KR101636156B1 - 흰잎 마름병 저항성 메틸전이효소 및 이를 이용한 형질 전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체, 상기 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터 및 상기 식물 형질 전환체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법에 관한 것이다.
본 발명은 벼에 내재적으로 존재하며 흰잎 마름병에 대한 저항성 유전자, LOC_Os06g20770의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 흰잎 마름병에 대해 강력한 저항성을 갖는 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.

Description

흰잎 마름병 저항성 메틸전이효소 및 이를 이용한 형질 전환 식물체{Methyltrasnferase gene resistant to a bacterial blight, and the transgenic plant using the same}

본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체, 상기 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터 및 상기 식물 형질 전환체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법에 관한 것이다.

벼 흰잎 마름병은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 에 의해서 발생되는 세균성 도관병으로, 발병시기는 7월 초~수확기이나 주로 7월 상순~8월 중순에 발병한다. 중간 기주식물인 줄풀 및 겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚 및 벼 그루터기에서 세균의 월동이 가능하다. 세균이 편모(鞭毛)에 의해 물을 따라 전염하고 벼잎의 물구멍과 공기구멍 부위 및 절단된 뿌리로 침입한다. 병 발생은 해마다 발생이 많은 상습발생지 위주로 발생하나 침관수지역이 아닌 지역에서도 발생이 많다.

보통 출수기 전후에 나타나나 상습발생지나 다발생 발생지에는 본답 초기에 발병하며, 드물게는 묘판에서도 발병된다. 국내에서 최초 발병보고는 1930년 전라남도 해남군에서 처음 발견된 이래 1960년까지 남부 일부 지역에 제한적인 발생을 보이다 이병성 품종인 금남풍의 재배 확대로 전국적인 발생을 나타내었으며, 이후 다수계 품종 재배에 의한 밀양 23호에 의해 피해가 확대되어 재배기간 중 후기에 발생되는 잎에서의 발병 뿐만 아니라 이앙 후 분열기까지 주 전체가 발생되는 금성형 증상을 보여 벼의 3대 병해의 하나로 간주된다.

벼 흰잎 마름병균은 그람음성세균으로 분류되고 벼의 세균성 위조병을 유발하는 식물병원세균으로 세계적으로 널리 분포하여 벼에 큰 피해를 주지만, 병원균이 벼의 도관 내에서 증식하므로 약제방제 효과는 매우 낮으며, 현재까지 이 병에 특이적인 살균제 또한 없는 실정이다.

또한, 기존의 작물에 대한 저항성 부여방법은 외래 유전자의 도입을 통해 식물체로 하여금 새로운 형질을 부여하는 기술이 대다수였다.

한편, 화영벼는 농촌진흥청에서 정한 18종의 고품질 품종 중의 하나로, 벼흰빛잎마름병에 강하면서 'Chukei 830'을 모본으로 하고 약배양에서 육성된 양질이면서 도열병 및 벼줄무늬잎마름병에 강한 'YR 4811 Acp 8'을 부본으로 인공교배하여 1986년 잡종 제1세대를 양성하였다. 벼흰빛잎마름병, 도열병, 벼줄무늬잎마름병 등에 강하고 벼오갈병과 흑조위축병에는 약하며 충해에는 민감하다.

이에 본 발명자들은 아직 극복되지 못한 벼 흰잎 마름병에 대한 저항성 유전자를 동정하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 천연형 벼 화영의 보유 유전자 중 흰잎 마름병에 저항성을 부여하는 메틸전이효소 유전자 (LOC_Os06g20770)를 동정해내어, 이를 활성화시킨 형질전환체가 흰잎 마름병에 저항성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 식물을 감염시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 감염된 식물의 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 식물의 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증진된 식물 형질 전환체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성이 강화된, 식물 형질 전환체를 제공한다.

본 발명에서는 메틸전이효소인 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성이 강화되도록, LOC_Os06g20770의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 해당 유전자를 발현하여 흰잎 마름병에 대해 저항성을 갖춘 형질전환 벼를 제조하였다.

보다 상세하게는 본 발명자들은 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 형질전환 방법을 통해 만들어진 10만 개통의 벼 돌연변이 집단에서 흰잎 마름병에 저항성이 있는 식물 형질 전환체를 관찰하였다. 상기 식물 형질 전환체는 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의해 유전자를 발현시키는 발현 유도 서열을 포함하는 T-DNA 가 genome 상에 삽입되어 삽입된 지역의 유전자 기능이 활성화된 식물체로, T-DNA의 삽입 위치는 genome DNA PCR과 염기서열 분석을 통해 확인할 수 있으며, 데이터 베이스에서 유전자 locus id를 찾을 수 있다.

본 발명에서 용어 "메틸전이효소"는 메틸기전이를 촉매하는 효소의 총칭으로, 메틸기전달효소의 일종으로 기질인 아미노기, 히드록시기, 티올기를 메틸화하여 메틸화효소라고 부르는 경우도 있다

본 발명에서 용어, "LOC_Os06g20770"는 Oryza sativa 6번째 유전체 (chromosome)에 존재하는 유전자로, 이의 발현물은 단백질 메틸전이효소의 일종이다. 상기 LOC_Os06g20770 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지며, 상기 염기서열은 서열번호 3의 아미노산 서열로 코딩된다.

