CN117402878A - 一种水稻冷诱导型启动子pOsNPR3.1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种水稻冷诱导型启动子pOsNPR3.1及其应用。所述pOsNPR3.1启动子为如下A1)或A2)：A1)序列1所示的DNA分子；A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明通过农杆菌介导法将含有启动子pOsNPR3.1驱动GUS表达的重组载体转化至水稻中，得到pNPR3:GUS转基因水稻。然后通过对pNPR3:GUS转基因水稻冷处理前后GUS基因表达情况进行检测，发现GUS基因表达受冷胁迫诱导。说明pOsNPR3.1启动子为冷诱导型启动子，可以应用到水稻耐逆的遗传育种实践当中，对提高水稻的耐逆性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及水稻基因工程技术领域，具体涉及一种水稻冷诱导型启动子pOsNPR3.1及其应用。
背景技术
解析水稻耐冷分子调控机制为水稻耐冷性状的遗传改良和耐冷分子育种提供重要的指导。
从基因层面研究作物的抗逆性，可以更好的指导育种工作的高效进行。在转基因作物的研究中，启动子是影响转入基因表达效率的一个重要因素。成功地应用转基因植物高质量、高产量地表达外源基因，需要有高效率的启动子。现有报道中水稻中多用CaMV35S启动子的转基因抗逆作物会持续表达相关抗逆蛋白，然而在无逆境环境下，抗逆基因的表达会消耗有限的能量，从而不利于作物的正常生长发育。
发明内容
本发明的目的是提供一种冷诱导型的启动子及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种DNA分子，所述DNA分子为如下A1)或A2)：
A1)序列1所示的DNA分子；
A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的DNA分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的DNA分子的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的DNA分子的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
第二方面，本发明要求保护与上述DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)含有上述DNA分子的表达盒；
B2)含有上述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有上述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有上述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，B1)所述表达盒(5’至3’)可包括启动子区(由所述DNA分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。
所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。
在制备所述表达盒时，可应用衔接头连接DNA片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的DNA、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。
所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。
上述生物材料中，B2)所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为利用现有的植物表达载体构建得到的含有上述DNA分子或上述表达盒的载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。
上述生物材料中，B3)所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌(如根癌农杆菌LBA4404)。所述重组微生物可为含有上述DNA分子或上述表达盒或上述重组载体的微生物。
上述生物材料中，B4)所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述DNA分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述DNA分子，也可用常规育种技术将所述DNA分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
第三方面，本发明要求保护上述DNA分子或生物材料的新用途。
本发明要求保护上述DNA分子在作为启动子或冷诱导型启动子中的应用。
本发明要求保护上述DNA分子或生物材料在启动目的基因表达中的应用。
本发明要求保护上述DNA分子或生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
