CN117486988A - 一种与植物抗逆性相关的蛋白OsNPR3.1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白OsNPR3.1及其编码基因与应用。本发明将OsNPR3.1的编码基因序列导入水稻，得到OsNPR3.1过量表达水稻，本发明还将水稻中编码OsNPR3.1蛋白的DNA分子敲除，得到OsNPR3.1基因敲除水稻。通过实验证明：与野生型水稻相比，OsNPR3.1过量表达水稻耐冷性提高，OsNPR3.1基因敲除水稻耐冷性降低，说明OsNPR3.1具有调控植物耐冷性的功能，对于利用基因工程技术培育耐冷植物，增加植物产量具有重大价值。

Description

一种与植物抗逆性相关的蛋白OsNPR3.1及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物抗逆性相关的蛋白OsNPR3.1及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是我国第一大粮食作物，全国约有2/3的人以稻米为食。东北寒地稻作区是我国主要的粳稻生产基地，占全国粳稻总面积的43％，产量占全国粳稻总产量的40％，在保障我国粮食安全中具有举足轻重的地位和作用。由于地理位置因素，东北稻区低温冷害时有发生，是限制寒地水稻生产的主要因素。特别是黑龙江省，每3～5年就发生1次较大的低温冷害，每次均造成减产30％以上，导致水稻难以稳产。因此，提高水稻耐冷性对保障寒地水稻高产稳产具有重大的战略意义，而解析水稻耐冷分子调控机制则为水稻耐冷性状的遗传改良和耐冷分子育种提供重要的指导。
植物耐低温胁迫是一个复杂的遗传性状，受多个基因/数量性状基因座控制。与其它农艺性状相比，水稻低温耐受性的遗传研究进展缓慢，目前只鉴定出少数耐低温基因。近年来研究表明NPR1类蛋白在植物抗病反应中发挥重要作用，但在非生物胁迫应答过程中却鲜有报道。目前OsNPR3.1在冷胁迫应答过程中的功能未有报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供OsNPR3.1蛋白的新用途。
本发明提供了OsNPR3.1蛋白在如下1)或2)或3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述OsNPR3.1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于水稻且与植物耐逆性相关的蛋白质。
上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、MYC标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a4)所述的蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索1对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述同一性包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。
上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明的第二个目的是提供与OsNPR3.1蛋白相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与OsNPR3.1蛋白相关的生物材料在如下1)或2)或3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码上述OsNPR3.1蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下B1)或B2)所示的基因：
B1)序列2所示的DNA分子；
B2)与B1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述OsNPR3.1蛋白的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsNPR3.1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码OsNPR3.1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsNPR3.1蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述A2)中，所述表达盒(OsNPR3.1基因表达盒)是指能够在宿主细胞中表达OsNPR3.1蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动OsNPR3.1转录的启动子，还可包括终止OsNPR3.1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
上述A3)和A4)中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为利用现有的植物表达载体构建得到的含有上述核酸分子或上述表达盒的载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述A5)-A8)中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述重组微生物可为含有上述核酸分子或上述表达盒或上述重组载体的微生物。
上述应用中，所述调控植物耐逆性可为提高植物耐逆性；所述耐逆性可为耐冷性。
