CN111778258B

CN111778258B - Myb140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株

Info

Publication number: CN111778258B
Application number: CN202010056501.7A
Authority: CN
Inventors: 胡尚连; 罗学刚; 曹颖; 黄艳; 王博雅
Original assignee: Southwest University of Science and Technology
Current assignee: Southwest University of Science and Technology
Priority date: 2020-01-18
Filing date: 2020-01-18
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2040-01-18
Also published as: CN111778258A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种MYB140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株，MYB140基因的序列为SEQ ID NO：1。转基因烟草T1,T2,T4植株中木质素生物合成途径的关键酶基因，包括苯丙氨酸酶(PAL)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、肉桂酰‑CoA还原酶(CCR)、儿茶酚‑O‑甲基转移酶(COMT)基因的转录升高；其中CCR基因转录水平升高最多，其表达水平可达野生型植株的67.51倍。结果证明了毛竹MYB140基因对木质素生物合成起正调控作用，其过量表达能通过上调CCR、CAD、COMT、PAL等基因的表达水平，显著提高植物的木质素含量。

Description

MYB140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种MYB140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株。

背景技术

目前，最接近的现有技术：竹子为多年生禾本科(Gramimineae)竹亚科(Bambusoideae)植物，茎为木质，世界上竹类资源非常丰富，大约有1250种，有三月竹、慈竹、毛竹等。在我国，竹类资源十分丰富，共有40多属500多种，现有竹林面积为538.10万公顷。虽然种类很多，但最具代表性的竹材当属毛竹。毛竹是用途最为广泛的竹类植物，中国是毛竹的故乡，长江以南生长着世界上约85％的毛竹。在日常生活中，毛竹的用途十分普遍。例如，毛竹的纤维细而且不短，竹壁厚，长相对于宽来说尺寸大，纤维相互交错，是常见竹类植物中最良好的造纸原材料；毛竹还是可食用的绿色蔬菜；此外，毛竹还具有保护土壤、减少水土流失等主要的生态价值。

木质素是一类沉积于维管植物细胞壁中的由三种苯丙烷单元通过醚键和碳碳键相互连接形成的具有三维网状结构的苯丙烷类聚合物，在植物中的主要作用是硬化细胞壁使其能承拓整株植物的重量。在生产生活中，因为它的化学结构十分稳定，所以用途十分广泛：在农林业中，木质素可以作为肥料、农药缓释剂及饲料添加剂等；在轻工领域中，它可以作为表面活性剂、染料分散剂、活性炭和碳纤维等；此外，由木质素降解改性产生的香草醛是食用与日化香精、医药中间体并能作为用于多动症、眩晕等的抗癫痫药物。因此想要更好地利用对人类有益的植物，那么提高植物体内的木质素含量十分必要。

植物MYB转录因子是一类蛋白，可以和基因启动子的顺式作用元件发生特异性相互作用，并且对基因的起始转录进行调控，大部分含有4个功能结构域。根据DNA结合区的保守性，将转录因子分为bHLH(basichelix-loop-helix)、亮氨酸拉链(bZIP,the basicleueine zipper)、WRKY蛋白、MYB蛋白(v-myb avian myeloblastosis viral oncogenehomolog)等多个不同家族。在真核生物界中，MYB类转录因子普遍存在，它们的共同特征是N端含有特有的一段保守的DNA结合域：含有由51-52个氨基酸残基组成的保守结构域，呈螺旋－折叠－螺旋(HTH)结构。从玉米中分离出植物第一个MYB类转录因子基因C1，C1基因主要参与调控玉米花青素的合成。水稻基因组中据估计含有183个MYB家族成员。R3-MYB、R2R3-MYB和R1R2R3-MYB是MYB的三个亚家族，这是根据其在DNA结合结构域中高度保守的不完全重复序列(分别为1,2和3)的数量来划分的。大多数植物MYB蛋白质是R2R3类型例如:拟南芥中有126个R2R3成员，而水稻中至少125个。已有的研究表明，MYB转录因子对基因的调控主要是结合到基因启动子区域的顺式作用元件来实现其转录调控作用，例如：富含AC的元件AC-II(ACCAACC)和AC-III(ACCTAAC)等；7bp的SMRE(Secondary wall MYB-responsiveelement)元件ACC(A/T)A(A/C)(T/C)。

MYB转录因子对木质素生物合成的调控，次生壁合成过程MYB转录因子的作用是转录激活作用或转录抑制作用，二者相互结合完成对次生壁的调控。大多数MYB转录因子起到转录激活作用。研究发现，在杨树中PtrMYB021与AtMYB46同源，表明PtrMYB021在拟南芥中参与次生壁的形成过程。有些基因特异调控木质素合成，例如AtMYB63；有些基因即使是调控其他物质的生物合成，但也会或多或少的影响木质素的在植物体内的含量，如AtMYB75在调控花青素的合成的同时，也会参与木质素合成的调控。此外，还有一些MYB转录因子对次生壁的合成起到抑制作用。