본 발명에서 상기 식물 형질 전환체 제조에 사용되는 LOC_Os06g20770 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자 일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자 일 수 있으며, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 코딩되는 유전자 일 수 있다.

상기 LOC_Os06g20770 (TIGR, Os06g0313320 (RAP-DB))의 genome DNA 크기는 2671 bp (서열번호 1)이며 대표 coding sequence (LOC_Os06g20770.1)의 크기는 1098 bp (서열번호 2)로 4개의 exon과 3개의 intron으로 구성되며, 365 개의 아미노산으로 번역되어 단백질 (서열번호 3)이 만들어진다. 이 단백질은 plant methyltransferase domain (Methyltransf_7)을 암호화 한다 (도 1B).

상기 LOC_Os06g20770 유전자는 벼에 내재적으로 존재하는 유전자로, 본 발명에서 용어, "내재적"이란 생물이 천연의 상태로 가지고 있는 것을 의미하는데, 본 발명에서는 식물, 바람직하게는 벼(Oriza sp .) 유전체(chromosome)가 천연적으로 가지고 있는 유전자를 표시할 때 사용한다.

본 발명에서 용어, "활성 강화"는 특정 유전자의 활성을 강화시키는 것을 의미하고, 용어 "활성화"와 혼용하여 사용될 수 있다. 또한 불활성화된 유전자를 활성화시키거나 활성이 낮은 유전자의 활성을 높이는 것도 포함한다. 1) 해당하는 유전자를 1 카피 이상 도입, 2) 해당하는 유전자의 발현 조절 부위에 발현을 유도하는 서열을 삽입, 3) 활성이 강화된 형태로 변형시키는 방법으로 강화, 또는 4) 이의 조합에 의해 활성이 강화되도록 변형시킬 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 LOC_Os06g20770의 발현 조절 부위에 발현을 유도하는 서열 또는 프로모터(promoter)를 삽입할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4로 기재되는 발현 유도 서열을 포함하는 서열을 삽입할 수 있다.

본 발명에서 용어, "활성이 낮은 유전자"는 DNA, 즉 유전자 상으로는 존재하나 RNA로 전사(transcription)되는 비율이 낮거나, 단백질로 번역(translation) 되는 비율이 낮아서 본연의 기능을 발휘하지 못하는 것을 의미하고, 본 발명에서는 벼가 내재적으로 가지고 있는 유전자가 전사 또는 번역이 되는 비율이 낮아서 그 기능을 제대로 발현하지 못하는 것을 의미하고, 특히, LOC_Os06g20770 유전자가 그 기능을 제대로 발현하지 못하는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 LOC_Os06g20770 유전자의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열(서열번호 4)을 삽입함으로써, LOC_Os06g20770 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 4). 또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 상기 LOC_Os06g20770 유전자의 활성이 강화되도록 형질전환된 식물 형질 전환체가 흰잎 마름병에 대해 병 저항성을 가지는 것을 확인하였다(도 5).

본 발명에서 용어, "발현 유도 서열"은 유전자의 발현 조절 부위에 존재할 때 발현을 촉진하는 기능을 하는 서열을 제한없이 포함하며, 전사인자 결합 부위, 인핸서(enhancer), 조효소 결합 부위(co-factor binding region) 등을 포함한다. 본 발명에서 상기 유전자의 발현 조절 부위에 삽입되는 서열은 서열번호 4로 기재되는 발현 유도 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA 염기서열 상의 삽입, 결실 또는 대체 등의 변이를 통해 특정 형질이 발생하거나 사라지거나 조절되는 모든 행위를 의미하며, 특히 본 발명에서는 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어, "형질 전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환 식물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 활성의 변이가 유발되어 생성된 유전자 재조합체를 포함한다.

본 발명에서 용어, "식물 형질 전환체"는 형질전환의 대상이 될 수 있는 모든 식물을 포함하며, 특히, LOC_Os06g20770 유전자 또는 이에 해당하는 유전자가 불활성되거나 활성이 낮은 식물은 모두 제한없이 포함한다. 바람직하게는 상기 식물 형질 전환체는 벼(Oryza sp .)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 화영벼일 수 있다.

본 발명에서 상기 식물 형질 전환체는 흰잎 마름병에 대한 저항성을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 화영벼에 상기 내재적 유전자인 LOC_Os06g20770의 발현 조절 부위에 서열번호 4의 발현 유도 서열을 삽입하는 형질전환을 통하여 LOC_Os06g20770에 해당하는 유전자의 활성이 강화되는 형질전환체를 제조하였으며, 이를 SAMT 12라고 명명하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 식물의 병 저항성 증진용 재조합 벡터를 제공한다.

상기 메틸전이효소, LOC_Os06g20770 및 발현 유도 서열은 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "병 저항성"은 각종 질병에 대해 발병이 잘 일어나지 않거나, 발병되더라도 병 진행의 속도가 현저히 느리거나, 회복이 되는 능력이 뛰어난 것을 의미한다. 본 발명에서 병 저항성은 흰잎 마름병에 대한 저항성을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"는 특정 서열이 변이, 삽입 또는 제거되는 유전자 재조합 과정을 거친 벡터를 의미하며, 바람직하게는 발현 유도 서열이 삽입된 벡터를 의미하고, 더욱 바람직하게는 해당 발현 유도 서열을 LOC_Os06g20770의 발현 조절 부위에 삽입할 수 있는 기능을 하는 재조합 벡터를 의미한다.