所述提高植物耐逆性体现为：在冷胁迫条件下，植物中OsNPR3.1蛋白含量和/或活性越高或OsNPR3.1基因表达量越高，植物的耐冷性越高。进一步体现为：在冷胁迫条件下，植物中OsNPR3.1蛋白含量和/或活性越高或OsNPR3.1基因表达量越高，植物的存活率越高，过氧化物酶和超氧化物酶的酶活越高，丙二醛含量越低。
所述植物育种的目的为培育耐逆植物品种(如耐冷植物品种)。
本发明的第三个目的是提供抑制OsNPR3.1蛋白的物质在如下4)或5)中的应用：
3)降低植物耐逆性；
4)培育耐逆性降低的转基因植物。
进一步的，所述抑制OsNPR3.1蛋白的物质可为抑制OsNPR3.1蛋白活性的物质或抑制编码OsNPR3.1蛋白基因表达的物质或敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质。
所述抑制OsNPR3.1蛋白活性的物质可为任何能够使植物中OsNPR3.1蛋白活性缺失的物质，如抑制OsNPR3.1蛋白合成或促进OsNPR3.1蛋白降解或抑制OsNPR3.1蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制剂)。
所述抑制编码OsNPR3.1蛋白基因表达的物质可为任何能够使植物中编码OsNPR3.1蛋白的基因无法表达的物质，如沉默植物中编码OsNPR3.1蛋白基因的物质(如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等)。
所述敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质可为以任何方式实现宿主细胞不产生OsNPR3.1基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分(例如启动子编辑)使得编码基因序列不被转录、通过与mRNA的结合阻止翻译等。通常，敲除在基因组DNA水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。具体的，所述敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质可为任何能够使植物中编码OsNPR3.1蛋白基因发生突变(所述突变形式可为缺失突变和/或插入突变和/或碱基替换)从而失去活性的物质，如锌指蛋白ZFN基因编辑系统或TALENs基因编辑系统或CRISPR/Cas9基因编辑系统等。
更进一步的，所述敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质为敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的载体。
上述应用中，所述耐逆性可为耐冷性。所述降低植物耐逆性体现为：在冷胁迫条件下，植物中的OsNPR3.1蛋白或其编码基因缺失或抑制，植物的耐冷性降低；进一步体现为：在冷胁迫条件下，植物中的OsNPR3.1蛋白或其编码基因缺失或抑制，植物存活率降低，超氧化物酶和过氧化物酶的酶活降低，丙二醛含量提高。
本发明的第四个目的是提供一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括如下步骤：提高受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
进一步的，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物具体体现在如下X1)-X4)中的任一种：
X1)所述转基因植物的存活率高于所述受体植物；
X2)所述转基因植物的过氧化物酶酶活高于所述受体植物；
X3)所述转基因植物的超氧化物酶酶活高于所述受体植物；
X4)所述转基因植物的丙二醛含量低于所述受体植物。
所述提高受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性的方法在受体植物中过表达OsNPR3.1蛋白。
更进一步的，所述过表达的方法为将OsNPR3.1蛋白的编码基因导入受体植物中。
在本发明的具体实施例中，所述OsNPR3.1蛋白的编码基因通过pCAMBIA3301-pOsNPR3.1-OsNPR3.1导入受体植物中；所述pCAMBIA3301-pOsNPR3.1-OsNPR3.1为在pCAMBIA3301-pOsNPR3.1载体的两个酶切位点(Nco1和BstEII)间插入序列2所示的DNA分子，且保持pCAMBIA3301-pOsNPR3.1载体的其他序列不变后得到的载体。所述pCAMBIA3301-pOsNPR3.1载体为在pCAMBIA3301载体的两个酶切位点(Xba1和Nco1)间插入序列1所示的DNA分子，且保持pCAMBIA33001载体的其他序列不变后得到的载体。
本发明的第五个目的是提供一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐逆性降低的转基因植物的方法包括如下步骤：降低受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物。
进一步的，所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物具体体现在如下Y1)-Y4)中的任一种：
Y1)所述转基因植物的存活率低于所述受体植物；
Y2)所述转基因植物的过氧化物酶酶活低于所述受体植物；
Y3)所述转基因植物的超氧化物酶酶活低于所述受体植物；
Y4)所述转基因植物的丙二醛含量高于所述受体植物。
