KR101640278B1 - 흰잎 마름병 및 도열병 저항성 인산화 효소 및 이를 이용한 형질전환 벼 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010가 활성화되도록 형질전환된 식물 형질 전환체, 상기 유전자를 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, LOC_Os01g65010 유전자를 활성화시키는 단계를 포함하는 벼의 병 저항성의 증진방법에 관한 것이다. 본 발명은 벼에 내재적으로 존재하였으나 활성이 없었던 흰잎 마름병 및 도열병에 대한 저항성 유전자, LOC_Os01g65010의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 흰잎 마름병 및 도열병에 대해 강력한 저항성을 갖는 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.

Description

흰잎 마름병 및 도열병 저항성 인산화 효소 및 이를 이용한 형질전환 벼{Kinase gene resistant to a bacterial blight and blast, and the transgenic plant using the same}

본 발명은 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010가 활성화되도록 형질전환된 식물 형질 전환체, 상기 유전자를 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, LOC_Os01g65010 유전자를 활성화시키는 단계를 포함하는 벼의 병 저항성의 증진방법에 관한 것이다.

벼 흰잎 마름병은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 에 의해서 발생되는 세균성 도관병으로, 발병시기는 7월 초∼수확기이나 주로 7월 상순∼8월 중순에 발병한다. 중간 기주식물인 줄풀 및 겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚 및 벼 그루터기에서 세균의 월동이 가능하다. 세균이 편모(鞭毛)에 의해 물을 따라 전염하고 벼잎의 물구멍과 공기구멍 부위 및 절단된 뿌리로 침입한다. 병 발생은 해마다 발생이 많은 상습발생지 위주로 발생하나 침관수지역이 아닌 지역에서도 발생이 많다.

보통 출수기 전후에 나타나나 상습발생지나 다발생 발생지에는 본답 초기에 발병하며, 드물게는 묘판에서도 발병된다. 국내에서 최초 발병보고는 1930년 전라남도 해남군에서 처음 발견된 이래 1960년까지 남부 일부 지역에 제한적인 발생을 보이다 이병성 품종인 금남풍의 재배 확대로 전국적인 발생을 나타내었으며, 이후 다수계 품종 재배에 의한 밀양 23호에 의해 피해가 확대되어 재배기간 중 후기에 발생되는 잎에서의 발병 뿐만 아니라 이앙 후 분얼기까지 주 전체가 발생되는 금성형 증상을 보여 벼의 3대 병해의 하나로 간주된다.

벼 흰잎 마름병균은 그람음성세균으로 분류되고 벼의 세균성 위조병을 유발하는 식물병원세균으로 세계적으로 널리 분포하여 벼에 큰 피해를 주지만, 병원균이 벼의 도관 내에서 증식하므로 약제방제 효과는 매우 낮으며, 현재까지 이 병에 특이적인 살균제 또한 없는 실정이다.

한편, 벼 도열병은 Magnaporthe gresea에 의하여 유발되는 병으로 전세계적으로 가장 파괴적인 질병 중의 하나이다. 병원균인 Magnaporthe gresea는 불완전균류에 속하며 분생포자를 형성하는데, 균사 발육 온도는 16~40℃이고 최적 온도는 27~29℃이다. 분생포자의 발아 최적온도는 25~28℃이다. 도열병균은 피해짚의 목 가지 마디에서 균사의 상태로 월동하거나, 잡초에서 월동한 후 다음해 전염원이 된다. 일단 벼 도열병균의 분생자경이 형성되고 분생포자 형성, 분생포자 이탈, 분생포자의 비산, 식물체에의 부착, 발아, 부착기형성, 침입, 병반형성의 과정을 거친다. 병발생 환경을 살펴보면 온도는 27~29℃와 90%이상의 습도에서 발병이 높다.

이에 대해 질병 저항성(R) 유전자를 사용하는 것이 상기 질병의 통제를 위한 가장 효과적이며 환경친화적인 방식이다. 벼 도열병 저항성은 일반적으로 하기의 2 가지 유형으로 분류된다; 질적 (완전 또는 주요) 및 양적 (부분 또는 QTL) (Bonman 및 Mackill 1988, Oryza 25: 103-110). 현재까지 벼 도열병에 대한 50 개를 초과하는 많은 수의 주요 저항성 유전자가 맵핑되었으며 (Jeung 등 2007, Theor. Appl. Genet. 115:1163-1177), 저항성 유전자에 밀접하게 연관된 DNA 마커가 개발되었다.

마그나포르테 그리세아(Magnaporthe gresea)에 대해 완전 저항성(complete resistance)을 가진 벼 재배종이 최근에 개발되었으나, 많은 경우에 보다 더 강력한 악성 균주의 출현으로 상기 저항성은 해당 계통의 초기 재배 수년 내에 소실되었다(Bonman 및 Mackill 1988, Oryza 25: 103-110).

또한, 기존의 작물에 대한 저항성 부여방법은 외래 유전자의 도입을 통해 식물체로 하여금 새로운 형질을 부여하는 기술이 대다수였다.

한편, 동진벼는 내병, 양질, 다수성 신품종육성을 목표로 1975년에 농촌진흥청에서 금남풍과 낙동벼 그리고 사도미노리를 교배하여 개발된 품종으로, 병해 저항성의 경우 줄무늬잎마름병에 강하고, 도열병에는 중간 정도의 저항성을 가지며, 흰잎 마름병과 기타 병충해에는 약한 편이다. 이에, 동진벼의 흰잎 마름병과 도열병에 대한 저항성 연구와 개량된 품종에 대한 육성 전략이 요구되고 있다. 또한, 화영벼는 양질, 내병, 다수성등의 유용형질을 개선하고자 쥬케이830과 도열병 및 줄무늬잎마름병에 강한 YR4811Acp 8을 교배하여 육성한 품종으로, 도열병이나 줄무늬흰잎 마름병, 흰잎 마름병에 강한 품종으로 알려져 있으나 외래병균이나 병균의 빠른 저항성 극복을 고려할 때 지속적인 저항성 강화 연구가 필요하다.

이에 본 발명자들은 아직 극복되지 못한 벼 흰잎 마름병 및 도열병에 대한 저항성 유전자를 동정하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 재배벼 동진/화영의 보유 유전자 중 발현이 없는 유전자 중에 흰잎 마름병 및 도열병에 저항성을 부여하는 인산화 효소 유전자(LOC_Os01g65010)를 동정해내어, 이를 과발현시킨 형질전환체가 흰잎 마름병 및 도열병에 저항성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010가 활성화되도록 형질전환된, 식물 형질 전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010을 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 병 저항성 증진용 재조합 벡터로 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는 병 저항성이 증진된 형질전환체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 LOC_Os01g65010 유전자를 활성화시키는 단계를 포함하는 벼의 병 저항성의 증진방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010가 활성화되도록 형질전환된, 식물 형질 전환체를 제공한다.

본 발명에서는 벼에 내재적으로 존재하였으나 활성이 없었던 유전자, LOC_Os01g65010의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 해당 유전자를 발현하여 흰잎 마름병 및 도열병에 대해 저항성을 갖춘 형질전환벼를 제조하였다.

본 발명에서 용어, "내재적"이란 생물이 천연의 상태로 가지고 있는 것을 의미하는데, 본 발명에서는 식물, 바람직하게는 벼(Oriza sp.)가 천연적으로 가지고 있는 유전자를 표시할 때 사용한다.

