CN117143905A - 梨转录因子PbrbZIP15与PbrXylA1基因启动子互作在调控果实可溶性糖积累中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了梨转录因子PbrbZIP15与PbrXylA1基因启动子互作在调控果实可溶性糖积累中的应用。本发明首次揭示了梨转录因子PbrbZIP15调控PbrXylA1基因表达。本发明阐明了梨PbrbZIP15与PbrXylA1基因启动子中的G‑box元件(转录起始位点ATG上游‑858到‑853)互作在调控果实可溶性糖(果糖、蔗糖、总糖)积累的分子机制，为实现梨糖代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。挖掘出调控梨果实糖代谢的bZIPs基因家族成员及编码木糖异构酶(XylA)的下游靶基因PbrXylA1。

Description

梨转录因子PbrbZIP15与PbrXylA1基因启动子互作在调控果 实可溶性糖积累中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种梨转录因子PbrbZIP15通过调控可溶性糖代谢关键基因PbrXylA1的表达进而促进果实中可溶性糖(果糖、蔗糖、总糖)的积累。
背景技术
成熟梨(Pyrus)果实中的可溶性糖的组成和丰度对其是否被消费者接受至关重要。其中果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇是梨果实中主要可溶性糖。虽然测序技术的发展为鉴定梨性状形成相关基因提供了大量信息，但是对于参与梨果实发育过程中糖积累的基因及分子调控机制的了解仍然有限。
在植物中，特定的转录因子(Transcription factor，TFs)通过与启动子中相应的顺式作用元件结合，操纵结构基因转录激活，从而影响植物的生长发育和抗逆耐受，因此可通过操纵一些转录因子的表达水平来有意地改变水果性状，达到育种的目的。然而，迄今为止仅从梨基因组中鉴定出极少数参与可溶性糖代谢的转录因子。碱性亮氨酸拉链(Basicleucine zipper,bZIP)是植物中广泛分布且进化保守的一类TFs，研究发现该家族的S亚家族成员多具有进化保守的上游开放阅读框，其可介导蔗糖诱导的翻译抑制，bZIP家族的拟南芥AtbZIP11、烟草tbz17和番茄SlbZIP1/2均属于该亚家族成员且参与糖代谢过程。
bZIP成员在果实糖分积累过程中调控机制的研究尚处于起步阶段。苹果中MdbZIP23/46可与MdWRKY9互作，提升MdWRKY9对MdSWEET9b的激活作用，从而促进蔗糖与总糖的积累。转录因子PpybZIP43可与PpySPS3基因启动子中的G-box元件特异性结合来调控其表达，促进‘丰水’梨果实中蔗糖的合成。然而是否还存在其他bZIP成员及其下游靶基因参与梨果实糖代谢的调控，调控的分子机制如何，这些问题仍需进一步的探索。
发明内容
本发明的目的在于提供PbrXylA1基因或与PbrXylA1基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树果实中可溶性糖积累中的应用。
本发明的另一目的在于提供bZIP家族转录因子PbrbZIP15或与转录因子PbrbZIP15相关的生物材料在调控蔷薇科果树果实中可溶性糖积累中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种提高蔷薇科果树果实中可溶性糖积累的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供PbrXylA1基因或与PbrXylA1基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树果实中可溶性糖积累中的应用，所述PbrXylA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，与PbrXylA1基因相关的生物材料为(1)～(8)中的至少一种：
(1)所述PbrXylA1基因编码的蛋白；
(2)含有所述PbrXylA1基因的表达盒；
(3)含有所述PbrXylA1基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有所述PbrXylA1基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
更进一步优选的，与PbrXylA1基因相关的生物材料优选为所述PbrXylA1基因编码的蛋白，或包含所述PbrXylA1基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
更进一步优选的，所述PbrXylA1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体的，上述的应用中，过表达或沉默所述的PbrXylA1基因促进或抑制果实或/和愈伤组织中葡萄糖转化，提高或降低果实中可溶性糖(果糖、蔗糖、总糖)的含量。