MYB类转录因子可和苯丙烷途径基因启动子区的AC元件相结合，整个苯丙烷代谢的调控受到这种结合的影响。木质素生物合成的关键基因，如肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、肉桂醇脱氢酶(CAD)和儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)基因等基因的启动子区均含有一个或多个AC元件。R2R3型MYB转录因子和LIM通过与AC元件的结合对木质素生物合成途径进行调控。多个与木质素生物合成相关的MYB类转录因子可以在模式植物拟南芥中鉴定出，例如AtMYB46是SND1的直接靶蛋白，可直接对木质素途径进行调控；在次生壁沉积的纤维和维管细胞内AtMYB58和AtMYB63两个基因可以专一表达，且木质素生物合成途径基因的表达能通过这两个基因过量表达被激活，从而造成木质素的错位沉着；次生木质部的形成还受AtMYB77、At MYB73、At MYB44和AtMYB51这四种基因的影响。此外，在其他植物中木质素的生物合成由很多其它的MYB转录因子或正或负影响着，例如火炬松的PtMYB4，杨树(欧洲山杨和美洲山杨的杂交中)的PttMYB21a和桉树胶的EgMYB2。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有植物内的木质素含量低。

解决上述技术问题的难度：从木材、秸秆中提取木质素是获取木质素物质的主要途径之一。木材中木质素含量相对较高，如针叶木为26-30％，阔叶木为23-30％。但木材主要是浆用，制浆造纸工业每年要从植物中分离大约1.4亿吨纤维素，同时得到近亿吨左右的木质素副产物。但迄今为止，超过95％的木质素以“黑液”的形式直接排入江河或浓缩后烧掉，既污染环境，又浪费资源。因此在纤维素含量高而木质素含量低且容易去除是木本植物育种的标准。与木本植物相比，草本植物木质素平均含量约为16％，并且随着草本植物龄的增加，其含量也有所下降，如2年生草本植物木质素为14.5％，4年生12％。提高草本植物的由于木质素是植物的次生代谢产物，传统育种方法有极大的限制，很难定向控制；而基因工程方法通过调控木质素生物合成相关基因的表达，具有在分子水平上定向改良木质素的优势。本发明中通过在烟草中过量表达MYB140，木质素含量显著增加，与对照相比增加了6.58％～7.12％，为提高草本植物木质素含量提供一个有效的途径。

解决上述技术问题的意义：木质素聚合、胺化以及降解改性产生的化学物质在日常生活中的应用不可或缺。竹材里面含有较为丰富的纤维素与木质素，其中毛竹又具有较高的代表性。但目前为止，人们对竹子里的MYB家族转录因子的研究较少。为了提高植物体内木质素含量，更好地利用毛竹这种资源植物，将目光转向改变代谢途径中的代谢流，从源头上增加木质素的合成。故将与调控木质素生物合成相关的毛竹MYB140转录因子通过构建双元表达载体遗传转化烟草进行研究，揭示出MYB140基因的调控机理，为培育对人类有益的植物提供更多选择。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种MYB140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株。

本发明是这样实现的，一种MYB140基因，所述MYB140基因的序列为SEQ ID NO：1。

本发明的另一目的在于提供一种由所述MYB140基因构建的双元表达载体，MYB140基因插入pCAMBIA-1303N质粒中构建双元表达载体。

进一步，双酶切pMD19-T Vector重组质粒和pCAMBIA-1303N Vector质粒对含有MYB140基因的pMD19-T Vector重组质粒和pCAMBIA-1303N Vector分别进行的双酶切反应，得到目的基因序列和空的线性pCAMBIA-1303N载体。

进一步，目的基因和pCAMBIA-1303N载体酶切产物的回收，酶切产物的回收；目的基因和pCAMBIA-1303N载体酶切产物的连接反应，将回收的MYB140基因和相应的线性pCAMBIA-1303N载体进行连接。

本发明的另一目的在于提供一种由所述双元表达载体转化的烟草植株，通过叶盘法遗传转化烟草，筛选到MYB140基因过量表达的转基因T₂代烟草植株。

本发明的另一目的在于提供一种所述MYB140基因在植物转基因工程中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：MYB基因是常见的植物转录因子，可以参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节，与木质素合成相关。本发明克隆了一个编码241个氨基酸残基的毛竹MYB140基因。通过与拟南芥、玉米、水稻等植物中MYB基因的系统进化树分析，表明MYB140位于单子叶植物特异的亚簇中。将MYB140基因插入pCAMBIA-1303N质粒中构建双元表达载体，再通过叶盘法遗传转化烟草，筛选到MYB140基因过量表达的转基因T₂代烟草植株T1,T2,T4。与野生型植株相比，MYB140基因过量表达的显著增加了木质素含量，降低了纤维素含量。组织解剖学分析发现，转基因烟草植株的木质部宽度明显粗于野生型烟草的木质部。实时荧光定量PCR反应表明，与对照相比，转基因烟草T1,T2,T4植株中木质素生物合成途径的关键酶基因，包括苯丙氨酸酶(PAL)、肉桂醇脱氢酶(CAD)、肉桂酰-CoA还原酶(CCR)、儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)基因的转录升高；其中CCR基因转录水平升高最多，其表达水平可达野生型植株的67.51倍。结果证明了毛竹MYB140基因对木质素生物合成起正调控作用，其过量表达能通过上调CCR、CAD、COMT、PAL等基因的表达水平，显著提高植物的木质素含量。