본 발명에서 용어, "내재적 불활성 유전자"란 DNA, 즉 유전자 상으로는 존재하나 RNA로 전사(transcription)되지 못하거나, 단백질로 번역(translation)되지 못하여 본연의 기능을 발휘하지 못하는 것을 의미하고, 본 발명에서는 벼가 내재적으로 가지고 있는 유전자가 전사 또는 번역되지 않는 특성상 그 기능을 발현하지 못하는 것을 의미하고, 특히, LOC_Os01g65010 유전자가 그 기능을 발현하지 못하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "LOC_Os01g65010" 는 Oryza sativa 1번째 유전체(chromosome)에 존재하는 유전자로, 이의 발현물은 세린/쓰레오닌 단백질 인산화 수용체의 전구체로 nRD 인산화 효소의 일종이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서 LOC_Os01g65010 유전자는 천연형 벼에서 불활성화되어 있는 것을 확인하였으며(도 3), 이의 활성을 유도한 형질전환을 통하여 해당 형질전환체가 병 저항성을 가지는 것을 확인하였다(도 4). 특히, 흰잎 마름병 및 도열병에 대하여 병 저항성을 가졌다.

본 발명에서 상기 내재적 불활성 유전자는 바람직하게는 LOC_Os01g65010 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 8로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명에서 용어, "활성화"는 특정 유전자의 활성을 강화시키는 것을 의미하고, 1) 해당하는 유전자를 1 카피 이상 도입, 2) 내재적 유전자의 발현 조절 부위에 발현을 유도하는 서열을 삽입, 3) 활성이 강화된 형태로 변형시키는 방법으로 강화, 또는 4) 이의 조합에 의해 활성화되도록 변형시킬 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 내재적 유전자의 발현 조절 부위에 발현을 유도하는 서열 또는 프로모터(promoter)를 삽입할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 9로 기재되는 발현 유도 서열을 포함하는 서열을 삽입할 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 서열을 삽입할 수 있다.

본 발명에서 용어, "발현 유도 서열"은 유전자의 발현 조절 부위에 존재할 때 발현을 촉진하는 기능을 하는 서열을 제한없이 포함하며, 전사인자 결합 부위, 인핸서(enhancer), 조효소 결합 부위(co-factor binding region) 등을 포함한다. 본 발명에서 내재적 불활성 유전자의 발현 조절 부위에 삽입되는 서열은 서열번호 9로 기재되는 발현 유도 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, LOC_Os01g65010 유전자의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열(서열번호 2)을 삽입함으로써, LOC_Os01g65010의 유전자가 발현되는 것을 확인하였다(도 3).

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA 염기서열 상의 삽입, 결실 또는 대체 등의 변이를 통해 특정 형질이 발생하거나 사라지거나 조절되는 모든 행위를 의미하며, 특히 본 발명에서는 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어, "형질 전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환 식물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 활성의 변이가 유발되어 생성된 유전자 재조합체를 포함한다.

본 발명에서 용어, "식물 형질 전환체"는 형질전환의 대상이 될 수 있는 모든 식물을 포함하며, 특히, LOC_Os01g65010 유전자 또는 이에 해당하는 유전자가 불활성화되어 있는 식물은 모두 제한없이 포함한다. 바람직하게는 상기 식물 형질 전환체는 벼(Oryza sp.)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동진벼 또는 화영벼일 수 있다.

본 발명에서 상기 식물 형질 전환체는 흰잎 마름병, 도열병 또는 둘다에 대한 저항성을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 동진벼에 상기 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010의 발현 조절 부위에 서열번호 2의 발현 유도 서열을 삽입하는 형질전환을 통하여 LOC_Os01g65010에 해당하는 유전자가 발현하는 흰잎 마름병 및 도열병에 저항성을 갖는 형질전환체를 제조하였으며, 이를 nRDK-18이라고 명명하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010을 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

상기 내재적 불활성 유전자, LOC_Os01g65010 및 발현 유도 서열은 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "병 저항성"은 각종 질병에 대해 발병이 잘 일어나지 않거나, 발병되더라도 병 진행의 속도가 현저히 느리거나, 회복이 되는 능력이 뛰어난 것을 의미한다. 본 발명에서 병 저항성은 흰잎 마름병, 도열병 또는 둘다에 대한 저항성을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"는 특정 서열이 변이, 삽입 또는 제거되는 유전자 재조합 과정을 거친 벡터를 의미하며, 바람직하게는 발현 유도 서열이 삽입된 벡터를 의미하고, 더욱 바람직하게는 해당 발현 유도 서열을 LOC_Os01g65010의 발현 조절 부위에 삽입할 수 있는 기능을 하는 재조합 벡터를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는, T-DNA를 포함하는 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 아그로박테리움을 통해 벼 세포에 도입하여, LOC_Os01g65010의 발현 조절 부위에 T-DNA 서열이 삽입되어 내재적 불활성 유전자였던 LOC_Os01g65010 유전자가 발현이 유도되었다(도 3).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010을 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계; 벼 잎에 상기 아그로박테리움을 감염시키는 단계 및 감염된 벼 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는 병 저항성이 증진된 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 그람양성의 세균으로, 식물의 뿌리나 줄기의 상처를 통해 식물세포에 감염되어, 자신이 가지고 있는 유전자를 식물 세포의 유전체에 삽입하여 식물세포의 형질전환을 일으키는 암종세균의 일종이다. 본 발명에서 상기 아그로박테리움은 바람직하게는 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

본 발명에서 용어, "캘러스(callus)"란, 식물에 상처가 났을 때 생기는 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 즉, 미분화세포를 의미하며, 특히, 본 발명에서는 식물의 잘린 부위에 아그로박테리움 등 형질전환용 암종세균을 감염시켰을 때 감염된 세포가 미분화상태로 상처부위에 덩어리진 것을 의미한다. 즉, 본 발명에서는 암종세균에 감염되어 형질전환된 세포만이 암종 덩어리를 생성하는 특징을 이용하여 형질전환된 미분화세포를 얻을 수 있는데 이것이 캘러스 형태로 생성되게 된다.

상기 병 저항성이 증진된 형질전환체의 제조방법은, 바람직하게는 수득된 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 캘러스는 상기 설명한대로 미분화된 상태의 세포 덩어리에 불과하기 때문에, 이를 온전한 종자로 수득하기 위해서는 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하는 것이 필요할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 수득된 캘러스를 루트-인덕션 배지에서 배양하여 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하였다.

또 하나의 양태로, 본 발명은 LOC_Os01g65010 유전자를 활성화시키는 단계를 포함하는 벼의 병 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명의 LOC_Os01g65010 유전자, 활성화 및 병 저항성 등은 상기 설명한 바와 같다.

본 발명은 벼에 내재적으로 존재하였으나 활성이 없었던 흰잎 마름병 및 도열병에 대한 저항성 유전자, LOC_Os01g65010의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 흰잎 마름병 및 도열병에 대해 강력한 저항성을 갖는 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.