상기 재조합 벡터는 LOC_Os06g20770 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다

본 발명의 일 실시예에서는, LOC_Os06g20770 유전자의 발현 조절 부위에 서열번호 4의 발현 유도 서열 포함하는 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 아그로박테리움을 통해 벼 세포에 도입하여, 내재적 유전자였던 LOC_Os06g20770 유전자의 발현을 증가하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 식물을 감염시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 감염된 식물의 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 식물의 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증진된 식물 형질 전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 그람양성의 세균으로, 식물의 뿌리나 줄기의 상처를 통해 식물세포에 감염되어, 자신이 가지고 있는 유전자를 식물 세포의 유전체에 삽입하여 식물세포의 형질전환을 일으키는 암종세균의 일종이다. 본 발명에서 상기 아그로박테리움은 바람직하게는 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.

본 발명에서 용어, "캘러스(callus)"란, 식물에 상처가 났을 때 생기는 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 즉, 미분화세포를 의미하며, 특히, 본 발명에서는 식물의 잘린 부위에 아그로박테리움 등 형질전환용 암종세균을 감염시켰을 때 감염된 세포가 미분화상태로 상처부위에 덩어리진 것을 의미한다. 즉, 본 발명에서는 암종세균에 감염되어 형질전환된 세포만이 암종 덩어리를 생성하는 특징을 이용하여 형질전환된 미분화세포를 얻을 수 있는데 이것이 캘러스 형태로 생성되게 된다.

상기 병 저항성이 증진된 형질전환체의 제조방법은, 바람직하게는 수득된 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 캘러스는 상기 설명한대로 미분화된 상태의 세포 덩어리에 불과하기 때문에, 이를 온전한 종자로 수득하기 위해서는 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하는 것이 필요할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 수득된 캘러스를 루트-인덕션 배지에서 배양하여 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하였다(실시예 2).

또 하나의 양태로, 본 발명은 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 식물의 병 저항성의 증진방법을 제공한다.

본 발명의 LOC_Os06g20770 유전자, 활성 강화 및 병 저항성 등은 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서, 상기 용어 "증진"은 본 발명에서 대조군 벼와 비교하여 적어도 5% 또는 10%, 바람직하게는 적어도 20% 또는 40%, 더욱 바람직하게는 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상의 병 저항성을 의미하며, 벼가 원래 가지고 있는 병 저항성에 비해 상기 유전자를 도입하여 병 저항성이 증가되는 것을 의미한다.

본 발명은 벼에 내재적으로 존재하는 흰잎 마름병에 대한 저항성 유전자, LOC_Os06g20770의 발현 조절 부위에 발현 유도 서열을 삽입함으로써, 흰잎 마름병에 대해 강력한 저항성을 갖는 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.

도 1은 흰잎 마름병에 대한 저항성과 관련된 유전자로 선별된 LOC_Os06g20770의 구조에 대한 개요도로, 도 1의 A는 유전자 상의 구조를 나타내며, 도 1의 B는 유전자가 발현된 단백질의 구조를 나타낸다. 이에 표시된 Methyltransf_7은 메틸전이효소 활성 부분 (methyltransferase domain)을 의미한다.
도 2는 LOC_Os06g20770의 발현을 조절하는 부위에 T-DNA를 포함한 유전자 발현 유도 서열이 삽입된 SAMT 12 유전자 변형 벼의 게놈 DNA의 일부분을 나타내는 구조도이다.
도 3은 SAMT 12 유전자 변형 벼에서 T-DNA 삽입위치를 PCR로 확인한 도면이다.
도 4는 SAMT 12 유전자 변형 벼에서 LOC_Os06g20770의 발현을 확인하는 RT-PCR 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 SAMT 12 유전자 변형 벼의 흰잎 마름병에 대한 저항성을 실험한 결과를 보여주는 도면으로, 도 5의 A는 천연형 벼 및 SAMT 12 유전자 변형 벼의 흰잎 마름병균을 가위 접종법으로 접종한 결과를 보여주는 사진이고, 도 5의 B는 이의 감염에 의해 파괴된 벼 잎의 길이를 측정하여 평균 낸 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Bioinformatics를 통한 형질전환 타겟 유전자 선별

화영벼의 유전체가 보유한 식물체의 질환 저항성과 밀접한 관련이 있을 것으로 예측되는 메틸전이효소 230개를 동정하였다. 이 중, microarray data를 바탕으로 MeV v2.0 프로그램을 이용하여 흰잎 마름병에 저항성을 가질 확률이 높은 유전자를 108개 선별하였다. 선별된 유전자에 대하여 형질전환체를 제조하여 병 저항성을 갖는 유전자를 동정해 내는 과정에서, 본 발명의 LOC_Os06g20770이 흰잎 마름병에 저항성을 갖는 유전자로 선별되었다.