本发明还提供转录因子PbrbZIP15或与转录因子PbrbZIP15相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中可溶性糖积累中的应用，所述转录因子PbrbZIP15的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，与转录因子PbrbZIP15相关的生物材料为以下(1)～(8)中的至少一种：
(1)编码所述转录因子PbrbZIP15的基因；
(2)含有(1)所述基因的表达盒；
(3)含有(1)所述基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有(1)所述基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
更进一步优选的，所述与转录因子PbrbZIP15相关的生物材料优选为编码所述转录因子PbrbZIP15的基因，或包含编码所述转录因子PbrbZIP15的基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
更进一步优选的，(1)中编码所述转录因子PbrbZIP15的基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。
具体的，上述的应用中，所述的转录因子PbrbZIP15通过调控上述PbrXylA1基因的表达量，以调控果实中葡萄糖转化与可溶性糖(果糖、蔗糖、总糖)的积累。更具体的，过表达或沉默所述的转录因子PbrbZIP15能够提高或抑制所述PbrXylA1基因的表达量，进一步促进或抑制果实或/和愈伤组织中葡萄糖转化与可溶性糖(果糖、蔗糖以及总糖)的积累。
更具体的，所述的转录因子PbrbZIP15通过与所述PbrXylA1基因启动子进行互作调控上述的PbrXylA1基因的表达量，以调控果实中葡萄糖转化与可溶性糖(果糖、蔗糖以及总糖)的积累，所述的PbrXylA1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。研究表明，转录因子PbrbZIP15特异地结合于PbrXylA1基因上游启动子中的G-box元件(转录起始位点ATG上游-858到-853)，促进PbrXylA1基因的转录，进而促进梨果实和愈伤组织中葡萄糖转化与可溶性糖(果糖、蔗糖以及总糖)的积累。
本发明还提供一种提高蔷薇科果树果实中可溶性糖积累的方法，过表达转录因子PbrbZIP15的编码基因或/和PbrXylA1基因提高果实中果糖、蔗糖以及总糖中至少一种的含量；所述转录因子PbrbZIP15的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述的PbrXylA1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的具体实施方式中，所述的蔷薇科果树为梨；所述的可溶性糖为果糖、蔗糖和总糖中的至少一种。
本发明具体实施方式的研究过程中，以‘早红考密斯(ERC)’和‘翠冠(CG)’梨果实为实验材料，对不同生长发育时期的梨果实进行转录组测序分析，并基于前人报道与转录组注释鉴定出所有的bZIP家族转录因子PbrbZIPs基因，分析‘ERC’和‘CG’果实生长发育过程中PbrbZIPs基因表达谱，以及其基因表达水平与糖分含量(葡萄糖、果糖、山梨醇、蔗糖与总糖)、甜度指数及不同糖分比值间的相关性(相关性系数设为|R|>0.8)。研究发现，PbrbZIP15表达水平在果实发育的中后期远高于其他成员，且其在‘ERC’果实发育过程中的基因表达量整体高于‘CG’，而且PbrbZIP15是所有PbrbZIPs中与果糖与总糖含量、甜度指数以及果糖/山梨醇的比值相关性最高的成员，因此筛选出可能参与调控可溶性糖代谢的家族成员PbrbZIP15。
构建重组质粒pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP，转化农杆菌GV3101，侵染烟草叶片，进行DAPI染色，并利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光，发现PbrbZIP15位于细胞核中。
构建pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP过表达载体和pTRV2-PbrbZIP15沉默载体，转入农杆菌GV3101，收集阳性菌株，注射到梨果实果肉皮层组织中。另外，用携带PbrbZIP15基因过表达载体(pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP)的农杆菌侵染梨愈伤组织，经PCR鉴定获得阳性株系后，将阳性转基因株系及其对照(采用pCAMBIA1300空载转化梨愈伤组织)转移至以山梨醇和蔗糖(1:1)作为混合碳源，以及以葡萄糖作为单一碳源的MS培养基上生长。