本发明以毛竹为材料，克隆了MYB140基因，对其进行了聚类分析，同时构建了双元表达载体并进行了转化烟草研究。系统进化分析表明MYB140位于单子叶植物特异的亚簇中，与水稻OsMYB1亲缘关系最近。将MYB140基因构建双元表达载体并遗传转化烟草。对MYB140基因过量表达的转基因植株T1、T2、T4进行木质素和纤维素含量的测定。结果发现，MYB140基因过量表达显著增加了木质素含量，降低了纤维素含量。组织解剖学分析表明，转基因烟草3个株系的木质部宽度明显高于野生型植株，约为野生型植株木质部宽的2倍，且导管细胞更大。结果说明MYB140基因正向调控着木质素的生物合成。PAL、CCR、COMT、CAD基因是木质素生物合成途径的关键基因。实时荧光定量PCR分析表明，与野生型植株相比，转基因植株中与木质素生物合成相关的基因的表达量都在升高：CCR基因表达水平升高最高可达野生型植株的67.51倍；其次是PAL基因的表达水平，最高可达4倍；而COMT与CAD基因的转录本的丰度只是略微增高，最高表达量分别比野生型植株高1.78倍和1.55倍。NtCesA7是与烟草纤维素生物合成直接相关的基因。任取两个转基因株系T1、T2进行NtCesA7基因的qPCR分析，结果发现株系T1、T2与野生型相比，它们的NtCesA7基因表达量均显著降低。其中，T1株系里的NtCesA7基因表达水平几乎检测不到，T2株系里的NtCesA7基因表达水平降低了50％左右。结果说明在烟草植株中过表达毛竹MYB140基因，会上调CCR、CAD、COMT、PAL等基因的表达水平，降低NtCesA7基因的表达水平。

附图说明

图1是本发明实施例提供的MYB140基因构建双元表达载体的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的MYB140基因表达的转基因烟草植株的方法流程图。

图3是本发明实施例提供的pMD19-T载体图谱和多克隆位点示意图。

图4是本发明实施例提供的pCAMBIA-1303N载体图谱和多克隆位点示意图。

图5是本发明实施例提供的木质素标准曲线绘制示意图。

图6是本发明实施例提供的纤维素标准曲线绘制示意图。

图7是本发明实施例提供的毛竹叶总RNA电泳图。

图8是本发明实施例提供的毛竹MYB140基因全长扩增示意图；(M：DL2000DNAMaker)。

图9是本发明实施例提供的毛竹MYB140与其他植物物种MYB基因编码蛋白的聚类分析示意图。

图10是本发明实施例提供的菌液PCR验证示意图。

图11是本发明实施例提供的转基因植株的阳性验证示意图；M：DL 2000DNAMaker；1：阴性对照(ddH2O)；2：阳性对照(质粒PCR)；3-6：转基因烟草植株。

图12是本发明实施例提供的转基因烟草半定量示意图。

图13是本发明实施例提供的木质素含量测定示意图；(T检验，**p<0.01)。

图14是本发明实施例提供的纤维素含量测定示意图；(T检验，**p<0.01)。

图15是本发明实施例提供的烟草茎组织解剖学分析示意图。

图16是本发明实施例提供的木质素生物合成的代谢路径示意图。

图17是本发明实施例提供的木质素生物合成相关基因实时荧光定量PCR结果分析示意图；(T检验，*p<0.05)。

图18是本发明实施例提供的NtCesA7基因实时荧光定量PCR结果分析示意图；(T检验，*p<0.05)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种MYB140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的MYB140基因的序列为SEQ ID NO：1。

如图1所示，本发明实施例提供的MYB140基因构建双元表达载体的方法本以下步骤：

S101：双酶切pMD19-T Vector重组质粒和pCAMBIA-1303N Vector质粒对含有MYB140基因的pMD19-T Vector重组质粒和pCAMBIA-1303N Vector分别进行的双酶切反应，得到目的基因序列和空的线性pCAMBIA-1303N载体。重组质粒与pCAMBIA-1303N Vector均用KpnI和Hind III进行酶切；

S102：加好样后放入上海齐欣科DHP-9052电热恒温培养箱中，于37℃下酶切2h(约半小时进行混匀一次)。待反应完成后取出冷却，并于0.8％的琼脂糖凝胶中进行电泳(80V，30min)检验。