실시예 2. 발현 유도체 삽입된 형질전환 벼 제조

2-1. 벼 형질전환용 재조합 벡터 제조

타겟 유전자의 발현 조절 부위의 염기서열에 발현 유도 서열을 삽입하기 위해 벡터를 제작하였다. 먼저, 유전체 삽입을 위한 T-DNA, 삽입위치의 왼쪽 유전자 서열을 확인하기 위한 N-GUS, 서열번호 4의 유전자의 발현 유도 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하기 위한, 담배 잎 모자이크바이러스 35S 프로모터 유래 DNA, 삽입위치의 오른쪽 유전자 서열을 확인하기 위한 L-0.5/1.5를 가지는 벡터를 제작하였다. 삽입된 유전체로부터 타겟 유전자의 확인과 증폭을 위한 프라이머는 아래와 같다.

Enhancer-F (정방향, 서열번호 9)

5'- gatccccaacatggtggagc -3'

Enhancer-R (역방향, 서열번호 10)

5'- ggatctagatatcacatcaa -3'

PCR 증폭 조건은 처음 DNA의 열변성을 위하여 94℃에서 3분간 1 cycle, 그리고 94℃ 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 2분간으로 총 35 cycle을 실시하였으며, 최종 DNA 합성은 7분으로 하였다.

해당 증폭된 PCR 산물을 1.0%의 아가로즈겔(agarose gel)로 전기영동 한 후 EtBr(ethidium bromide) 용액에 염색하여 UV lamp하에서 염기 크기에 해당하는 band를 절단하여 아가로즈겔(agarose gel) 정제법으로 정제하였다.

추출한 PCR 산물을 상기 제한효소 BamHⅠ/KpnⅠ으로 절단하였다. 또한, 재조합 벡터인 pGA2772 벡터를 제한효소 BamHⅠ/KpnⅠ로 절단하여, 절단된 벡터를 상기 아가로즈겔 정제법으로 정제하였다. 상기 PCR 산물에 의한 DNA 단편을 절단된 재조합 벡터에 삽입하여, 조절부위 발현 유도체 서열 (Enhance sequence, 서열번호 4)이 삽입된 재조합 벡터 pGA2772 vector를 제조하였다.

2-2. 형질전환체 제조

상기 제조된 벡터를 전기충격 방법(electroporation)을 이용하여 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하였다. 배양실에서 무균상태로 자란 화영벼에 리프 디스트(leaf disc)법으로 형질전환하였다. 구체적으로는 벼잎을 대략 5 x 5 mm 크기로 잘라서 200 ㎕의 아그로박테리움이 포함된 MSO 액체 배지(MS 염 4.3g, 수크로스 30g/L, pH 5.6 내지 5.8)에 넣었다가 암조건에서 2 내지 3일 동안 배양하고, 배양된 잎 절편을 캘러스-슈트(callus-shoot) 유도 배지(MSO배지에 100㎍ NAA, 1mg BA, 500㎍ 세포탁심, 1mg 포스피노트리신(phospinothricin), 0.7% 피토 한천(phyto agar), pH 5.6)으로 옮기고, 새로운 배지로 옮겨 주었다. 유도된 발아는 1.5 내지 2 cm 정도 자라면 루트-인덕션 배지(MSO배지에 250㎍ 세포탁심, 10mg 포스피노트리신, 0.7% 피토 한천, pH 5.6)로 옮겨 주었다.

발현 유도체가 삽입된 상기 유전자 형질전환 벼를 SAMT 12로 명명하였으며, 이의 유전자 구조는 도 2에 개시된 바와 같다. 구체적으로는, 화영 벼의 첫 번째 유도체에 존재하는 LOC_Os06g20770의 발현 조절 부위로 예측되는 상류부분 (upstream region)에 T-DNA 서열 (서열번호 5)을 삽입하여, 도 2와 같은 유전체 구조를 가진 형질전환체를 제작하였다.

2-3. 재조합 벡터의 벼 유전체 삽입위치 확인

T-DNA 삽입에 의해 만들어진 SAMT 12에 대한 inverse-PCR 및 염기 서열 분석을 통해 T-DNA가 삽입된 염색체를 분석하였다.

상기 선발된 계통의 벼 종자를 MSO 배지에 28℃에서 10일간 배양하였다. 이렇게 배양한 개체들의 잎 100mg을 채취하여 액체질소를 이용하여 급냉각한 후 분쇄하였다. 분쇄된 잎에서 one step buffer (1M Tris (pH9.5) 5ml, 0.5M EDTA 1ml, KCl 3.73g을 넣고 물로 50ml을 맞춰 조제)을 이용하여 DNA를 추출하였다.

SAMT 12는 LOC_Os06g20770 유전자의 발현조절 상류부분에 T-DNA가 삽입된 계통으로 T-DNA 삽입위치에서 앞뒤에서 만들어진 프라이머 (서열번호 6 및 서열번호 7)와 T-DNA 삽입서열 중 L1.5s 프라이머 (서열번호 8)를 이용하여 PCR로 유전형 분석을 하였다.

PCR 반응은 95℃에서 5분 후; 95℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 1분 을 38회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분을 진행하였다. PCR 산물은 agarose gel을 이용하여 전기영동으로 확인하였다(도 3). 이를 통해 유전형을 선발하였다.