도 1은 흰잎 마름병 및 도열병에 대한 저항성과 관련된 유전자로 선별된 LOC_Os01g65010의 구조에 대한 개요도로, 도 1의 A는 유전자 상의 구조를 나타내며, 도 1의 B는 유전자가 발현된 단백질의 구조를 나타낸다. 이에 표시된 SP는 단백질의 막관통을 유도하는 신호 펩티드(Signal peptied) 도메인을 의미하고, Lectin은 렉틴 단백질 도메인을 의미하며, TM은 막관통 도메인(Transmembrane domain)을 의미하고, PK는 단백질 인산화 효소 활성 부분(Protein kinase)을 의미한다.
도 2는 LOC_Os01g65010의 발현을 조절하는 부위에 T-DNA를 포함한 유전자 발현 유도 서열이 삽입된 nRDK-18 유전자 변형 벼의 게놈 DNA의 일부분을 나타내는 구조도이다.
도 3은 nRDK-18 유전자 변형 벼에서 LOC_Os01g65010의 발현을 확인하는 RT-PCR 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 nRDK-18 유전자 변형 벼의 흰잎 마름병 또는 도열병에 대한 저항성을 실험한 결과를 보여주는 도면으로, 도 4의 A는 천연형 벼 및 nRDK-18 유전자 변형 벼의 흰잎 마름병균을 가위 접종법으로 접종한 결과를 보여주는 사진이고, 도 4의 B는 천연형 벼 및 nRDK-18 유전자 변형 벼의 도열병을 펀치 접종법으로 접종한 결과를 보여주는 사진이며, 도 4의 C 및 D는 각기 전자와 후자를 측정하여 평균 낸 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Bioinformatics를 통한 형질전환 타겟 유전자 선별

동진/화영벼의 유전체가 보유한 식물체의 질환 저항성과 밀접한 관련이 있다고 알려진 nRD(non-Arginine-Aspartate) 인산화 효소 448개를 동정하였다. 이 중, bioinformatics tool(Web site: http://www.ricearray.org, Program: Mev- Multi Experimet Viewer)을 이용하여 흰잎 마름병 및 도열병에 저항성을 가질 확률이 높은 유전자를 61개 선별하였다. 선별된 유전자에 대하여 형질전환체를 제조하여 병 저항성을 갖는 유전자를 동정해 내는 과정에서, 본 발명의 LOC_Os01g65010이 흰잎 마름병 및 도열병에 저항성을 갖는 유전자로 선별되었다(*p< 1.8).

이 과정에서 총 448개의 nRD 인산화 효소에서 단 5개의 유전자만이 병 저항성과 관련된 신규한 유전자였다. 상기 벼의 내재적인 병 저항성 관련 후보 nRD 인산화 효소 유전자 중에서 실제적으로 병 저항성과 관련된 유전자는 1.1% 뿐이었으며 또한, 흰잎 마름병 및 도열병 동시에 저항성을 갖게 하는 유전자는 오직 1개 뿐이었다.

실시예 2. 발현 유도체 삽입된 형질전환 벼 제조

2-1. 벼 형질전환용 재조합 벡터 제조

타겟 유전자의 발현 조절 부위의 염기서열에 발현 유도 서열을 삽입하기 위해 벡터를 제작하였다.

먼저, 유전체 삽입을 위한 T-DNA, 삽입위치의 왼쪽 유전자 서열을 확인하기 위한 N-GUS, 서열번호 9의 유전자의 발현 유도 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위한, 담배 잎 모자이크바이러스 35S 프로모터 유래 DNA, 삽입위치의 dhfmsWHr 유전자 서열을 확인하기 위한 L-0.5/1.5를 가지는 벡터를 제작하였다. 삽입된 유전체로부터 타겟 유전자의 확인과 증폭을 위한 프라이머는 아래와 같다.

Enhancer-F (정방향, 서열번호 3)

5'-ccggtaccATGGCGGCGGTGGTGGAGGG-3'

Enhancer-R (역방향, 서열번호 4)

5'-ccggatccTTAGCTTAGAGATGAGACGAA-3'

PCR 증폭 조건은 처음 DNA의 열변성을 위하여 94℃에서 3분간 1 cycle, 그리고 94℃ 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 2분간으로 총 35 cycle을 실시하였으며, 최종 DNA합성은 7분으로 하였다.

해당 증폭된 PCR 산물을 1.0%의 아가로즈겔(agarose gel)로 전기영동 한 후 EtBr(ethidium bromide) 용액에 염색하여 UV lamp하에서 염기 크기에 해당하는 band를 절단하여 아가로즈겔(agarose gel) 정제법으로 정제하였다.

추출한 PCR 산물을 상기 제한효소 NotⅠ/KpnⅠ으로 절단하였다. 또한, 재조합 벡터인 pGA2772 벡터를 제한효소 NotⅠ/KpnⅠ로 절단하여, 절단된 벡터를 상기 아가로즈겔 정제법으로 정제하였다. 상기 PCR 산물에 의한 DNA 단편을 절단된 재조합 벡터에 삽입하여, 유래 발현 유도체 서열이 포함된 재조합 벡터를 제조하였다.

2-2. 형질전환체 제조

상기 제조된 벡터를 전기충격 방법(electroporation)을 이용하여 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하였다. 배양실에서 무균상태로 자란 화영벼에 리프 디스트(leaf disc)법으로 형질전환하였다. 구체적으로는 벼잎을 대략 5 x 5 mm 크기로 잘라서 200 ㎕의 아그로박테리움이 포함된 MSO 액체 배지(MS 염 4.3g, 수크로스 30g/L, pH 5.6 내지 5.8)에 넣었다가 암조건에서 2 내지 3일 동안 배양하고, 배양된 잎 절편을 캘러스-슈트(callus-shoot) 유도 배지(MSO배지에 100㎍ NAA, 1mg BA, 500㎍ 세포탁심, 1 mg 포스피노트리신(phospinothricin), 0.7% 피토 한천(phyto agar), pH 5.6)으로 옮기고, 새로운 배지로 옮겨 주었다. 유도된 발아는 1.5 내지 2 cm 정도 자라면 루트-인덕션 배지(MSO배지에 250㎍ 세포탁심, 10mg 포스피노트리신, 0.7% 피토 한천, pH 5.6)로 옮겨 주었다.

발현 유도체가 삽입된 상기 유전자 형질전환 벼를 nRDK-18로 명명하였으며, 이의 유전자 구조는 도 2에 개시된 바와 같다. 구체적으로는, 동진벼의 1번째 유전체에 존재하는 LOC_Os01g65010의 발현 조절 부위로 예측되는 상류 부분(upstream region)에 T-DNA 서열을 삽입하여, 도 2와 같은 유전체 구조를 가진 형질전환체를 제작하였다.

2-3. 재조합 벡터의 벼 유전체 삽입위치 확인

제조된 형질전환체의 유전체를 대상으로 타겟 유전자의 발현 유도를 위한 벡터의 삽입위치를 삽입된 벡터의 말단에 특이적인 프라이머를 사용하여 확인하였다.

이에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

pGA2772LiRS-F (서열번호 5)

5’-CAGGACGTAACATAAGGGACTGA-3’

상기 프라이머를 이용하여 확인한 결과, 재조합 벡터의 삽입 위치가 타겟 유전자의 발현 조절 부위임을 확인하였다.

실시예 3. 형질전환 벼의 유전자 활성 검증

상기 실시예 2에서 제조한 화영벼에서 발현되지 않는 LOC_Os01g65010 유전자의 발현 조절 부위에 발현 유도체를 삽입한 형질전환 벼(nRDK-18)에서 LOC_Os01g65010 유전자 활성을 역전사 효소 PCR(RT-PCR, reverse transcriptase-PCR)로 확인하였다.

구체적으로는, 형질전환 벼(nRDK-18)의 잎 0.1g에서 total RNA를 추출하였다. 이를 주형으로 하여 LOC_Os01g65010의 발현을 확인할 수 있는 RNA 역전사용 프라이머(정방향;5'-CTCACTGTGGTACAGAGACC-3', 서열번호 6, 역방향; 5'-GTGTTGTTGCCTTCACCATT-3', 서열번호 7)와 역전사 효소(reverse transcriptase DNA polymerase)를 이용하여 역전사 효소 PCR을 행하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 천연형의 화영벼에서는 LOC_Os01g65010dl 전혀 발현되지 않는데에 비하여 본 발명의 형질전환 벼에서는 LOC_Os01g65010가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 형질전환 벼의 병 저항성 검정

4-1. 형질전환 벼(nRDK-18)의 벼 흰잎 마름병에 대한 저항성 검정

상기 실시예 2에서 제조된 형질전환 벼가 흰잎 마름병에 대해 저항성을 보이는지 확인하기 위해, LOC_Os01g65010 발현 조절부위에 발현 유도체가 삽입된 형질전환 벼인 nRDK-18와 대조군으로 천연형 동진벼 및 기타 다른 nRD 인산화 효소 형질전환체를 6주간 키워 흰잎 마름병을 유발하는 균주인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae(strain : PXO99Az)를 가위에 묻혀 접종한 2주 후 병증 측정하였다(도 4). 병증 측정은 접종한 부위로부터 감염되어 파괴된 상처 길이(Lesion Lengths)를 측정하여 천연형과 기타 병 저항성과 관련없는 것으로 확인된 다른 nRD 인산화 효소 형질전환체와 비교하였다.