再进一步的，所述降低受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性的方法为将敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质导入受体植物中。
更进一步的，所述敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质可为敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的载体；所述载体表达靶向OsNPR3.1基因的sgRNA和Cas9核酸酶。所述sgRNA的靶序列可为序列4所示的DNA分子。
在本发明的具体实施例中，所述敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的载体为CRISPR-OsNPR3.1基因敲除载体。所述CRISPR-OsNPR3.1基因敲除载体为在pCAMBIA1300载体的HindIII、EcoRI酶切位点间插入序列4所示的DNA分子，且保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变后得到的载体。
本发明的第六个目的是提供一种特异sgRNA或含有所述sgRNA编码基因的表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或转基因植物细胞系，所述sgRNA的靶序列为序列4所示的DNA分子。
上述任一所述方法或应用中，所述耐冷性为幼苗期耐冷性。
上述任一所述方法或应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步的，所述禾本科植物为水稻。在本发明的一个具体实施例中，所述水稻为垦粳8号。
本发明提供了OsNPR3.1蛋白在调控植物耐逆性中的应用。本发明将编码OsNPR3.1蛋白的DNA分子导入目的植物，得到OsNPR3.1过量表达水稻，通过实验证明：该OsNPR3.1过量表达水稻的耐冷性高于受体植物，说明OsNPR3.1过量表达提高了植物对冷胁迫的耐受性。本发明还将目的植物中编码OsNPR3.1蛋白的DNA分子敲除，得到OsNPR3.1基因敲除水稻，通过实验证明：该OsNPR3.1基因敲除水稻的耐冷性低于受体植物，说明OsNPR3.1缺失降低了植物对冷胁迫的耐受性。以上结果表明：OsNPR3.1具有调控植物耐冷性的功能，对于培育耐冷植物，增加植物产量具有重大价值。
附图说明
图1为荧光定量PCR分析OsNPR3.1冷胁迫表达模式。
图2为OsNPR3.1启动子和CDS区克隆。图2A为OsNPR3.1启动子的克隆；图2B为OsNPR3.1的CDS区的克隆。
图3为OsNPR3.1过量表达载体的构建。图3A为OsNPR3.1过量表达载体示意图；图3B为OsNPR3.1的CDS区和启动子克隆；图3C为过量表达载体酶切鉴定OsNPR3.1的CDS区；图3D为过量表达载体酶切鉴定OsNPR3.1的启动子区。
图4为OsNPR3.1过量表达水稻的获得与鉴定。图4A为DNA水平鉴定；图4B为RNA水平鉴定。
图5为OsNPR3.1过量表达水稻幼苗期的耐冷性分析。图5A为野生型和OsNPR3.1过量表达水稻幼苗期冷处理前后的表型比较；图5B为冷处理后野生型和OsNPR3.1过量表达水稻存活率；图5C为冷处理前后野生型和OsNPR3.1过量表达水稻的超氧化物酶酶活比较；图5D为冷处理前后野生型和OsNPR3.1过量表达水稻的过氧化物酶酶活比较；图5E为冷处理前后野生型和OsNPR3.1过量表达水稻的丙二醛含量比较。
图6为OsNPR3.1基因敲除载体的构建。图6A为OsNPR3.1基因敲除载体示意图；图6B为OsNPR3.1的sgRNA序列；图6C为psgR-Cas9-OsNPR3.1片段PCR扩增；图6D为CRISPR-OsNPR3.1基因敲除载体菌落PCR鉴定。
图7为OsNPR3.1基因敲除水稻的获得与鉴定。图7A为OsNPR3.1基因敲除水稻DNA水平检测；图7B为NPR3-KO#6和NPR3-KO#10水稻编辑后序列；图7C为NPR3-KO#6和NPR3-KO#10水稻编辑后结构域。
图8为OsNPR3.1基因敲除水稻幼苗期的耐冷性分析。图8A为野生型和OsNPR3.1基因敲除水稻幼苗期冷处理前后的表型比较；图8B为冷处理后野生型和OsNPR3.1基因敲除水稻存活率；图8C为冷处理前后野生型和OsNPR3.1基因敲除水稻的丙二醛含量比较；图8D为冷处理前后野生型和OsNPR3.1基因敲除水稻的超氧化物酶酶活比较；图8E为冷处理前后野生型和OsNPR3.1基因敲除水稻的过氧化物酶酶活比较。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pCAMBIA3301载体记载于如下文献：Sun X L,Sun M Z,Jia B W,Qin Z I,Yang K J,Chen C,Yu Q Y,Zhu Y M.A Glycine soja methionine sulfoxidereductase B5a interacts with the Ca2+/CAM-binding kinase GsCBRLK and activatesROS signaling under carbonate alkaline stress.PLANT J 2016,86(6):514-529中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的psgR-Cas9-Os载体记载于如下文献：Miao C,Wang Z,Zhang L,Yao J,Hua K,Liu X,Shi H,Zhu JK.The