CN114540372A - 陆地棉GhLTP17-A及其调控纤维发育方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花GhLTP17‑A基因，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。本发明属于植物基因功能技术领域，具体是提供了一种首次克隆获得棉花GhLTP17‑A基因，并进行表达特性分析，通过转基因技术，在植物(拟南芥和棉花)中验证了该基因的功能，对进一步了解脂质转移蛋白的功能，培育棉花新种质资源有着重要的实际意义。

Description

陆地棉GhLTP17-A及其调控纤维发育方面的应用

技术领域

本发明属于棉花种质资源培育和分子生物学技术领域，具体涉及一种棉花GhLTP17-A及其调控纤维发育方面的应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物，棉纤维是棉花的核心价值体现，棉纤维作为世界上最重要的天然纤维主要来源，是棉花的核心价值所在，在纺织工业的悠久历史中发挥着不可替代的作用。随着棉纺产业的快速发展和人们生活质量的日益提高，对棉纤维的品质也提出了更高的要求，近年来，转基因技术的应用为棉纤维品质的精准改良提供实践条件，而发掘调控棉纤维生长、发育的重要基因是高品质纤维棉花品种培育的重要基础。

而脂类作为一种重要的膜结构成分，也是一种重要的信号分子，研究发现，棉花纤维伸长发育过程中很多细胞活动需要脂质的参与，尤其是棉花伸长期的纤维细胞中脂类含量很高。脂质转移蛋白LTP(Lipid Transfer Proteins)能够在体外膜之间进行磷脂和脂肪酸的转运。在植物的生长发育过程中，LTP被认为能够参与植物生殖和营养生长发育过程的调控。

自从棉花LTP在几十年前从棉花纤维中被分离出来，LTP对纤维伸长的作用开始被相继报道。例如，韩超惠等人通过陆地棉中11种LTP组织表达模式分析显示，GhLTP3、GhLTP6、GhLTP7、GhLTP8和GhLTP11均在纤维细胞中特异表达，并且GhLTP3的表达在纤维伸长后期达到最大值，GhLTP6、GhLTP7、GhLTP8和GhLTP11在纤维起始阶段高度表达；邓等人在对雷蒙德氏棉LTP-GPI家族基因分析中发现了两类基因在纤维起始和伸长阶段特异表达，可能参与纤维发育调控；研究表明MYB基因能够对棉纤维的启动和伸长进行调节，Hsu等人发现棉花LTP3能够与一种MYB蛋白互作来调控纤维的起始；陆地棉中GhLTPG1被报道能够通过介导磷酸磷脂酰肌醇(PIP)的转运对棉花纤维的伸长起正向调控的作用；陆地棉中GhLTPXI17,GhLTPXI24,GhLTPXI27,GhLTPXI28被报道在拟南芥中过表达能够促进了表皮毛的伸长发育等。将海岛棉中的GbLTP1和GbLTP3基因导入新疆陆地棉中发现受体棉花的抗黄萎病能力及纤维品质都得到了明显的提高。

总的来说，虽然LTP的生物化学和生物学研究都取得了重大进展，但对LTP这一蛋白家族结构的认识和植物体内功能多样性的研究仍有很大的空间。因此研究LTP在棉花纤维发育中的功能，对探究棉花纤维发育机制有着重要的意义。因此，研究并利用脂质蛋白调控纤维伸长具有重要意义。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种首次克隆获得棉花GhLTP17-A基因，并进行表达特性分析，通过转基因技术，在植物(拟南芥和棉花)中验证了该基因的功能，对进一步了解脂质转移蛋白的功能，培育棉花新种质资源有着重要的实际意义的XX。

本发明采取的技术方案如下：本发明公开了一种陆地棉GhLTP17-A基因，所述GhLTP17-A基因CDS序列如序列表SEQ No:2所示；所述GhLTP17-A氨基酸序列如序列表SEQNo:1所示。

在本方案中，通过对陆地棉同源基因GhLTP17-A基因克隆和载体进行构建，包括以下步骤：

(1)植株材料和试剂选择；

(2)RNA提取与反转录；

(3)引物设计和基因克隆；

(4)构建过表达载体及VIGS沉默载体。

并对陆地棉同源基因GhLTP17-A基因功能进行验证，所述验证方法包括

(1)拟南芥遗传转化、VIGS沉默陆地棉及qPCR检测；

(2)转基因拟南芥获得及表型分析；

(3)陆地棉VIGS沉默植株获得及表型分析；

(4)GhLTP17-A基因与其他表皮毛调控基因的互作关系。

进一步地，得出陆地棉GhLTP17-A基因的应用，具有抑制陆地棉纤维发育的作用。

本方案一种陆地棉GhLTP17-A及其调控纤维发育方面的应用，采用上述方案本发明取得的有益效果如下：

1、现有技术中未报道关于陆地棉同源基因GhLTP17-A调控陆地棉纤维发育方面的功能和应用，本发明以陆地棉同源基因GhLTP17-A基因为切入点，克隆基因GhLTP17-A进一步通过载体构建、拟南芥转化和VIGS沉默等方法研究陆地棉GhLTP17-A基因的功能，旨在为基因资源挖掘利用，探究棉花的纤维发育调控通路，将为棉花纤维的分子改良提供理论基础。

