CN116144616A - 与水稻抗病相关的OsCYP51H4蛋白质及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与水稻抗病相关的OsCYP51H4蛋白及其编码基因与应用。所述OsCYP51H4蛋白的氨基酸序列如序列2所示。本发明通过在野生型水稻中花11中过表达OsCYP51H4蛋白质，获得OsCYP51H4过表达株系，通过敲除野生型水稻中的OsCYP51H4基因，获得了两个OsCYP51H4敲除突变体材料Oscyp51h4‑2和Oscyp51h4‑4，并通过对OsCYP51H4过表达株系和OsCYP51H4敲除突变体材料的抗病性进行分析发现：OsCYP51H4基因突变后，植株更容易受到尖孢菌的侵染而发病，而过表达该基因可以提高水稻对尖镰孢菌的抗性。说明OsCYP51H4蛋白可调控水稻抗病性。

Description

与水稻抗病相关的OsCYP51H4蛋白质及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及与水稻抗病相关的OsCYP51H4蛋白质及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是重要的粮食作物，立枯病是水稻旱育秧苗期最严重的病害之一。近年来，在北方稻区发病逐年加重，对水稻苗期生长和旱育壮秧构成了巨大威胁。水稻立枯病主要发病时期为2叶1心期，苗床表现是水稻苗分布不均匀；发病植株根部变成黄褐色，茎基部出现褐色病斑随后逐渐变为灰白色并枯烂，不易将秧苗连根拔出；叶片不展，叶片心叶枯黄，叶尖不吐水。有报道称尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的致病性相对较强，确定其为黑龙江省水稻立枯病的主要致病菌之一。
目前，采用化学防控和农业防治的手段，均无法有效控制病害的发生，且成本高，对环境污染大。因此，深入挖掘抗病基因，将有利于推动水稻抗立枯病分子辅助育种，加快水稻抗病育种进程。改良植物抗病性，对于作物育种和农业生产具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质，本发明提供的蛋白质来源于水稻，其名称为OsCYP51H4，所述OsCYP51H4蛋白质为如下(a1)-(a4)任一所述的蛋白质：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性相关的蛋白质；
(a4)与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗病性相关的蛋白质。
上述(a2)所述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述(a3)所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(a4)所述蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述(a1)-(a4)任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明的另一个目的是提供编码OsCYP51H4蛋白质的核酸分子。
上述所述核酸分子为如下(b1)或(b2)任一所述的DNA分子：
(b1)序列表中序列1或序列3所示的DNA分子；
(b2)与(b1)具有75％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsCYP51H4蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OsCYP51H4核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsCYP51H4蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”是指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保护范围。
所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达OsCYP51H4蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动OsCYP51H4转录的启动子，还可包括终止OsCYP51H4转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为含有序列1所示的用于编码OsCYP51H4蛋白质的DNA分子的载体。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
所述重组微生物可为含有上述核酸分子或上述表达盒或上述重组载体的酵母、细菌、藻和真菌。所述细菌具体可为农杆菌。
本发明还有一个目的是提供上述OsCYP51H4蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体或重组微生物的新用途。
本发明提供了上述OsCYP51H4蛋白质或上述核酸分子或上述表达盒、重组载体或重组微生物在如下(c1)-(c3)任一种中的应用：