grain yield modulator miR156 regulatesseed dormancy through the gibberellin pathway in rice.Nat Commun.2019Aug23；10(1):3822中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pCAMBIA1300载体记载于如下文献：Nour-Eldin HH,Hansen BG,MH,Jensen JK,Halkier BA.Advancing uracil-excision based cloningtowards an ideal technique for cloning PCR fragments.Nucleic Acids Res.2006；34(18):e122中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型水稻品种“垦粳8号(农丰13B229)”为粳型常规水稻，2018年黑龙江审定，审定编号为黑审稻2018007，具体信息记录于国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/variety/varis/617734.htm)，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、冷胁迫下OsNPR3.1的表达模式分析
对三叶期水稻幼苗进行4℃冷处理，分别在处理0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h时取相同位置的叶片，采用Trizol法提取总RNA，采用反转录试剂盒HiScript III 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme，R312)反转录获得cDNA。将获得的cDNA稀释10倍，以稀释后的cDNA为模板，采用OsNPR3.1-qRT-F和OsNPR3.1-qRT-R引物进行荧光定量PCR。同时以水稻的延伸因子1-α基因(elongation factor 1-gene，osa-ELF1-α)为内参基因。检测所用引物序列如下：
OsNPR3.1-qRT-F：5’-TTGCTTGAAAGTGGCACAGC-3’；
OsNPR3.1-qRT-R：5’-TCCCTTTCTTGTTGCCAGGT-3’；
osa-ELF1-α-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCAC-3’；
osa-ELF1-α-R：5’-TCTTGTCAGGGTTGTAGCCGAC-3’。
qRT-PCR检测结果如图1所示。结果显示：在4℃冷胁迫处理3h后，OsNPR3.1的表达量呈现上升趋势，并在24h时达到最高，说明OsNPR3.1的表达受冷胁迫诱导，可能参与水稻冷胁迫应答。
实施例2、OsNPR3.1基因启动子和CDS区的克隆
1、引物的设计
通过phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Osativa_v7_0)数据库获取水稻OsNPR3的基因组序列，选择OsNPR3基因的首要转录本-OsNPR3.1的CDS区进行克隆，同时选择OsNPR3.1基因转录起始点上游1014bp的DNA序列作为启动子。应用PrimerPremier 5.0设计OsNPR3.1启动子和CDS区克隆引物。引物序列如下：
OsNPR3.1-NP-F：5’-CGTTGGATGAACTACATTGCTGATATTGAT-3’；
OsNPR3.1-NP-R：5’-TCTTATCCGGAAATTTCGCGCGT-3’；
OsNPR3.1-CDS-F：5’-ATGGAGACGTCCACCATAAG-3’；
OsNPR3.1-CDS-R：5’-TTACCGTGATAGCTTCCCTTTC-3’。
2、OsNPR3.1基因的克隆
1)选取成熟的、饱满的野生型水稻垦粳8号种子，经过42℃下处理3-5天以打破休眠。
2)使用10％ NaClO灭菌30分钟，无菌蒸馏水清洗5遍后置于黑暗条件下浸种1天，然后将萌动的水稻种子转移至30℃环境中黑暗催芽培养1天，再将萌发的水稻苗转移到Yoshida溶液中在28℃、14h光照，25℃、10h黑暗条件下培养至三叶期。
3)取三叶期幼苗叶片，使用CTAB法提取水稻基因组DNA，采用引物OsNPR3.1-NP-F和OsNPR3.1-NP-R进行PCR扩增，将符合预期的PCR片段进行回收(图2A)，连接pEASY-T载体，并对阳性克隆进行测序鉴定，测序结果表明：PCR扩增得到大小为1014bp的片段，其核苷酸序列如序列1所示，该片段包含OsNPR3.1的启动子序列，并将测序正确的载体命名为T-pOsNPR3.1，用于后续研究。
4)取三叶期幼苗叶片，通过Trizol法(Invitrogen，15596026)提取总RNA，反转录获得cDNA，以获得的cDNA为模板，采用引物OsNPR3.1-CDS-F和OsNPR3.1-CDS-R进行PCR扩增，将符合预期的PCR片段进行回收(图2B)，连接pEASY-T载体，并对阳性克隆进行测序鉴定，测序结果表明：PCR扩增得到大小为1770bp的片段，其核苷酸序列如序列2所示，该片段包含OsNPR3.1的CDS区序列，并将测序正确的载体命名为T-OsNPR3.1，用于后续研究。
实施例3、OsNPR3.1过量表达材料的获得及耐冷性分析
一、OsNPR3.1过量表达载体的构建
为获得OsNPR3.1过量表达水稻，构建了如图3A所示的植物表达载体进行后续的遗传转化。具体步骤如下：
