer)オリゴヌクレオチドＤ； 5'- GGCAG CTGTT CATAA TTTAC AGAGT GAGTG ACAGT CAG -3' （38mer）
を用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。反応後の溶液の一部を0.8％アガロースゲル電気泳動に供して分析したところ、約3kbのDNA断片が増幅していることが確認された。
【００２１】
（3）本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターのクローニングとシークエンス
(2)で得られたPCR反応液にTEを添加して200μlに調整し、これに等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（24：23：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを回収した。該DNAを70％エタノールでリンスした後TEに懸濁し、PvuII 30Uを作用させて完全消化した。該反応後、上記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行い、回収したDNAを50μlのTEに懸濁し、スピンカラムS-400（ファルマシア社製）に供して精製した。該カラムからの溶出液1μlを0.8％アガロースゲルで分析した結果、約2kbと約1kbのサイズのDNA断片が存在することが判った。pUC18ベクター2μgにSmaI 10Uを作用させて完全消化した後、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液について上記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行ってベクターＤＮＡを回収しこれをTEに懸濁した。このベクターＤＮＡ50ngと上記のインサート50ngとをライゲーションキット（宝酒造製）を用いてライゲーション反応に付した後、大腸菌JM109株のコンピテントセル（宝酒造製）に導入した。該導入処理を行なった菌株をアンピシリン100μg/mlを含むLB培地上で培養し、生育してきたクローンからプラスミドDNAを調製した。このDNAを制限酵素で切断してアガロースゲル電気泳動することにより、目的とする約2kbまたは約1kbのサイズのDNA断片を含有するプラスミドをそれぞれ選抜した。これらのプラスミドの塩基配列を、pUC18ベクターに存在する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＥおよびＦ、
オリゴヌクレオチドＥ；5'- AACAA TTTCA CACAG GAAAC AGCTA TGACC -3' (30mer)
オリゴヌクレオチドＦ；5'- CAGTC ACGAC GTTGT AAAAC GACGG CCAGT -3'（30mer）
をプライマーに用い、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI）、蛍光シークエンサー（ABI）を用いて分析した。さらに、明らかとなった塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーに用いて前述と同様に塩基配列を分析した。その結果、前記約2kbのサイズのDNA断片は、配列番号１で示される塩基配列を有することが判明した。このDNA断片を含有する前記プラスミドをpCR16G6Pと名付けた（図１）。また、前記約1kbのサイズのDNA断片は配列番号２で示される塩基配列を有することが判明した。このDNA断片を含有する前記プラスミドをpCR16G6T（図２）と名付けた。
【００２２】
実施例2 （本発明プロモーターを導入したトランスジェニックタバコの作製）
Tiプラスミド発現ベクターの構築
実施例1で得られた配列番号１で示される塩基配列を有するプラスミドを鋳型にして、クローニング用の制限酵素認識配列を有する下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
を合成し、これをプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。増幅したDNA断片にHindIII 10U、XbaI 10Uを作用させて完全消化した後、一部を0.8％アガロースゲルで分画し、約1.7kbのサイズのＤＮＡバンドを切り出してこれに含まれるDNAをガラスビーズ（バイオラッド社製）を用いて精製した。同様に残りの溶液を4％Nusieve Agarose ゲルで分画し、約250bpのサイズのバンドを切り出してこれに含まれるDNAを精製した。ｐBIN19由来のベクターｐIG121HM 2μgをHindIII 10U、XbaI 10Uで消化し、さらにアルカリフォスファターゼを作用させて脱リン酸化反応を行った後、前記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行ってベクターDNAを回収した。該ベクターDNAと上記の2種のDNA断片（約1.7kb、約250bp）とをライゲーションキットを用いてライゲーション反応に供した後、大腸菌HB101株のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、該導入処理を行なった菌株をカナマイシン50μg/mlを含むLB培地上で培養した。生育してきたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素HindIII、XbaIで切断してアガロースゲル電気泳動で分析することにより、上記の約1.7kbのDNA断片と約250bpのDNA断片の両方を含むプラスミドを選抜した。さらに選抜したプラスミドDNAを鋳型にして、前述のオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行い、約2kbのDNA断片が増幅されることを確認した。このようにして調製されたβ−グルクロニダーゼ遺伝子の上流に本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターをｐBICR16G6P（図３）と名付けた。
【００２３】
（2）トランスジェニックタバコの作製
以下のトランスジェニック植物の作製は、S.B.Gelvin、R.A.Schilperoort and D.P.S.Verma著；Plant Molecular Biology/Manual（1988）（Kliwer Academic Publishers発行、Valvekens et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5536-5540（1988）に記載の方法に準じて行った。
アグロバクテリウム菌C58C1をYEB培地中で、30℃にて一晩振とう培養した後、新たなYEB培地に植え継ぎ、培養液の濁度がOD600=0.6に達するまで培養した。以下の操作は、低温室にて行った。この培養液を遠心分離して菌体を集め、これを冷やしておいた滅菌蒸留水に懸濁した後、再度遠心分離して集菌した。この菌体の洗いを2回繰り返し、さらに滅菌蒸留水を10%グリセロール溶液に変えて同様の操作を行った。こうして得られた菌体を培養液の400倍濃縮になるように10%グリセロール溶液に懸濁した。このようにして調製した菌体懸濁液に、上記のようにして構築した本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6Pまたは対照としてpIG121HMベクターを、エレクトロポレーション法を用いて導入し、導入処理を行なった菌株をカナマイシン50μg/mlを含むYEBプレート上で培養した。生育してきたカナマイシン耐性クローンからアルカリ-SDS法によりプラスミドDNAを調製し、該DNAを0.8%アガロースゲル電気泳動で分析し、ゲルをエチジウムブロマイド染色してDNAバンドを検出することにより、Tiプラスミド発現ベクターが導入されていることを確認した。さらにこのプラスミドDNAを鋳型にして、前述のオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行い、約2kbのDNA断片が増幅することを確認し、目的の発現ベクターが導入されていることを確認した。
無菌培養したタバコの葉部切片（0.7cm角）を、カナマイシン50μg/mを含むYEB液体培地で30℃にて1晩培養したアグロバクテリウム菌培養液に２分間浸し、滅菌したろ紙で余分な水気を除いた後、MS-NB培地上に置いた。16時間明所、8時間暗所の条件下で25℃にて5日間共存培養後、切片をMS液体培地で洗浄し、MS-NBC培地上に置いた。さらに5日間培養後、選択薬剤を含むMS-NBCK培地に切片を移し、約1カ月程度静置培養し、再生したシュートを葉部切片本体より切断して、MS-CK培地に植え継いだ。約1カ月後、発根した個体を土壌に植え替え自殖種子を得た。
【００２４】
（3）トランスジェニックタバコにおける導入遺伝子の確認
トランスジェニックタバコの種子を2.5% 次亜塩素酸/0.002% Triton X-100に5分間浸し、次いで、滅菌水で4-5回洗浄後、カナマイシン100μg/mlを含むMS培地で培養し無菌発芽させた。カナマイシン耐性を示した個体からCTAB法によりゲノムDNAを調製し、このDNA 50ngを鋳型に、レポーター遺伝子であるGUS遺伝子の塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＩと、配列番号７で示される塩基配列からなるDNAを含む本発明プロモーターの塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＪ、
