CN117363648B - 一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用 - Google Patents

一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用，属于基因工程应用技术领域，具体公开了狗尾草SvMOC1基因在调控狗尾草分蘖数中的应用。本发明首先构建SvMOC1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，然后将CRISPR/Cas9基因编辑载体导入狗尾草，分析SvMOC1基因在狗尾草中的功能。结果表明，狗尾草中SvMOC1基因失活后，由多分蘖表型变为单杆表型。本发明公开的SvMOC1基因在改良狗尾草分蘖数方面有着重要的应用价值，可以为其它近缘禾本科植物的分蘖调控机理研究提供理论依据。

Description

一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及植物转基因生物技术育种，尤其涉及一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用。
背景技术
狗尾草（Setaria viridis）属单子叶植物纲禾本科黍亚科狗尾草属，黍亚科植物常分布在热带和亚热带地区，高粱、甘蔗、玉米、谷子、薏苡、黄茅、白茅等都属于黍亚科，该科植物具有热带植物的典型特征。狗尾草是新型的转基因模式植物，与双子叶模式植物拟南芥相比具有生长周期短、植株矮小、易于种植、容易转化、基因组小、二倍体、能产生大量自交系种子等优点，是优良的单子叶模式植物。由于其起源于热带，具有C4光合作用系统，与谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草类亲缘关系接近，是重要的C4植物模型。狗尾草对非生物胁迫耐受能力强，抗性基因丰富，是研究耐旱、耐热、耐盐等胁迫反应的重要模式植物；狗尾草与重要的能源作物柳枝稷、芒草等黍亚科草类形态学上非常相似，也是研究这些能源草类的重要模式植物。
目前，狗尾草作为模式植物在国外的研究越来越热门，狗尾草ME34和A10的全基因组测序和重测序数据都已公布，国内越来越多研究单位开始关注它，特别是谷子（俗称小米）（Setaria italica）育种家们。谷子属于禾本科黍亚科狗尾草属的一年生植物，与狗尾草相比，谷子茎秆粗壮，分蘖少，狭长披针形叶片，具有细毛，穗状圆锥花序，每穗结实数百至上千粒。狗尾草和谷子的核型基本相同，带型相近，基因组大小都约为510Mb，因此，狗尾草是研究谷子基因的重要模型，也是研究人工选择对作物进化影响的模式植物。
狗尾草是谷子的野生祖先。普通狗尾草植株矮小，分蘖多，穗子小，生物产量低，易落粒，不能满足人们生产和生活的需要。但在很久之前，先民们发现了狗尾草的自然变异现象，于是从中选择植株高大、穗大、不落粒、分蘖少、香味多等高产、适于栽培的变异个体进行种植，经过数千年的栽培驯化和改良，一批高产优质、抗病抗倒伏的谷子新品种就这样诞生了，狗尾草就一步一步变成了现在生产中栽培的谷子品种。
分蘖是禾本科等植物在地面以下或接近地面处所发生的分枝，分蘖的形成过程分为分蘖芽的形成和分蘖芽的伸长，其过程受到遗传因素、环境条件以及植物激素的共同调控。狗尾草分蘖多，易倒伏，需经常修剪多余的分蘖。而“分蘖少”是狗尾草人工选育进化为谷子的一个重要成果，谷子分蘖少，抗倒伏，株型更利于栽培。目前水稻、高粱、小麦中都已经克隆出多个调控分蘖的基因，但狗尾草和谷子的分蘖基因的研究却很少，对其分蘖机制的研究更是缺乏报道。因此，研究狗尾草的分孽基因，可以改善狗尾草株型使其易于种植管理，还对改善谷子株型、提高谷子产量具有重要的理论和实践意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供是一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达框，所述基因表达框包括SvMOC1基因，基因号Sevir.4G229000，基因序列如SEQ ID NO：1所示，是一种Scarecrow-like protein 18蛋白，位于狗尾草4号染色体，与水稻的OsMOC1的氨基酸序列同源性为80%，与谷子的氨基酸序列同源性为100%。
一种SvMOC1基因编辑重组载体，利用CRISPR/Cas9技术构建的将权上述SvMOC1基因表达框失活的重组载体；
其中，SvMOC1基因中的两个基因编辑位点序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
一种包含上述SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株。
进一步的，所述重组菌株采用农杆菌，优选农杆菌AGL1。
一种SvMOC1基因在调控黍亚科植物分蘖数中的应用。