上述任一所述应用中，所述制备转基因植物或所述植物育种的目的为培育耐逆植物品种(如耐冷植物品种)。
第四方面，本发明要求保护一种目的基因的表达方法，所述方法为如下C1)-C4)中任一种：
C1)包括如下步骤：以上述DNA分子作为启动子来启动目的基因表达；
C2)包括如下步骤：将上述DNA分子插入到目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因表达；
C3)包括如下步骤：将目的基因插入上述表达盒中的上述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因表达；
C4)包括如下步骤：将目的基因插入上述重组载体中的上述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因表达。
上述任一所述启动目的基因表达可为在植物中启动目的基因表达。
上述任一所述启动目的基因表达可为在冷胁迫条件下启动目的基因表达。所述冷胁迫具体可为4℃胁迫。
上述任一所述目的基因可为植物内源基因，也可为外源基因(如GUS基因)。
上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。
进一步的，所述双子叶植物可为禾本科植物。
更进一步的，所述禾本科植物可为水稻。
在本发明的具体实施例中，所述水稻为垦粳8号。
本发明提供了一种OsNPR3.1的启动子pOsNPR3.1，通过农杆菌介导法将含有该启动子驱动GUS表达的重组载体转化至水稻中，得到pNPR3:GUS转基因水稻，然后通过对pNPR3:GUS转基因水稻冷处理前后GUS基因表达情况进行检测，发现GUS基因表达受冷胁迫诱导。说明pOsNPR3.1启动子为冷诱导型启动子，可以应用到水稻耐逆的遗传育种实践当中，对提高水稻的耐逆性具有重要意义。
附图说明
图1为荧光定量PCR分析OsNPR3.1冷胁迫表达模式。
图2为OsNPR3.1启动子区克隆。
图3为pNPR3:GUS植物表达载体的构建。图3A为pNPR3:GUS植物表达载体示意图；图3B为OsNPR3.1的启动子克隆；图3C为植物超量表达载体酶切鉴定OsNPR3.1的启动子区。
图4为pNPR3:GUS转基因水稻的获得与鉴定。图4A为DNA水平鉴定；图4B为RNA水平鉴定。
图5为pNPR3:GUS转基因水稻GUS基因4℃冷处理表达模式。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pCAMBIA3301载体记载于如下文献：Sun X L,Sun M Z,Jia B W,Qin Z I,Yang K J,Chen C,Yu Q Y,Zhu Y M.A Glycine soja methionine sulfoxidereductase B5a interacts with the Ca2+/CAM-binding kinase GsCBRLK and activatesROS signaling under carbonate alkaline stress.PLANT J 2016,86(6):514-529中，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型水稻品种“垦粳8号(农丰13B229)”为粳型常规水稻，2018年黑龙江审定，审定编号为黑审稻2018007，具体信息记录于国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/variety/varis/617734.htm)，公众可从申请人(黑龙江八一农垦大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、冷胁迫下OsNPR3.1的表达模式分析
对三叶期水稻幼苗进行4℃冷处理，分别在处理0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h时取相同位置的叶片，采用Trizol法提取总RNA，采用反转录试剂盒HiScript III 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme，R312)反转录获得cDNA。将获得的cDNA稀释10倍，以稀释后的cDNA为模板，采用引物OsNPR3.1-qRT-F和OsNPR3.1-qRT-R进行荧光定量PCR。同时以水稻的延伸因子1-α基因(elongation factor 1-gene，osa-ELF1-α)为内参基因。检测所用引物序列如下：
OsNPR3.1-qRT-F：5’-TTGCTTGAAAGTGGCACAGC-3’；
OsNPR3.1-qRT-R：5’-TCCCTTTCTTGTTGCCAGGT-3’；
osa-ELF1-α-F：5’-GCACGCTCTTCTTGCTTTCAC-3’；
osa-ELF1-α-R：5’-TCTTGTCAGGGTTGTAGCCGAC-3’。
qRT-PCR检测结果如图1所示。结果显示：在4℃冷胁迫处理3h后，OsNPR3.1的表达量呈现上升趋势，并在24h时达到最高，说明OsNPR3.1的表达受冷胁迫诱导，可能参与水稻冷胁迫应答。