オリゴヌクレオチドＩ；5'- ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC -3' (30mer)
オリゴヌクレオチドＪ；5'- TCTGC ATCGG CGAAC TGATC -3' （20mer）
との組み合わせをプライマーに用いるか、またはレポーター遺伝子であるGUS遺伝子の塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＫと、NOSターミネーターの塩基配列の一部を有するオリゴヌクレオチドＬ、
オリゴヌクレオチドＫ；5'- ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C -3'（21mer）
オリゴヌクレオチドＬ；5'- GATAA TCATC GCAAG ACCGG -3' （20mer）
との組み合わせをプライマーに用いてそれぞれPCR反応を行い（94℃1分間次いで55℃2分間72℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）、PCR産物の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動で分画した。その結果、目的とする約310bp、約400bpの長さのDNA断片の増幅を確認した。
【００２５】
実施例３ （トランスジェニックタバコにおける本発明プロモーターの発現活性測定）
実施例２で得られたトランスジェニックタバコの実生の葉と根におけるGUS活性の測定とGUS染色をJefferson Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405(1987)に記載の方法に準じて行った。GUS活性は、4-methylumberlifer-β-D-glucuronideを基質とした蛍光法で測定し、活性染色は 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロン酸（X-Gluc）を基質として行い青色色素（インジゴチン）の沈着量を測定した。
（1）GUS染色
上記トランスジェニックタバコの種子を、カナマイシン100μg/mlを含むMS培地で培養して無菌発芽させ、1週間後、3週間後、1カ月後に、カナマイシン耐性の植物体を引き抜き、GUS染色液（1 mM X-Gluc、0.5 mM K3Fe(CN)6、0.5 mM Fe4Fe(CN)6、0.3% Triton X-100）に浸して37℃で1晩反応させた。反応後、100%エタノールを用いて脱色し、その染色パターンを観察した。その結果、本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6P導入したトランスジェニックタバコにおいて、該発現プラスミド上で本発明プロモーターの下流に接続されているβ−グルクロナーゼ遺伝子が葉部、根部、茎部で高発現していることが確認された。
【００２６】
（2）GUS活性測定
上記トランスジェニックタバコ種子をカナマイシン100μg/mlを含む培地で培養して無菌発芽させ、25℃で培養した。播種後1週間、3週間、1ヶ月後に、カナマイシン耐性の植物体の根部0.8g、葉部0.5gを採取して乳鉢にとり、それぞれ1ml、0.5mlの抽出バッファー（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール）を添加し、海砂を適当量加え摩砕した。この摩砕液をエッペンドルフチューブに移して遠心分離し、上清を分取した。得られた上清液のタンパク質濃度の定量はBIO-RAD社のProtein assay reagent を用いた方法で行った。この液10〜70μlを500μlの反応基質液（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール、1mM 4-methylumberlifer-β-D-glucuronide ）に添加し、37℃で保温した。一定時間おきに反応液100μlをサンプリングし、直ちに900μlの反応停止液（0.2M 炭酸ナトリウム溶液）を添加して混合した。このように調製したサンプルの蛍光を分光蛍光光度計（日立製作所 F-2000）で測定した（励起光波長365nm、発光波長455nm）。この測定値と測定に用いた上記上清液のタンパク質濃度の値からGUS活性を算出した。結果を表１（播種後1週間）、表２（播種後３週間）および表３（播種後１ヶ月）に示す。表１〜３において、本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6Pを導入したタバコ個体がIP-8〜１４、pIG121HMベクターを導入したタバコ個体がPIG-1〜２である。相対比は、各生育段階における葉部、根部でのGUS活性値を、pIG121HMベクター導入タバコ（PIG-２）の該活性値を1として表した値である。本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6P（本発明プロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入したトランスジェニックタバコでは葉部、根部の試料から高いGUS活性が検出され、最も高いものではpIG121HMベクター（35Sプロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入した場合の8倍高い活性を示した。
【００２７】
【表１】
【表２】
【表３】
実施例４（トランスジェニックアラビドプシスにおける本発明プロモーターの発現活性測定）
（１）トランスジェニックアラビドプシスの作製
Tiプラスミド発現ベクターpBICR16G6Pを導入したアグロバクテリウムC58C1を用いてアラビドプシスへの遺伝子導入を行った。
無菌播種後、23℃で2-3週間生育させたアラビドプシスの根を1cm程度に切断し、CIMプレートで2日間培養した後、これを、30℃で2晩振とう培養したアグロバクテリウム培養液に浸し、再びCIMプレート上で培養した。2日後、該根部切片をSIMC培地に移し、さらに2日後、SIMCH培地に植え継いだ。約1カ月経って再生してきたシュートを切断してMS培地に植え替え、発根させた。発根した個体を土壌、またはロックウールに植え、人工気象器で育てて自殖種子を得た。
【００３１】
（２）トランスジェニックアラビドプシスにおける導入遺伝子の確認
（１）で得られた自殖種子を1%次亜塩素酸に5分間浸し、滅菌蒸留水で3-5回洗浄した後、ハイグロマイシン20μg/mlを含むMS培地で培養して無菌発芽させた。ハイグロマイシン耐性を示した個体からアラビドプシスはロゼット葉を4-5枚をとって、CTAB法によりゲノムDNAを調製した。このゲノムDNA50ngを鋳型にしてPCRを行い（94℃1分間次いで55℃2分間さらに72℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）、PCR産物の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動で分画した。プライマーには、オリゴヌクレオチドIおよびJの組合せ、またはオリゴヌクレオチドKおよびLの組合せを用いた。
オリゴヌクレオチドＩ；5'- ATCAA CACCT CAACA TTGAT GTTAG CGTAC -3' (30mer)
オリゴヌクレオチドＪ；5'- TCTGC ATCGG CGAAC TGATC -3' （20mer）
オリゴヌクレオチドＫ；5'- ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C -3'（21mer）
オリゴヌクレオチドＬ；5'- GATAA TCATC GCAAG ACCGG -3' （20mer）
その結果、それぞれ目的とする約310bp、約400bpの長さのDNA断片の増幅が確認された。
【００３２】
（３）発現活性測定
（3-1）GUS染色
実施例４（２）で遺伝子の導入が確認されたトランスジェニックアラビドプシスの種子を、上記と同様にハイグロマイシン20μg/mlを含むMS培地で培養して無菌発芽させ、ハイグロマイシン耐性を示した個体を3週間生育させた。植物体を生育培地から抜き、GUS染色液（1 mM X-Gluc、0.5 mM K3Fe(CN)6、0.5 mM Fe4Fe(CN)6、0.3% Triton X-100）に浸して37℃で1晩保温した。次いで、100%エタノールで数回洗浄して脱色し、青色色素の沈着を観察した。その結果、本発明プロモーターの下流に接続されているβ−グルクロニダーゼ遺伝子が葉部、根部、茎部で高発現していることが確認された。
【００３３】
（3-2）GUS活性測定