도 4의 C에서 확인할 수 있듯이, nRDK-18 형질전환체는 평균 파괴된 상처 길이가 천연형 또는 타 nRD 인산화 효소 형질전환체의 반정도에 불과하여(천연형 vs. nRDK-18 : 16.5 vs. 7.2), 흰잎 마름병에 대한 강력한 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다.

4-2. 형질전환 벼(nRDK-18)의 도열병에 대한 저항성 검정

상기 실시예 2에서 제조된 형질전환 벼가 도열병에 대해 저항성을 보이는지 확인하기 위해, LOC_Os01g65010 발현 조절부위에 발현 유도체가 삽입된 형질전환 벼인 nRDK-18와 대조군으로 천연형 동진벼 및 기타 다른 nRD 인산화 효소 형질전환체를 6주간 키워 도열병을 유발하는 곰팡이 균주인 Magnaporthe grisea (strain : PO6-6)를 펀치를 이용하여 접종한 2주 후 병증 측정하였다(도 4). 병증 측정은 접종한 부위로부터 감염되어 파괴된 상처 길이(Lesion Lengths)를 측정하여 천연형과 기타 병 저항성과 관련없는 것으로 확인된 다른 nRD 인산화 효소 형질전환체와 비교하였다.

도 4의 D에서 확인할 수 있듯이, nRDK-18 형질전환체는 평균 파괴된 상처 길이가 천연형 또는 타 nRD 인산화 효소 형질전환체의 70%정도에 불과하여(천연형 vs. nRDK-18 : 2.25 vs. 1.6), 도열병에 대한 강력한 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 형질전환 벼 nRDK-18은 활성화되어 있지 않던 내재적 유전자 LOC_Os01g65010를 활성화시킴으로써 흰잎 마름병 및 도열병에 대한 저항성을 가질 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Kinase gene resistant to a bacterial blightand blast,, and the transgenic plant using the same <130> PA120852KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 824 <212> PRT <213> Oryza sativa LOC_Os01g65010 <400> 1 Met Ala Pro Pro Cys Ser Ser Ala Leu Val Leu Pro Cys Leu Leu Val 1 5 10 15 Ile Ala Met Ala Ala Leu Gln Ser Ala Val Val Phe Ala Asp Thr Val 20 25 30 Thr Ala Lys Arg Pro Leu Ser Gly Ser Gln Ser Ala Leu Val Ser Lys 35 40 45 Arg Arg Lys Phe Ala Leu Gly Phe Phe Gln Pro Glu Asn Ser Gln His 50 55 60 Trp Tyr Leu Gly Ile Trp Tyr Asn Gln Ile Ser Lys His Thr Pro Val 65 70 75 80 Trp Val Ala Asn Arg Gly Thr Pro Ile Ser Asn Pro Asp Thr Ser Gln 85 90 95 Leu Thr Ile Ala Thr Asp Gly Asn Met Val Leu Leu Asp Asn Ser Thr 100 105 110 Thr Ala Ile Trp Ser Thr Asn Ile Ser Lys Ile Ala Ser Asn Ser Thr 115 120 125 Val Gly Val Ile Leu Asp Thr Gly Asn Leu Val Leu Ala Asp Glu Ser 130 135 140 Asn Thr Ser Ile Ile His Trp Gln Ser Phe Asp His Phe Gly Asn Thr 145 150 155 160 Trp Leu Pro Gly Gly Lys Leu Gly Arg Asn Asn Lys Leu Ala Gly Val 165 170 175 Ser Thr Arg Leu Val Ala Trp Lys Ala Arg Asn Asp Pro Ser Pro Gly 180 185 190 Val Phe Ser Leu Glu Leu Asp Pro Asn Gly Thr Ser Gln Tyr Leu Leu 195 200 205 Glu Trp Ser Ile Thr Gln Gln Tyr Trp Thr Ser Gly Asn Trp Thr Gly 210 215 220 Arg Ile Phe Ala Asp Val Pro Glu Met Thr Gly Cys Tyr Pro Ser Ser 225 230 235 240 Thr Tyr Thr Phe Asp Tyr Val Asn Gly Glu Asn Glu Ser Glu Ser Tyr 245 250 255 Phe Val Tyr Asp Leu Lys Asp Glu Ser Val Leu Thr Arg Phe Phe Leu 260 265 270 Ser Glu Met Gly Gln Ile Gln Phe Leu Thr Trp Ile Tyr Ala Ala Lys 275 280 285 Asp Trp Met Pro Phe Trp Ser Gln Pro Lys Val Lys Cys Asp Val Tyr 290 295 300 Ser Leu Cys Gly Pro Phe Ser Val Cys Thr Glu Asn Ala Leu Thr Ser 305 310 315 320 Cys Ser Cys Leu Arg Gly Phe Ser Glu Gln Asn Val Gly Glu Trp Leu 325 330 335 Gln Gly Asp His Thr Ser Gly Cys Arg Arg Asn Val Glu Leu Gln Cys 340 345 350 Ser Ser Asn Ala Ser Val Met Gly Arg Thr Asp Gly Phe Tyr Thr Met 355 360 365 Ala Asn Val Arg Leu Pro Ser Asn Ala Glu Ser Val Val Val Ile Gly 370 375 380 Asn Asp Gln Cys Glu Gln Ala Cys Leu Arg Ser Cys Ser Cys Thr Ala 385 390 395 400 Tyr Ser Tyr Asn Gly Ser Cys Ser Leu Trp His Gly Asp Leu Ile Asn 405 410 415 Leu Gln Asp Val Ser Ala Ile Ser Ser Gln Gly Ser Ser Thr Val Leu 420 425 430 Ile Arg Leu Ala Ala Ser Glu Leu Ser Gly Gln Lys Gln Lys Asn Thr 435 440 445 Lys Asn Leu Ile Thr Ile Ala Ile Val Ala Thr Ser Val Leu Val Leu 450 455 460 Met Ile Ala Ala Leu Phe Phe Ile Phe Arg Arg Arg Met Val Lys Glu 465 470 475 480 Thr Thr Arg Val Glu Gly Ser Leu Ile Ala Phe Thr Tyr Arg Asp Leu 485 490 495 Lys Ser Val Thr Lys Asn Phe Ser Glu Lys Leu Gly Gly Gly Ala Phe 500 505 510 Gly Leu Val Phe Lys Gly Ser Leu Pro Asp Ala Thr Val Val Ala Val 515 520 525 Lys Lys Leu Glu Gly Phe Arg Gln Gly Glu Lys Gln Phe Arg Ala Glu 530 535 540 Val Ser Thr Ile Gly Asn Ile Gln His Val Asn Leu Ile Arg Leu Leu 545 550 555 560 Gly Phe Cys Ser Glu Lys Ser Arg Arg Leu Leu Val Tyr Glu Tyr Met 565 570 575 Pro Asn Gly Ser Leu Asp Lys Gln Leu Phe Asp Asn Lys Lys His Val 580 585 590 Leu Ser Trp Asn Thr Arg Tyr Gln Ile Ala Leu Gly Ile Ala Arg Gly 595 600 605 Leu Asp Tyr Leu His Glu Lys Cys Arg Asp Cys Ile Ile His Cys Asp 610 615 620 Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asp Gly Ser Phe Ala Pro Lys Val 625 630 635 640 Ala Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Met Gly Arg Asp Ile Ser Arg Val 645 650 655 Leu Thr Thr Ala Arg Gly Thr Val Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Trp Ile 660 665 670 Ala Gly Thr Ala Val Thr Ala Lys Ala Asp Val Phe Ser Tyr Gly Met 675 680 685 Thr Leu Leu Glu Ile Val Ser Gly Arg Arg Asn Val Gln Gly Arg Arg 690 695 700 Arg Arg Gln Glu Gln Gln Asp Asp Gly Gly Ala Ala Ala Asp Arg Pro 705 710 715 720 Phe Pro Leu Val Ala Ala Gly Arg Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Arg 725 730 735 Arg Glu Glu Leu Val Ser Ala Val Val Asp Gly Arg Leu Gly Gly Asp 740 745 750 Ala Asp Met Gly Glu Ala Glu Arg Ala Cys Arg Val Ala Phe Trp Cys 755 760 765 Ile Gln Asp Asp Glu Asn Ala Arg Pro Ala Met Ala Thr Val Val Gln 770 775 780 Val Leu Glu Gly Leu Val Glu Ile Gly Val Pro Pro Ile Pro Arg Ser 785 790 795 800 Leu Gln Phe Leu Ala Glu Leu Ala Asp Gln Ser Asn Tyr Leu Gln Phe 805 810 815 Phe Ser Asp Leu Leu Pro Ser Asn 820 <210> 2 <211> 16174 <212> DNA <213> Inserting Sequence <400> 2 gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac ggatccgagg taccaggtac caggtgagtt 60 ccattcttac taccacggtg ctattttttt tgctatgtgg ctaattacat gactaacttg 120 gggtgctaaa tcttacaggt tatatgcagg ttatatgcag gtcccgggta ggtcagtccc 180 ttatgttacg tcctgtagaa accccaaccc gtgaaatcaa aaaactcgac ggcctgtggg 240 cattcagtct ggatcgcgaa aactgtggaa ttgatcagcg ttggtgggaa agcgcgttac 300 aagaaagccg ggcaattgct gtgccaggca gttttaacga tcagttcgcc gatgcagata 360 ttcgtaatta tgcgggcaac gtctggtatc agcgcgaagt ctttataccg aaaggttggg 420 caggccagcg tatcgtgctg cgtttcgatg cggtcactca ttacggcaaa gtgtgggtca 480 ataatcagga agtgatggag catcagggcg gctatacgcc atttgaagcc gatgtcacgc 540 cgtatgttat tgccgggaaa agtgtacgta tcaccgtttg tgtgaacaac gaactgaact 600 ggcagactat cccgccggga atggtgatta ccgacgaaaa cggcaagaaa aagcagtctt 660 acttccatga tttctttaac tatgccggaa tccatcgcag cgtaatgctc tacaccacgc 720 cgaacacctg ggtggacgat atcaccgtgg tgacgcatgt cgcgcaagac tgtaaccacg 780 cgtctgttga ctggcaggtg gtggccaatg gtgatgtcag cgttgaactg cgtgatgcgg 840 atcaacaggt ggttgcaact ggacaaggca ctagcgggac tttgcaagtg gtgaatccgc 900 acctctggca