(c1)调控植物抗病性；
(c2)培育抗病性提高的转基因植物；
(c3)植物育种。
所述调控植物抗病性具体体现为：当植物中OsCYP51H4蛋白质活性被抑制或不表达OsCYP51H4蛋白质时，该植物抗病性降低；当植物中OsCYP51H4蛋白质含量提高或过表达OsCYP51H4蛋白质时，该植物抗病性提高。
本发明还有一个目的是提供抑制上述OsCYP51H4蛋白质的物质的新用途。
本发明提供了抑制上述OsCYP51H4蛋白质的物质在如下(d1)-(d3)任一种中的应用：
(d1)降低植物抗病性；
(d2)培育抗病性降低的转基因植物；
(d3)植物育种。
进一步的，所述抑制上述OsCYP51H4蛋白质的物质可为抑制上述OsCYP51H4蛋白质活性的物质或抑制编码上述OsCYP51H4蛋白质基因表达的物质或敲除编码上述OsCYP51H4蛋白质基因的物质。
所述抑制上述OsCYP51H4蛋白质活性的物质可为任何能够使植物中上述OsCYP51H4蛋白质活性缺失的物质，如抑制上述OsCYP51H4蛋白质合成或促进上述OsCYP51H4蛋白质降解或抑制上述OsCYP51H4蛋白质功能的蛋白质、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制剂)。
所述抑制编码上述OsCYP51H4蛋白质基因表达的物质可为任何能够使植物中编码上述OsCYP51H4蛋白质的基因无法表达的物质，如沉默植物中编码上述OsCYP51H4蛋白质基因的物质(如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等)。
所述敲除意味着携带敲除物质的宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物，敲除物质可以是以任何方式实现宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分(例如启动子编辑)使得编码基因序列不被转录、通过与mRNA的结合阻止翻译等。通常，敲除在基因组DNA水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。进一步的，所述敲除编码上述OsCYP51H4蛋白质基因的物质可为任何能够使植物中编码上述OsCYP51H4蛋白质的基因发生突变(所述突变形式可为缺失突变和/或插入突变和/或碱基替换)从而失去活性的物质，如锌指蛋白ZFN基因编辑系统或TALENs基因编辑系统或CRISPR/Cas9基因编辑系统等。
更进一步的，所述敲除编码上述OsCYP51H4蛋白质基因的物质为CRISPR/Cas9基因编辑系统。
在本发明的具体实施例中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶序列如序列4所示。
本发明还有一个目的是提供一种培育抗病性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育抗病性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中OsCYP51H4蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物。
进一步的，所述提高受体植物中OsCYP51H4蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达OsCYP51H4蛋白质。
更进一步的，所述过表达的方法为将编码上述OsCYP51H4蛋白质的核酸分子导入受体植物。
本发明最后一个目的是提供一种培育抗病性降低的转基因植物的方法。
本发明提供的培育抗病性降低的转基因植物的方法为如下1)或2)：
1)包括抑制受体植物中上述OsCYP51H4蛋白质，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性低于所述受体植物；
2)用序列5或序列6所示的DNA分子替换植物OsCYP51H4基因中序列1第168-187位所示的DNA分子，得到抗病性降低的转基因植物。
所述1)中，所述抑制受体植物中上述OsCYP51H4蛋白质的方法为将上述抑制所述OsCYP51H4蛋白质的物质导入受体植物中。
所述2)中，所述替换为纯合型替换，即同源染色体中发生相同的替换。
上述任一所述应用或方法中，所述抗病性为对尖孢镰孢菌所致病害的抗性。所述尖孢镰孢菌具体可为Fo21菌株。
上述任一所述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。进一步的，所述单子叶植物可为水稻。更进一步的，所述水稻为野生型水稻中花11。
本发明提供了一种来源于水稻的OsCYP51H4蛋白质，通过在野生型水稻中花11中过表达OsCYP51H4蛋白质，获得OsCYP51H4过表达株系，通过敲除野生型水稻中的OsCYP51H4基因，获得了两个OsCYP51H4敲除突变体材料Oscyp51h4-2和Oscyp51h4-4，并通过对OsCYP51H4过表达株系和OsCYP51H4敲除突变体材料的抗病性进行分析发现：OsCYP51H4基因突变后，植株更容易受到尖孢菌的侵染而发病，而过表达该基因可以提高水稻对尖镰孢菌的抗性。说明OsCYP51H4蛋白可调控水稻抗病性。