实施例2、OsNPR3.1基因启动子的克隆
1、引物的设计
通过phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Osativa_v7_0)数据库获取OsNPR3.1基因转录起始点上游1014bp的DNA序列作为启动子。应用PrimerPremier 5.0设计OsNPR3.1启动子克隆引物。引物序列如下：
OsNPR3.1-NP-F：5’-CGTTGGATGAACTACATTGCTGATATTGAT-3’；
OsNPR3.1-NP-R：5’-TCTTATCCGGAAATTTCGCGCGT-3’；
2、OsNPR3.1启动子的克隆
选取成熟的、饱满的野生型水稻(垦粳8号)种子，经过42℃下处理3-5天以打破休眠。使用10％ NaClO灭菌30分钟，无菌蒸馏水清洗5遍后置于黑暗条件下浸种1天，然后将萌动的水稻种子转移至30℃环境中黑暗催芽培养1天，再将萌发的水稻苗转移到Yoshida溶液中在28℃、14h光照，25℃、10h黑暗条件下培养至三叶期。取三叶期幼苗叶片，使用CTAB法提取水稻基因组DNA，采用引物OsNPR3.1-NP-F和OsNPR3.1-NP-R进行PCR扩增，将符合预期的PCR片段进行回收(图2)，连接pEASY-T载体，并对阳性克隆进行测序鉴定，测序结果表明：PCR扩增得到大小为1014bp的片段，其核苷酸序列如序列1所示，该片段包含OsNPR3.1的启动子序列(pOsNPR3.1)，并将测序正确的载体命名为T-pOsNPR3.1，用于后续研究。
实施例3、pOsNPR3:GUS转基因水稻的构建及pOsNPR3.1启动子活性分析
一、pOsNPR3:GUS表达载体的构建
构建了如图3A所示的植物表达载体进行后续的遗传转化。具体步骤如下：
1、以T-pOsNPR3.1质粒为模板采用引物pOsNPR3.1-XF和pOsNPR3.1-XR进行PCR扩增(图3B)，得到增添酶切位点(Xba1和Nco1)的启动子序列(pOsNPR3.1片段)。引物序列如下(下划线代表构建载体所需的重组序列)：
pOsNPR3.1-XF：5’-GGTACCCGGGGATCCTCTAGACGTTGGATGAACTACATTGCTGA-3’；
pOsNPR3.1-XR：5’-TTACCCTCAGATCTACCATGGTCTTATCCGGAAATTTCGCG-3’。
2、用限制性内切酶Xba1和Nco1对pCAMBIA3301载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、CE重组酶(Vazyme，C112)和步骤1获得的pOsNPR3.1片段在37℃下孵育30min，在重组酶的催化作用下，获得pCAMBIA3301-pOsNPR3.1:GUS，并进行大肠杆菌转化，对PCR扩增阳性的单克隆进行测序鉴定。测序结果表明：pCAMBIA3301-pOsNPR3.1:GUS为在pCAMBIA3301载体的两个酶切位点(Xba1和Nco1)间插入序列1所示的DNA分子，且保持pCAMBIA33001载体的其他序列不变后得到的载体。
二、pOsNPR3:GUS转基因水稻的获得及鉴定
1、采用冻融法将步骤一获得的pCAMBIA3301-pOsNPR3.1:GUS转化根癌农杆菌EHA105，得到重组菌pCAMBIA3301-pOsNPR3.1:GUS/EHA105。
2、采用农杆菌介导法将重组菌pCAMBIA3301-pOsNPR3.1:GUS/EHA105菌液侵染野生型水稻垦粳8号的胚性愈伤组织20min，然后将愈伤组织转接到共培养培养基(含20mg/L乙酰丁香酮的NB培养基，pH5.2)。
3、25℃黑暗培养2-4天后取愈伤组织，用含500mg/L头孢霉素的无菌水溶液清洗，然后接种至筛选培养基(含15mg/L固杀草和100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的NB培养基，pH5.8)。
4、32℃、24h光照条件下培养6周后取愈伤组织，接种至分化培养基(含30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白水解物、100mg/L阿莫西林克拉维酸钾、2mg/L KT和0.02mg/L NAA的MS培养基，pH5.8)，首先在25℃、黑暗的条件下培养5-7天，然后转移至26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至愈伤组织表面有绿点产生。
5、将有绿点的愈伤组织转移至新的分化培养基，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至幼苗再生芽长度约为2cm。
6、将幼苗转移至生根培养基(含100mg/L阿莫西林克拉维酸钾的MS培养基，pH5.8)，在26℃、16h光照/8h黑暗的条件下培养至株高为10-15cm且根系发达，得到再生植株(T0代)。
7、将再生植株(T0代)移栽到事先拌好的培养基质(培养基质的组成：1质量份草炭土+1质量份君子兰土+3质量份土壤)，浇水，先放置在暗光条件下培养3-5天，然后移至户外正常培养。
8、取再生植株的叶片，提取基因组DNA，采用引物GUS-CF和GUS-CR进行PCR鉴定，得到PCR鉴定阳性的再生植株(图4A)。引物序列如下：