accgggtgaa ggttatctct atgaactgtg cgtcacagcc aaaagccaga 960 cagagtgtga tatctacccg cttcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg aagggccaac 1020 agttcctgat taaccacaaa ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat gaagatgcgg 1080 acttacgtgg caaaggattc gataacgtgc tgatggtgca cgaccacgca ttaatggact 1140 ggattggggc caactcctac cgtacctcgc attaccctta cgctgaagag atgctcgact 1200 gggcagatga acatggcatc gtggtgattg atgaaactgc tgctgtcggc tttaacctct 1260 ctttaggcat tggtttcgaa gcgggcaaca agccgaaaga actgtacagc gaagaggcag 1320 tcaacgggga aactcagcaa gcgcacttac aggcgattaa agagctgata gcgcgtgaca 1380 aaaaccaccc aagcgtggtg atgtggagta ttgccaacga accggatacc cgtccgcaag 1440 tgcacgggaa tatttcgcca 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tatgttacta gatcgggaat taattcatcg ataggctagt 2340 catggtgact gtacgttgta agtgcagcaa actgccgacg cgatgcaaac tgtacacgtt 2400 aacatgccac tcacctggaa cgcacaatgg ccactaggtg cggccgtagt gtggatttca 2460 aagagagaga gagagagaga gagctaatca cgtaaacgta aacacagcag atagcagaga 2520 tgttgattag gcaaaacagt ataaaagcca atccaataaa ctacatttag cgaagtgcta 2580 tactaatgca ctaataacga actgttcttt tcttaagatc ggagccagta atgggttgtc 2640 agcaggagaa gcacgtaaac cttgaaacat actaagttcc acagtcgaga gtaaaccgta 2700 atcaacacaa gaaacaaaca taaaattgaa caaacgcgca tattataagt gacgaagcgg 2760 tctcacataa aacagggcac acaggttaca acaacgaggg ttgtaagccc attaagcccc 2820 aaacatcaga tcaccacaag caaatgtctc gaagacacac gcacacggca acaggataac 2880 tccacactgg cagatcatgg gatagcagca gttatcaatc aggccttgac acacagaaca 2940 tcaagccccc agacgacgac gactcctcta gatcccggtc ggcatctact ctattccttt 3000 gccctcggac gagtgctggg gcgtcggttt ccactatcgg cgagtacttc tacacagcca 3060 tcggtccaga cggccgcgct tctgcgggcg atttgtgtac gcccgacagt cccggctccg 3120 gatcggacga ttgcgtcgca tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa attgccgtca 3180 accaagctct gatagagttg gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg gagccgcggc 3240 gatcctgcaa gctccggatg cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc catacaagcc 3300 aaccacggcc tccagaagaa gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc gaacatcgcc 3360 tcgctccagt caatgaccgc tgttatgcgg ccattgtccg tcaggacatt gttggagccg 3420 aaatccgcgt gcacgaggtg ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag catcagctca 3480 tcgagagcct gcgcgacgga cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg ccagtgatac 3540 acatggggat cagcaatcgc gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg accgattcct 3600 tgcggtccga atgggccgaa cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc gatcgcatcc 3660 atggcctccg cgaccggctg cagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag gtcttgcaac 3720 gtgacaccct gtgcacggcg ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctgaa ttccccaatg 3780 tcaagcactt ccggaatcgg gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac ataacgatct 3840 ttgtagaaac catcggcgca gctatttacc cgcaggacat atccacgccc tcctacatcg 3900 aagctgaaag cacgagattc ttcgccctcc gagagctgca tcaggtcgga gacgctgtcg 3960 aacttttcga tcagaaactt ctcgacagac gtcgcggtga gttcaggctt tttcatatct 4020 cattgccccc cgggatccgt cgagtcagcc tgaaaggaca aaatacatgt tagcgcctta 4080 gtggtacatt attatttcag tacagcaaga taacacaatt caaaagactg acccataata 4140 aataactagt cctcaattta aaatttgagt tcctaaatag acatctatga atatgctgta 4200 catcggcact acagaaaata cgattcccaa taattgaaca attgtacttt atttagttgt 4260 tactacaaca atggaagata caagatcgtt tcaaaactac catacatgca tggagtattt 4320 gttccacaga tctggaaaaa acagatctga cgggcagtgt caccaaacac tagacatatg 4380 tatttgtatt aggtggatga cgtgtacaaa catgactacc agatctagaa ttagaacgcg 4440 gcgtgctttg gaaatgttaa gtagatccaa atacatcggt aacaaatgaa catattcata 4500 tgacatagct gtaaaacatc atgatctatc atatcaacta gaggggatct cggcatgtat 4560 cattctattg catctagaac catagcattt ccatgtgaca aacaattttg aaacatacat 4620 tgctcagatc taccataaga acaccatgtt catgacagca tcgaccatga tttccacatt 4680 taacagcatc ccgaggtcag atccagtgtt tagaactatc atttcagcaa aattcacaaa 4740 ataaatcctc caattcgcct acatatatcc attccacgca tcctaggacc agatccacca 4800 taccagtata cacgaacact aaacatttca tcagatccgc taactacgac agagaaaacg 4860 cagatccaga caaccagatc caccgacaaa taaacacagc cccccacatc caacaaccgc 4920 gaatccaccc agatctgacc cagaagcagg cacgaagaac acggggggtg agggagatgg 4980 gacgcggatc caagcttggc ggcggattgg gttgatgctg cgacggcggc ggagaaggga 5040 gagaggggag aggaggaaaa gcgcggaggc gcggagagag gcgagtacga agacgccttt 5100 ctctgcgttg tctcggctta gggtttgcga tccccgcact ccgcccgttt tatagggcca 5160 gacagcctgg acctctcagg agcggaagcg aagggatggg ggagtttttc gttttacccc 5220 ctttgacgtc ttcaaaattc actcgcatct cacatcgtgc ctgcaaaggt cgggtggttg 5280 gatcatatcg agaatattta ataagttagg gagctttctg ataatatcca ccgcaaggag 5340 gccatttcgt ttgcactcgg ttgaagtcca tacccgcctc tcgttagttt cactgacagg 5400 tgggtccaga ggcttccttc gtgtgcggtt agcgagtgca cgcgtcgctc caagaaaaag 5460 cagtaggtga cctggccacc tcgttgtagg tgcgaccgat gcagacgtcc cgcttgccgg 5520 tgggcccacg ttacagctgg gtcccacata tcggtgggtg cgatgagttg ttcggtgcgt 5580 aggagtagat tggatcccaa cgggtggttg cgtcgtcggc ggccctgccg attttatttt 5640 cgatttttga aatgcgagag cgggagaacg gcaccgttgg cttggctgtg gatgccgtta 5700 gccgcaccgg actattcggc ccagttccat tttggcccaa cttgaaacag cgcggagcac 5760 aagacggggg agcccattta ggcccgtaat ctcagccctg tagaaagtcc gtgtcgttgc 5820 gatggaccag aaagcccata aaccttggag gcgttctctg ctgggaataa aataagttca 5880 cactctgtcc ctcaacttta cgtcgagttt gtttgacatc gctaatgccc agtaccagaa 5940 atcttggata caaataaggt ttgatataaa gtggcacgtg gtgaatggca tcgtttgaaa 6000 aatcttcaga tcgagcgggc ttcacaagcc gtaagtgcaa gtgccaaaat ttgtgaagaa 6060 aattacttcc ttcatttcac aatgtaagtt attttagcat tttccacatt catattgata 6120 tcaataaatt tagatagata tatatgtctg aattcgtacc gttaacgagc tctagaagct 6180 tcagtactac gcgtctcgag gcctattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 6240 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 6300 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 6360 ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 6420 gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 6480 aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 6540 catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 6600 taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 6660 ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa 6720 ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca 6780 gtgaattcac tagtgattgc tctagacact gatagtttcg gatctagata tcacatcaat 