利用RT-qPCR技术检测梨果实与愈伤组织中PbrbZIP15基因相对表达量，发现瞬时过表达PbrbZIP15的果实该基因表达量显著升高，而瞬时沉默PbrbZIP15的果实该基因表达量显著降低。同样，PbrbZIP15过表达阳性系愈伤组织中该基因表达量显著升高。
利用超高效液相色谱法(UPLC)检测，发现瞬时过表达PbrbZIP15的果实与PbrbZIP15阳性系愈伤组织中果糖、蔗糖、总糖含量及甜度系数均显著提升，而在瞬时沉默PbrbZIP15的果实中则观察到相反的现象。此外，葡萄糖培养基上的PbrbZIP15阳性系愈伤组织中葡萄糖含量显著低于对照。
通过对‘早红考密斯(ERC)’和‘翠冠(CG)’梨果实不同生长发育时期转录组数据中糖代谢相关差异表达基因进行表达谱分析，结合其与PbrbZIP15基因表达量(相关性系数设为|R|>0.6)、糖分含量与甜度指数的(相关性系数设为|R|>0.8)相关性，筛选出转录因子PbrbZIP15可能调控的5个下游靶基因(PbrSS1，PbrXylA1，PbrSOT19，PbrSOT21，PbrERDL6-1)。
利用RT-qPCR进行基因表达量检测，发现上述5个预测的下游靶基因中只有PbrXylA1在PbrbZIP15过表达愈伤组织中上调表达，并且PbrXylA1基因的相对表达量在瞬时过表达PbrbZIP15的梨果实中显著上调而在瞬时沉默PbrbZIP15的果实中显著下调，说明PbrbZIP15对PbrXylA1的表达存在正向调控作用。
构建重组质粒pCAMBIA1300-PbrbZIP15，并以包含G-box元件或其突变体的PbrXylA1启动子序列构建报告载体pGreenⅡ0800-PbrXylA1pro-LUC或pGreenⅡ0800-PbrXylA1Mutpro-LUC，分别转入农杆菌GV3101与GV3101(psoup)。以携带pCAMBIA1300-PbrbZIP15与报告载体的农杆菌菌株共同侵染烟草叶片，进行萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性检测，发现pCAMBIA1300-PbrbZIP15与pGreenⅡ0800-PbrXylA1pro-LUC共转化的烟草叶片Luc/Ren比值显著高于对照组(pCAMBIA1300空载和pGreenⅡ0800-PbrXylA1pro-LUC共转的烟草叶片)，而pCAMBIA1300-PbrbZIP15与pGreenⅡ0800-PbrXylA1Mutpro-LUC共转化的烟草叶片Luc/Ren比值与其对照组之间没有显著差异(pCAMBIA1300空载和pGreenⅡ0800-PbrXylA1Mutpro-LUC共转化的烟草叶片)。
以携带pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP的梨愈伤组织为原材料，对包含和不包含G-box元件的PbrXylA1启动子片段进行染色质免疫共沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)分析，发现PbrbZIP15可与包含G-box的PbrXylA1启动子片段结合，而不能与不包含G-box元件的PbrXylA1启动子片段结合。
构建猎物载体PbrbZIP15-AD，并以包含G-box元件或其突变体的PbrXylA1启动子片段构建诱饵载体PbrXylA1_pro-pAbAi或PbrXylA1_Mutpro-pAbAi，利用Matchmaker GoldYeast One-Hybrid Library Screening System酵母单杂交文库筛选系统检测到PbrbZIP15可以与包含G-box结合元件的启动子片段(PbrXylA1_pro-pAbAi)结合，但突变这一元件(PbrXylA1_Mutpro-pAbAi)，PbrbZIP15不能与其结合。
结合进一步的电泳迁移率(EMSA)试验结果，得出PbrbZIP15通过与PbrXylA1启动子中的G-box(-858)～(-853)元件结合进而激活其表达。
构建pCold-PbrXylA1载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达，获取纯化后His-PbrXylA1重组蛋白进行体外酶活试验。另外，采用CRISPR-Cas9技术敲除HXK1基因，并构建pRS425-PGK1p-MdFRK2-CYC1t载体将MdFRK2导入酿酒酵母CEN.PK2-1D,获得工程菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2)；构建pRS423-SED1p-PbrXylA1-ADH1t，转入工程菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2)，获得目的菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)，同时将pRS423-SED1p-ADH1t空载转入CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2)，获得对照菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+EV)；将CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)及其对照菌株分别培养于以果糖和葡萄糖为碳源的培养基上，观察其长势并测定XylA活性。结合两试验结果得出，PbrXylA1具有催化葡萄糖与果糖异构化能力，且对葡萄糖的异构活性远高于果糖。