이에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

SAMT 12_F (서열번호 6)

5'-GCGGAGGCAGTGTTTAATTT- 3'

SAMT 12_R (서열번호 7)

5'-GCAGATGTCTAGCCTCACTT- 3'

L1.5s (서열번호 8)

5'-AGTACATTAAAAACGTCCGC- 3'

실시예 3. 형질전환 벼의 유전자 활성 검증

LOC_Os06g20770 유전자의 발현 조절 부위에 발현 유도체를 삽입한 형질전환 벼 (SAMT 12)에서 LOC_Os06g20770 유전자 활성을 역전사 효소 PCR (RT-PCR, reverse transcriptase-PCR)로 확인 하였다.

구체적으로는, 형질전환 벼 (SAMT 12)의 잎 0.1g에서 total RNA를 추출하였다. 이를 주형으로 하여 LOC_Os06g20770의 발현을 확인할 수 있는 RNA 역전사용 프라이머와 역전사 효소 (reverse transcriptase DNA polymerase)를 이용하여 역전사 효소 PCR을 수행하였다.

도3 에서 확인할 수 있듯이, 천연형 화영벼에 비하여 본 발명의 형질전환 벼에서는 유전자 LOC_Os06g20770의 발현이 높아졌다는 것을 확인할 수 있었다.

RT-SAMT 12_F (정방향, 서열번호 11)

5'- TCCACTTGTACAGGTCCCTA -3'

RT-SAMT 12_R (역방향, 서열번호 12)

5'- CTCTTTCGGCCTAGGAATGT -3'

실시예 4. 형질전환 벼( SAMT 12)의 벼 흰잎 마름병에 대한 저항성 검정

상기 실시예 2에서 제조된 형질전환 벼가 흰잎 마름병에 대해 저항성을 보이는지 확인하기 위해, LOC_Os06g20770 발현 조절부위에 발현 유도체가 삽입된 형질전환 벼인 SAMT 12와 대조군으로 천연형 화영벼를 6주간 생장시켜 흰잎 마름병을 유발하는 균주인 Xanthomonas oryzae pv . oryzae (strain : Xoo korea race 3a)를 가위에 묻혀 접종한 2주 후 병증을 측정하였다 (도 5). 병증 측정은 접종한 부위로부터 감염되어 파괴된 상처 길이(Lesion Lengths)를 측정하여 천연형 화영벼와 비교하였다.

