CN113337520A - 陆地棉GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了棉花GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用，通过克隆陆地棉开花调控相关MADS‑box基因中GhA0749和GhD0744基因，构建过表达载体和VIGS沉默载体，进行拟南芥遗传转化和棉花VIGS沉默验证该基因功能。发现陆地棉GhA0749和GhD0744基因能够促进拟南芥早花3～5d，使得VIGS沉默陆地棉现蕾期推迟5～7d，开花期推迟3～5d。这将为挖掘调控开花时间相关的重要基因，解析棉花开花调控途径提供有效支撑，为利用这些基因改良优质中晚熟品种的早熟性，创制出早熟优质棉种质资源，实现早熟性和优良纤维品质的协同改良，进而培育出早熟性强的优质棉品种具有重要作用。

Description

陆地棉GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用
技术领域
本发明属于棉花种质资源培育和分子生物学领域，具体涉及：棉花GhA0749和GhD0744 转录因子及其调控开花方面的应用。
背景技术
食者粮也，衣者棉也，衣食住行“衣”为先。棉花不仅是我国重要的农业经济产品更是关系国计民生的战略物资。棉纤维、棉籽、棉花秆更是我国纺织业、国防工业、医药业和日常生活中的重要生产原料，由此可见棉花在我国国民经济和人民生活中的重要性。中国是最大的棉花生产国和消费国，在长期的实际生产中我们发现，由于我国各地区气候条件差异大，棉花熟性难以和各地气候高度适应，使得季节性干旱等气候因素导致棉花减产、影响棉花品质。另外，我国人均耕地面积少，粮棉争地严重。这些种植现状使得我国对于棉花熟性的要求越来越高，例如，西北内陆棉区通过选育早熟、熟性集中品种来应对无霜期短，有效积温低等不利条件；长江流域植棉区，通过选育早熟品种来提高复种指数；黄河流域利用早熟棉晚春播的特点来增加植棉面积，增加农民种植收益。但目前早熟育种遇到瓶颈，对棉花熟性的调控机理尚不明晰，因此，棉花熟性成为限制我国棉花高产优质育种的重要因素之一。研究发现棉花早熟性是由多个农艺性状(生育期、现蕾期、开花期、吐絮期、第一果节位、霜前花率等)综合的复杂性状，其中现蕾期，开花期又是决定棉花早熟性最重要的因素之一[1]。因此，挖掘调控开花时间相关的重要基因，解析棉花开花调控途径，有效拓宽棉花育种基因资源，补充熟性性状相关机理，结合分子育种手段，进一步利用这些基因改良优质中晚熟品种的早熟性，创制出早熟优质棉种质资源，实现早熟性和优良纤维品质的协同改良，进而培育出早熟性强的优质棉品种具有重要作用。
植物中，MADS-box是最重要的与开花调控相关的基因家族，其成员数量庞大，所编码的蛋白作为转录因子在开花调控的过程中具有不可替代的作用。目前在拟南芥等模式植物中研究较为清楚，例如，FLC基因是拟南芥春化的主要决定因素，AG基因影响胚珠发育和花形态建成，SEP3与生长素信号转导有关，SOC1和AP1基因发挥调控花时和花发育的作用，SHP基因与果荚炸裂有关，AGL8基因在花序顶端分生组织中起作用，影响开花[2-6]。在棉花中，对于MADS-box基因的研究不如拟南芥等模式植物丰富，但也有研究发现，GhSOC1可以促进拟南芥开花并改变棉花的花器官[7]。过表达和VIGS沉默GhAP1可分别导致拟南芥早花和棉花晚花，AP1基因还会参与决定花分生组织器官[8]。Anti-GhCAL转基因棉花植株花芽分化较晚，花期较长[9]。然而不同植物在自然界所处生境不同，他们各自演化历程及生长特性不同，在进化过程中的某些信号途径一些节点可能发生了分歧。棉花MADS-box基因的生物学功能是否与已报道拟南芥同源基因的功能相似，其他物种中的调控途径是否适用于棉花等均有待验证和探寻。
现有技术存在的问题：现有技术中未报道关于棉花同源基因GhA0749和GhD0744调控陆地棉开花方面的功能和应用。本发明以陆地棉同源基因GhA0749和GhD0744基因为切入点，克隆基因GhA0749(GH_A07G0749)和GhD0744(GH_D07G0744)。进一步通过载体构建、拟南芥转化和VIGS沉默等方法研究陆地棉GhA0749和GhD0744基因的功能，旨在为基因资源挖掘利用，探究棉花的开花调控通路，促进早熟棉的培育提供理论和技术依据。
发明内容
本发明要解决的关键技术问题在于提供棉花同源基因GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
1.陆地棉同源基因GhA0749(GH_A07G0749)和GhD0744(GH_D07G0744)基因序列，所述GhA0749基因CDS序列如序列表SEQ No.1所示；所述GhD0744基因CDS序列如序列表SEQNo.2所示。