进一步的，利用包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株转化黍亚科植物，获得转化体。
进一步的，所述黍亚科植物为狗尾草。
进一步的，所述转化体是利用包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株转化狗尾草后获得的SvMOC1纯合突变的转基因狗尾草株系，其编辑位点的突变形式为：位点1处缺失112 bp，具体的为起始密码子ATG下游的46-157 bp缺失，位点2无突变；该突变导致从第16个氨基酸开始移码突变，并在第148个氨基酸后终止翻译；
所述转化体是突变黍亚科植物中的SvMOC1基因，使其失活或降低活性，以降低转化体的分蘖数。
进一步的，所述应用是以狗尾草的成熟种子作为外植体，经诱导愈伤后，所得狗尾草愈伤组织利用包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株转化，再通过再生狗尾草植株的分蘖表型来验证SvMOC1基因的功能。
进一步的，所述应用的具体过程包括以下步骤：
1）狗尾草愈伤的诱导
取狗尾草干燥成熟种子消毒，清洗，晾干后，种子芽点朝上接在狗尾草愈伤诱导培养基上，24℃暗培养30~40d，观察愈伤诱导情况，待种子诱导出胚性愈伤后，挑取胚性愈伤至新的狗尾草愈伤诱导培养基上，24℃预培养（暗培养）5~7d，得预培养的狗尾草愈伤组织；
其中，狗尾草愈伤诱导培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、kinetin 0.0005 g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L和植物凝胶4.0g/L，pH值为5.8；
2）农杆菌菌液的制备
取包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株，置于含羧苄青霉素和卡那霉素的LB平板上划板，28℃培养2~4d，分离出单菌落；
挑取3~5个单菌落，同时置于含50μg/mL的羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，28℃振荡培养至菌液OD600为0.5~1.0之间，所得菌液离心，倒去培养液，收集菌体，然后加入狗尾草侵染液，摇匀，调整OD600，得侵染液；
其中，LB培养基中含有蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L和NaCl 10.0g/L；
取LB培养基，每毫升加入50μg羧苄青霉素和50μg卡那霉素，得含羧苄青霉素和卡那霉素的LB平板；
狗尾草侵染液中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、乙酰丁香酮0.06 g/L和0.1wt%泊洛沙姆，pH值为5.2；
3）侵染和共培养
将侵染液活化培养，得活化好的菌液；
取预培养的狗尾草愈伤组织，使用活化好的菌液侵染，侵染完后，所得经侵染的狗尾草愈伤组织加至狗尾草共培养液中，暗培养，得共培养完成后的愈伤组织；
其中，狗尾草共培养液中含有MS干粉2.2 g/L、蔗糖30.0g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006 g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、kinetin 0.0005g/L和乙酰丁香酮0.06 g/L，pH值为5.2；
4）抑菌和筛选
将共培养完成后的愈伤组织置于狗尾草筛选培养基上，24℃暗培养2周，完成一次继代，转至24℃光照培养2周（14h/10h光/暗培养），整个筛选过程总用时4周，得抗性愈伤组织；
其中，狗尾草筛选培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006 g/L、kinetin 0.0005 g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、特美汀0.5g/L、潮霉素0.04 g/L和植物凝胶4.0 g/L，pH值为5.8；
5）分化和生根
取抗性愈伤组织转移至狗尾草分化培养基中，24℃光培养2~4周，得分化幼苗；
取分化幼苗接入狗尾草生根培养基中，24℃采用14h/10h光/暗培养方式进行生根培养1~2周，具体生根培养时间根据幼苗大小决定，待生根完成后，得到狗尾草再生植株；
其中，狗尾草分化培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30.0g/L、kinetin 0.002g/L、特美汀0.5g/L、潮霉素0.02g/L和植物凝胶4.0g/L，pH值为5.8；
狗尾草生根培养基中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖15.0g/L、特美汀0.5g/L、潮霉素0.02g/L和植物凝胶Gelzan 4.0g/L，pH值为5.8；