2、通过使用过表达载体以及VIGS载体，在拟南芥中过表达基因GhLTP17-A发现，与对照野生型拟南芥比较，转基因拟南芥的表皮毛发育不良，进一步利用荧光定量发现，在转基因拟南芥中正向调控表皮毛的相关基因(GL2、TTG1)表达水平显著低于对照野生型拟南芥，负向调控表皮毛的相关基因(CPC)表达水平显著高于对照野生型拟南芥，而因此推测该基因能够通过调控表皮毛相关发育基因GL2、TTG1及CPC的表达从而调控拟南芥表皮毛发育。而表皮毛与纤维均为单细胞发育而来，其调控机制一致。在中棉所24中利用VIGS沉默GhLTP17-A基因，发现沉默植株18DPA的纤维明显长于对照组中棉所24，综上，证明GhLTP17-A在调控棉花纤维发育中的应用。首次克隆获得棉花GhLTP17-A基因，并进行表达特性分析，通过转基因技术，在植物(拟南芥和棉花)中验证了该基因的功能。对进一步了解脂质转移蛋白的功能，培育棉花新种质资源有着重要的实际意义。

附图说明

图1为本方案的GhLTP17-A氨基酸序列；

图2为本方案的GhLTP17-A核苷酸序列；

图3为本方案中GhLTP17-A基因克隆及其组织特异性分析图；

图4为本方案中GhLTP17-A调控表皮毛发育及其互作分析图；

图5为本方案中GhLTP17-A的VIGS载体构建及阳性对照的获得示意图；

图6为本方案中利用VIGS技术验证GhLTP17-A调控纤维发育。

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1-6所示，

实施例1：

本实施例提供陆地棉GhLTP17-A(Gh_A08G0129)和基因序列，所述GhLTP17-A基因CDS序列如序列表SEQ No:2所示；所述GhLTP17-A氨基酸序列如序列表SEQ No:1所示。

实施例2：

棉花总RNA的提取，cDNA合成，GhLTP17-A的CDS全长克隆及GhLTP17-A组织特异性表达分析：

用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取棉花各组织RNA、进一步进行反转录，反应体系与程序参照试剂盒说明书进行，高保真酶扩增基因片段，反应结束后，回收反应条带(图3a)，进行测序鉴定。后用酶切连接方式把GhLTP17-A构建到2300载体中，图3c为载体图的开放阅读框，所用酶切位点为PacI，KpnI。荧光定量分析GhLTP17-A在棉花中的组织特异性表达情况，结果说明GhLTP17-A在15和18天纤维中优势表达(图3b)。

引物列表1

实施例3：

GhLTP17-A转基因拟南芥表皮毛表型鉴定分析以及可能调控网络分析：

通过浸花法侵染盛花期的野生型拟南芥(Col-0)，成熟后收取到T0代种子将其种在含有卡那抗性的MS固体培养基进行阳性苗的筛选，通过连续的筛选培育，最终得到稳定的T5代转基因苗。

体视显微镜下对叶片表皮毛进行观察，发现与野生型相比GhLTP17-A的过表达株系L1、L2和L3中叶片的表皮毛表现出明显的发育不良，具体表现为大量表皮毛分支变细扭曲(图4b)。

通过在体视镜下对已长出9片真叶的整个植株进行观察并拍照，肉眼观察可发现转基因植株发育愈加成熟的叶片表皮毛，其发育不良的表皮毛数目占比越大(图4a)。接着，对GhLTP17-A过表达植株和野生型植株第7、8片真叶表皮毛数目及发育情况进行统计(图4c)，统计结果显示，同一时期的第7片真叶平均表皮毛数目为168±4.5根，其中发育不良的表皮毛约为152±6根，占比约90.5％左右，第8片真叶表皮毛数目为159±5根，其中发育不良的表皮毛为116±3.8根，占比约72.9％左右。野生型第7、8片真叶表皮毛平均数目为178±5.2根，表皮毛无发育不良现象。

对参与表皮毛发育调控的相关基因(GL2、TTG1、CPC)在转基因株系L1、L2、L3和野生型植株中的转录水平进行了测定，其中GL2和TTG1对表皮毛的发育有正向调控的作用，而CPC是一个负向调控的转录因子。

测定结果发现正向调控基因GL2和TTG1在GhLTP17-A过表达的植株中的表达与野生型相比显著下调，而参与负向调控的CPC的表达则有显著的上调(图4d)，表明GhLTP17-A能够抑制表皮毛的发育，并能够通过刺激其他表皮毛发育相关基因的表达来影响表皮毛的发育及表皮细胞的命运进程。