构建重组质粒pBI221-PbrXylA1-GFP，与内质网的marker(ER-rkCD3-959-mcherry)共同转染拟南芥原生质体，利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光，发现PbrXylA1定位于内质网。
构建pCAMBIA1300-PbrXylA1-GFP过表达载体和pTRV2-PbrXylA1沉默载体，转入农杆菌GV3101，收集阳性菌株，注射到梨果实果肉皮层组织中。另外，用携带PbrXylA1过表达载体(pCAMBIA1300-PbrXylA1-GFP)的农杆菌侵染愈伤组织，经PCR鉴定获得阳性株系后，将阳性转基因株系及其对照(采用pCAMBIA1300空载转化的愈伤组织)转移至以山梨醇和蔗糖(1:1，w:w)作为混合碳源以及以葡萄糖作为单一碳源的MS培养基上生长。
利用RT-qPCR技术检测梨果实与愈伤组织中PbrXylA1基因相对表达量，发现瞬时过表达PbrXylA1的果实该基因表达量显著升高，而瞬时沉默PbrXylA1的果实该基因表达量显著降低。同理，PbrXylA1过表达阳性系愈伤组织中该基因表达量显著升高。
利用超高效液相色谱法(UPLC)检测，发现瞬时过表达PbrXylA1的果实与PbrXylA1阳性系愈伤组织中果糖、蔗糖、总糖含量及甜度系数均显著提升，而在瞬时沉默PbrXylA1的果实中则观察到相反的现象。此外，过表达PbrXylA1的阳性系愈伤组织中葡萄糖含量显著低于对照。
研究表明，bZIP家族转录因子PbrbZIP15通过与PbrXylA1基因启动子区域中的G-box元件(转录起始位点ATG上游-858到-853)结合，调控PbrXylA1基因的转录表达。本发明通过转录组、亚细胞定位、双荧光素酶实验、染色质免疫共沉淀定量PCR(ChIP-qPCR)、酵母单杂(Y1H)、电泳迁移率(EMSA)、体外酶活试验、酿酒酵母异源表达、梨果实瞬时过表达或沉默相关基因以及梨愈伤组织转基因等技术，阐明梨PbrbZIP15正调控PbrXylA1基因转录进而调控果实中葡萄糖异构与果糖、蔗糖以及总糖积累的分子机制，为实现梨可溶性糖代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、首次揭示了bZIP家族转录因子PbrbZIP15调控梨果实PbrXylA1基因表达。
2、本发明阐明了梨PbrbZIP15与PbrXylA1基因启动子中的G-box元件(转录起始位点ATG上游-858到-853)互作在调控果实中可溶性糖(果糖、蔗糖、总糖)积累的分子机制，为实现梨可溶性糖代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。
3、本发明挖掘出调控梨果实糖代谢的bZIPs基因家族成员及编码木糖异构酶(XylA)的下游靶基因PbrXylA1。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1‘早红考密斯(ERC)’和‘翠冠(CG)’梨果实生长发育过程中bZIP家族成员PbrbZIPs基因表达谱。颜色刻度表示归一化处理后的值(Log2(FPKM值+1))，其中红色表示高水平，绿色表示低水平，黄色表示中等水平。
图2‘早红考密斯(ERC)’和‘翠冠(CG)’梨果实生长发育过程中PbrbZIPs基因表达水平、甜度指数、糖分含量及其比值间的相关性热图。颜色刻度表示相关性系数，其中负相关用绿色表示，正相关用红色表示，‘Fru’、‘Glu’、‘Sor’与‘Suc’分别代表果糖、葡萄糖、山梨醇与蔗糖。
图3qRT-PCR验证PbrbZIP15基因在‘早红考密斯(ERC)’和‘翠冠(CG)’梨果实不同发育时期的相对表达量。‘CG’果实45DAFB的表达丰度设置为1.0。数据代表三个生物学重复的平均值。
图4PbrbZIP15定位于细胞核。
图5PbrbZIP15基因参与可溶性糖积累的功能验证。(a)瞬时过表达PbrbZIP15基因促进果实可溶性糖的积累；(b)瞬时沉默PbrbZIP15基因抑制果实可溶性糖的积累；(c)过表达PbrbZIP15基因促进混合碳源培养基上生长的梨愈伤组织中糖分积累；(d)过表达PbrbZIP15基因促进葡萄糖碳源培养基上生长的梨愈伤组织中糖分积累。OE-B4与OE-B11代表过表达PbrbZIP15的两个转基因愈伤组织阳性系。数据代表三个生物学重复的平均值，‘*’与‘**’表示样本之间的差异显著性(p<0.05；p<0.01)。