6）再生植株的PCR鉴定
将狗尾草再生植株，进行潮霉素抗性基因检测，得阳性转化苗；
7）阳性转化苗的编辑位点鉴定
对阳性转化苗的SvMOC1编辑位点进行PCR及测序鉴定，所得从编辑位点开始双峰的转基因植株的种子继续种植，PCR检测鉴定筛选出纯合突变的转基因株系，其编辑位点的突变形式为：位点1处缺失112 bp，具体的为起始密码子ATG下游的46-157 bp缺失，位点2无突变；该突变导致从第16个氨基酸开始移码突变，并在第148个氨基酸后终止翻译；
8）纯合突变转基因株系的分蘖表型鉴定
取纯合突变的转基因株系种植并收获种子，再次种植，所得植株无分蘖情况。
本发明的一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用的有益效果为：
本发明首先通过构建SvMOC1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体，然后将CRISPR/Cas9基因编辑载体导入狗尾草，分析SvMOC1基因在狗尾草中的功能；结果表明，狗尾草中SvMOC1基因失活后，由多分蘖表型变为单杆表型，获得了分蘖数减少的转基因狗尾草植株，对培育不同株型的狗尾草品系有实际的应用价值；
由于狗尾草是禾本科黍亚科的模式植物，谷子、糜子、高粱、甘蔗、玉米、薏苡、黄茅、白茅等都属于黍亚科，它们与狗尾草亲缘关系很近，基因利用的相似性很高；其中，狗尾草和谷子的MOC1基因的氨基酸序列更是完全一致，因此本发明公开的SvMOC1基因不仅在改良狗尾草分蘖数方面有着重要的应用价值，也可为其它近缘禾本科植物（如谷子及其它黍亚科植物）的分蘖调控机理研究提供理论依据和参考。
附图说明
图1是本发明实施例1中的植物表达载体pRLG103终载体结构图；
图2是本发明实施例2中的狗尾草再生植株的PCR鉴定图；泳道1-7为再生植株HPT基因的PCR扩增产物；M为DL2000Marker，单位为bp，从上往下分子量依次为2000、1000、750、500、250和100；K-为阴性对照，K+为阳性对照，K为水对照；
图3是本发明实施例2中的阳性转化苗的MOC1基因的PCR图；泳道1-7为阳性转化苗MOC1基因的PCR扩增产物；M为DL2000Marker，单位为bp，从上往下分子量依次为2000、1000、750、500、250和100；K+为阳性对照，K为水对照；
图4是本发明实施例2中的阳性转化苗的PCR测序峰图；
图5是本发明实施例2中的基因编辑SvMOC1的狗尾草纯合突变体的表型鉴定结果图；其中A图为植株分蘖表型图；B图为分蘖数统计分析图；ME34为野生型狗尾草，moc1-1、moc1-2和moc1-3分别为SvMOC1纯合突变体1-12的后代，白色三角表示分枝，bar=5cm。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其它不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
另，下面公开的具体实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为常规可购买产品。
实施例1 狗尾草SvMOC1基因编辑载体的构建
植物基因编辑载体系统采用从美国明尼苏达大学Voytas 实验室和中国农大陈其军教授实验室获得的专门用于植物基因编辑的sgRNA 单元和多元载体系统。本发明选择该系统的3个中间载体pJG310、pJG338和pJG471，以及一个骨架载体pRLG103（见图1），最终构建成为含有2个编辑位点的植物基因编辑载体。
载体的具体构建方法具体如下：
S1、选择狗尾草SvMOC1基因，基因号Sevir.4G229000，基因序列如SEQ ID NO：1所示，是一种Scarecrow-like protein 18蛋白，位于狗尾草4号染色体，与水稻的OsMOC1的氨基酸序列同源性为80%，与谷子的氨基酸序列同源性为100%。
S2、利用在线CRISPR靶点分析网站（http://crispor.tefor.net）分析狗尾草SvMOC1基因的外显子的靶点，根据靶点的特异性、编辑效率及脱靶率选择合适的靶点，在第一个外显子的前300bp各选择两个靶点（即两个基因编辑位点，序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示），然后根据两个靶点序列分别设计退火引物，具体表1。
表1 狗尾草SvMOC1基因编辑引物
备注：下划线的序列为编辑位点识别序列。