附图说明
图1为OsCYP51H4在不同时期不同组织部位的表达情况。G：萌发期；S：苗期；B：孕穗期；M：成熟期。
图2为OsCYP51H4的亚细胞定位。
图3为pCAMBIA1302-OsCYP51H4载体的结构示意图。
图4为OsCYP51H4基因敲除突变体的核苷酸(A)及氨基酸(B)序列。
图5为OsCYP51H4基因的qRT-PCR分析。
图6为OsCYP51H4突变体和过表达植株的抗病性分析(Bar＝1cm)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的培养基及其配方具体如下：
NB2诱导愈伤培养基：N6培养基+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+300mg/L水解酪蛋白，7g/L琼脂粉，pH 5.8。
NB1愈伤继代培养基：N6培养基+0.5mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+300mg/L水解酪蛋白，7g/L琼脂粉，pH 5.8。
NB2C共培养基：NB2培养基+10g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮(AS)，pH5.2。
NB1S1筛选培养基I：NB1培养基+50mg/L潮霉素+250mg/L替卡西林，7g/L琼脂粉，pH5.8。
NB1S2筛选培养基II：NB1培养基+100mg/L潮霉素+200mg/L替卡西林，7g/L琼脂粉，pH 5.8。
AAM-AS培养基：AAM盐分和氨基酸+MS维生素+100μmol/L乙酰丁香酮(AS)，pH 5.2。
RE1预分化培养基：MS盐分和维生素+300mg/L水解酪蛋白+1mg/L 6-BA+0.5mg/LKT+0.2mg/L ZT+0.25mg/L NAA+100mg/L潮霉素+250mg/L替卡西林+30g/L蔗糖+30g/L山梨醇，10g/L琼脂粉，pH 5.8。
RE2预分化培养基：MS盐分和维生素+300mg/L水解酪蛋白+1mg/L 6-BA+0.5mg/LKT+0.2mg/L ZT+0.25mg/L NAA+50mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+30g/L山梨醇，10g/L琼脂粉，pH5.8。
生根培养基：1/2MS培养基+0.5mg/L NAA，7g/L琼脂粉，pH＝5.8。
下述实施例中的pCambia1302载体记载于文献“Liu L,Zheng C,Kuang B,Wei L,Yan L,Wang T(2016)，Receptor-Like Kinase RUPO Interacts with PotassiumTransporters to Regulate Pollen Tube Growth and Integrity in Rice.PLoS Genet12(7):e1006085”中。
下述实施例中的pOs-sgRNA和pH-Ubi-cas9-7载体系统均记载于文献“Jin Miaoetal.,Targeted mutagenesis inrice using CRISPR-Cas system.Cell Research(2013)
23:1233-1236.”中。
下述实施例中的尖孢镰孢菌Fo21菌株记载于文献“张俊华等，水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌致病力降低T-DNA突变体的筛选与插入位点鉴定”中。
实施例1、OsCYP51H4的表达模式分析
为了研究OsCYP51H4的功能，本实施例检测了野生型粳稻品种中花11(ZH11)16个组织部位中该基因的表达情况，包括：萌芽期的胚根、胚芽和胚乳；苗期的根、茎、叶片和短缩茎；孕穗期的稻壳、水稻节、雌蕊、叶鞘、雄蕊和叶片；成熟期的稻壳、胚和胚乳。具体步骤如下：
用华越洋生物科技有限公司生产的超快新型植物RNA提取试剂盒(Quick RNAIsolation Kit)提取水稻不同发育时期不同组织部位的总RNA。用反转录试剂盒FastQuantRT Kit(with gDNase)(天根，KR106)进行反转录。从反转录所得cDNA中扩增该基因，以OsActin(Os03g50885)基因的表达作为内参。
OsCYP51H4的引物序列如下：
qPCR-OsCYP51H4-F：5'-GACACAAGGAACGAGCAGCAT-3'；
qPCR-OsCYP51H4-R：5'-TCAGATCAACCACGCCACACT-3'。
内参基因的引物为：
OsActin-F：5'-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3'；
OsActin-R：5'-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3'。
PCR反应体系如下：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 3μL，ddH2O 6.2μL。
PCR反应程序如下：95℃30s；95℃10s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。