2.陆地棉同源基因GhA0749和GhD0744基因克隆和载体构建方法，包括：
(1)植株材料和试剂选择；(2)RNA提取与反转录；(3)引物设计和基因克隆；(4) 构建过表达载体及VIGS沉默载体。
3.陆地棉同源基因GhA0749和GhD0744基因功能验证方法，包括：
(1)拟南芥遗传转化、VIGS沉默陆地棉及qPCR检测；(2)转基因拟南芥获得及表型分析；(3)陆地棉VIGS沉默植株获得及表型分析；(4)GhA0749和GhD0744基因与其他开花调控基因的互作关系。
4.陆地棉GhA0749基因的应用，所述基因的应用是促进陆地棉开花。
5.陆地棉GhD0744基因的应用，所述基因的应用是促进陆地棉开花。
6.陆地棉GhA0749基因的应用，所述基因通过正调控AP1基因，负调控FT基因促进陆地棉开花。
7.陆地棉GhD0744基因的应用，所述基因通过正调控AP1基因，负调控FT基因促进陆地棉开花。
有益效果：本发明利用基因克隆的方式，成功克隆GhA0749(GH_A07G0749)和GhD0744 (GH_D07G0744)基因。并构建过表达载体和VIGS沉默载体，在拟南芥中过表达基因GhA0749和GhD0744发现，转基因拟南芥比野生型拟南芥早花3～5d。在早熟品种中棉所 74中利用VIGS沉默GhA0749和基因，发现沉默植株比对照组植株迟现蕾5～7d，迟开花3～ 5d。说明，GhA0749和GhD0744基因能够促进开花。
进一步利用荧光定量发现，在转基因拟南芥中AP1基因，CAL基因表达量上升，FT基因表达量下降。VIGS沉默陆地棉中，AP1基因下降，CAL基因无明显变化，FT基因表达量上升。说明GhA0749和GhD0744基因在开花期之前能够正调控AP1基因，与FT基因存在负调控关系。因此推测在陆地棉中，当FT积累到一定程度后，激活GhA0749和GhD0744基因的表达，并且伴随FT基因表达量降低，GhA0749和GhD0744基因进一步激活AP1基因表达调节陆地棉开花。
过表达基因GhA0749和GhD0744能够促进拟南芥早花3～5d。VIGS沉默GhA0749和GhD0744能够使得陆地棉迟现蕾5～7d，晚花3～5d。说明基因GhA0749和GhD0744能够促进植株开花。此外，基因GhA0749和GhD0744正调控AP1基因，与FT基因存在负调控关系。
附图说明
图1为pCAMBIA2300载体结构图；其中，A：pCAMBIA2300载体图；B：多克隆位点序列。
图2为沉默载体TRV156结构图；其中，MCS为多克隆位点。
图3为图3RNA琼脂糖凝胶电泳图；其中，jin668四叶期RNA为提取RNA条带。
图4为PCR扩增目的基因、菌液PCR和单酶切检测阳性；其中，A：PCR扩增目的基因；B：菌液PCR检测克隆载体阳性；C：单酶切检测克隆载体阳性。
图5为菌液PCR、双酶切检测VIGS沉默载体和过表达载体阳性；其中，A：沉默载体菌液PCR检测阳性；B：沉默载体双酶切检测阳性；C：过表达载体菌液PCR检测阳性；D：过表达载体双酶切检测阳性。
图6为转基因拟南芥表型分析；其中，A：野生型及转基因拟南芥33d表型；B：野生型及转基因拟南芥40d表型；C-E:野生型及转基因拟南芥75d果荚；F：野生型及转基因拟南芥开花期统计；G：目的基因在野生型及转基因拟南芥中的相对表达量。
图7为VIGS陆地棉现蕾期表型分析；其中，A-D：VIGS沉默阳性对照、VIGS空载体对照以及VIGS沉默GhA0749和GhD0744阳性陆地棉现蕾期局部放大；E：VIGS沉默阳性对照、VIGS沉默空载体对照以及VIGS沉默GhA0749和GhD0744阳性陆地棉现蕾期整株； F：VIGS陆地棉中目的基因表达量。
图8为VIGS陆地棉开花期表型分析；其中，A-D：VIGS沉默阳性对照、VIGS空载体对照组陆地棉以及VIGS沉默GhA0749和GhD0744阳性陆地棉开花期局部放大；E：VIGS 沉默阳性对照、VIGS沉默空载体对照以及VIGS沉默GhA0749和GhD0744阳性陆地棉开花期整株；F：VIGS沉默陆地棉中目的基因表达量。
图9为转基因拟南芥及VIGS陆地棉中AP1、CAL、FT及SOC1基因表达量分析；其中，A-D：转基因拟南芥中AP1、CAL、FT及SOC1基因表达量分析；E-H：沉默陆地棉中AP1、 CAL、FT及SOC1基因表达量分析。
具体实施方法
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供陆地棉GhA0749(GH_A07G0749)和GhD0744(GH_D07G0744)基因序列，所述GhA0749基因CDS序列如序列表SEQ No.1所示；所述GhD0744基因CDS序列如序列表SEQNo.2所示。