6840 ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgttc ctcgtgggtg 6900 ggggtccatc tttgggacca ctgtcggtag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat 6960 cgcaatgatg gcatttgtag aagccatctt ccttttctac tgtcctttcg atgaagtgac 7020 agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct 7080 caatagccct ctggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt 7140 cgtgctccac catgttgggg atctagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg 7200 ttggaacgtc ttctttttcc acgatgttcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac 7260 tgtcggtaga ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtaga 7320 agccatcttc cttttctact 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cgaagagttg cgaggcagcg gcctggtgga acacgcctgg gtcaatgatg 10740 acctggtgca ttgcaaacgc tagggccttg tggggtcagt tccggctggg ggttcagcag 10800 ccagcgcttt actggcattt caggaacaag cgggcactgc tcgacgcact tgcttcgctc 10860 agtatcgctc gggacgcacg gcgcgctcta cgaactgccg ataaacagag gattaaaatt 10920 gacaattgtg attaaggctc agattcgacg gcttggagcg gccgacgtgc aggatttccg 10980 cgagatccga ttgtcggccc tgaagaaagc tccagagatg ttcgggtccg tttacgagca 11040 cgaggagaaa aagcccatgg aggcgttcgc tgaacggttg cgagatgccg tggcattcgg 11100 cgcctacatc gacggcgaga tcattgggct gtcggtcttc aaacaggagg acggccccaa 11160 ggacgctcac aaggcgcatc tgtccggcgt tttcgtggag cccgaacagc gaggccgagg 11220 ggtcgccggt atgctgctgc gggcgttgcc ggcgggttta ttgctcgtga tgatcgtccg 11280 acagattcca acgggaatct ggtggatgcg catcttcatc ctcggcgcac ttaatatttc 11340 gctattctgg agcttgttgt ttatttcggt ctaccgcctg ccgggcgggg tcgcggcgac 11400 ggtaggcgct gtgcagccgc tgatggtcgt gttcatctct gccgctctgc taggtagccc 11460 gatacgattg atggcggtcc tgggggctat ttgcggaact gcgggcgtgg cgctgttggt 11520 gttgacacca aacgcagcgc tagatcctgt cggcgtcgca gcgggcctgg cgggggcggt 11580 ttccatggcg ttcggaaccg tgctgacccg caagtggcaa cctcccgtgc ctctgctcac 11640 ctttaccgcc tggcaactgg cggccggagg acttctgctc gttccagtag ctttagtgtt 11700 tgatccgcca atcccgatgc ctacaggaac caatgttctc ggcctggcgt ggctcggcct 11760 gatcggagcg ggtttaacct acttcctttg gttccggggg atctcgcgac tcgaacctac 11820 agttgtttcc ttactgggct ttctcagccc ggggaccgcc gtgttgctag gatggttgtt 11880 cttggatcag acgctgagtg cgcttcaaat catcggcgtc ctgctcgtga tcgggagtat 11940 ctggctgggc caacgttcca accgcactcc tagggcgcgt atagcttgcc ggaagtcgcc 12000 ttgacccgca tggcataggc ctatcgtttc cacgatcagc gatcggctcg ttgccctgcg 12060 ccgctccaaa gcccgcgacg cagcgccggc aggcagagca agtagagggc agcgcctgca 12120 atccatgccc acccgttcca cgttgttata gaagccgcat agatcgccgt gaagaggagg 12180 ggtccgacga tcgaggtcag gctggtgagc gccgccagtg agccttgcag ctgcccctga 12240 cgttcctcat ccacctgcct ggacaacatt gcttgcagcg ccggcattcc gatgccaccc 12300 gaagcaagca ggaccatgat cgggaacgcc atccatcccc gtgtcgcgaa ggcaagcagg 12360 atgtagcctg tgccgtcggc aatcattccg agcatgagtg cccgcctttc gccgagccgg 12420 gcggctacag ggccggtgat cattgcctgg gcgagtgaat gcagaatgcc aaatgcggca 12480 agcgaaatgc cgatcgtggt cgcgtcccag tgaaagcgat cctcgccgaa aatgacccaa 12540 agcgcggccg gcacctgtcc gacaagttgc atgatgaaga agaccgccat cagggcggcg 12600 acgacggtca tgccccgggc ccaccggaac gaagcgagcg ggttgagagc ctcccggcgt 12660 aacggccggc gttcgccttt gtgcgactcc ggcaaaagga aacagcccgt caggaaattg 12720 aggccgttca aggctgccgc ggcgaagaac ggagcgtggg gggagaaacc gcccatcagc 12780 ccaccgagca caggtcccgc gaccatcccg aacccgaaac aggcgctcat gaagccgaag 12840 tgccgcgcgc gctcatcgcc atcagtgata tcggcaatat aagcgccggc taccgcccca 12900 gtcgccccgg tgatgccggc cacgatccgc ccgatataga gaacccaaag gaaaggcgct 12960 gtcgccatga tggcgtagtc gacagtggcg ccggccagcg agacgagcaa gattggccgc 13020 cgcccgaaac gatccgacag cgcgcccagc acaggtgcgc aggcaaattg caccaacgca 13080 tacagcgcca gcagaatgcc atagtgggcg gtgacgtcgt tcgagtgaac cagatcgcgc 13140 aggaggcccg gcagcaccgg cataatcagg ccgatgccga cagcgtcgag cgcgacagtg 13200 ctcagaatta cgatcagggg tatgttgggt ttcatgtctg gcctccggac cagcctccgc 13260 tggtccgatt gaacgcgcgg attctttatc actgataagt tggtggacat attatgttta 13320 tcagtgataa agtgtcaagc atgacaaagt tgcagccgaa tacagtgatc cgtgccgccc 13380 tggacctgtt gaacgaggtc ggcgtagacg gtctgacgac acgcaaactg gcggaacggt 13440 tgggggttca gcagccggcg ctttactggc acttcaggaa caagcgggcg ctgctcgacg 13500 cactggccga agccatgctg gcggagaatc atacgcattc ggtgccgaga gccgacgacg 13560 actggcgctc atttctgatc gggaatgccc gcagcttcag gcaggcgctg ctcgcctacc 13620 gcgatggcgc gcgcatccat gccggcacgc gaccgggcgc accgcagatg gaaacggccg 13680 acgcgcagct tcgcttcctc tgcgaggcgg gtttttcggc cggggacgcc gtcaatgcgc 13740 tgatgacaat cagctacttc actgttgggg ccgtgcttga ggagcaggcc ggcgacagcg 13800 atgccggcga gcgcggcggc accgttgaac aggctccgct ctcgccgctg ttgcgggccg 13860 cgatagacgc cttcgacgaa gccggtccgg acgcagcgtt cgagcaggga ctcgcggtga 13920 ttgtcgatgg attggcgaaa aggaggctcg ttgtcaggaa cgttgaagga ccgagaaagg 13980 gtgacgattg atcaggaccg ctgccggagc gcaacccact cactacagca gagccatgta 14040 gacaacatcc cctccccctt tccaccgcgt cagacgcccg tagcagcccg ctacgggctt 14100 tttcatgccc tgccctagcg tccaagcctc acggccgcgc tcggcctctc tggcggcctt 14160 ctggcgctcc tgctgcggcg tccgctcgtg ggccgtggcg cgggtccgcg cgccggcctc 14220 gtgcgcctgg cgctcgcggg cgaggtccag ggcggccgtc ttcacgttct gccttgcgca 14280 gatgagatag atccagtctg caagtgtcag aaacgagtct gcatttgatg ccctgaacgt 14340 cttcatacat ctgataagcc cctcccggaa gtctgctttc tctccgtcag aaagcatacc 14400 ctgaccggtt tcaatcacgg accgttctgt caggtaatgc tctgtccagt catacagagc 14460 cgggtttgtc acccgtataa gctgaagcag gcacaaatca gggaaataaa caaaatcccg 14520 catccccgga taaagaaaaa tcagggaatt aatggcctga tggatttccc gtggcgtcga 14580 aagtgcggca ccataggtat cagtcaccgc gatgagatcc cttaccattc cagagtctgg 14640 cggttgatta ttaatttgct gatatagagc ctcagcccgc tggcgaaatt cattacgtaa 14700 atcaaaggct tcaggtcggg gtaatttaaa actaagctga atgattttct ggagataacg 14760 gctgccatct tcgatattca gcgcatgttc aacggcatga gtgataatct gcctgtcata 14820 acagagaata tgggtaaagc ggggcagatc ggctactgca cgcacaagcc tgaacacttc 14880 cgccacctgg gatggctcca gtcggtccag atcatccatg acaacaatga acttcagatc 14940 cagactcacc agttgtcctg caatttcagc ccgaagctag cttggctgcc atttttgggg 15000 tgaggccgtt cgcggccgag gggcgcagcc cctgggggga tgggaggccc gcgttagcgg 15060 gccgggaggg ttcgagaagg gggggcaccc cccttcggcg tgcgcggtca cgcgcacagg 15120 gcgcagccct ggttaaaaac aaggtttata aatattggtt taaaagcagg ttaaaagaca 15180 ggttagcggt ggccgaaaaa cgggcggaaa cccttgcaaa tgctggattt tctgcctgtg 15240 gacagcccct caaatgtcaa taggtgcgcc cctcatctgt cagcactctg cccctcaagt 15300 gtcaaggatc gcgcccctca tctgtcagta gtcgcgcccc tcaagtgtca