実施例４（２）で遺伝子の導入が確認されたトランスジェニックアラビドプシスの種子をハイグロマイシン20μg/mlを含む培地で培養して無菌発芽させ、23℃で3週間培養した。根部、葉部、それぞれ3個体分を乳鉢にとり、それぞれに抽出バッファー（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール）を添加し、海砂を加えて摩砕した。この摩砕液をエッペンドルフチューブに移して遠心分離し、上清を分取した。該上清10-70μl分を500μlの反応基質液（50mM リン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA、0.1% Triton X-100、0.1% Sarcosyl、10mM メルカプトエタノール、1mM 4-methylumberlifer-β-D-glucuronide ）に添加して37℃で保温し、一定時間おきに100μlをサンプリングし、直ちに900μlの反応停止液（0.2M 炭酸ナトリウム溶液）と混合した。このように調製したサンプルを分光蛍光光度計（日立製作所 F-2000）で測定した（励起光波長365nm、発光波長455nm）。また、該上清のタンパク質濃度をバイオラッド社のProtein assay reagent を用いた方法で定量した。前記の蛍光値と前記上清のタンパク質濃度からGUS活性を算出した。その結果、本発明プロモーターを有するTiプラスミド発現ベクターｐBICR16G6P（本発明プロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入したトランスジェニックアラビドプシスでは葉部、根部の試料から高いGUS活性が検出され、最も高いものではpIG121HMベクター（35Sプロモーターとβ−グルクロニダーゼ遺伝子とが連結されてなるＤＮＡを有する）を導入した場合の8倍高い活性を示した。
【００３４】
実施例５（ダイズにおける本発明プロモーターの発現活性測定）
実施例２（１）のように取得したプラスミドpBICR16G6Pを含有する組換え大腸菌クローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製した。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlに添加し、37℃、1晩振とう培養した。得られた培養液を培養後8000rpmで10分間遠心分離を行うことにより菌体を回収し、QIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製した。
該プラスミドDNAを、森川らの遺伝子銃（C.M.Particle Gun System, Rhebock shoko Co.）を用いた直接導入法（Yang N−S，Christou P編、Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，W．H．Freeman and Co．Publishers，New York, pp.52-59）、パーティクルガン法（植物細胞工学,2,631-637,1990）、および特開平03-291501に記載の方法により、Finer J. and Nagasawa A.（Plant Cell, Tissue and Organ Culture,15,125-136,1988）に記載の方法に準じて誘導・増殖したダイズ不定胚またはダイズ展開葉に導入した。0.5〜1μmの金粒子（徳力本店製）をエタノールで数回洗浄し、60mg/mlとなるように滅菌水に懸濁した。プラスミドpBICR16G6Pの精製DNAを0.5μg DNA/mlとなるように滅菌水に溶解させたDNA溶液20μlに、50μlの前記金粒子懸濁液、50μlの2.5M CaCl2、20μlの0．1Mスペルミジンを加え、攪拌した。室温に30分間静置し、9000rpmで10秒間遠心した後、上清を除去し、沈澱に60μlの75%エタノールを添加して懸濁した。9000rpmで10秒間遠心した後、上清を除去し、沈澱を300μlの100%エタノールに懸濁し、ハンディータイプの超音波破砕機（トミー精工製）を用いて1秒間ずつ3回の超音波処理を行った。このような処理を行った金粒子懸濁液10μlをプロジェクタイル（レーボック商工製）に供試して乾燥させた後、これにさらに10μlの金粒子懸濁液を供試し、同様に乾燥させた。このプロジェクタイルを遺伝子銃にセットし、110mmHg真空下、335m/secの速度でMS寒天培地上に置いたダイズ不定胚およびダイズ展開葉に２回撃ち込んだ。対照として、pBI121（クロンテック社製）およびpBI221（クロンテック社製）を上記と同様にしてダイズ不定胚およびダイズ展開葉に撃ち込んだ。撃ち込み後、25℃で24時間静置培養し、GUS染色液（1 mM X-Gluc、0.5 mM K3Fe(CN)6、0.5 mM Fe4Fe(CN)6、0.3% Triton X-100）に浸して37℃で1晩保温した後、ダイズ不定胚における染色スポットを観察した。その結果、pBICR16G6Pベクターを導入した不定胚において青色の斑点が認められた。またダイズ展開葉は、前記の保温後に100％エタノールに浸して脱色した後、その染色スポットを観察した。その結果、pBICR16G6Pベクターを導入した展開葉において青色の斑点が認められた。
【００３５】
実施例６（本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターの作製）
（1）T-DNA内部を除去したTiプラスミドの構築
pBI101ベクター（クロンテック社製）5ngを鋳型にして下記のオリゴヌクレオチドP、およびオリゴヌクレオチドQ、
オリゴヌクレオチドP；5’―GGGAA TTCTC AGATT GTCGT TTCCC GCCTT CAG―3’(33mer)
オリゴヌクレオチドQ；5’―CAGAT CTGGG GAACC CTGTG GTTG―3’(24mer)
をプライマーに用いてPCR（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイクル）反応を行った。該PCR反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウム、2倍量のエタノールを添加して混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、DNAを沈殿させた。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE[10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)]20μlに懸濁した。得られたDNAにSphI 30U、EcoRI 30Uを作用させて完全消化した後、該消化液に、前述と同様に1/10量の3M酢酸ナトリウム、2倍量のエタノールを添加して混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離した後、沈澱したDNAを70%エタノールでリンスし、20μlのTEに懸濁した。これを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲルで泳動分画し、186bpのサイズのバンドを含むゲルを切り出し、これに含まれるDNAを精製した。一方、pBI101ベクター（クロンテック社製）2μgをSphI 10UおよびEcoRI 10Uで消化し、前述と同様にエタノール沈澱を行い、10μlのTEに懸濁した。このベクターDNA 50ngと、切り出したゲルから精製したDNA5ngを含む溶液とをライゲーションキット(宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンからプラスミドDNAを調製し、これを制限酵素SphI、EcoRIで切断してアガロースゲル電気泳動で分析することにより、上記の186bpのDNA断片を含み、T−DNA領域内にEcoRI認識配列のみを含むプラスミドを選抜しこれをpBIΔと名付けた。
【００３６】
(2)本発明プロモーターを含むプラスミドpCR16G6Pの改変
配列番号1で示される塩基配列を有する本発明プロモーターの3’末端側にクローニング用のHindIII認識部位、XbaI認識部位を導入するために、プラスミドpCR16G6P 5ngを鋳型にして下記のオリゴヌクレオチドR、およびオリゴヌクレオチドS、
オリゴヌクレオチドR;5’-GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG-3’(30mer)
オリゴヌクレオチドS;5’-AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC-3’(30mer)