实施例2
本实施例提供陆地棉GhA0749和GhD0744基因克隆和载体构建方法，包括：
1.植株材料和试剂选择
本发明所使用的陆地棉jin668，早熟棉品种中棉所74以及野生型拟南芥皆由本实验室保存，种植于实验室植物培养间和人工气候培养箱。本发明采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司。反转录试剂盒Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit和荧光定量试剂盒FastStart Essential DNA Green Master购买自罗氏公司。抗生素购自索莱宝公司。限制酶购自宝日医生物技术有限公司。Taq预混液购自艾科瑞公司。
pGM-T克隆试剂盒，TOP10感受态细胞购自天根生化科技有限公司，过表达载体pCAMBIA2300购自HonorGene公司(图1)，沉默载体TRV156(图2)由中国农学科学院棉花研究所转基因课题组馈赠。GV3101农杆菌感受态细胞购买自上海唯地生物技术有限公司。
2.RNA提取与反转录
于陆地棉jin668四叶期时采集叶片，使用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA 后，使用罗氏反转录试剂盒Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为 cDNA，步骤详见其说明书。
结果显示：提取jin668四叶期幼叶RNA，通过超微量紫外分光光度计检测显示，各RNA 260/280均在1.9～2.1之间，纯度较好。使用1.2％琼脂糖凝胶，150V电泳15min，检测结果同样显示RNA质量较好，可用于后续反转录和荧光定量实验(图3)。
3.引物设计和基因克隆
使用NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计克隆引物、过表达引物和VIGS沉默引物，结果见表1。
表1 GhA0749和GhD0744克隆引物、过表达引物(含酶切位点及保护碱基)和VIGS沉默引物(含酶切位点及保护碱基)
Figure BDA0003108484200000051
使用艾科瑞Taq预混液PCR扩增目的基因，利用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收目标片段，通过天根pGM-T克隆试剂盒连接目的基因片段与克隆载体，并转化TOP10大肠杆菌感受态进行蓝白斑筛选，最终使用天根快速质粒小提试剂盒提取阳性克隆质粒后送生工生物工程有限公司测序。具体步骤见各试剂盒说明书。
结果显示：以陆地棉jin668的cDNA为模板，使用克隆引物，通过PCR扩增目的基因，将扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶，100V电泳30min(图4A)。利用天根通用型琼脂糖凝胶回收试剂盒回收扩增产物后，16℃过夜连接回收的目的基因扩增产物和pGM-T载体。第二d 将过夜连接的产物转化TOP10大肠杆菌，12～16h后进行蓝白斑筛选，将白斑挑至5ml含有氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃，150rpm，12h后进行菌液PCR检测阳性(图 4B)。同时提取质粒，使用EcoR I限制酶单酶切检测阳性(图4C)。将阳性克隆载体送测序。
4.构建过表达载体及VIGS沉默载体
设计过表达引物与沉默引物，并在引物5’端加上保护碱基和酶切位点(表1)。以1.2.3 中的阳性质粒为模板，PCR扩增目的基因及沉默目标片段。按如下体系双酶切扩增产物、过表达载体pCAMBIA2300以及沉默载体TRV156：
Figure BDA0003108484200000061
Figure BDA0003108484200000062
使用根通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物，将目的基因与过表达载体pCAMBIA2300、沉默目标片段与沉默载体TRV156连接，并送测序。成功获得过表达载体与VIGS沉默载体后，进一步使用冻融法将过表达载体与VIGS沉默载体转化农杆菌GV3101。设计过表达引物，分别在正向引物和反向引物的5’端添加限制性酶切位点EcoR I(GAATTC)和Sal I(GTCGAC)并添加保护碱基(表1)。使用NCBI设计沉默引物，产物长度为150bp 左右，同时在正向引物和反向引物的5’端添加限制性酶切位点EcoR I(GAATTC)和Xho I(CTCGAG)以及保护碱基(表1)。