ataccgcagg 15360 gcacttatcc ccaggcttgt ccacatcatc tgtgggaaac tcgcgtaaaa tcaggcgttt 15420 tcgccgattt gcgaggctgg ccagctccac gtcgccggcc gaaatcgagc ctgcccctca 15480 tctgtcaacg ccgcgccggg tgagtcggcc cctcaagtgt caacgtccgc ccctcatctg 15540 tcagtgaggg ccaagttttc cgcgaggtat ccacaacgcc ggcggccgcg gtgtctcgca 15600 cacggcttcg acggcgtttc tggcgcgttt gcagggccat agacggccgc cagcccagcg 15660 gcgagggcaa ccagcccggt gagcgtcgga aagggtcgac gatcttgctg cgttcggata 15720 ttttcgtgga gttcccgcca cagacccgga ttgaaggcga gatccagcaa ctcgcgccag 15780 atcatcctgt gacggaactt tggcgcgtga tgactggcca ggacgtcggc cgaaagagcg 15840 acaagcagat cacgcttttc gacagcgtcg gatttgcgat cgaggatttt tcggcgctgc 15900 gctacgtccg cgaccgcgtt gagggatcaa gccacagcag cccactcgac cttctagccg 15960 acccagacga gccaagggat ctttttggaa tgctgctccg tcgtcaggct ttccgacgtt 16020 tgggtggttg aacagaagtc attatcgcac ggaatgccaa gcactcccga ggggaaccct 16080 gtggttggca tgcacataca aatggacgaa cggataaacc ttttcacgcc cttttaaata 16140 tccgattatt ctaataaacg ctcttttctc ttag 16174 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Enhancer-F <400> 3 ccggtaccat ggcggcggtg gtggaggg 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Enhancer-R <400> 4 ccggatcctt agcttagaga tgagacgaa 29 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pGA2715L1.5S-F <400> 5 agtacattaa aaacgtccgc 20 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer rt-Os10g35040-F <400> 6 gcgctgagcc acgagt 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer rt-Os10g35040-R <400> 7 gtcgcctccc cgtctc 16 <210> 8 <211> 2475 <212> DNA <213> Oryza sativa LOC_Os01g65010 <400> 8 atggcgccgc cctgctcctc tgctctcgtt cttccttgcc tgcttgtcat agccatggcc 60 gctctgcaaa gtgctgtggt gtttgccgat accgtcactg ccaaacgccc gttgtccggc 120 agccagagtg cactggtgtc caagcgtcgc aagttcgcgc tcggtttctt ccagccagaa 180 aattcacagc attggtacct tggcatctgg tacaaccaaa tttccaaaca cacacctgtc 240 tgggttgcaa acaggggcac tccaatctcg aatccggaca cctcacaact aaccatagca 300 accgacggca acatggtatt actcgacaat tcaacaactg caatttggtc cacgaacatc 360 tccaagatcg cctccaactc cacggtcggt gtcatcctcg acaccggcaa ccttgtcctc 420 gcagacgaat cgaacacctc catcatccac tggcagagct tcgaccattt cggcaacacc 480 tggctccccg gcggcaagct cggccggaat aacaagctcg ccggcgtgag cacccgtctg 540 gtcgcatgga aggctcgcaa tgacccatct ccaggcgtct tctccctcga gctggatccg 600 aatggcacga gccaatacct gctcgaatgg agcatcacgc agcagtactg gacgagcggc 660 aactggactg gccgcatatt cgccgacgtg ccggagatga cgggatgcta cccgagctcg 720 acgtacacct tcgactacgt caatggcgag aacgagagcg agagctactt cgtgtacgac 780 ctcaaggacg agtccgtcct cacgaggttc ttcctgagcg agatggggca gatccagttc 840 ttgacatgga tctacgcagc caaggactgg atgccgttct ggtctcagcc caaggtgaag 900 tgcgacgtgt actcgctgtg tggcccgttc agtgtctgca ccgagaacgc actgacatct 960 tgtagctgcc tccggggatt cagcgagcag aacgttggcg agtggttgca gggagatcac 1020 acttcagggt gcagaagaaa cgtcgagctg cagtgtagca gcaatgcctc agtgatgggg 1080 aggactgatg gtttctacac gatggccaac gtgagattac caagcaatgc agagagcgtg 1140 gtggtcatag gaaatgatca gtgtgagcaa gcatgcttaa gaagttgttc ttgcactgct 1200 tactcctaca acggcagctg ctcactgtgg catggagacc tcatcaacct gcaggatgtg 1260 tctgccatta gtagccaagg aagcagcact gttttgattc gcttggccgc ttcagaattg 1320 tctggccaga agcagaagaa caccaagaac ttgatcacta ttgccatcgt tgctactagt 1380 gttctagtac tcatgatagc tgctttgttt ttcatcttca gaagaagaat ggtaaaggaa 1440 acaacaagag tggaaggttc cttgatagca ttcacatacc gtgacctgaa atctgtgacc 1500 aaaaatttct ccgagaagct cgggggaggc gcattcggtt tagtgttcaa agggtcgcta 1560 cctgatgcga ccgtggtggc cgtgaagaag ctcgaaggtt ttcgtcaggg ggagaagcag 1620 tttcgcgcgg aggtgagcac gatcggcaac atccaacacg tcaacctgat tcgattgctc 1680 gggttttgct cggagaaatc gcgaaggcta ctcgtctacg agtacatgcc aaacggttca 1740 ctggacaagc aactttttga caataaaaaa catgtcctga gttggaacac gaggtaccag 1800 attgctcttg gaatcgcgag gggattagac tacctccacg agaaatgcag ggattgcatc 1860 atacactgcg acatcaagcc agagaacata ctgctcgatg gctcgtttgc acccaaggtc 1920 gccgacttcg ggctcgccaa gctcatgggc cgcgacatca gccgcgtgct gaccacggcg 1980 aggggcacgg tggggtacat cgcgccggag tggatcgccg gcacggccgt cacggcgaag 2040 gcggacgtgt tcagctacgg catgacgctg ctcgagatcg tgtcggggag gcggaacgtg 2100 cagggacgac ggaggaggca ggagcagcag gacgacggcg gcgcggcggc ggaccgccca 2160 ttcccgttgg tggcggcggg caggctcgtc ggcggcggcg gaggccggcg ggaggagctg 2220 gtcagcgccg tggtggacgg ccggctcggc ggcgacgccg acatgggcga ggcggagaga 2280 gcatgcaggg tggcgttctg gtgcatccag gacgacgaga acgcgaggcc ggccatggcg 2340 acggtggtgc aggtgctcga agggctcgtg gagatcggcg tcccgccgat tccgagatca 2400 cttcagttcc tcgcggagtt ggccgatcaa tcaaattact tgcagttctt ctccgattta 2460 ttaccgtcga attga 2475 <210> 9 <211> 1400 <212> DNA <213> enhanced sequence <400> 9 gaattgatcc ccaacatggt ggagcacgac actctcgtct actccaagaa tatcaaagat 60 acagtctcag aagaccagag ggctattgag acttttcaac aaagggtaat atcgggaaac 120 ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatcg aaaggacagt agaaaaggaa 180 gatggcttct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca agatgcctct 240 accgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga acatcgtgga aaaagaagac 300 gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata tctagatccc caacatggtg 360 gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccagagg 420 gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca 480 gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat 540 cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat 600 ggacccccac ccacgaggaa catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 660 caagtggatt gatgtgatat ctagatcccc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac 720 tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa 780 agggtaatat cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa 840 aggacagtag aaaaggaaga tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct 900 atcgttcaag atgcctctac cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggaac 960 atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 1020 tagatcccca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca 1080 gtctcagaag accagagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc 1140 ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat 1200 ggcttctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctacc 1260 gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggaaca tcgtggaaaa agaagacgtt 1320 ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct agatccgaaa ctatcagtgt 1380 ctagctagag tcgagaattc 1400