S103：目的基因和pCAMBIA-1303N载体酶切产物的回收，克隆毛竹MYB140基因中回收PCR产物进行回收。

S104：目的基因和pCAMBIA-1303N载体酶切产物的连接反应，将回收的MYB140基因和相应的线性pCAMBIA-1303N载体进行连接。

如图2所示，本发明实施例提供的MYB140基因表达的转基因烟草植株的方法包括以下步骤：

S201：碱抽提法提取烟草成熟叶DNA，严格按照碱抽提法(CTAB法)进行烟草叶DNA的提取；

S202：PCR体系进行阳性验证，然后进行电泳检测，观察目的基因条带是否正确；

S203：进行半定量PCR分析，验证MYB140基因在转入烟草基因组后是否在转录水平进行表达。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

1、材料和方法

1.1实验材料与主要仪器

1.1.1实验材料

由西南科技大学生命科学与工程学院资源圃(年平均气温17.2℃，年平均降雨量793.5mm)提供毛竹叶。将采取的毛竹叶切碎、均匀混合后，在研钵中用液氮迅速研磨，然后用Plant RNA Kit试剂盒提取总RNA，最后由北京百迈客公司进行高通量测序。剩余的RNA用

RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA，并于-20℃冰箱中保存。

1.1.2主要试剂和菌种

(1)T4-DNA连接酶、10×Loading buffer、DL 2000DNA Marker、DL5000 DNAMaker、pMD-19T vector、

RT reagent Kit反转录试剂盒、LA Taq DNA聚合酶反应试剂盒、rTaq DNA聚合酶反应试剂盒与E.coli DH 5α等由宝生物工程(大连)TaKaRa公司提供。

(2)质粒中量小提试剂盒、IPTG、X-Gal、琼脂糖凝胶回收试剂盒及Amp+等由北京天根生化科技有限公司提供。

(3)质粒回收试剂盒、PlantRNAKit试剂盒、DNA胶回收试剂盒等由Omega Bio-tec公司提供。

(4)酵母提取物、琼脂糖和胰蛋白胨由Gene公司提供。

(5)Green View染料由BioBRK公司提供。

(6)SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)由天根生化科技(北京)有限公司提供。

(7)Β-巯基乙醇、无水乙醇、硫酸、盐酸、丙酮、巯基乙酸及其他生化试剂和常规试剂均为超纯和分析纯。

1.1.3仪器设备

Eppendorf Research 2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL、5mL移液器。EppendorfMiniSpin plus离心机。Eppendorf Centrifuge 5810R离心机。上海齐欣科DHP-9052电热恒温培养箱。上海齐欣科DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱。FerroTec恒温金属浴。Bio-RadPTC-200PCR自动扩增仪。苏州安泰HS-840-U净化超净工作台。哈尔滨东联电子H2Q-F160振荡培养箱。SG超纯水器。美的电磁炉。国华企业SHA-C恒温振荡器。SANYO MLS-3780高压蒸汽灭菌器。Sartorius万分之一电子天平。常州智博瑞仪HH-1数显恒温水浴锅。WD-9403C紫外仪。Bio-Rad GelDoc凝胶成像系统。Bio-Rad Mini-Sub Cell GT电泳槽。Power-PAC3000电泳仪。Thermo forma超低温冰柜。JJW-2000VA精密净化交流稳压电源。CFX96tm Real-TimeSystem梯度实时定量基因分析仪。N35 Icematic制冰机。

1.1.4实验中其他主要试剂的配制

(1)CTAB分离缓冲液(200mL):1M Tris-HCl(pH8.0,100mmol/L)10mL,CTAB(十六烷基)2g,NaCl(1.4mol/L)8.18g，乙二铵四乙酸二钠0.74g,β-巯基乙醇(40mmol/L)0.2mL。

(2)氯仿混合液：氯仿：异戊醇＝24:1。

(3)Updegraff试剂：150mL 80％的乙酸中加入15mL硝酸。

(4)蒽酮溶液：将洗好后的棕色试剂瓶于烘箱中烘干后，称取0.2g蒽酮粉末状固体溶于100mL硫酸中，并在使用前于冰箱中放置2小时。

其余试剂如间苯三酚-乙醇溶液、LB液体培养基、LB固体培养基、50×Tris-乙酸(TAE)贮存液(1000mL)、IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)(200mg/mL)、氨苄青霉素(Amp+)(100mg/mL)等的配置严格按照实验操作步骤。

1.2试验方法

1.2.1毛竹总RNA的提取

严格按照Omega Bio-tec公司提供的Plant RNA Kit试剂盒所提供的操作方法提取毛竹叶TotalRNA。

注意：全部试验过程必须戴好口罩和手套，提取过程中最好全程将待提取物放置于冰上，少走动并尽量不说话，严格按照试剂盒中的方法操作。用DEPC水处理并高温灭菌的RNase-free一次性枪头和离心管。