使用Delta Delta CT relative quantitation法(2-ΔΔCT法)分析该基因在不同组织部位中的表达量。
结果如图1所示，OsCYP51H4在所选取不同时期的不同组织部位均有表达，其中孕穗期的叶片表达量最高，其次是孕穗期的雌蕊和苗期的叶片。推测其可能参与组织特异的生物功能。
实施例2、OsCYP51H4的亚细胞定位分析
植物P450是膜结合蛋白，主要与内质网(ER)相关，偶尔与质体相关。使用蛋白定位的预测软件(http://psort.hgc.jp/)，预测CYP51H4主要定位于ER。
1、构建亚细胞定位载体
(1)在水稻基因注释网站Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上下载OsCYP51H4的编码区序列。用软件Primer Premier6.0设计目的基因编码区的引物，设计好的引物分别加上用于BP反应的同源重组序列并委托上海美吉生物医药科技有限公司合成。引物序列如下：
PGWB505-OsCYP51H4-GFP-F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGATCACATATTCTCC-3'；
PGWB505-OsCYP51H4-GFP-R：
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGGAAAGCGTCCGTCTCTT-3'。
(2)以cDNA为模板采用步骤(1)中的引物进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：5×KAPA Buffer A 5μL，dNTP(10mM)0.5μL，F(10μm)1.25μL，R(10μm)1.25μL，plasmids 100ng，KAPA 0.1μL，ddH2O补齐25μL。
PCR反应程序如下：95℃3min预变性；95℃15s，55℃15s，72℃2min，接35个循环；终延伸72℃5min。用1％的琼脂糖凝胶电泳，电压80V，1h 30min，切胶回收。
(3)将保存于-80℃携带入门载体pDONR207质粒的大肠杆菌DB3.1活化并提取质粒。通过同源重组(BP反应)将目的序列整合至pDONR207。BP反应体系如下：PCR回收产物(10-20ng/μL)1μL，pDONR207 plasmid(50ng/μL)3μL，BP Mix 1μL。用枪头轻轻吹吸均匀，25℃孵育1h。取2μL反应液加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，吹吸混匀，迅速插入冰中静置20min，42℃热激90s，迅速插入冰中静置2min，在超净台中加入750μL LB液体培养基(不加任何抗生素)，置于摇床中培养，37℃，200rpm培养45min；取50μL培养好的菌液涂布于LB+Strep(streptomycin，100μg/mL)固体培养基上，37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。待单菌落长出后，挑取单菌落于400μL LB+Strep(100μg/mL)液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养4h；利用载体引物(pDONR-F：5'-TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC-3'；pDONR-R：5'-GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC-3')进行阳性克隆鉴定；提取阳性克隆的质粒，取1μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测浓度，-20℃保存备用。回收完成后取1μL检测质粒质量和浓度。通过同源重组(LR反应)将目的片段整合至表达载体PGWB505，LR反应体系如下：PGWB505 plasmid(40ng/μL)1μL，线性化的重组载体(5-20ng/μL)2μL，LR Mix 0.5μL。25℃过夜。转化步骤同上。当单菌落长出后，挑取单菌落于400μL LB+Strep(100μg/mL)液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养4h；利用引物(PGWB505-F：5'-CATTTGGAGAGAACACGGG-3'和PGWB505-R：5'-CCGGACACGCTGAACTTGTGG-3')进行阳性克隆鉴定；提取阳性克隆的质粒，取1μL质粒检测质粒质量和浓度，-20℃保存备用。
2、将制备好的表达载体导入农杆菌EHA105。
(1)将浸泡于75％酒精保护液中的电击杯用无水乙醇冲洗一遍，放置于超净台中晾干。
(2)提前将电击杯进行彻底冰浴，大约需10min；取100ng质粒加入100μL农杆菌EHA105感受态细胞中，轻轻吹吸混匀2-3次，随即转入电击杯中，防止产生气泡，盖上杯盖。
(3)设置电击仪为1800V，将电击杯放入电击仪中，听到“滴滴”两声后取出电击杯，迅速加入750μL LB液体培养基，28℃，200rpm，培养2-3h。