をプライマーに用いてPCR（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイクル）を行った。該PCR反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加し混合した後、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、DNAを沈殿させた。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE（10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)）20μlに懸濁し、これにXbaI 50Uを添加し37℃で1時間保温した。これに、前述と同様に1/10量の3M酢酸ナトリウム、2倍量のエタノールを添加し混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離後、沈澱したDNAを70%エタノールでリンスし、20μlのTEに懸濁した。これを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約250bpのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、ゲルに含有されているDNAを精製した。さらにプラスミドpCR16G6P 2μgにXbaI 10Uを作用させて完全消化した後、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、20℃にて15000rpm、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製されたDNA50ngと前述のように4% Nusieve Agaroseから回収したDNA断片5ngをライゲーションキット(宝酒造製)を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、該培養液から、8000rpmで2分間遠心を行うことにより菌体を回収し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素XbaIで切断して4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画することにより、上記の約250bpのDNA断片を含むプラスミドを選抜した。また選抜したプラスミドを用いて、下記のオリゴヌクレオチドS、
オリゴヌクレオチドS;5’―AACAA TGTAT GTCCG GTGTA CATCT ATGAC―3’(30mer)
をプライマーにして、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI）、蛍光シークエンサー（ABI）を用いて塩基配列を決定し、目的とする約250bpのDNA断片が含まれていることを確認した。このようにして得られたプラスミドをpCR16G6P−2と名付けた。
【００３７】
(3)本発明ターミネーターを含むプラスミドpCR16G6Tの改変
配列番号2で示される塩基配列を有する本発明ターミネーターを含むプラスミドpCR16G6Tを用いて、クローニング用のSacI認識部位、EcoRI認識部位を付加した本発明ターミネーターを含むプラスミドpCR16G6T-２を構築した。すなわち、まず、配列番号6で示される塩基配列を含むpC16プラスミド（Plant Cell Physiology, 38(9):1080-1086(1997),特開平07-188288）のDNA 50μgをDraI 50U、SacI 50Uを作用させて消化し、該消化液に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加して混合した後、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離した。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE[10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)]10μlに懸濁し、4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供した。泳動後、189bpのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、該ゲルに含有されているDNAを精製した。
一方、プラスミドpCR16G6T 5ngを鋳型にして、下記のオリゴヌクレオチドTおよびオリゴヌクレオチドU；
オリゴヌクレオチドT;5’―TTCAT AATTT ACAGA GTGAG TGACA GTCAG―3’(30mer)
オリゴヌクレオチドU;5’―GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC―3’(34mer)
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃1分間さらに74℃2分間の保温を1サイクルとしてこれを30サイクル）を行った。該PCR反応液に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加して混合した後、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、DNAを沈殿させた。沈澱したDNAを70%エタノールでリンスした後、TE[10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM EDTA(pH8.0)]20μlに懸濁し、DraI 20UおよびEcoRI 20Uを添加して37℃で1時間保温した。次いでこれに、前述と同様に1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量のエタノールを添加して混合し、14000rpm、10分間、4℃で遠心分離後、沈澱したDNAを70%エタノールでリンスし、20μlのTEに懸濁した。これを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動で分画した後、800bpのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、該ゲルに含有されているDNAを精製した。
pUC18ベクター（宝酒造製）のDNA 2μgをEcoRI 20U、SacI 20Uを作用させて消化し、前述と同様にエタノール沈澱し、TE10μlに懸濁した。該DNA 20ngと上述のように4% Nusieve Agaroseから精製した2種のDNA断片各30ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。培養後、白色を呈したコロニーを形成したクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液を8000rpmで2分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素SacI、EcoRIで切断して4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画することにより、989bpのDNA断片が検出できるプラスミドを選抜した。このプラスミドをpCR16G6T−２と名付けた。
【００３８】
（４）本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターの構築
実施例６（２）のようにして作製されたプラスミドpCR16G6P−2のDNA 2μgをEcoRI 20U、SalI 20Uを作用させて消化し、0.8% アガロースゲル（同仁製）電気泳動で分画した後、約2kbのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理し、該ゲルに含有されているDNA断片（以下、DNA断片Gと記す。）を精製した。同様に実施例６（３）のようにして作製されたプラスミドpCR16G6T−2のDNA 2μgをEcoRI 20U、SalI 20Uを作用させて消化し、4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画した後、約1kbのサイズのDNA断片を含むゲルを切り出し、これをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理し、該ゲルに含有されているDNA断片（以下、DNA断片Hと記す。）を精製した。一方、pBluescriptKS−ベクター（クロンテック社製）のDNA 2μgをEcoRI 20Uで完全消化し、これにさらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。次いでこれに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製したベクターDNA 50ng、前述のDNA断片G 50ngおよびDNA断片H 25ngを混合してライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加してトランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。培養後、白色を呈したコロニーを形成したクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液を8000rpmで2分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素EcoRIで切断して0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画することにより、約3kbのDNA断片が検出できるプラスミドを選抜した。さらに該プラスミドのDNA 2μgをEcoRI 20Uで完全消化し、1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。一方、上述のプラスミドpBIΔのDNA 2μgをEcoRI 20Uで完全消化し、これにさらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液を前記のようにフェノール処理し、エタノール沈澱した後、得られたDNAをTE 10μlに懸濁した。このように調製したDNA 50ngと上記のEcoRI消化したプラスミドDNAをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液を8000rpmで2分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。これを制限酵素EcoRI、または、EcoRIおよびSalIで切断して0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画することにより、EcoRI消化物から約3kbのDNA断片が検出され、EcoRIとSalIとによる消化物から約2kbおよび約1kbのDNA断片が検出されるプラスミドを選抜した。このプラスミドをpBICR16G6PTと名付けた。