1.2.2毛竹cDNA的合成

cDNA的合成使用

RT reagent Kit prefect real Time反转录试剂盒中的试剂，并按照说明书进行严格操作(操作时置于冰上)，操作步骤如下：

第一步，去基因组DNA的PCR反应的10μL加样体系如表1所示：

表1去基因组DNA加样体系

加样后混合均匀，于PTC-200PCR自动扩增仪上进行PCR反应，扩增程序如下：

①42℃ 2min；

②4℃ hold；

2、cDNA合成的PCR反应的20μL体系如表2所示：

表2 cDNA合成

加样后混合均匀，于PTC-200PCR自动扩增仪上进行PCR反应，反转录扩增程序如下：

①37℃ 15min；

②85℃ 5s；

③4℃ hold；

于-20℃保存反转得到的cDNA。

1.2.3克隆毛竹MYB140基因

(1)引物设计

根据毛竹MYB140基因序列利用Primer 5.0设计包含酶切位点的上下游引物MYB140-ltt-F和MYB140-ltt-R(表3)，分别带有BamH I和Spe I酶切位点。并将设计好的引物委托上海生工生物工程有限公司合成引物与DNA测序。

表3克隆MYB140基因全长的引物序列SEQ ID NO：2

(2)PCR反应扩增MYB140基因全长序列

以毛竹叶cDNA为模板扩增毛竹MYB140基因的全长序列。PCR反应在PCR自动扩增仪上进行。PCR反应的25μL反应体系和反应程序如表4和表5：

表4毛竹MYB140基因全长的PCR反应体系

表5毛竹MYB140基因全长的PCR反应程序

(3)回收PCR产物

将上一步的扩增产物全部进行琼脂糖凝胶电泳(80V,30min)，观察后，用手术刀小心在紫外照胶仪中切下目的片段(最好紧紧沿着条带切下)，然后用DNA片段胶回收试剂盒进行胶回收，回收后取2～5μL回收产物进行电泳，检查效果是否如愿。

(4)PCR回收产物和T载体连接

取上一步所得样品再次进行PCR扩增反应，使其在目的基因末端加上多聚polyA的尾巴，程序为：PCR仪中72℃反应30min，然后于4℃保存。所用体系(20μL)如表6所示：

表6PCR回收产物

将加尾后的PCR产物与pMD-19T vector(TaKaRa公司，如图3)载体进行连接，连接反应程序为：PCR仪中16℃连接16h，4℃保存2h。反应体系(20μL)如下表所示(T4 ligase最后加入)：

表7T载体连接的PCR反应体系

(5)大肠杆菌的转化，用CaCl₂法制备E.coli DH5α感受态细胞，并将连接产物转E.coli DH5α感受态细胞到中，步骤如下：

(1)在苏州安泰HS-840-U净化超净工作台内放置一把100μL的移液枪，开启紫外线灭菌30min后风吹10min左右。

(2将E.coli DH5α(约100μL)感受态细胞)从-80℃冰箱取出，然后迅速放于冰盒。

(3)当E.coli DH5α感受态细胞半融化状态时将约20μL连接产物全部加入，轻弹混匀，放置于冰盒中冰浴30min，同时开启水浴锅(提前准备)，将温度调至42℃。

(4)倒板：将50mL不含抗生素的LB固体培养基熬化，冷却至室温后依次加入12μLIPTG(浓度200mg/mL)、120μL X-gal(浓度为20mg/mL)和50μL氨苄青霉素(Amp+)(浓度为100μg/mL)，摇匀后倒4个平板。

(5)冰浴完成后，于42℃水浴锅中热激90s，随即插入冰中冷却10min(不晃动)(热激使大肠杆菌细胞膜通透性增大，利于外源DNA进入细胞)。

(6)时间到后，向1.5mLEP管中加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，此步骤在超净工作台内完成。然后置于37℃摇床上，150rpm振荡培养45min～1h。

(7)培养45min～1h后，于离心机中5000rpm离心1min，弃上清，留下少许上清使菌体重悬，再取适量重悬物均匀涂板，用封口膜封好培养皿边缘，于37℃倒置过夜培养至单菌落长出，进行蓝白斑筛选。

注意：所有操作均在无菌超净台中进行。

(6)单菌落蓝白斑挑选、摇菌，严格按照操作方法进行实验。

(7)提取质粒，准确按照质粒小提试剂盒(TIANprep Mini PlasmidKit)的操作步骤进行试验。

(8)测序及序列分析

将已经鉴定了的含有重组质粒的1mL菌液送往成都华大基因公司进行序列的测定。

(9)MYB140基因系统进化树的构建

从NCBI中下载氨基酸Fasta格式数据，处理后导入Mega6软件进行比对，构建毛竹MYB氨基酸序列进化树(Neighbor Joining法，Bootstrap参数为1000replicates)。构建进化树所用的MYB基因编码的蛋白如表8。

表8构建进化树所用的MYB基因编码的蛋白

续表8

1.2.4双元表达载体的构建

(1)双酶切pMD19-T Vector重组质粒和pCAMBIA-1303N Vector质粒对含有MYB140基因的pMD19-T Vector重组质粒和pCAMBIA-1303N Vector(图4)分别进行的双酶切反应，得到目的基因序列和空的线性pCAMBIA-1303N载体。重组质粒与pCAMBIA-1303N Vector均用KpnI和Hind III进行酶切。20μL酶切反应体系如下：