(4)取50-200μL培养好的菌液涂布于LB+Rif+Strep(两种抗生素浓度均为100μg/mL)固体培养基上，28℃倒置培养36h。
(5)待单菌落长出后，挑取单菌落接种于LB+Rif+Strep(两种抗生素浓度均为100μg/mL)液体培养基中，28℃，200rpm，培养36h。
3、烟草转化
(1)准备生长状态良好的3-4周的本氏烟草。
(2)取10μL阳性克隆菌液转接入30mL LB+Rif+Strep(两种抗生素浓度均为100μg/mL)的新鲜培养基中，置于摇床，28℃，200rpm，培养20-24h。
(3)2000g，离心15min收集菌体细胞。
(4)用MMA溶液(2-(N-吗啉)乙磺酸pH＝5.6 10mM，MgCl2 10mM，AS，100μM)重悬菌体细胞，调整OD600至0.6，室温静置2h。
(5)用注射器的针头在烟草叶片背面扎几个孔，然后拔掉针头用注射器进行注射，将注射过的叶片进行标记，2-3天后对烟草叶片精细荧光观察。
结果如图2所示。从图2中可以观察到OsCYP51H4-GFP融合蛋白和ER的标记HDEL:mCherry蛋白几乎有相似的荧光模式，表明OsCYP51H4与大多数的植物CYP450蛋白一样，主要定位在内质网(ER)上。
实施例3、OsCYP51H4过表达载体及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
一、OsCYP51H4过表达载体的构建
1、OsCYP51H4编码区的扩增
(1)在水稻基因注释网站Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上下载OsCYP51H4的编码区序列。
(2)用软件Primer Premier 6.0设计目的基因编码区的引物，设计好的引物分别加上18bp的表达载体序列并委托上海美吉生物医药科技有限公司。引物序列如下：
51H4-SpeI-OE-GFP-F：5'-CCACCATGGTAGATCTGAATGGATCACATATTCTCC-3'；
51H4-SpeI-OE-GFP-R：5'-CCTTGCTCACCATACTAGAGGAAAGCGTCCGTCTCT-3'。
(3)以野生型水稻中花11号的总RNA反转录的cDNA作为模板扩增目的片段。
PCR反应体系如下：2×PCR buffer for KOD FX 10μL，2mM dNTP 2μL，KOD FX(1U/μL)0.5μL，Forward primer(10μΜ)1μL，Reverser primer(10μM)1μL，cDNA0.5μL，ddH2O 4μL，总体积20μL。
PCR反应程序如下：94℃2min；98℃10s，68℃30s，68℃2min，35个循环；68℃10min。
PCR反应结束后取1μL用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小是否正确。使用GenStar公司的StarPrep Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收上述扩增产物。
2、过表达载体pCambia1302的线性化
用SpeⅠ将改造过的pCambia1302载体进行酶切，得到线性化载体。酶切体系如下：10×H buffer 20μL，SpeⅠ(Takara)2μL，plasmid 10μL，ddH2O 8μL，总体积40μL。酶切反应在37℃进行，反应时间为5h左右，具体时间根据电泳检测酶切效果确定。酶切反应所得目的片段的回收使用GenStar公司的StarPrep Gel Extraction Kit胶回收试剂盒。
3、pCambia1302-OsCYP51H4载体的构建
将线性化载体(酶切产物)与插入片段(扩增产物)按照摩尔比为1:2的比例进行重组反应，50℃反应5min，得到重组产物；降至4℃或立即置于冰上冷却。取5-10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。加入900μL LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。5,000rpm(2,500×g)离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12-16h。挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定。菌落PCR鉴定为阳性的菌落，可再将剩余菌液接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定，或直接进行一代测序。鉴定结果正确的载体命名为pCambia1302-OsCYP51H4(图3)。
测序结果表明：pCambia1302-OsCYP51H4载体为将序列3所示的DNA分子插入pCambia1302载体的SpeⅠ酶切位点处，且保持pCambia1302载体其它序列不变后得到的载体。pCambia1302-OsCYP51H4载体表达OsCYP51H4蛋白，OsCYP51H4蛋白的氨基酸序列如序列2所示。
二、CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
使用pOs-sgRNA和pH-Ubi-cas9-7载体系统构建用于敲除OsCYP51H4的CRISPR/Cas9基因编辑载体。具体构建步骤如下：