도 5의 B에서 확인할 수 있듯이 SAMT 12 형질전환체는 평균 병증의 길이가 천연형 화영벼의 반 정도에 불과하여 (천연형 vs. SAMT 12 : 18.6cm vs. 5.6cm), 흰잎 마름병에 대한 강력한 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 형질전환 벼 SAMT 12는 내재적 유전자 LOC_Os06g20770를 활성화시킴으로써 흰잎 마름병에 대한 저항성을 가질 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Methyltrasnferase gene resistant to a bacterial blight, and the transgenic plant using the same <130> KPA141023-KR <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2671 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggagacca agccagtgct ctgcaaggca atagaggggg tttttgcgtc cctatcctct 60 ccagctccgg cgaagatcgt catcgctgac ctcggctgct cgtcgggtcc caacacgctg 120 ctagtcgtgt cgggagtgat cagcatgatc tccactagtg gctacccgga aaagacggaa 180 ctacagttct tccttaatga cctacctggc aatgacttta actacgtctt ccggtcgctg 240 cagcagctca agcagcttgc tgaccggaag gagagattgt tggagccacc atactacatc 300 gctggtctac caggatcgtt ctacactagg ctcttccctt gccagagtgt ccacctcttc 360 cactgttcct acgccctcat gtggcgctcc aaggtacaca ctgcatatga tcaaattatc 420 ccaaaattga caaaaaaaaa tgcaagagga aatccgatcg cctataagac tgcacaacat 480 ttttttctca ccggaagggg acccctacac acaactacac aaacatagca tgtatatgac 540 aaattaaatg tagctaaacg tgcagtcttc acaaatttga aatcgtttga gatcgtttac 600 ctagccaaat atatttatta taaactctca tatcaatttt ttttttgaaa ataaggtatt 660 tttacaggcg gttctgtatg atgtccaaac tttgaaaatt catagaaaac ccattttaaa 720 tctgattgag gacttgaacc atagttaaga tagttgtttt agggacataa agtctcccat 780 agttttgaaa tgctgtataa ctggtaagta gcctacacgt gaatgagagg atatcggttt 840 gaattctata tttcgcatga aaaatcgtgc gatttgtgag taattattgc tgtataaatg 900 ctcactaagt tataaatatt ttttaggttt ttcccatgaa aatgaaaaat cagaaatttt 960 cacaagcagt tgtggatcca cttgtacagg tggttaataa tatatttatt atagatccgc 1020 ctatataaat cagttatcaa ctacctccac aaatggtttt cctggtagtg atatgtaata 1080 tttgtctttt tatattgata ttatataaat caatgatcag cattacatta taatcctccc 1140 tgaaaaaaat ccatggtgaa aggtccctaa agagctctca agtggcgtcc atctgaataa 1200 aggcaacatc tgcatcggga aggctacgcc atcacatgtc gtcaaattgt tccagaagaa 1260 gttcaaagag gacttctcac tgttcctcgc acttcgctca gaggaactcg taagtggcgg 1320 ctgcatggtg ctaacattcc taggccgaaa gagctcagaa atgctggcgc atggcgacgt 1380 cgacaccatg tgggaattac ttgccgaagc tctccaaatt ttggtccaaa aggtatttag 1440 catagtttcc cctcctactt tttatttgac gccggaagat ctaaacttaa ttgtctcaat 1500 gtcaaataaa gacagaatca agtattaggg acttctttgg agcgcatgca caaatcatgt 1560 gcagtttatt tcataaatat ttagttcaaa ttcactacta gaaaaaaata ttttgcagac 1620 agccaaaaca catttttcag gcagccataa cctctgcatg tacctacagg cttgcgaaaa 1680 ttaataattt tttgcaggcg gtggaaaatt agatccctct ctatataact tcgtagtcag 1740 atattcacag ctaaaaataa gatcctcctg taaaatttat aaacctcgct gtgaaaaatc 1800 gttttttcta gccatgctac tttcgttcaa acccgttcag aattccttca cttgaaatta 1860 ctccctccat cccaaaatat ttgatgccgt tgacttttta aaaaatgttt gacagttcgt 1920 cttattcaat tttttaagta attattaatt tttttcctat catttgattt attgttaaat 1980 atatttttat gtatacatgt agttttacac atttcacaaa cgtttttgaa taagacgaac 2040 ggtcaaacat gtttaaaaaa gtcagggcgt caaacattta gaaaaggagg gagtatataa 2100 ggaggtgtaa tcttgtgcca acaggggcgc gtgaaggaag aggatctgac caccttcaac 2160 ctgccgttct acgcgccatc ggtggacgag gtgactgagc tgatagagga gagtggcctc 2220 ttcgacgtcg agcacacggg cgtcttcgag tcgagttggg acccccacga cgactccaag 2280 tccaacggcg atgcggtggc cgactgcgcc cgcagcgccg acagcatcgc gaactgcagc 2340 atcagggccg tcatcaagcc gctcatcacg gaccacttcg gggagtccat cgttgacgag 2400 ctcttccagg tgtatgtccc ccttgttgcc aagcatcttg agaaaggaag ggctatgtac 2460 cctgtcattg ttgtctccct gaagggaagg ctctaaaaac tggacacacc ggccggtagc 2520 ccctatagtg tgctattctt atgaacctat atatatgtaa tgtatgtttt agtcatatat 2580 ttttcttaat gatgtttaga ccagggattg tatttactcc ttgtgtcaca ctcctgcaga 2640 tactaatctt accacttaag ttgtccatca a 2671 <210> 2 <211> 1098 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atggagacca agccagtgct ctgcaaggca atagaggggg tttttgcgtc cctatcctct 60 ccagctccgg cgaagatcgt catcgctgac ctcggctgct cgtcgggtcc caacacgctg 120 ctagtcgtgt cgggagtgat cagcatgatc tccactagtg gctacccgga aaagacggaa 180 ctacagttct tccttaatga cctacctggc aatgacttta actacgtctt ccggtcgctg 240 cagcagctca agcagcttgc tgaccggaag gagagattgt tggagccacc atactacatc 300 gctggtctac caggatcgtt ctacactagg ctcttccctt gccagagtgt ccacctcttc 360 cactgttcct acgccctcat gtggcgctcc aaggtttttc ccatgaaaat gaaaaatcag 420 aaattttcac aagcagttgt 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Thr Leu Leu Val Val Ser Gly Val Ile Ser 35 40 45 Met Ile Ser Thr Ser Gly Tyr Pro Glu Lys Thr Glu Leu Gln Phe Phe 50 55 60 Leu Asn Asp Leu Pro Gly Asn Asp Phe Asn Tyr Val Phe Arg Ser Leu 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Gln Leu Ala Asp Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Pro 85 90 95 Pro Tyr Tyr Ile Ala Gly Leu Pro Gly Ser Phe Tyr Thr Arg Leu Phe 100 105 110 Pro Cys Gln Ser Val His Leu Phe His Cys Ser Tyr Ala Leu Met Trp 115 120 125 Arg Ser Lys Val Phe Pro Met Lys Met Lys Asn Gln Lys Phe Ser Gln 130 135 140 Ala Val Val Asp Pro Leu Val Gln Val Pro Lys Glu Leu Ser Ser Gly 145 150 155 160 Val His Leu Asn Lys Gly Asn Ile Cys Ile Gly Lys Ala Thr Pro Ser 165 170 175 His Val Val Lys Leu Phe Gln Lys Lys Phe Lys Glu Asp Phe Ser Leu 180 185 190 Phe Leu Ala Leu Arg Ser Glu Glu Leu Val Ser Gly Gly Cys Met Val 195 200 205 Leu Thr Phe Leu Gly Arg Lys Ser Ser Glu Met Leu Ala His Gly Asp 210 215 220 Val Asp Thr Met Trp Glu Leu Leu Ala Glu Ala Leu Gln Ile Leu Val 225 230 235 240 Gln Lys Gly Arg Val Lys Glu Glu Asp Leu Thr Thr Phe Asn Leu Pro 245 250 255 Phe Tyr Ala Pro Ser Val Asp Glu Val Thr Glu Leu Ile Glu Glu Ser 260 265 270 Gly Leu Phe Asp Val Glu His Thr Gly Val Phe Glu Ser Ser Trp Asp 275 280 285 Pro His Asp Asp Ser Lys Ser Asn Gly Asp Ala Val Ala Asp Cys Ala 290 295 300 Arg Ser Ala Asp Ser Ile Ala Asn Cys Ser Ile Arg Ala Val Ile Lys 305 310 315 320 Pro Leu Ile Thr Asp His Phe Gly Glu Ser Ile Val Asp Glu Leu Phe 325 330 335 Gln Val Tyr Val Pro Leu Val Ala Lys His Leu Glu Lys Gly Arg Ala 340 345 350 Met Tyr Pro Val Ile Val Val Ser Leu Lys Gly Arg Leu 355 360 365 <210> 4 <211> 1361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 4 gatccccaac atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca aagatacagt 60 ctcagaagac cagagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct 120 cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa aggaagatgg 180 cttctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctaccga 240 cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggaacatc gtggaaaaag aagacgttcc 300 aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctag atccccaaca tggtggagca 360 cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc agagggctat 420 tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 480 ctgtcacttc atcgaaagga cagtagaaaa ggaagatggc ttctacaaat gccatcattg 540 cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctaccgac agtggtccca aagatggacc 600 cccacccacg aggaacatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 