结果显示：以阳性克隆载体质粒为模板，使用过表达及沉默引物扩增目的基因及沉默目标片段，使用天根通用型DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收扩增产物。在37℃条件下双酶切目的基因、沉默目标片段、过表达载体和沉默载体。然后用T4 DNA连接酶16℃过夜连接目的基因和过表达载体，沉默目标片段和沉默载体。最后将连接产物转化农杆菌，待长出菌落，将单克隆菌落挑至含有其庆大霉素(Gen)、硫酸卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)的LB液体培养基中扩繁。利用菌液PCR以及双酶切检测获得阳性菌株和质粒，将阳性质粒送测序(图5)。
实施例3
本实施例提供陆地棉GhA0749和GhD0744基因在调节开花方面的应用，包括：
1.拟南芥遗传转化、VIGS沉默陆地棉及qPCR检测
于野生型拟南芥花序出现后，使用浸花法侵染拟南芥花序，收货T0代种子。使用含有卡那抗生素Kan(50μg/ml)的MS培养基筛选获得T1代阳性植株，并继续在含有Kan的MS 培养基中筛选获得T2代阳性植株。待陆地棉(中棉所74)双子叶展平时，通过注射法获得 VIGS陆地棉植株。使用荧光定量(qPCR)检测转基因拟南芥及VIGS陆地棉中目的基因表达量，同时利用qPCR检测GhA0749和GhD0744与其他开花调控基因间的关系。所使用引物见表2。
表2拟南芥及陆地棉中AP1、CAL、FT、SOC1、GhA0749和GhD0744基因荧光定量引物
Figure BDA0003108484200000071
2.转基因拟南芥获得及表型分析
将测序成功的阳性过表达载体转化农杆菌后保存于-80℃冰箱，通过浸花法转化野生型拟南芥(WT)，一周后重复浸染一次。待拟南芥成熟后，收集T0代种子。于含有Kan的MS培养基中筛选获得T1代阳性植株，15d后转移至小花盆。采集拟南芥叶片，利用荧光定量检测发现过表达株系中，目的基因GhA0749和GhD0744显著高于野生型(图6G)。通过对转基因植株以及野生型植株开花时间的统计分析，发现基因GhA0749和GhD0744分别能够促进拟南芥提前开花3～5d(图6A、B、F)。另外，转基因拟南芥果荚炸裂数量较野生型多 (图6C-E)。
3.陆地棉VIGS沉默植株获得及表型分析
通过注射法，沉默陆地棉中棉所74中的目的基因，使用荧光定量检测阳性沉默植株中目的基因的表达量发现，目的基因GhA0749和GhD0744的表达量均降低(图7F)。通过统计 VIGS沉默植株和对照植株的现蕾期及开花期，发现沉默陆地棉植株比对照组植株迟现蕾5～ 7d(图7B-E和图8F)，迟开花3～5d(图8B-F)。
4.GhA0749和GhD0744基因与其他开花调控基因的互作关系
为了进一步探究GhA0749和GhD0744基因与AP1、CAL、FT、SOC1基因间的调控关系，使用NCBI Primer-BLAST设计引物(表2)，利用荧光定量分析转基因拟南芥和VIGS陆地棉中各基因的表达情况。发现转基因拟南芥中AtAP1基因表达量明显高于野生型拟南芥，而沉默陆地棉中GhAP1降低(图9A、E)。FT基因表达量在过表达拟南芥中降低，在沉默陆地棉中升高(图9C、G)。CAL基因表达量仅在过表达拟南芥中升高，在沉默陆地棉中没有明显变化(图9B、F)。SOC1基因的表达水平在过表达拟南芥和沉默陆地棉中均没有明显变化(图9D、H)。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
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<110> 甘肃农业大学
<120> 陆地棉GhA0749和GhD0744转录因子及其调控开花方面的应用
<160> 2
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）
<400> 1
1 ATGGGGAGGG GTAGGGTTCA GTTGAAGAGA ATTGAAAACA AGATCAACAG GCAAGTCACT
61 TTCTCAAAGA GAAGGTCTGG CTTATTGAAG AAAGCCCATG AAATCTCTGT GCTTTGTGAT
121 GCTGAAGTTG CTTTGATTGT TTTCTCAACT AAAGGGAAGC TCTTTGAATA CTCATCAGAT
181 TCTTGCATGG AGAGGATCCT CGAACGGTAT GAAAGATATT CTTATTCAGA GAGGCAACTT
241 GCTGCAAATG AAAATGAACG AACTGGAAGT TGGACTTTGG AACATGCAAA ACTTAAAGCC
301 AGGATGGAGG TTTTACAAAG AAACCAAAGG CATTATATGG GAGAAGATCT TGAGAATTTG