【００３９】
(5)ターミネーターの改変
実施例６（４）で作製されたpBICR16G6PTのDNA1μgを制限酵素HindIIIで消化し、1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁した。該DNAにさらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該ポリメラーゼ反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製したDNA50ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。この反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/ml を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。生育してきたクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中、37℃で1晩振とう培養し、得られた培養液から、前述のようにして菌体を回収し、該菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。このDNAに制限酵素HindIIIを作用させ、0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画することにより、HindIIIの切断認識サイトを欠失しているプラスミドを選抜した。このプラスミドをpBICR16G6PTΔと名付けた。
【００４０】
実施例７（本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターの発現活性測定）
（1）β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子の発現ベクターへの導入
プラスミドpBI221（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20U、SacI 20Uで消化し、消化液の1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁した。該DNAにさらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。これをれを0.8%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動で分画した後、約1.7kbのGUS遺伝子を含むDNA断片を含むゲルを切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりDNAを精製した。一方、pBluescriptKS−（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取した。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁した。このように調製したDNA 50ngと前述のGUS遺伝子を含むDNA断片100ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。白色を呈したコロニーの一部を、ベクターの配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、およびGUS遺伝子の配列に基き合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドM；5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドK；5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。該PCR反応液を4% Nusieve Agarose（FMC社製）で分画後、410bpのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜した。該プラスミドを有するクローンの培養菌体を、前述と同様にQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製した。このプラスミドDNA2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで消化した後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画し、約1.7kbのDNA断片が含まれるゲルを切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりプラスミドDNAを精製した。一方、前述のプラスミドpBICR16G6PTΔのDNA 2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行った。該反応液をフェノール処理、エタノール沈澱後、TE10μlに懸濁した。このように調製したDNA 50ngと前述のように精製した約1.7kbのDNA断片20ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させた。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養した。白色を呈したコロニーの一部を、オリゴヌクレオチドUおよびGUS遺伝子の配列に基き合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドU；5’―GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC―3’(34mer)
オリゴヌクレオチドK；5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行った。該PCR反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画した後、約1.1kbのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜した。選抜されたプラスミドをpBICR16G6PTΔGと名付けた。該プラスミドを有するクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製した。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlに添加し、37℃、1晩振とう培養した。得られた培養液を8000rpmで10分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製した。
【００４１】
（２）ダイズにおける発現活性測定
（１）で作製したプラスミドpBICR16G6PTΔGのDNAを、実施例5に準じて、森川らの遺伝子銃（C.M.Particle Gun System,レーボック商工製）を用いることによりダイズの不定胚に撃ち込んだ。対照として、pBI221（クロンテック社製）を同様に撃ち込んだ。撃ち込み後の不定胚を、25℃で24時間静置培養し、次いでGUS染色液に浸して37℃で1晩保温した。保温後、その染色スポットを観察した結果、pBICR16G6PTΔGを導入したダイズ不定胚において青色の斑点が認められた。
【００４２】
実施例８（プロモーターの改変）
（１）改変プロモーターの作製
（1-1）4塩基付加
配列番号1で示される塩基配列を含むプラスミドpCR16G6PのDNA 2μgをSacI 20Uで消化し、さらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取する。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE10μlに懸濁する。これを1.0%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約3.9kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Aと記す。）または約880bpのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Bと記す。）を含むゲルをそれぞれ切り出し、該ゲルからプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。得られたDNA断片A 50ng、DNA断片B 100ngを混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、ライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。ベクターの配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、配列番号１に基き合成したオリゴヌクレオチドG、