660 ggattgatgt gatatctaga tccccaacat ggtggagcac gacactctcg tctactccaa 720 gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca gagggctatt gagacttttc aacaaagggt 780 aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac 840 agtagaaaag gaagatggct tctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcgt 900 tcaagatgcc tctaccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggaacatcgt 960 ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctagat 1020 ccccaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc 1080 agaagaccag agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg 1140 attccattgc ccagctatct gtcacttcat cgaaaggaca gtagaaaagg aagatggctt 1200 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctaccgacag 1260 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gaacatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 1320 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctagatc c 1361 <210> 5 <211> 8275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-DNA <400> 5 gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac ggatccgagg taccaggtac caggtgagtt 60 ccattcttac taccacggtg ctattttttt tgctatgtgg ctaattacat gactaacttg 120 gggtgctaaa tcttacaggt tatatgcagg ttatatgcag gtcccgggta ggtcagtccc 180 ttatgttacg tcctgtagaa accccaaccc gtgaaatcaa aaaactcgac ggcctgtggg 240 cattcagtct ggatcgcgaa aactgtggaa ttgatcagcg ttggtgggaa agcgcgttac 300 aagaaagccg ggcaattgct gtgccaggca gttttaacga tcagttcgcc gatgcagata 360 ttcgtaatta tgcgggcaac gtctggtatc agcgcgaagt ctttataccg aaaggttggg 420 caggccagcg tatcgtgctg cgtttcgatg cggtcactca ttacggcaaa gtgtgggtca 480 ataatcagga agtgatggag catcagggcg gctatacgcc atttgaagcc gatgtcacgc 540 cgtatgttat tgccgggaaa agtgtacgta tcaccgtttg tgtgaacaac gaactgaact 600 ggcagactat cccgccggga atggtgatta ccgacgaaaa cggcaagaaa aagcagtctt 660 acttccatga tttctttaac tatgccggaa tccatcgcag cgtaatgctc tacaccacgc 720 cgaacacctg ggtggacgat atcaccgtgg tgacgcatgt cgcgcaagac tgtaaccacg 780 cgtctgttga ctggcaggtg gtggccaatg gtgatgtcag cgttgaactg cgtgatgcgg 840 atcaacaggt ggttgcaact ggacaaggca ctagcgggac tttgcaagtg gtgaatccgc 900 acctctggca accgggtgaa ggttatctct atgaactgtg cgtcacagcc aaaagccaga 960 cagagtgtga tatctacccg cttcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg aagggccaac 1020 agttcctgat taaccacaaa ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat gaagatgcgg 1080 acttacgtgg caaaggattc gataacgtgc tgatggtgca cgaccacgca ttaatggact 1140 ggattggggc caactcctac cgtacctcgc attaccctta cgctgaagag atgctcgact 1200 gggcagatga acatggcatc gtggtgattg atgaaactgc tgctgtcggc tttaacctct 1260 ctttaggcat tggtttcgaa gcgggcaaca agccgaaaga actgtacagc gaagaggcag 1320 tcaacgggga aactcagcaa gcgcacttac aggcgattaa agagctgata gcgcgtgaca 1380 aaaaccaccc aagcgtggtg atgtggagta ttgccaacga 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gcccgacagt cccggctccg 3120 gatcggacga ttgcgtcgca tcgaccctgc gcccaagctg catcatcgaa attgccgtca 3180 accaagctct gatagagttg gtcaagacca atgcggagca tatacgcccg gagccgcggc 3240 gatcctgcaa gctccggatg cctccgctcg aagtagcgcg tctgctgctc catacaagcc 3300 aaccacggcc tccagaagaa gatgttggcg acctcgtatt gggaatcccc gaacatcgcc 3360 tcgctccagt caatgaccgc tgttatgcgg ccattgtccg tcaggacatt gttggagccg 3420 aaatccgcgt gcacgaggtg ccggacttcg gggcagtcct cggcccaaag catcagctca 3480 tcgagagcct gcgcgacgga cgcactgacg gtgtcgtcca tcacagtttg ccagtgatac 3540 acatggggat cagcaatcgc gcatatgaaa tcacgccatg tagtgtattg accgattcct 3600 tgcggtccga atgggccgaa cccgctcgtc tggctaagat cggccgcagc gatcgcatcc 3660 atggcctccg cgaccggctg cagaacagcg ggcagttcgg tttcaggcag gtcttgcaac 3720 gtgacaccct gtgcacggcg ggagatgcaa taggtcaggc tctcgctgaa ttccccaatg 3780 tcaagcactt ccggaatcgg gagcgcggcc gatgcaaagt gccgataaac ataacgatct 3840 ttgtagaaac catcggcgca gctatttacc cgcaggacat atccacgccc tcctacatcg 3900 aagctgaaag cacgagattc ttcgccctcc gagagctgca 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ggccctgccg attttatttt 5640 cgatttttga aatgcgagag cgggagaacg gcaccgttgg cttggctgtg gatgccgtta 5700 gccgcaccgg actattcggc ccagttccat tttggcccaa cttgaaacag cgcggagcac 5760 aagacggggg agcccattta ggcccgtaat ctcagccctg tagaaagtcc gtgtcgttgc 5820 gatggaccag aaagcccata aaccttggag gcgttctctg ctgggaataa aataagttca 5880 cactctgtcc ctcaacttta cgtcgagttt gtttgacatc gctaatgccc agtaccagaa 5940 atcttggata caaataaggt ttgatataaa gtggcacgtg gtgaatggca tcgtttgaaa 6000 aatcttcaga tcgagcgggc ttcacaagcc gtaagtgcaa gtgccaaaat ttgtgaagaa 6060 aattacttcc ttcatttcac aatgtaagtt attttagcat tttccacatt catattgata 6120 tcaataaatt tagatagata tatatgtctg aattcgtacc gttaacgagc tctagaagct 6180 tcagtactac gcgtctcgag gcctattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 6240 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 6300 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 6360 ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 6420 gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 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gcaatgatgg catttgtaga 7320 agccatcttc cttttctact gtcctttcga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc 7380 cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctc tggtcttctg 7440 agactgtatc tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttgggga 7500 tctagatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca 7560 cgatgttcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggtagag gcatcttgaa 7620 cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtagaa gccatcttcc ttttctactg 7680 tcctttcgat gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta 7740 ccctttgttg aaaagtctca atagccctct ggtcttctga gactgtatct ttgatattct 7800 tggagtagac gagagtgtcg tgctccacca tgttggggat ctagatatca catcaatcca 7860 cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgttcctc gtgggtgggg 7920 gtccatcttt gggaccactg tcggtagagg catcttgaac gatagccttt cctttatcgc 7980 aatgatggca tttgtagaag ccatcttcct tttctactgt cctttcgatg aagtgacaga 8040 tagctgggca atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa 8100 tagccctctg gtcttctgag actgtatctt tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt 8160 gctccaccat gttggggatc ctctagagtc gagaattcag tacattaaaa acgtccgcaa 8220 tgtgttatta agttgtctaa gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgcca 8275 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMT 12_F primer <400> 6 gcggaggcag tgtttaattt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMT 12_R primer <400> 7 gcagatgtct agcctcactt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L1.5s primer <400> 8 agtacattaa aaacgtccgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhancer-F <400> 9 gatccccaac atggtggagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhancer-R <400> 10 ggatctagat atcacatcaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-SAMT 12_F <400> 11 tccacttgta caggtcccta 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-SAMT 12_R <400> 12 ctctttcggc ctaggaatgt 20