表9重组质粒与pCAMBIA-1303N载体酶切体系

加好样后放入上海齐欣科DHP-9052电热恒温培养箱中，于37℃下酶切2h(约半小时进行混匀一次)。待反应完成后取出冷却，并于0.8％的琼脂糖凝胶中进行电泳(80V，30min)检验。

(2)目的基因和pCAMBIA-1303N载体酶切产物的回收，酶切产物的回收步骤克隆毛竹MYB140基因中回收PCR产物进行回收。

(3)目的基因和pCAMBIA-1303N载体酶切产物的连接反应，将回收的MYB140基因和相应的线性pCAMBIA-1303N载体进行连接。加样体系(20μL)如下表所示：

表10目的基因和载体pCAMBIA-1303N酶切产物连接体系

反应程序为：PCR仪中16℃连接16h，4℃条件2-4h。

(4)连接产物的转化，将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5α。严格按照实验操作方法操作。

(5)质粒提取并验证

1)对构建的重组质粒进行PCR验证

分取上述步骤提取的质粒1μL加入到60μL TE溶液中，混匀，用于PCR验证模板。PCR反应所需的试剂由TaKaRa公司的Taq聚合酶反应试剂盒提供，扩增反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR自动扩增仪上面进行。

2)对构建的重组质粒进行酶切验证

对上一步所得的重组质粒按20μL酶切体系在上海齐欣科DHP-9052电热恒温培养箱中，于37℃条件下反应2h。用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。若出现的目的片段和空载体片段达到预期，就表明所构建的质粒是重组质粒。

1.2.5遗传转化烟草，准确按照叶盘法转化烟草的方法将MYB140基因遗传转化烟草。

1.2.6PCR体系进行阳性植株验证，从烟草的叶组织中分离出总DNA。为了验证MYB140基因已整合到基因组DNA中，提取总DNA后PCR扩增采用MYB140的特异性引物：5′-ATGGGGAGGTCGCCGTGCTG-3′(正向)和5′-TCATTTCATTTCAAGGCTTC-3′(反向)，SEQ ID NO：3。

(1)碱抽提法提取烟草成熟叶DNA，严格按照碱抽提法(CTAB法)进行烟草叶DNA的提取。

(2)PCR体系进行阳性验证，PCR反应的20μL加样体系及反应程序如下表所示：

表11 PCR体系阳性验证加样体系

表12 PCR体系阳性验证程序

然后进行电泳检测，观察目的基因条带是否正确。

(3)半定量PCR

进行半定量PCR分析，验证MYB140基因在转入烟草基因组后是否在转录水平进行表达。半定量PCR反应20μL体系及反应程序如下所示：

表13半定量PCR反应体系

表14半定量PCR反应程序

扩增后，在1％的琼脂糖凝胶中进行电压为80V电泳，电泳时间为30min左右。

1.2.7木质素含量的测定

(1)称取1g烟草成熟叶鲜样，在研钵中加入液氮研磨至细粉状，用5mL移液枪加入5mLpH为7.2的0.1M磷酸缓冲液于10mL试管中，在恒温水浴锅37℃条件下水浴30min，每隔15min取出摇匀一次，7800r/min离心15min。此步骤操作两次；

(2)加入5mL80％的乙醇在恒温水浴锅中于80℃条件下水浴1h(每20min摇匀一次)，7800r/min离心15min，弃上清液。此步骤操作三次；

(3)加入10mL丙酮抽提一次，7800r/min离心15min，在恒温烘箱中于60℃条件下烘干(一天一夜即可)；

(4)向烘干的细胞壁残渣中加入750μLH₂O，250μLHCl，100μL巯基乙酸，在恒温水浴锅中于80℃下孵育3h(每半个小时摇匀一次)，7800r/min离心15min，加入1mLH₂O漂洗，7800r/min离心15min。此步骤操作两次；

(5)加入1mL1MNaOH，重悬沉淀于28℃180r/min的恒温摇床中过夜。7800r/min离心15min，收集上清液；

(6)往上清液中加入200μLHCl，完全均匀混合后在冰箱中于4℃条件下孵育4h(每半小时摇匀一次)，7800r/min离心15min，弃上清液；

(7)加入1mL 1MNaOH溶解沉淀；

(8)将母液用1MNaOH稀释50倍后，用分光光度计测量其在280nm下的吸光度值。

(9)使用碱性木质素进行标准曲线绘制如图5所示。

1.2.8纤维素含量的测定

(1)对烟草成熟叶鲜样的预处理如木质素含量测定的步骤(1)、(2)、(3)。将所得的干样进行称重，定量进行下列实验(此处选择称取10mg来进行以下实验)；

(2)在放入10mg干样的试管中加入3mLupdegraffer试剂，将其置于恒温水浴锅里孵育30min(每隔15min取出摇匀一次)，水浴锅温度为100℃，然后在转速为7800r/min的离心机中进行15min的离心。倒掉上清液，然后加入10mL蒸馏水进行洗涤，在转速为7800r/min的离心机中进行15min的离心，倒掉上清液。此步骤操作两次。最终在60℃的恒温烘箱中干燥；