オリゴヌクレオチドM；5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドG;5’―GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA―3’(28mer)
を含むPCR反応液に、生育してきたコロニーの一部を懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。この反応液の一部を0.8%アガロース電気泳動に供して分画し、約2kbのDNA断片が増幅されているプラスミドを複数選抜する。選抜されたプラスミドを含むクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB2mlに植え、37℃で1晩培養する。この培養液を遠心分離することにより集菌し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。該プラスミドDNAを制限酵素SacIで消化し、1.0%アガロース電気泳動に供し、SacIの認識サイトを欠失したプラスミドを選抜する。このようなプラスミドが含有する本発明プロモーターの塩基配列として配列番号3で示される塩基配列を挙げることができる。該塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列と比較して、４塩基が付加されている。
【００４３】
（1-2）4塩基付加
実施例８(1-1)と同様の方法で、配列番号1で示される塩基配列中のSphIを欠失させることができる。配列番号１で示される塩基配列を含むプラスミドpCR16G6PのDNA 2μgをSphI 20Uで消化し、さらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、前述と同様にフェノールクロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、沈澱をTE10μlに懸濁する。これを0.8%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約3kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Cと記す。）または約1.6kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Dと記す。）を含むゲルをそれぞれ切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりゲルに含まれるDNA断片を精製する。得られたDNA断片C 50ngおよびDNA断片D 100ngを混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、ライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。ベクターの配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、配列番号１で示される塩基配列に基き合成したオリゴヌクレオチドN、
オリゴヌクレオチドM;5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドN;5’―AGGAC GACTT AGGTG AATAC―3’(20mer)
を含むPCR反応液に、生育してきたコロニーの一部を懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。この反応液の一部を0.8%アガロース電気泳動に供して分画し、約1.6kbのDNA断片が増幅されているプラスミドを複数選抜する。選抜されたプラスミドを含有するクローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB2mlに植え、37℃で1晩培養する。この培養液を遠心分離することにより集菌し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。該プラスミドDNAを制限酵素SphIで消化し、1.0%アガロース電気泳動に供して分画することにより、SphIの認識サイトを欠失したプラスミドを選抜する。このようなプラスミドが含有する本発明プロモーターの塩基配列として配列番号4で示される塩基配列を挙げることができる。該塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列と比較して、４塩基が付加されている。
また、上記のように調製された配列番号4で示される塩基配列からなる本発明プロモーターのDNAを用いて、実施例８（1-1）と同様の操作を行なうことによりさらにSacI認識サイトを欠失させた本発明プロモーターのDNAを調製することができる。
【００４４】
（1-3）4塩基欠失
実施例８（1-1）（1-2）と同様の方法で、配列番号1で示される塩基配列を含むプラスミドpCR16G6PのDNA 2μgをXbaI 20Uで消化し、さらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、該反応液に等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取する。これに1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁する。このDNA溶液の一部を0.8%アガロース（同仁製）ゲル電気泳動に供して分画した後、約4.7kbのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Eと記す。）を含むゲルを切り出し、該ゲルをプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いて処理することによりDNAを精製した。また、上記のDNA溶液の残りを4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供して分画し、約250bpのサイズのDNA断片（以下、DNA断片Fと記す。）を含むゲルを切り出し、該ゲルから前述と同様にプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。このようにして調製されたDNA断片E 50ng分、およびDNa断片F 20ngを混合し、ライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、該ライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。生育してきたコロニーの一部を、ベクター上の配列に基き合成したオリゴヌクレオチドM、配列番号１で示される塩基配列に基き合成したオリゴヌクレオチドO、
オリゴヌクレオチドM；5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドO；5’―ATACA TCTTT TCAAA TTTCA―3’(20mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。この反応液の一部を4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画し、約250bpのDNA断片が検出されるクローンを複数選抜する。さらに選抜クローンをアンピシリン100μg/mlを含むLB2mlに植え、37℃で1晩培養する。この培養液を遠心分離することにより集菌し、得られた菌体をQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。該プラスミドDNAを制限酵素XbaIで消化し、4% Nusieve Agarose（FMC社製）ゲル電気泳動に供することにより、XbaIの認識サイトを欠失したプラスミドを取得する。このようなプラスミドが含有する本発明プロモーターの塩基配列として配列番号5で示される塩基配列を挙げることができる。該塩基配列は、配列番号１で示される塩基配列と比較して、４塩基が欠失している。
上記のように調製された配列番号4で示される塩基配列からなる本発明プロモーターのDNAを用いて、実施例８（1-1）または（1-2）と同様の操作を行なうことにより、さらにSacI認識サイトまたはSacI認識サイトを欠失させることができる。
【００４５】
（２）発現ベクターの構築
発現ベクターの構築は実施例2と同様の方法で行なうことができる。実施例８（1-1）、（1-2）または（1-3）で得られる本発明プロモーターを含有するプラスミドをそれぞれ鋳型にして、クローニング用の制限酵素認識配列を有する下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TATTT AGAAT GTTAT TGCTG -3'（30mer）