1、靶序列的设计和引物对的合成
利用CRISPOR网站(http://crispor.tefor.net/)设计gRNA靶点序列，并使用Cas-offinder网站(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)评估脱靶情况。该靶点序列后特征序列为NGG序列(即PAM序列)，靶点序列长度为20bp，为提高Cas9蛋白切割效率，5'端第一位设定为G。
OsCYP51H4-gRNA靶点序列如下：5'-GAAGACGAGCAAGCCGCGGC-3'(序列4)。
合成OsCYP51H4靶序列的引物对如下：
OsCYP51H4-gRNA-F：5'-TGTGTGAAGACGAGCAAGCCGCGGC-3'；
OsCYP51H4-gRNA-R：5'-AAACGCCGCGGCTTGCTCGTCTTCA-3'。
2、中间载体的构建
通过退火反应使对应的两条单核苷酸引物形成二聚体结构，经Bsa I酶切后与pOs-sgRNA载体连接，形成含有水稻OsCYP51H4基因靶点序列的pOs-sgRNA-OsCYP51H4-spacer重组质粒。
3、CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
利用invitrogen LR Clonase II催化克隆载体pOs-pOs-sgRNA-OsCYP51H4-spacer和表达载体pH-Ubi-cas9-7进行LR反应，形成pH-Ubi-cas9-7-OsCYP51H4-spacer重组载体，该载体即为CRISPR/Cas9基因编辑载体。重组质粒通过热激法转化大肠杆菌DH5α后进行测序鉴定和质粒提取。
实施例4、水稻转基因植株的创制与鉴定
1、水稻转基因植株的创制
将pCambia1302-OsCYP51H4载体或CRISPR/Cas9基因编辑载体通过电击法转化农杆菌EHA105，然后用含有目标载体的农杆菌浸染野生型水稻中花11号成熟胚胚性愈伤，获得水稻转基因植株。具体步骤如下：
挑选饱满成熟的水稻种子去除颖壳，置于70％乙醇中表面消毒5min，然后在0.1％HgCl中消毒10min(或20％ NaClO中消毒20min)，消毒完成后用无菌水冲洗数次，使种子表面尽量不残留消毒物质，将处理好的种子置于无菌水中浸泡5-15h。在超净台中，切取种子胚放于NB2诱导培养基上，将切面接触培养基，每个培养皿放置20粒左右，于25℃暗培养4-5周。将诱导出的愈伤组织转接于继代培养基NB1上，25℃黑暗条件下培养2-3周；挑选浅黄色质地较密的胚性愈伤组织转移到新的NB1继代培养基上继续培养2-3周。选择生长良好的黄色致密胚性愈伤组织将其切成2mm大小，转移到新的NB1培养基上，25℃继续暗培养4-6天可用于转化。将愈伤浸泡在新鲜的AAM-AS重悬的OD600为0.5左右的农杆菌中20min左右，期间不时摇晃。倒掉菌液用移液枪吸干菌液，然后将愈伤块放到铺有滤纸的培养皿上5-10min，吸干愈伤表面的残液，然后转移到覆盖一层滤纸的NB2C共培养基上，25℃培养3-4天。将将共培养好的愈伤转移至NB1S1培养基上筛选培养两周，两周后转移到NB1S2筛选培养基上暗培养两代，每代15天左右，大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。将鲜黄色的抗性愈伤组织转移到分化培养基RE1上进行分化培养，先暗培养1周，再置于光下培养2-3周。将已分化出不定芽的愈伤组织转到分化培养基RE2上光照培养2周，如果状态不好可再RE2上继续诱导分化。分化出的植株长至2-3cm时，转移到1/2MS生根培养基上，培养两周左右，待小苗长至10cm左右时，打开容器封口膜，炼苗5-7天，即可移栽到培养间或大田。
2、水稻转基因植株的鉴定
(1)突变体阳性植株的鉴定
取生长状态良好的T0代植株叶片利用CTAB法提取DNA，用潮霉素抗性基因的检测引物筛选阳性植株，引物序列具体如下：
Hyg-F：5'-CGAGAGCCTGACCTATTGCAT-3'；
Hyg-R：5'-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3'。
对筛选到的阳性植株进行PCR鉴定，Sanger测序分析靶序列的变化，若发生纯合突变则为有效的基因敲除植株，可在T0代直接观察表型；若为杂合突变，还需在T1代分离后观察纯合突变体的表型。
鉴定OsCYP51H4靶序列的引物对如下：
gRNA-F：5'-TAAAGCAGAGGCAGCAGAGG-3'；
gRNA-R：5'-CCCAAGTGACCTGAGCGTAA-3'。
选取两个阳性的OsCYP51H4敲除突变体材料记为Oscyp51h4-2和Oscyp51h4-4，核苷酸及氨基酸序列突变情况如图4所示。
与野生型水稻中花11的序列相比，Oscyp51h4-2的区别仅在于在OsCYP51H4基因(序列3)两条同源染色体上均发生了碱基A插入，该碱基A插入位置位于序列1第117位和第118位之间，导致蛋白翻译提前终止。
与野生型水稻中花11的序列相比，Oscyp51h4-4的区别仅在于在OsCYP51H4基因(序列3)两条同源染色体上均发生了碱基缺失，该缺失碱基位于序列1第117位，导致蛋白翻译提前终止。
(2)过表达阳性植株的鉴定