1、以T-pOsNPR3.1质粒为模板采用引物pOsNPR3.1-XF和pOsNPR3.1-XR进行PCR扩增(图3A-B)，得到增添酶切位点(Xba1和Nco1)的启动子序列(pOsNPR3.1片段)。引物序列如下(下划线代表构建载体所需的重组序列)：
pOsNPR3.1-XF：5’-GGTACCCGGGGATCCTCTAGACGTTGGATGAACTACATTGCTGA-3’；
pOsNPR3.1-XR：5’-TTACCCTCAGATCTACCATGGTCTTATCCGGAAATTTCGCG-3’。
2、用限制性内切酶Xba1和Nco1对pCAMBIA3301载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、CE重组酶(Vazyme，C112)和步骤1获得的pOsNPR3.1片段在37℃下孵育30min，在重组酶的催化作用下，获得pCAMBIA3301-pOsNPR3.1，并进行大肠杆菌转化，对PCR扩增阳性的单克隆进行测序鉴定。测序结果表明：pCAMBIA3301-pOsNPR3.1为在pCAMBIA3301载体的两个酶切位点(Xba1和Nco1)间插入序列1所示的DNA分子，且保持pCAMBIA33001载体的其他序列不变后得到的载体。
3、以T-OsNPR3.1质粒为模板采用引物OsNPR3.1-XF和OsNPR3.1-XR进行PCR扩增(图3A-B)，得到增添酶切位点(Nco1和BstEII)的OsNPR3.1 CDS序列(OsNPR3.1片段)。引物序列如下(下划线代表构建载体所需的重组序列)：
OsNPR3.1-XF：5’-ACGGGGGACTCTTGACCATGGATGGAGACGTCCACCATAAGCT-3’；
OsNPR3.1-XR：5’-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTTACCGTGATAGCTTCCCTTTCTT-3’。
4、用限制性内切酶Nco1和BstEII对pCAMBIA3301-pOsNPR3.1载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、CE重组酶(Vazyme，C112)和步骤3获得的OsNPR3.1片段在37℃下孵育30min，在重组酶的催化作用下，获得pCAMBIA3301-pOsNPR3.1-OsNPR3.1，并进行大肠杆菌转化，对PCR扩增阳性的单克隆进行酶切鉴定(图3C-D)和测序鉴定。
测序结果表明：pCAMBIA3301-pOsNPR3.1-OsNPR3.1为在pCAMBIA3301-pOsNPR3.1载体的两个酶切位点(Nco1和BstEII)间插入序列2所示的DNA分子，且保持pCAMBIA3301-pOsNPR3.1载体的其他序列不变后得到的载体。
二、OsNPR3.1过量表达水稻的获得及鉴定
1、采用冻融法将步骤一获得的pCAMBIA3301-pOsNPR3.1-OsNPR3.1转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌pCAMBIA3301-pOsNPR3.1-OsNPR3.1/EHA105。
2、采用农杆菌介导法将重组菌pCAMBIA3301-pOsNPR3.1-OsNPR3.1/EHA105菌液侵染野生型水稻品种“垦粳8号”的胚性愈伤组织20min，然后将愈伤组织转接到共培养培养基(含20mg/L乙酰丁香酮的NB培养基，pH5.2)。
3、25℃黑暗培养2-4天后取愈伤组织，用含500mg/L头孢霉素的无菌水溶液清洗，然后接种至筛选培养基(含15mg/L固杀草和100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的NB培养基，pH5.8)。
4、32℃、24h光照条件下培养6周后取愈伤组织，接种至分化培养基(含30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白水解物、100mg/L阿莫西林克拉维酸钾、2mg/L KT和0.02mg/L NAA的MS培养基，pH5.8)，首先在25℃、黑暗的条件下培养5-7天，然后转移至26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至愈伤组织表面有绿点产生。
5、将有绿点的愈伤组织转移至新的分化培养基，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至幼苗再生芽长度约为2cm。
6、将幼苗转移至生根培养基(含100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的MS培养基，pH5.8)，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至株高为10-15cm且根系发达，得到再生植株(T0代)。
7、将再生植株(T0代)移栽到事先拌好的培养基质(培养基质的组成：1质量份草炭土+1质量份君子兰土+3质量份土壤)，浇水，先放置在暗光条件下培养3-5天，然后移至户外正常培养。
8、取再生植株的叶片，提取基因组DNA，采用引物OsNPR3.1-CF和NOS-R进行PCR鉴定，得到PCR鉴定阳性的再生植株(图4A)。引物序列如下：
OsNPR3.1-CF：5’-TTGCTTGAAAGTGGCACAGC-3’；
NOS-R：5’-TGTTTGAACGATCGGGGAAATTC-3’。