GUS-CF：5’-TGCTGTGCCTGAACCGTTAT-3’；
GUS-CR：5’-GCTAACGTATCCACGCCGTA-3’。
9、分别取PCR鉴定阳性的再生植株的嫩叶，提取总RNA并反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用引物GUS-QF和GUS-QR进行荧光定量PCR，同时以水稻的延伸因子1-α基因(osa-ELF1-α)为内参基因。
GUS-QF：5’-TACCGACGAAAACGGCAAGA-3’；
GUS-QR：5’-CGGTGATATCGTCCACCCAG-3’。
荧光定量PCR鉴定结果如图4B所示。从图中可以看出：在正常条件下，6个pOsNPR3:GUS转基因株系中的GUS基因均可以正常表达，说明导入的OsNPR3启动子具有活性，可以驱动GUS基因表达。
10、将荧光定量PCR鉴定过量表达的再生植株自交，每个单株分别收获T1代种子，将阳性的T1代植株进行自交，每个单株分别收获T2代种子，按照步骤9的方法对T2代种子长成的植株进行荧光定量PCR鉴定；对于某一T1代植株来说，如果其自交得到的T2代植株均为PCR鉴定阳性，该T1代植株为一个纯合的转基因植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系，直至获得T3代pOsNPR3:GUS转基因水稻纯合体株系。随机选取3个T3代pOsNPR3:GUS转基因水稻纯合体株系pOsNPR3:GUS-4、pOsNPR3:GUS-5和pOsNPR3:GUS-7用于下述启动子活性分析。
三、pOsNPR3:GUS转基因水稻冷处理下GUS基因表达分析
选取饱满的T3代pOsNPR3:GUS转基因水稻纯合体株系pOsNPR3:GUS-4、pOsNPR3:GUS-5和pOsNPR3:GUS-7种子，蒸馏水清洗后30℃浸种、催芽3～5天至破胸露白。将发芽的种子播种于湿润的育秧土中，培养至三叶期后转移至4℃人工气候箱进行冷处理，分别在处理0h、0.5h、1h、3h、6h、9h、12h和24h时取相同位置的叶片，采用Trizol法提取总RNA，采用反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme，R312)反转录获得cDNA。将获得的cDNA稀释10倍，以稀释后的cDNA为模板，采用引物GUS-QF和GUS-QR进行荧光定量PCR。同时以水稻的延伸因子1-α基因(elongation factor 1-gene，osa-ELF1-α)为内参基因。
结果如图5所示，结果显示：冷处理后3个T3代pOsNPR3:GUS转基因水稻纯合体株系pNPR3:GUS-4、pNPR3:GUS-5和pNPR3:GUS-7中GUS的表达量均上升，在24h达到最高。GUS基因的表达模式与OsNPR3.1基因的表达模式一致。说明pOsNPR3启动子具有冷诱导特性。
综上所述，pOsNPR3:GUS转基因水稻在冷胁迫下GUS基因的表达得到增强，可以应用到水稻耐逆的遗传育种实践当中，对提高水稻的耐逆性具有重要意义。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种DNA分子，为如下A1)或A2)：
A1)序列1所示的DNA分子；
A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.与权利要求1所述DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有权利要求1所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.权利要求1所述DNA分子在作为启动子或冷诱导型启动子中的应用。
4.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的生物材料在启动目的基因表达中的应用。
5.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。
6.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的生物材料在植物育种中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为水稻。
10.一种目的基因的表达方法，为如下C1)-C4)中任一种：
C1)包括如下步骤：以权利要求1所述的DNA分子作为启动子来启动目的基因表达；
C2)包括如下步骤：将权利要求1所述的DNA分子插入到目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因表达；
C3)包括如下步骤：将目的基因插入权利要求2所述表达盒中的所述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因表达；
C4)包括如下步骤：将目的基因插入权利要求2所述重组载体中的所述DNA分子的下游，由所述DNA分子启动所述目的基因表达。
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