组培苗转移至培养间后，等待3-4周植株生长稳定状态良好，取少量叶片利用CTAB法提取DNA或取幼嫩叶片进行直扩。用潮霉素抗性基因的检测引物筛选阳性植株，引物序列如下：
Hyg-F：5'-CGAGAGCCTGACCTATTGCAT-3'；
Hyg-R：5'-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3'。对照阴性对照、阳性对照，扩增出目的片段的植株即为阳性转基因植株，命名为OsCYP51H4-OE。并对阳性转基因植株和野生型水稻中花11进行基因表达量的验证。
荧光定量引物序列如下：
qPCR-OsCYP51H4-F：5'-GACACAAGGAACGAGCAGCAT-3'；
qPCR-OsCYP51H4-R：5'-TCAGATCAACCACGCCACACT-3'。
内参基因的引物序列如下：
OsActin-F：5'-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3'；
OsActin-R：5'-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3'。
阳性转基因植株且基因表达量显著高于阴性对照的单株，在田间加代繁种后得到OsCYP51H4-OE的T1代转基因阳性材料，用于抗病性的分析。与野生型水稻中花11相比，OsCYP51H4-OE的T1代转基因阳性材料叶片中OsCYP51H4基因的表达量提高约40倍(图5)。
实施例5、OsCYP51H4突变体和过表达植株的抗病性分析
1、尖孢镰孢菌孢子悬浮液制备
实验前，将尖孢镰孢菌Fo21菌株于PDA(不含抗生素)培养基上进行活化，在28℃恒温箱中培养7d，待菌落长满培养皿。用打孔器打成直径5mm菌栓，投入PDA(不含抗生素)液体培养基中，28℃震荡培养72h后可以使用，浓度约为10 7个/mL。
2、病原菌接种水稻幼苗
以野生型水稻中花11、实施例4中制备的OsCYP51H4过表达阳性株系OsCYP51H4-OE及OsCYP51H4敲除突变体株系Oscyp51h4-2和Oscyp51h4-4的种子为实验材料，每个材料80-100粒左右，10％ NaClO消毒10min，用水冲洗后，培养箱内浸种，露白后育秧。在2叶-3叶期(12天左右)进行接种病原菌；设蒸馏水处理组为对照，冲洗干净后，浸入盛有100mL浓度为10 7个/mL的孢子悬浮液的培养瓶中，每瓶10棵左右，每个处理重复3次。水稻的培养条件是25℃，正常的光周期，约5天后观察表型。
结果如图6所示。在水处理第5天，野生型、突变体株系和过表达水稻株系的茎基部生长正常，无病斑出现。在尖孢镰孢菌(Fo21)接菌第5天，与野生型对照植株相比，突变体材料茎基部的病斑面积较大，颜色较深，即发病较野生型严重。而过表达材料在接菌后的第5天，与野生型相比，几乎没有病斑出现，即使出现发病症状明显较对照轻。由此可知，OsCYP51H4基因突变后，植株更容易受到尖孢菌的侵染而发病，而过表达该基因可以提高水稻对尖镰孢菌的抗性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种蛋白质，为如下(a1)-(a4)任一所述的蛋白质：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性相关的蛋白质；
(a4)与(a1)具有98％以上同一性且与植物抗病性相关的蛋白质。
2.与编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(b1)或(b2)任一所述的DNA分子：
(b1)序列表中序列1或序列3所示的DNA分子；
(b2)与(b1)具有75％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体或重组微生物在如下(c1)-(c3)任一种中的应用：
(c1)调控植物抗病性；
(c2)培育抗病性提高的转基因植物；
(c3)植物育种。
6.抑制权利要求1所述蛋白质的物质在如下(d1)-(d3)任一种中的应用：
(d1)降低植物抗病性；
(d2)培育抗病性降低的转基因植物；
(d3)植物育种。
7.一种培育抗病性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性高于所述受体植物。
8.一种培育抗病性降低的转基因植物的方法，为如下1)或2)：
1)包括抑制受体植物中权利要求1所述的蛋白质，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性低于所述受体植物；
2)用序列5或序列6所示的DNA分子替换植物OsCYP51H4基因中序列1第168-187位所示的DNA分子，得到抗病性降低的转基因植物。
9.根据权利要求5或6所述的应用或权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抗病性为对尖孢镰孢菌所致病害的抗性。
10.根据权利要求5-7任一所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；或，所述单子叶植物为水稻。
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