9、分别取PCR鉴定阳性的再生植株的嫩叶，提取总RNA并反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用引物OsNPR3.1-QF和OsNPR3.1-QR进行荧光定量PCR，同时以水稻的延伸因子1-α基因(osa-ELF1-α)为内参基因。
OsNPR3.1-QF：5’-TTGCTTGAAAGTGGCACAGC-3’；
OsNPR3.1-QR：5’-TCCCTTTCTTGTTGCCAGGT-3’。
荧光定量PCR鉴定结果如图4B所示。从图中可以看出：在正常条件下，5个转基因株系的OsNPR3.1表达量显著高于野生型。同时发现，在4℃冷处理12h后，5个转基因株系的OsNPR3.1表达量大幅度高于野生型，说明成功获得OsNPR3.1过量表达水稻。
10、将荧光定量PCR鉴定过量表达的再生植株自交，每个单株分别收获T1代种子，将阳性的T1代植株进行自交，每个单株分别收获T2代种子，按照步骤9的方法对T2代种子长成的植株进行荧光定量PCR鉴定；对于某一T1代植株来说，如果其自交得到的T2代植株均为PCR鉴定阳性，该T1代植株为一个纯合的转基因植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系，直至获得T3代过量表达OsNPR3.1转基因水稻纯合体株系。随机选取2个T3代过量表达OsNPR3.1转基因水稻纯合体株系pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6用于下述耐冷性分析。
三、OsNPR3.1过量表达水稻的耐冷性分析
选取饱满的野生型水稻品种垦粳8号(WT)、T3代过量表达OsNPR3.1转基因水稻纯合体株系pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6种子，蒸馏水清洗后30℃浸种、催芽3～5天至破胸露白。将发芽的种子播种于湿润的育秧土中，培养至三叶期后进行幼苗期冷处理，冷处理方法如下：在4℃培养箱中培养4天，恢复培养5天。冷处理后拍照并统计存活率；在冷处理前和冷处理2天后，分别取水稻幼苗相同部位的叶片，采用参考文献“miR535 negativelyregulates cold tolerance in rice”中的方法测定超氧化物酶酶活、过氧化物酶酶活和丙二醛含量，每个指标测定15个样本，实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。
结果如图5所示，结果显示：冷处理后野生型水稻和OsNPR3.1过量表达水稻都逐渐失绿甚至死亡，但OsNPR3.1过量表达水稻恢复后长势明显优于野生型水稻(图5A)。冷处理恢复后野生型水稻、OsNPR3.1过量表达水稻pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6的平均存活率分别为55.1％、64％和69％(图5B)，OsNPR3.1过量表达水稻pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6的存活率均显著高于野生型水稻。对冷处理前后野生型水稻和OsNPR3.1过量表达水稻pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6的SOD(超氧化物酶)酶活、POD(过氧化物酶)酶活和MDA(丙二醛)含量进行测定发现：冷处理前野生型水稻与OsNPR3.1过量表达水稻pNPR3:NPR3-3和pNPR3:NPR3-6水稻各个酶的酶活性以及丙二醛含量无差异(图5C、D和E)；冷处理后野生型水稻、OsNPR3.1过量表达水稻pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6的平均超氧化物酶酶活分别为937.624U/g、1080.7U/g和1090.97U/g；冷处理后野生型水稻、OsNPR3.1过量表达水稻pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6的平均过氧化物酶酶活性分别为45.7308U/mg、50.3235U/mg和48.0441U/mg；冷处理后野生型水稻、OsNPR3.1过量表达水稻pNPR3:NPR3#3和pNPR3:NPR3#6的平均丙二酮含量为20.3333μmol/g、17.2733μmol/g和17.8933μmol/g(图5C、D和E)。以上生理指标变化表明，OsNPR3.1过量表达水稻ROS清除相关酶活性显著高于野生型水稻。
综上所述，OsNPR3.1过量表达提高了水稻对冷胁迫的耐受性。
实施例4、OsNPR3.1基因敲除水稻的获得及耐冷性分析
一、CRISPR-OsNPR3.1基因敲除载体构建
1、sgRNA靶标序列
基于OsNPR3.1基因CDS区序列，通过在线网站Optimized CRISPR Design(https://zlab.bio/guide-design-resources)设计用于构建CRISPR-OsNPR3.1的sgRNA靶序列，设计的sgRNA靶序列如下：GATTCGCCATACACTACGCTG(序列4)。
2、合成两条单链引物OsNPR3.1-sgRNA-F/OsNPR3.1-sgRNA-R(图6B)，退火合成双链sgRNA，与经BbsI消化的psgR-Cas9-Os载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态，获得中间载体psgR-Cas9-OsNPR3.1(图6C)。
OsNPR3.1-sgRNA-F：5’-TGGCGATTCGCCATACACTACGCTG-3’；
OsNPR3.1-sgRNA-R：5’-AAACCAGCGTAGTGTATGGCGAATC-3’。