S3、分别将设计的退火引物双链化，然后将两个靶点的双链片段分别经内切酶BsmBI和内切酶BsaI酶切后，分别连入中间载体pJG310和pJG338，得连接产物；将连接产物转化到大肠杆菌DH5α内，挑选单克隆测序验证。最后将验证的连入了正确靶点序列的pJG310和pJG338载体的连接产物、含有cas9酶的pJG471载体进行AarI酶切，再一起连入骨架载体pRLG103中，所得连接产物转化到大肠杆菌DH5α内，挑选单克隆的菌液进行菌液PCR鉴定及序列测定，筛选阳性克隆。其中，菌液的PCR引物见表2，反应体系为：无菌水9.5 μL，引物（10 μM）各1 μL，Taq Mix 12.5 μL，菌液模板 1 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30 s，62℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环；最后72℃延伸7 min。
表2 基因编辑载体的菌液PCR鉴定引物
将菌液PCR的扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离检测。根据菌液PCR检测的结果，选择几个阳性克隆送测序公司进行序列测定，保存测序正确的阳性克隆，提取质粒，命名为103-SvMOC1，然后用液氮冻融法转化至农杆菌AGL1内，获得将含有103-SvMOC1质粒的AGL1菌，用甘油保存于-80℃备用。
实施例2 重组基因编辑载体转化狗尾草
以狗尾草ME34的成熟种子为外植体，诱导愈伤，进行重组基因编辑载体菌株转化，通过再生狗尾草植株的分蘖表型来验证SvMOC1基因的功能，具体包括以下步骤：
1）狗尾草愈伤的诱导
狗尾草愈伤诱导培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、kinetin 0.0005 g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L和植物凝胶4.0g/L，pH值为5.8。
选取经休眠处理的狗尾草ME34干燥成熟种子，去除种皮后，加入1wt%的次氯酸钠水溶液及1滴吐温20溶液，消毒约10min，期间手动摇晃。消毒完成后，用无菌水清洗5次，滤纸上晾干水分后，种子芽点朝上接在狗尾草愈伤诱导培养基上，24℃暗培养30~40d，观察愈伤诱导情况。待种子诱导出胚性愈伤后，挑取胚性愈伤至新的狗尾草愈伤诱导培养基上，24℃预培养5~7d（本实施例中预培养采用暗培养的方式，培养的时间为7d），得预培养的狗尾草愈伤组织。
2）农杆菌菌液的制备
LB培养基中含有蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L和NaCl 10.0g/L。
取LB培养基，每毫升加入50μg羧苄青霉素和50μg卡那霉素，得含羧苄青霉素和卡那霉素的LB平板。
狗尾草侵染液中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、乙酰丁香酮0.06 g/L和0.1wt%泊洛沙姆，pH值为5.2。
取出-80℃保存的含有103-SvMOC1质粒的AGL1菌的菌液，置于含羧苄青霉素和卡那霉素的LB平板上划板，28℃暗培养2~4d（本实施例中暗培养3d），分离出单菌落。挑取3~5个单菌落，同时置于含50μg/mL的羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，28℃振荡培养，至菌液OD600为0.5~1.0之间（本实施例中OD600为0.6），所得103-SvMOC1/AGL1菌液于5000rpm离心10min，倒去培养液，收集菌体，然后加入狗尾草侵染液，摇匀，调整OD600为0.6，得103-SvMOC1/AGL1菌侵染液。
3）侵染和共培养
狗尾草共培养液中含有MS干粉2.2 g/L、蔗糖30.0g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006 g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、kinetin 0.0005g/L和乙酰丁香酮0.06 g/L，pH值为5.2。
将以103-SvMOC1/AGL1菌侵染液于20℃、以100rpm活化培养2~3h，得活化好的菌液；
取预培养的狗尾草愈伤组织收集至50mL的无菌离心管中，将活化好的菌液倒入其中，于20℃、100rpm轻摇振荡侵染1h，侵染完后，倒掉菌液，所得经侵染的狗尾草愈伤组织倒在含有多层滤纸的无菌培养皿中，摊开晾干菌液。同时，在新的无菌培养皿中放置6层滤纸，加入5~6mL狗尾草共培养液，将晾干的经侵染的狗尾草愈伤组织转移至其中，平铺在滤纸上，用封口膜封口后，于20℃暗培养7d（本实施例中暗培养7d），得共培养完成后的愈伤组织。
4）抑菌和筛选
狗尾草筛选培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30g/L、ZnSO4･7H2O 0.035g/L、CuSO4･5H2O 0.0006 g/L、kinetin 0.0005 g/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.002g/L、特美汀0.5g/L、潮霉素0.04 g/L和植物凝胶4.0 g/L，pH值为5.8。