(3)在烘干的样品中加入2mL体积比为67％H₂SO₄，充分混匀后，于50℃的恒温烘箱中放置1h(每20min摇匀一次)；

(5)取1mL反应液于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至10mL；

(6)从10mL稀释液中吸取1mL放入新玻璃试管中，加入4mL蒸馏水稀释后，置于冰上冷却；

(7)加入10mL预冷的蒽酮试剂，充分混匀后，置于冰上直至所有的样品都混匀后，置于100℃的恒温水浴锅中孵育16min，取出后冰浴2～3min，再室温放置5～10min；

(8)取约3.5mL样品在625nm处使用分光光度计测量其吸光度值。

(9)使用纤维素标样进行标准曲线的绘制如图6所示。

1.2.9烟草茎组织解剖学观察

取烟草植株距离根约5cm处的茎进行徒手切片观察。用刀片将茎切成薄片，用镊子小心将其放置于载玻片中，在薄片正中央滴一滴间苯三酚-乙醇溶液，室温放置2min左右，然后再滴加一滴50％的盐酸溶液，等待片刻，显色后于显微镜下进行观察。

1.2.10实时荧光定量分析

(1)引物设计

用Plant RNA Kit试剂盒从烟草成熟叶组织中分离出总RNA。MYB140基因的表达用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)进行检测，野生型植株当做对照。用于扩增其他木质素和纤维素生物合成基因的基因特异性引物如表15所示。肌动蛋白基因(其核苷酸序列GenBank登录号为XM_016618658.1)用作参考，其PCR扩增是所用引物SEQ IDNO：4为：5′-ATCCTCGCATCCCTTAGCACAT-3′(正向)和5′-CTTATCGCCCTTCTTTCACAGC-3′(反向)，该引物对将从cDNA模板产生一条长231bp的片段。

表15用于qPCR分析的引物序列

(2)qPCR反应

进行qPCR反应的20μL加样体系表16所示：

表16 qPCR加样体系

程序如表格17所示：

表17 qPCR反应程序

2结果分析

2.1毛竹MYB140基因的全长克隆

2.1.1毛竹叶总RNA的提取

本发明中使用由OMEGA BIO-TEK公司提供的Plant RNA Kit试剂盒，用其提取毛竹叶Total RNA，并进行了电泳检测，结果如图7所示。电泳结果有三条带，分别代表28S RNA、18S RNA和5S RNA，其中28S RNA的亮度是18S RNA的两倍，并且无弥散片状，这表明所提取的RNA无降解，完整性较好。

2.1.2 MYB140基因PCR扩增

以毛竹基因组数据库为参考，使用Primer5.0设计基因特异性引物。以毛竹叶cDNA为模板进行PCR反应扩增，扩增得到了约700bp左右的条带(如图8)。测序结果表明，这个基因编码241个氨基酸残基，本实验将其命名为MYB140。

2.1.3 MYB140基因的聚类关系

为了对MYB140基因功能进行预测，将克隆得到的毛竹MYB140基因，与金鱼草、拟南芥、棉花、桉树、草莓、杨树、葡萄、针叶树、大麦、高粱、玉米和水稻等其他物种中的40条R2R3-MYB基因序列进行了系统进化树分析(图9)。

从图9可以看出，毛竹MYB140基因与水稻的OsMYB1基因聚在同一分枝上。OsMYB1基因是单子叶植物中的R2R3-MYB基因序列的亚组4成员，从而说明了毛竹MYB140基因属于单子叶特异的R2R3-MYB基因序列的亚组4成员。

2.2双元表达载体的构建与鉴定

2.2.1双元表达载体的构建

对酶切后的MYB140基因片段和pCAMBIA-1303N载体进行回收，用T4连接酶将MYB140基因片段和pCAMBIA-1303N载体在PCR仪中进行过夜连接，用Ecoli.DH5α的感受态细胞转化连接产物。

2.2.2菌落PCR验证

含pCAMBIA1303N-MYB140重组质粒的菌落PCR反应15μL体系和PCR反应程序如表18所示：

表18菌落PCR反应体系

表19菌落PCR反应程序

将扩增产物进行电泳(80V,30min)，结果如图10所示：

通过凝胶成像系统成像观察发现了预期的长约700bp的条带，十分明亮、特异性很高。

2.3转基因植株的验证

将过量表达载体遗传转化烟草，获得了15株抗性植株。提取其叶片的总DNA后进行PCR扩增，所采用MYB140的引物SEQ ID NO：5为：5′-ATGGGGAGGTCGCCGTGCTG-3′(正向)和5′-TCATTTCATTTCAAGGCTTC-3′(反向)，从而验证MYB140基因是否已成功整合到烟草基因组中(图11)。