3、采用HindIII与EcoRI双酶切中间载体psgR-Cas9-OsNPR3.1，获得sgRNA-Cas9表达盒片段，与HindIII、EcoRI消化过的pCAMBIA1300载体连接，获得CRISPR-OsNPR3.1基因敲除载体，并对其进行菌落PCR鉴定(图6D)与测序。
测序结果表明：CRISPR-OsNPR3.1基因敲除载体为在pCAMBIA1300载体的HindIII、EcoRI酶切位点间插入序列4所示的DNA分子，且保持pCAMBIA1300载体的其他序列不变后得到的载体。
二、OsNPR3.1基因敲除水稻的获得及鉴定
1、采用冻融法将步骤一获得的CRISPR-OsNPR3.1基因敲除载体转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌CRISPR-OsNPR3.1/EHA105。
2、采用农杆菌介导法将重组菌CRISPR-OsNPR3.1/EHA105菌液侵染野生型水稻品种“垦粳8号”的胚性愈伤组织20min，然后将愈伤组织转接到共培养培养基(含20mg/L乙酰丁香酮的NB培养基，pH5.2)。
3、25℃黑暗培养2-4天后取愈伤组织，用含500mg/L头孢霉素的无菌水溶液清洗，然后接种至筛选培养基(含40mg/L潮霉素和100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的NB培养基，pH5.8)。
4、32℃、24h光照条件下培养6周后取愈伤组织，接种至分化培养基(含30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白水解物、100mg/L阿莫西林克拉维酸钾、2mg/L KT和0.02mg/L NAA的MS培养基，pH5.8)，首先在25℃、黑暗的条件下培养5-7天，然后转移至26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至愈伤组织表面有绿点产生。
5、将有绿点的愈伤组织转移至新的分化培养基，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至幼苗再生芽长度约为2cm。
6、将幼苗转移至生根培养基(含100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的MS培养基，pH5.8)，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至株高为10-15cm且根系发达，得到再生植株(T0代)。
7、将再生植株(T0代)移栽到事先拌好的培养基质(培养基质的组成：1质量份草炭土+1质量份君子兰土+3质量份土壤)，浇水，先放置在暗光条件下培养3-5天，然后移至户外正常培养。
8、取再生植株的叶片，提取基因组DNA，采用引物CRISPR-OsNPR3.1-F和CRISPR-OsNPR3.1-R进行PCR扩增，并将PCR产物送公司测序(图7A)。引物序列如下：
CRISPR-OsNPR3.1-F：5’-GGTTGCCTCCACCTGCCATC-3’；
CRISPR-OsNPR3.1-R：5’-CGTCCATCCTGTGTCCTTTCCA-3’。
由于水稻是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变体指的是该植株的两条同源染色体的OsNPR3.1基因发生了相同的突变。
最终得到不同编辑类型的OsNPR3.1基因纯合突变体株系NPR3-KO#6和NPR3-KO#10。
测序结果表明：与野生型水稻品种“垦粳8号”的基因组DNA相比，OsNPR3.1基因纯合突变体株系NPR3-KO#6的差异仅在于对应于序列2所示的OsNPR3.1基因CDS区序列的第890-894位发生了5个碱基(CTGCG)的缺失突变，导致翻译提前终止，缺失NPR1_like结构域(图7B和C)。
与野生型水稻品种“垦粳8号”的基因组DNA相比，OsNPR3.1基因纯合突变体株系NPR3-KO#10的差异仅在于对应于序列2所示的OsNPR3.1基因CDS区序列的第890位和第891位之间发生了一个碱基C的插入突变，导致翻译提前终止，缺失NPR1_like结构域(图7B和C)。
9、将成功基因编辑的再生植株自交，每个单株分别收获T1代种子，按照步骤8的方法对T1代种子长成的植株进行PCR扩增与测序鉴定；将测序鉴定成功编辑的T1代植株进行自交，每个单株分别收获T2代种子，按照步骤8的方法对T2代种子长成的植株进行PCR扩增与测序鉴定；对于某一T1代植株来说，如果其自交得到的T2代植株均为鉴定成功编辑，该T1代植株为一个纯合的基因编辑植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系，直至获得T3代OsNPR3.1基因敲除水稻纯合株系NPR3-KO#6和NPR3-KO#10，用于下述耐冷性分析。
三、OsNPR3.1基因敲除水稻耐冷性分析
选取饱满的野生型水稻品种垦粳8号(WT)、T3代OsNPR3.1基因敲除水稻纯合株系NPR3-KO#6和NPR3-KO#10种子，蒸馏水清洗后30℃浸种、催芽3～5天，至破胸露白。将发芽的种子播种到湿润的育秧土中，培养至三叶期后进行幼苗期冷处理，冷处理方法如下：在4℃培养箱中培养3天，恢复培养4天。冷处理后拍照并统计存活率；在冷处理前和冷处理2天后，分别取水稻幼苗相同部位的叶片，采用参考文献“miR535 negatively regulates coldtolerance in rice”中的方法测定超氧化物酶酶活、过氧化物酶酶活和丙二醛含量，每个指标测定15个样本，实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。