引物列表2

实施例4：

利用VIGS技术沉默棉花GhLTP17-A基因：

研究表明表皮毛和纤维都是单细胞发育而来的，所以研究者经常通过观察表皮毛从而研究基因在棉花中的作用。通过拟南芥实验结果初步说明GhLTP17-A抑制纤维发育。

为了进一步探究GhLTP17-A在调控棉花纤维发育中的功能，构建了GhLTP17-A的VIGS基因沉默载体。

利用pCLCrVA载体系统(图5a)，利用酶切位点SpeI，AscI将含GhLTP17-A目的基因片段的重组载体以及CLCrVA空载(阴性对照，简称VA)和SU(阳性对照)农杆菌菌液与VB菌液1:1混合注射到一周大的陆地棉子叶背面。几周后，能观察到阳性对照基因SU沉默的棉花叶片出现黄化(图5b)，说明被接种的植株体内受CLCrV病毒系统性侵染目的基因已经被沉默，同时表明注射的VIGS体系正常。

接种后的VIGS植株中随机选取三株，通过RT-PCR检测目标基因的沉默效率如图5c，这说明在转入了GhLTP17-A重组载体的VIGS植株中，GhLTP17-A基因已经被沉默。且沉默效率在50％以下，后将这些植株用于后续的观察纤维表型研究中。

实施例5：

棉花GhLTP17-A基因调控棉花纤维发育：

利用病毒诱导的基因沉默体系(VIGS)来验证GhLTP17-A基因沉默后的功能，通过对GhLTP17-A基因沉默的棉花植株的观察，发现与阴性对照VA相比，GhLTP17-A出现明显的纤维变长表型(图6a)。

对GhLTP17-A及对照VA植株18天的纤维长度进行统计(图6b)，GhLTP17-A纤维长度约为3.6厘米，对照VA约为3.1厘米。结果说明棉花GhLTP17-A基因调控棉花纤维发育。这与拟南芥结果一致。

需要说明的是，本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；

所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

拟南芥材料：种类为哥伦比亚野生型(Columbia，Col-0)，拟南芥植株于温度为22℃，16h光照，8h黑暗环境条件的温室中生长，以用于转基因拟南芥的获得。

棉花材料：种类为陆地棉(Gossypium hihirsutum)中棉所24(ZM24)，棉花植株在河南郑州(东经112°42'-114°13',北纬34°16'-34°58')的田间种植，分别采集棉花不同时间的纤维用于组织特异性分析，VIGS实验所用的棉花植株种植于海南试验地，在温度为22℃，16h光照，8h黑暗环境条件的温室中培养至6片真叶后移入大棚中继续生长，并进行后续的取材及性状观察。

试剂：大肠杆菌感受态：DH5α感受态(Takara)、Trans1-T1感受态(全式金)，农杆菌感受态：GV3101感受态(唯地生物)同源重组酶(pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit)、T4 DNA连接酶、荧光定量试剂盒(All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR)购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶均购于纽英伦NEB(New England Biolabs)生物技术公司。多糖多酚植物RNA提取试剂盒(RNAprepPure Plant kit)、胶回收试剂盒及植物DNA提取试剂盒购于北京天根生物公司。质粒提取试剂盒、基因扩增高保真酶(MonAmp^TM 2×MonHI-FI Mix)、琼脂糖购自莫纳生物科技公司。反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser)购于大连TaKaRa公司。核酸染液、菌液鉴定PCR Mix(2×Rapid Taq Master Mix)购于南京诺唯赞公司。卡那霉素、氨苄霉素、利福平抗生素、头孢霉素、甘油、MES、表面活性剂(silwet-77)、乙酰丁香酮(AS)、NaCl、MgCl2均购自北京索莱宝科技有限公司。胰蛋白胨、琼脂粉、酵母提取物、MS培养基等购自英国Oxoid公司。本试验所涉及到的引物均使用Primer Premier 5.0生物软件设计并由上海生工生物工程有限公司和上海尚亚生物技术有限公司合成及完成后期测序。

另外还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.陆地棉同源基因GhLTP17-A基因序列，其特征在于：所述GhLTP17-A基因CDS序列如序列表SEQ No:2所示。

2.根据权利要求1所述的一种陆地棉同源基因GhLTP17-A基因序列，其特征在于：所述氨基酸序列如SEQ NO:1所示。

3.一种根据权利要求2所述的一种陆地棉GhLTP17-A基因在调控纤维发育方面的应用，其特征在于：所述陆地棉GhLTP17-A基因的应用是抑制陆地棉纤维发育。

4.根据权利要求3所述的一种陆地棉GhLTP17-A基因在调控纤维发育方面的应用，其特征在于：所述陆地棉同源基因GhLTP17-A基因克隆和载体构建方法，包括：

(1)植株材料和试剂选择；

(2)RNA提取与反转录；

(3)引物设计和基因克隆；

(4)构建过表达载体及VIGS沉默载体。

5.根据权利要求3所述的一种陆地棉GhLTP17-A基因在调控纤维发育方面的应用，其特征在于：所述陆地棉同源基因GhLTP17-A基因功能验证方法，包括：

(1)拟南芥遗传转化、VIGS沉默陆地棉及qPCR检测；

(2)转基因拟南芥获得及表型分析；

(3)陆地棉VIGS沉默植株获得及表型分析；

(4)GhLTP17-A基因与其他表皮毛调控基因的互作关系。

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