を合成し、これをプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。増幅したDNA断片にHindIII 10U、XbaI 10Uを作用させて完全消化した後、0.8％アガロースゲル電気泳動に供して分画し、実施例８（1-1）または（1-2）で得られる本発明プロモーター含有プラスミドを鋳型に得られたDNA断片の場合は約1.7kbのサイズのDNA断片を含むゲルと約250bpのサイズのDNA断片を含むゲルとを切り出し、また、実施例８（1-3）で得られる本発明プロモーター含有プラスミドを鋳型に得られたDNA断片の場合は約2kbのサイズのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出して、これらに含まれるDNAをガラスビーズ（バイオラッド社製）を用いて精製する。ｐBIN19由来のベクターｐIG121HMのDNA2μgをHindIII 10U、XbaI 10Uで消化し、さらにアルカリフォスファターゼを作用させて脱リン酸化反応を行った後、前記と同様にフェノール処理、エタノール沈澱を行ってDNAを回収する。該DNAと上記のゲルから回収されたDNA断片（約1.7kbおよび約250bp、または約2kb）とをライゲーションキット（宝酒造製）を用いてそれぞれライゲーション反応に供した後、大腸菌HB101株のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、該導入処理を行なった菌株をカナマイシン50μg/mlを含むLB培地上で培養する。生育してきたクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素HindIII、XbaIで切断して0.8％アガロースゲル電気泳動に供して分析することにより、約2kbのDNA断片を含むプラスミドを選抜する。さらに選抜したプラスミドDNAを鋳型にして、前述のオリゴヌクレオチドＧ及びＨ、
オリゴヌクレオチドＧ；5'- GGAAG CTTCA TGTGT GCCCT ACAGC ACA -3' (28mer)
オリゴヌクレオチドＨ；5'- GGTCT AGAGA TCTTT AGAAT GTGAT TGCTG -3'（30mer）
をプライマーに用いてPCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル）を行い、約2kbのDNA断片が増幅されることを確認する。このようにして、β−グルクロニダーゼ遺伝子の上流に配列番号３、４または５で示される塩基配列を有するTiプラスミド発現ベクターを調製することができる。またさらに、該発現ベクターからノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（NOS-t）を切り出して、pBICR16G6PTまたはpBICR16G6PTΔに含有される本発明ターミネーターと入れ替えることにより、本発明ターミネーターを含む発現ベクターを構築することができる。前述のようにして作製される発現ベクターを含有するクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製する。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlを入れ、37℃、1晩振とう培養する。培養液を8000rpmで10分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製する。
【００４６】
実施例９（本発明プロモーターおよび本発明ターミネーターを含有するTiプラスミド発現ベクターへのGUS遺伝子の導入）
実施例7（１）と同様の方法で発現ベクターへのGUS遺伝子のクローニングを行なう。プラスミドpBI221（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20U、SacI 20Uで消化し、1/10量の3M酢酸ナトリウムおよび2倍量の100％エタノールを添加して混合した後、15000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈澱したDNAを70％エタノールでリンスした後TE20μlに懸濁する。該DNAにさらにT4 DNAポリメラーゼ（宝酒造製）5Uを作用させて末端を平滑化した後、これに等量の中和フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）を添加して十分混合した後、15000rpm、20℃、5分間遠心分離し、上層を分取する。この溶液から前述と同様にDNAをエタノール沈澱し、TE10μlに懸濁する。これを0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画した後、約1.7kbのサイズのGUS遺伝子を含むDNA断片を含むゲルを切り出し、該ゲルからプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。一方、pBluescriptKS−（クロンテック社製）のDNA 2μgをSmaI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行う。該反応液を前述と同様にフェノール処理、エタノール沈澱した後、得られたDNAをTE10μlに懸濁する。このように調製したDNA50ngと前述のGUS遺伝子を含むDNA断片100ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させる。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌JM109コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をアンピシリン100μg/ml、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド40μg/ml（和光純薬製）を含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。白色を呈したコロニーの一部を、ベクターの配列に基いて合成したオリゴヌクレオチドMおよびGUS遺伝子の配列に基いて合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドM;5’―GTAAA ACGAC GGCCA GT ―3’(17mer)
オリゴヌクレオチドK;5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。該PCR反応液を4% Nusieve Agaroseゲル電気泳動に供して分画した後、410bpのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜する。該プラスミドを含有するクローンの培養菌体を前述と同様にQia−prep spin（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、プラスミドDNAを精製する。このプラスミドDNA2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで消化した後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画し、約1.7kbのDNA断片が含まれるゲルを切り出し、該ゲルからプレップAジーンDNA精製キット（バイオラッド社製）を用いてDNAを精製する。実施例6（４）記載のpBICR16G6PTのDNA 2μgを制限酵素SalI 20U、BamHI 20Uで完全消化し、さらにアルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させて脱リン酸化反応を行う。該反応液を前述と同様の方法でフェノール処理、エタノール沈澱後、沈殿したDNAをTE10μlに懸濁した。このように調製したDNA50ngと前述のように精製した約1.7kbのDNA断片20ngをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させる。このライゲーション反応液の1μlを大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造製）に添加し、トランスフォーメーションを行い、該大腸菌をカナマイシン50μg/mlを含むLBプレートに蒔き37℃で1晩培養する。白色を呈したコロニーの一部を、オリゴヌクレオチドU、およびGUS遺伝子の配列に基いて合成したオリゴヌクレオチドK、
オリゴヌクレオチドU；5’―GGGAA TTCCT GAAAA GGAAG TTCAT CGATC TATC―3’(34mer)
オリゴヌクレオチドK；5’―ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C―3’(21mer)
を含むPCR反応液に懸濁し、PCR反応（94℃1分間次いで55℃2分間さらに74℃3分間の保温を1サイクルとしてこれを40サイクル）を行う。該PCR反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供して分画した後、約1.1kbのサイズのDNA断片が増幅されているプラスミドを選抜する。選抜されたプラスミドをpBICR16G6PTGと名付けた。該プラスミドを含有するクローンをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地2ml中で37℃、1晩振とう培養し、前培養液を調製する。この前培養液0.5mlをカナマイシン50μg/mlを含むLB培地100mlに添加し、37℃、1晩振とう培養する。培養液を8000rpmで10分間遠心分離することにより菌体を回収し、該菌体をQIAGENプラスミド精製キット（QIAGEN社製）を用いて該キットに添付のプロトコールに従って処理し、菌体に含まれるプラスミドDNAを精製する。