361 AGTCTTAGAG AGCTTCAGAA CTTGGAGCAC CAACTTGATT CCGCCCTTAA ACACATACGT
421 TCAAGAAAGA ATCAGCTTAT GTTTGAATCC ATTTCCGAGC TTCAGAAAAA GGATAAAGCA
481 TTACAAGAGC AGAACAATGT CCTTGCAAAG AAGGTAAAGG AAAAGGAGAA GGAAATGGCC
541 CATCAGCCAC AACAAAACAA TTGCCAAGAT TCATCCTCAA TGCTTCCACA ACCACTGCAG
601 TCCTTGAACA CCAGTGACAC AAATGAAGCA AGGAGCAATG GAAGAGAAGA GGGTAATCCT
661 AGTCCAGCAC AACACCGCAA CTCCAATGTG CTATTGCCAC CGTGGATGAT TCCTCGTATT
721 GAGTAA
<210> 2
<211> 750
<212> DNA
<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）
<400> 2
1 ATGGGGAGGG GTAGGGTTCA GTTGAAGAGA ATTGAAAACA AGATCAACAG GCAAGTCACT
61 TTCTCAAAGA GAAGGTCTGG TTTATTGAAG AAAGCCCATG AAATCTCTGT GCTTTGTGAT
121 GCTGAAGTTG CTTTGATTGT TTTCTCAACT AAAGGGAAGC TCTTTGAATA CTCATCAGAT
181 TCTTGCATGG AGAGGATCCT CGAACGGTAT GAAAGATATT CTTATGCAGA GAGGCAACTT
241 GCTGCAAATG AAAATGAACG AACTGGTAGT TGGACTTTGG AACATGCAAA ACTTAAAGCC
301 AGGATGGAGG TGTTACAAAG AAACCAAAGG CATTATATGG GAGAAGATCT TGAGAATTTG
361 AGTCTTAGAG AGCTTCAGAA CTTGGAGCAC CAACTTGATT CTGCCCTTAA ACACATACGT
421 TCAAGAAAGA ATCAGCTCAT GTTTGAATCC ATTTCCGAGC TTCAGAAAAA GGATAAAGCA
481 TTACAAGAGC AGAACAATGT CCTTGCAAAG AAGGTAAAGG AAAAGGAGAA GGAGAAGGAA
541 AAGGAGAAGG AGAAGGAAAT GACCCATCAG CCACAACAAA ACAATTGCCA AGATTCATCC
601 TCAATGCTTC CACAACCACT GCAGTCCTTG AACATCAGTG ACACATATGA AGCAAGGAGC
661 AATGGAAGAG AAGAGGGTAA TCCTAGTGCA GCACAACATC GCAACTCCAA TGTGCTATTG
721 CCACCGTGGA TGATTCCTCG TATTGAGTAA

Claims (7)

1.陆地棉同源基因GhA0749和GhD0744基因序列，其特征在于所述GhA0749基因CDS序列如序列表SEQ No.1所示；所述GhD0744基因CDS序列如序列表SEQ No.2所示。
2.陆地棉GhA0749基因的应用，其特征在于所述GhA0749基因的应用是促进陆地棉开花。
3.根据权利要求2所述的陆地棉GhA0749基因的应用，其特征在于所述GhA0749基因通过正调控AP1基因，负调控FT基因促进陆地棉开花。
4.陆地棉GhD0744基因的应用，其特征在于所述GhD0744基因的应用是促进陆地棉开花。
5.根据权利要求4所述的陆地棉GhD0744基因的应用，其特征在于所述GhD0744基因通过正调控AP1基因，负调控FT基因促进陆地棉开花。
6.陆地棉同源基因GhA0749和GhD0744基因克隆和载体构建方法，包括：
(1)植株材料和试剂选择；(2)RNA提取与反转录；(3)引物设计和基因克隆；(4)构建过表达载体及VIGS沉默载体。
7.陆地棉同源基因GhA0749和GhD0744基因功能验证方法，包括：
(1)拟南芥遗传转化、VIGS沉默陆地棉及qPCR检测；(2)转基因拟南芥获得及表型分析；(3)陆地棉VIGS沉默植株获得及表型分析；(4)GhA0749和GhD0744基因与其他开花调控基因的互作关系。
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