在提取DNA进行初步阳性验证后，进行半定量PCR分析，从RNA水平进一步确定MYB140基因已转入烟草基因组中并能进行表达。电泳结果如图12所示：

由转基因烟草(pCAMBIA-1303N-MYB140)半定量PCR分析表明，WT没有目的条带，转基因烟草1、2、4植株表达量均较高，这说明了1、2、4号植株中MYB140基因过量表达。

收集MYB140基因过量表达的转基因烟草1、2、4植株种子，进行T₁代验证培养。在T₁代阳性验证中，转基因阳性率高达80％。

2.4木质素含量分析

2.4.1木质素含量的测定

为探究过表达MYB140基因对植株中木质素含量的影响，参照LiYi等人的方法测定细胞壁物质中木质素含量。

结果如图13所示，株系T2、T4与野生型植株相比，木质素含量显著增加，分别增加了6.58％和7.12％；而株系T1木质素含量与对照相比没有明显差异。

2.4.2纤维素含量分析

纤维素和木质素是植物次生壁的主要成分。通过蒽酮法测量细胞壁物质中纤维素的含量，探究MYB140基因在正向调控木质素生物合成的同时是否对纤维素含量产生影响。

结果如图14所示，与野生型植株相比，株系T1、T4的纤维素含量明显减少了6.67％和7.4％，而株系T2纤维素含量与对照相比差异不显著。

2.4.3组织解剖学观察

对转基因烟草茎部进行了间苯三酚染色。徒手切片发现转基因植株中木质素红色的部分明显宽于野生型植株(图15)。组织解剖学分析表明，转基因烟草3个株系的木质部宽度明显高于野生型植株，约为野生型植株木质部宽的2倍，且导管细胞更大(图15)。这些结果说明了MYB140基因正向调控着木质素的生物合成。

2.4.4实时荧光定量PCR分析

(1)木质素合成相关基因的qPCR分析

MYB140是上游转录因子，会对下游基因产生影响。PAL基因是控制木质素生物合成代谢流的总开关，CCR、CAD、COMT基因是木质素生物合成路径的关键基因(如图16)。为了进一步探究MYB140转录因子对木质素生物合成路径基因产生的影响，分别对PAL、CCR、CAD、COMT基因进行了实时荧光定量PCR分析。

如图17所示，通过对qPCR结果进行分析，发现与野生型植株相比，转基因烟草植株中PAL、CCR转录本的丰度显著增高，其中PAL转录本是野生型植株的1.33～4倍，CCR转录本是野生型植株的7.64～67.51倍。而CAD与COMT基因的表达水平只是有略微的上升，转基因植株的CAD基因表达水平至多比野生型植株的高1.55倍，COMT表达水平至多比野生型植株高1.78倍。

(2)烟草NtCesA7基因的qPCR分析

NtCesA7基因是与植物次生壁中纤维素合成直接相关的基因。为探究转基因植株在纤维素含量降低的情况下于其合成直接相关的基因的变化，任意选取了两个转基因株系T1与T2进行了NtCesA7基因的qPCR分析。

结果如图18所示，与野生型植株相比，转基因株系T1、T2的NtCesA7基因表达水平显著降低。其中，T1株系里的NtCesA7基因表达水平几乎检测不到，T2株系里的NtCesA7基因表达水平降低了50％左右。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>西南科技大学

<120>MYB140基因、构建的载体、表达的转基因烟草植株

<160>5

<210> 1

<211> 723

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggggaggtcgccgtgctgcgagaaggcgcacaccaacaagggtgcatggacaaaggaggaggacgaccggctcattgcccacatcaaggcgcacggtgaggggtgctggcgctcacttcccaaggccgcaggtctcctccgttgcggcaagagctgccgccttcggtggatcaactacctccggcccgacctcaagcgcggcaacttcactgaggaggaggacgagctgatcatcaagctccacagcctcttaggcaacaaatggtccctgatagctgggaggttaccggggaggacagacaacgagatcaagaactactggaacacgcacatcagaaggaagctgctgagccgggggatcgacccggtgacccaccggccgatcaacgagcacgcgtccagcataaccatatcgttcgagacggcgcgggaggagaagggcgccgtgttccggcgagaggagcccaaggtggcgatcaaccacgaccaggacccggttgattgggaccagggcaaaccgctcaagtgcccagacctcaacctcgacctctgcatcagtcccccgttccaagaggccgaacccatgaagcctgtgaagagggaggccggcgtctgcttcagctgcagcctggggctccccaagagcacagagtgcaagtgcagcaacttcctggggctcaggaccgccatgctcgacttcagaagccttgaaatgaaatga

<210>2

<211> 60

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

cgggatcccgatggggaggtcgccgtgctgggactagtcctcatttcatttcaaggcttc

<210>3

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atggggaggtcgccgtgctgtcatttcatttcaaggcttc

<210>4

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

atcctcgcatcccttagcacatcttatcgcccttctttcacagc

<210>5

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

atggggaggtcgccgtgctgtcatttcatttcaaggcttc

Claims

1.一种MYB140基因在提高植物木质素含量中的应用，其特征在于，所述MYB140基因的序列为SEQ ID NO：1。