Claims (15)

1. 서열번호 8로 기재되는 염기 서열로 이루어진 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010가 활성화된, 형질전환 벼(Oryza sp.)로서,
   상기 벼는 LOC_Os01g65010를 활성화시키는 발현 유도 서열 또는 프로모터(promoter)가 삽입된 벼의 흰잎 마름병, 또는 도열병 저항성 증진용 재조합 벡터를 포함하는 것인, 형질전환 벼.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 벼(Oryza sp.)는 동진벼 또는 화영벼인 것인, 형질전환 벼.
   
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 발현 유도 서열은 서열번호 9로 기재되는 서열을 포함하는 것인, 형질전환 벼.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 발현 유도 서열은 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 것인, 형질전환 벼.
   
8. 삭제
9. (a) 서열번호 8로 기재되는 염기 서열로 이루어진 내재적 불활성 유전자인 LOC_Os01g65010을 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는 형질전환용 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 단계;
   (b) 벼 잎에 상기 (a) 단계의 아그로박테리움을 감염시키는 단계; 및,
   (c) 상기 (b) 단계에 감염된 벼 세포를 캘러스(callus)화 하여 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증진된 형질전환체의 제조방법으로서,
   상기 병 저항성은 흰잎 마름병, 도열병 또는 둘 모두에 대한 저항성이고, 상기 형질전환체는 벼(Oryza sp.)인, 제조방법.
   
10. 제9항에 있어서, (d) 상기 (c) 단계에서 제조한 캘러스를 뿌리 및 성체 분화를 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
    
11. 삭제
12. 삭제
13. 제9항에 있어서, 상기 벼는 동진벼 또는 화영벼인 제조방법.
    
14. 제9항에 있어서, (a) 단계의 상기 발현 유도 서열은 서열번호 9로 기재되는 염기서열로 이루어진 것인, 제조방법.
    
15. 서열번호 8로 기재되는 염기 서열로 이루어진 LOC_Os01g65010 유전자를 활성화시키는 단계를 포함하는 벼의 병 저항성의 증진방법으로서,
    상기 활성화는 상기 LOC_Os01g65010 발현 조절 부위에 발현 유도 서열 또는 프로모터(promoter)를 삽입하는 것을 통해 이루어지고,
    상기 병 저항성은 흰잎 마름병, 도열병 또는 둘 모두에 대한 저항성인, 제조방법.

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