结果如图8所示，结果显示：冷处理后野生型水稻和OsNPR3.1基因敲除水稻都逐渐失绿甚至死亡，但野生型水稻恢复后长势明显优于OsNPR3.1基因敲除水稻(图8A)。冷处理恢复后野生型水稻、OsNPR3.1基因敲除水稻NPR3-KO#6和NPR3-KO#10的平均存活率分别为55.1％、38和38.5％(图8B)，野生型水稻存活率显著高于OsNPR3.1基因敲除水稻；对冷处理前后野生型水稻和OsNPR3.1基因敲除水稻的SOD(超氧化物酶)酶活、POD(过氧化物酶)酶活和MDA(丙二醛)含量进行测定发现：冷处理前野生型水稻与OsNPR3.1基因敲除水稻NPR3-KO#6和NPR3-KO#10各个酶的酶活性及丙二醛含量无差异(图8C、D和E)；冷处理后野生型水稻、OsNPR3.1基因敲除水稻纯合体株系NPR3-KO#6和NPR3-KO#10的平均超氧化物酶酶活分别为937.624U/g、695.672U/g和672.468U/g；野生型水稻、OsNPR3.1基因敲除水稻纯合体株系NPR3-KO#6和NPR3-KO#10的平均过氧化物酶酶活性分别为45.7308U/mg、38.6225U/mg和34.4668U/mg；野生型水稻、OsNPR3.1基因敲除水稻纯合体株系NPR3-KO#6和NPR3-KO#10的平均丙二酮含量分别为20.3333μmol/g、25.4667μmol/g和24.76μmol/g(图8C、D和E)。以上生理指标变化表明，OsNPR3.1基因敲除水稻ROS清除相关酶活性显著低于野生型水稻。
综上所述，OsNPR3.1基因敲除降低了水稻对冷胁迫的耐受性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.OsNPR3.1蛋白在如下1)或2)或3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述OsNPR3.1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于水稻且与植物耐逆性相关的蛋白质。
2.与OsNPR3.1蛋白相关的生物材料在如下1)或2)或3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码OsNPR3.1蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
所述OsNPR3.1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于水稻且与植物耐逆性相关的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下B1)或B2)所示的基因：
B1)序列2所示的DNA分子；
B2)与B1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述OsNPR3.1蛋白的DNA分子。
4.抑制OsNPR3.1蛋白的物质在如下4)或5)中的应用：
4)降低植物耐逆性；
5)培育耐逆性降低的转基因植物；
所述OsNPR3.1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于水稻且与植物耐逆性相关的蛋白质。
5.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物；所述OsNPR3.1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于水稻且与植物耐逆性相关的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达OsNPR3.1蛋白；
和/或，所述过表达的方法为将OsNPR3.1蛋白的编码基因导入受体植物中。
7.一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：降低受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物；
所述OsNPR3.1蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)将序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于水稻且与植物耐逆性相关的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中OsNPR3.1蛋白的含量和/或活性的方法为将敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质导入受体植物中；
和/或，所述敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的物质为敲除编码OsNPR3.1蛋白基因的载体。
9.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐冷性；
和/或，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；
和/或，所述单子叶植物为禾本科植物；
和/或，所述禾本科植物为水稻。
10.一种特异sgRNA或含有所述sgRNA编码基因的表达盒、载体、宿主细胞、工程菌或转基因植物细胞系，所述sgRNA的靶序列为序列4所示的DNA分子。
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