将共培养完成后的愈伤组织倒在含有2层滤纸的无菌培养皿中，摊开晾干。将晾干后的共培养完成后的愈伤组织置于狗尾草筛选培养基上，每皿约20~30粒，24℃暗培养2周，完成一次继代，转至24℃光照培养2周（本实施例中光照培养为14h/10h光/暗培养），整个筛选过程总用时4周，得抗性愈伤组织。
5）分化和生根
狗尾草分化培养基中含有MS干粉4.4g/L、蔗糖30.0g/L、kinetin 0.002g/L、特美汀0.5g/L、潮霉素0.02g/L和植物凝胶4.0g/L，pH值为5.8。
狗尾草生根培养基中含有MS干粉2.2g/L、蔗糖15.0g/L、特美汀0.5g/L、潮霉素0.02g/L和植物凝胶Gelzan 4.0g/L，pH值为5.8。
从狗尾草筛选培养基中将抗性愈伤组织转移至狗尾草分化培养基中，24℃光培养2~4周，得分化幼苗；
将分化幼苗接入狗尾草生根培养基中，24℃采用14h/10h光/暗培养方式进行生根培养1~2周，具体生根培养时间根据幼苗大小决定，待生根完成后，得到转入了103-SvMOC1的狗尾草再生植株，命名为ME34-103-SvMOC1。
6）再生植株的PCR鉴定
将ME34-103-SvMOC1狗尾草再生植株，用水洗掉培养基，移栽到温室内栽培，栽培过程中采集ME34-103-SvMOC1狗尾草再生植株的叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒（天根DP305）提取其基因组DNA，再以提取得到的DNA为模板，对ME34-103-SvMOC1狗尾草再生植株进行了潮霉素抗性基因（HPT）的PCR检测，以狗尾草ME34基因组DNA为阴性对照，无菌水为空白对照。检测引物见表3。PCR检测使用的酶为普通Taq Mix，反应体系为：无菌水9.5 μL、引物（10μM）各1 μL、Taq Mix 12.5 μL和DNA模板 1 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸7min。PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，部分再生植株的HPT 基因的PCR产物电泳图见图2。从图2可以看出样品1-7均能扩增出约500 bp的条带，与阳性对照一致，而阴性对照和水对照则无该条带，说明样品1-7均为阳性植株。根据HPT的PCR检测结果筛选出ME34-103-SvMOC1的阳性转化苗。
表3 HPT检测引物
7）阳性转化苗的编辑位点鉴定
以表4中的SvMOC1鉴定引物，对ME34-103-SvMOC1的阳性转化苗的SvMOC1编辑位点进行PCR及测序鉴定。PCR使用的酶为TaKaRa LA Taq ®with GC Buffer。PCR反应体系为：TaKaRa LA Taq（5U/μL）0.2μL、2×GC Buffer I 10.0μL、dNTP Mixture（2.5mM each）3.2μL、Template 2.0μL、SvMOC1鉴定引物各1.0μL、甘油0.4μL、DMSO 0.4μL和灭菌水1.8μL。PCR扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，进行40个循环；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，部分阳性转化苗的MOC1基因的PCR产物电泳图见图3。从图3可以看出样品1-7及野生型阳性对照均能扩增出约1000bp的条带，其中样品1和2的条带略小于阳性对照，说明其发生了片段缺失。将PCR产物送公司测序，根据测序峰图（图4）及序列来判断编辑效果，得出编辑位点的突变情况。
测序蜂图中如果有目标基因的一条或两条编辑染色体，从编辑位点附近的测序结果就会是双峰，但无法判断突变形式。只能通过继续种下一代分离到纯合突变植株，才能判断具体的突变形式。图4为样品1和2，其峰图从编辑位点上游开始出现双峰，且PCR产物条带小于目标条带，说明目的基因发生了突变，且为缺失突变。因此，将从编辑位点开始双峰的转基因植株的种子继续种植，PCR检测鉴定筛选出纯合突变的转基因株系1-12，其编辑位点的突变形式为：位点1处缺失112 bp，具体的为起始密码子ATG下游的46-157 bp缺失，位点2无突变。该突变导致从第16个氨基酸开始移码突变，并在第148个氨基酸后终止翻译。
表4 SvMOC1编辑位点的鉴定引物
8）纯合突变转基因株系的分蘖表型鉴定