Claims (19)

1. 벼의 흰잎 마름병 저항성 증진용 재조합 벡터를 포함하는 형질전환 벼로서,
   상기 재조합 벡터는 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는 것인,
   형질전환 벼.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 LOC_Os06g20770 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 형질전환 벼.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 LOC_Os06g20770 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 메틸전이효소로 코딩되는 것인, 형질전환 벼.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 벼는 화영벼인 형질전환 벼.
   
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 발현 유도 서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것인, 형질전환 벼.
   
8. 삭제
9. 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 발현 유도 서열을 포함하는, 벼의 흰잎 마름병 저항성 증진용 재조합 벡터.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 LOC_Os06g20770 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 LOC_Os06g20770 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 메틸전이효소로 코딩되는 것인, 재조합 벡터.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 발현 유도 서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.
    
13. 삭제
14. 삭제
15. (a) 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 벼를 감염시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 감염된 벼의 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 벼의 세포를 수득하는 단계를 포함하는,
    흰잎 마름병 저항성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법.
    
16. 제15항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 제조한 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
    
17. 삭제
18. 삭제
19. 메틸전이효소를 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 LOC_Os06g20770 유전자의 활성을 강화시키는 단계를 포함하는, 벼의 흰잎 마름병 저항성의 증진방법.
    
    

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