このようにして調製されるプラスミドpCR16G6PTGまたは実施例７（１）のように構築されたプラスミドpCR16G6PTΔGから、配列番号１で示される塩基配列を有する本発明プロモーターを切り出して、該プロモーターの替りに、実施例８記載の本発明プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Nature, 313:810-812）またはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Nucleic Acid Research,11(2):369-385(1983)）を挿入することもできる。
【００４７】
実施例１０（発現活性測定）
（１）トランスジェニック植物を用いた発現活性測定
実施例２（２）に準じて、タバコ葉切片に実施例８または９のように構築された発現プラスミドを導入したアグロバクテリウム菌を感染させ、植物体を再生させることにより、トランスジェニックタバコを作製することができる。得られたトランスジェニックタバコから、実施例3に準じてゲノムDNAを抽出し、該ゲノムDNAを鋳型としてPCR反応を行うことにより、GUS遺伝子の導入を確認することができる。該遺伝子の導入が確認できたクローンを用いて、実施例4に準じてGUS染色、GUS活性測定を行なうことにより、実施例８または９で構築された発現ベクターに含まれるプロモーターおよびターミネーターの活性を確認することができる。
【００４８】
（２）パーティクルガンによる導入遺伝子の発現測定
実施例８または９のように調製されたプラスミドを、実施例5に準じて、森川らの遺伝子銃（C.M.Particle Gun System、レーボック商工製）を用いることによりダイズの不定胚または未熟種子または展開葉またはニンジンの根部等の植物組織に撃ち込むことができる。対照としては、pBI221（クロンテック社製）またはpBI121（クロンテック社製）を用いることができる。上記のプラスミドを撃ち込んだ後、25℃で24時間静置培養し、GUS染色液に浸して37℃で1晩保温する。次いで、その染色スポットを観察することにより、実施例８または９で構築された発現ベクターに含まれるプロモーターおよびターミネーターの活性を確認することができる。尚、ダイズ展開葉を用いた場合は、保温後の展開葉を100％エタノールに浸し、脱色を行った後、上記と同様にその染色スポットを観察することにより、実施例８および2で構築した発現ベクターに含まれるプロモーターおよびターミネーターの活性を確認することができる。
【００４９】
実施例において用いられた培地の組成を以下に示す。
（1）タバコ用培地
▲１▼MS 寒天培地
MURASHIGE AND SKOOG BASAL MEDIUM(SIGMA社製)4.4g、ショ糖30gを蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOH で pH 5.8 に調製し、アガー（和光純薬）を8g 添加した後、オートクレーブ滅菌した。
▲２▼MS-NB寒天培地
MS寒天培地に、1-ナフタリン酢酸（NAA）0.1 μg/ml 、6-ベンジルアミノプリン（BA）1.0 μg/mlを添加した培地である。
▲３▼MS-NBC寒天培地
MS-NB寒天培地に、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
▲４▼MS-NBCK寒天培地
MS-NB寒天培地に、カナマイシン100μg/ml、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
▲５▼MS-CK寒天培地
MS寒天培地にカナマイシン100μg/ml、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
（2）アラビドプシス用培地
▲１▼MS 寒天培地
MURASHIGE AND SKOOG BASAl MEDIUM(SIGMA社製)4.4g、ショ糖20gを蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOH で pH 6.3 に調製し、ジェランガム（和光純薬製）を2g 添加した後、オートクレーブ滅菌した。
▲２▼CIM寒天培地
MS 寒天培地に、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）0.5μg/ml、カイネチン0.05μg/mlを添加した培地である。
▲３▼SIMC寒天培地
MS 寒天培地にN6-［２-イソペンテニル］アデニン（2-iP）5μg/ml、インドール酢酸（IAA）0.15μg/ml、クラフォラン300μg/mlを添加した培地である。
▲４▼SIMCH寒天培地
SIMC培地にハイグロマイシン20μg/mlを添加した培地である。
（3）細菌、ファージ用培地
▲１▼L-培地
バクトトリプトン（Difco社製）10g、バクトイーストエキストラクト（Difco社製）5g、NaCl 10gを蒸留水 1 L に溶かし、5M NaOH で pH 7.0 に調製し、オートクレーブ滅菌する。プレートの場合はこれに15gの寒天を添加する。
▲２▼YEB培地
バクトビーフエキストラクト（Difco社製）5g、バクトイーストエキストラクト（Difco社製）1g、ポリペプトン5g、ショ糖5g、10M NaOH 0.2mlを 蒸留水 1 Lに溶かし、オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ後、フィルター滅菌した1M MgSO4を0.2ml添加して用いる。プレートの場合はこれに15gの寒天を添加する。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子を植物の細胞内で効率よく発現させることの可能なプロモーターおよびターミネーターが提供可能となる。
【００５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明プロモーターを含有するプラスミドpCR16G6Pの制限酵素地図を示す図である。Promoterは本発明プロモーターを示す。また、Ampはアンピシリン耐性遺伝子、lacIはラクトースオペロンのリプレッサータンパク質遺伝子、lacZはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ORIは複製開始点を表す。
【図２】本発明ターミネーターを含有するプラスミドpCR16G6Tの制限酵素地図を示す図である。Terminatorは本発明ターミネーターを示す。また、Ampはアンピシリン耐性遺伝子、lacIはラクトースオペロンのリプレッサータンパク質遺伝子、lacZはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、ORIは複製開始点を表す。
【図３】本発明プロモーターを挿入した発現ベクターｐBICR16G6Pの制限酵素地図およびその構築過程を示す図である。G6-pは本発明プロモーターを示す。nos-pはノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、nos-tはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、35S-pはカリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーターを意味する。また、NPTIIはカナマイシン耐性遺伝子、GUSはβ−グルクロニダーゼ遺伝子、HPTはハイグロマイシン耐性遺伝子を表す。
【図４】本発明プロモーター、本発明ターミネーターを挿入した発現ベクターpBICR16G6PTΔGの制限酵素地図およびその構築過程を示す図である。G6-pは本発明プロモーターを示す。G6-tおよびG6-t'は本発明ターミネーターを示す。RB、LBはバイナリーベクターに存在する左右境界配列を示す。GUSはβ-グルクロニダーゼ遺伝子を表わす。
Claims (11)
- 以下の（ａ）のＤＮＡを含む植物プロモーター。
（ａ）配列番号1または配列番号7で示される塩基配列からなるＤＮＡ - 請求項１記載のプロモーター、所望の遺伝子および植物ターミネーターが機能可能な形で連結されてなるキメラ遺伝子。
- 請求項１記載のプロモーターを有するベクター。
- プロモーターの下流に遺伝子挿入部位および植物ターミネーターを有する請求項３記載のベクター。
- 請求項２記載のキメラ遺伝子を有するベクター。
- 請求項１記載のプロモーターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
- 請求項２記載のキメラ遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
- 請求項３〜５記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
- 宿主細胞が微生物細胞である請求項６〜８記載の形質転換体。
- 宿主細胞が植物細胞である請求項６〜８記載の形質転換体。
- 形質転換植物の製造過程において、請求項１記載の植物プロモーターを植物細胞に導入し該プロモーターの制御下に遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とする形質転換植物の製造方法。
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