为了验证纯合突变的转基因株系1-12的后代的分蘖表型的稳定性，取纯合突变的转基因株系1-12的种子3粒，在培养箱里种植并收获种子，命名为moc1-1、moc1-2和moc1-3。将种子moc1-1、moc1-2和moc1-3与野生型狗尾草种子ME34在同等条件下种植，观察统计它们的分蘖情况，分别统计数量为25株以上，实验重复3次。结果发现，对照狗尾草ME34有明显的分蘖情况，而moc1-1、moc1-2和moc1-3均无分蘖情况，（见图2）。这说明，狗尾草SvMOC1基因的突变能减少狗尾草的分蘖，具有重要的分蘖调节作用。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一种SvMOC1基因在调控黍亚科植物分蘖数中的应用，其特征在于，所述SvMOC1基因的基因号Sevir.4G229000，基因序列如SEQ ID NO：1所示；
所述黍亚科植物为狗尾草。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用过程中，获得一种SvMOC1基因编辑重组载体；
所述SvMOC1基因编辑重组载体是利用CRISPR/Cas9技术构建的SvMOC1基因表达框失活的重组载体；
其中，SvMOC1基因中的两个基因编辑位点序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用过程中，获得一种重组菌株；
所述重组菌株是包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组菌株采用农杆菌。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，利用包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株转化黍亚科植物，获得转化体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转化体是利用包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株转化狗尾草后获得的SvMOC1纯合突变的转基因狗尾草株系，其编辑位点的突变形式为：位点1处缺失112 bp，具体的为起始密码子ATG下游的46-157 bp缺失，位点2无突变；该突变导致从第16个氨基酸开始移码突变，并在第148个氨基酸后终止翻译；
其中，SvMOC1基因中的两个基因编辑位点序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是以狗尾草的成熟种子作为外植体，经诱导愈伤后，所得狗尾草愈伤组织利用包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株转化，再通过再生狗尾草植株的分蘖表型来验证SvMOC1基因的功能。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的具体过程包括以下步骤：
1）狗尾草愈伤的诱导
取狗尾草干燥成熟种子消毒，清洗，晾干后，种子芽点朝上接在狗尾草愈伤诱导培养基上暗培养，待种子诱导出胚性愈伤后，挑取胚性愈伤至新的狗尾草愈伤诱导培养基上预培养，得预培养的狗尾草愈伤组织；
2）农杆菌菌液的制备
取包含SvMOC1基因编辑重组载体的重组菌株，置于含羧苄青霉素和卡那霉素的LB平板上划板培养，分离出单菌落；
挑取单菌落，置于含羧苄青霉素和卡那霉素的LB培养液中，振荡培养，所得菌液离心，倒去培养液，收集菌体，然后加入狗尾草侵染液，摇匀，得侵染液；
3）侵染和共培养
将侵染液活化培养，得活化好的菌液；
取预培养的狗尾草愈伤组织，使用活化好的菌液侵染，侵染完后，所得经侵染的狗尾草愈伤组织加至狗尾草共培养液中，暗培养，得共培养完成后的愈伤组织；
4）抑菌和筛选
将共培养完成后的愈伤组织置于狗尾草筛选培养基上，暗培养2周，完成一次继代，转至光照培养2周，得抗性愈伤组织；
5）分化和生根
取抗性愈伤组织转移至狗尾草分化培养基中光培养，得分化幼苗；
取分化幼苗接入狗尾草生根培养基中进行生根培养，待生根完成后，得到狗尾草再生植株；
6）再生植株的PCR鉴定
将狗尾草再生植株，进行潮霉素抗性基因检测，得阳性转化苗；
7）阳性转化苗的编辑位点鉴定
对阳性转化苗的SvMOC1编辑位点进行PCR及测序鉴定，所得从编辑位点开始双峰的转基因植株的种子继续种植，PCR检测鉴定筛选出纯合突变的转基因株系，其编辑位点的突变形式为：位点1处缺失112 bp，具体的为起始密码子ATG下游的46-157 bp缺失，位点2无突变；该突变导致从第16个氨基酸开始移码突变，并在第148个氨基酸后终止翻译；
8）纯合突变转基因株系的分蘖表型鉴定
取纯合突变的转基因株系种植并收获种子，再次种植，所得植株无分蘖情况。
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WO2023193819A1 (zh) * 2022-04-03 2023-10-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过基因编辑培育早熟水稻品种的方法

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