图6果实发育过程中差异表达的糖代谢相关基因表达谱及其与PbrbZIP15基因表达水平、甜度指数、可溶性糖含量和不同糖组分比值的相关性。图中糖代谢相关基因在‘ERC’果实中至少在45、75和120DAFB三个时期表达量均高于(或低于)‘CG’(倍数≥1.5，FDR<0.01)。红色(或浅红色)线表示属性之间极显著(或显著)正相关性，而负相关属性之间用绿色(或浅绿色)线连接。与PbrbZIP15基因表达量具有极显著(或显著)正相关性的糖代谢相关基因用红色(或浅红色)背景突出显示，而具有负相关性的成员用绿色(或浅绿色)背景突出显示。与总可溶性糖含量呈极显著正(或负)相关的糖代谢相关基因ID用暗红色(或深绿色)标记，与甜度指数呈极显著正(或负)相关的基因用红色(或绿色)星号标记。与‘CG’相比，‘ERC’果实中各阶段表达丰度较高(或较低)的基因(倍数≥1.5，FDR<0.01)用红色(或绿色)‘☉’标记。数据代表三个生物学重复的平均值。极显著相关：|R|>0.8；显著相关：0.6<|R|≤0.8。
图7PbrbZIP15对PbrXylA1的表达存在正向的调控作用。(a)过表达PbrbZIP15的愈伤组织中5个候选下游靶基因(PbrSS1，PbrXylA1，PbrSOT19，PbrSOT21，PbrERDL6-1)的相对表达量。OE-B4表示过表达PbrbZIP15的阳性系愈伤组织。(b)梨果实中瞬时过表达或沉默PbrbZIP15对PbrXylA1表达丰度的影响。数据代表三个生物学重复的平均值，‘*’与‘**’表示样本之间的差异显著性(p<0.05；p<0.01)。
图8PbrbZIP15可与PbrXylA1基因中的G-box元件结合并激活其表达。(a)双荧光素酶实验；(b)染色质免疫共沉淀qPCR实验；(c)酵母单杂实验；(d)电泳迁移率试验。数据代表三个生物学重复的平均值，‘**’表示样本之间的差异显著性(p<0.01)。
图9体外酶活试验证PbrXylA1的葡萄糖与果糖异构活性。
图10酿酒酵母中异源表达PbrXylA1验证其催化葡萄糖异构的活性。(a)CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)菌株及其对照菌株在葡萄糖与果糖培养基上的生长状态。将OD值一致的等体积稀释菌液(10-6，50μl)涂布于平板中，28℃培养48h。(b)平板菌落计数。(c)CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)菌株及其对照菌株在葡萄糖与果糖培养基上的XylA活性。分别以果糖与葡萄糖作为底物。(d)葡萄糖培养基上两菌株的HXK活性。(e)葡萄糖培养基上两菌株的FRK活性。数据代表三个生物学重复的平均值，‘*’与‘**’表示样本之间的差异显著性(p<0.05；p<0.01)。
图11PbrXylA1定位于拟南芥原生质体内质网。
图12PbrXylA1基因在梨果实与愈伤组织中的功能验证。(a)瞬时过表达PbrXylA1基因促进果实中可溶性糖积累；(b)瞬时沉默PbrXylA1基因抑制果实中可溶性糖积累；(c)过表达PbrXylA1基因促进混合碳源培养基上生长的梨愈伤组织中糖分积累；(d)过表达PbrXylA1基因促进葡萄糖碳源培养基上生长的梨愈伤组织中糖分积累。OE-X5与OE-X6代表过表达PbrXylA1的两个转基因愈伤组织阳性系。数据代表三个生物学重复的平均值，‘*’与‘**’表示样本之间的差异显著性(p<0.05；p<0.01)。
图13bZIP家族转录因子PbrbZIP15与PbrXylA1基因启动子互作在调控梨果实中可溶性糖积累的作用机理。
具体实施方式
以下结合具体实施方式详细说明本发明。实施例是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方式中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1挖掘参与调控梨果实生长发育过程中可溶性糖积累的PbrbZIP15基因：
1.样品采集
本试验所用材料为‘早红考密斯(ERC)’和‘翠冠(CG)’梨果实，分别来自烟台果树研究所和南京农业大学湖熟试验基地。于盛花期后45天(45DAFB)、75天(75DAFB)、105天(105DAFB)到商业成熟期(120DAFB)，采收长势一致、无机械损伤和病虫害的果实，作为研究对象用来分析4种可溶性糖(蔗糖、山梨醇、果糖和葡萄糖)的含量和进行转录组测序。每个时期样品使用3个重复来减小误差，每个重复5个果实。
2.可溶性糖含量测定
提取果实中可溶性糖并利用超高效液相色谱(UPLC)法测定4种糖分含量(葡萄糖、果糖、山梨醇和蔗糖)。称取0.5g果肉，在液氮中研磨成粉末，采用80％的乙醇进行糖分含量提取，4℃12000rpm离心20min，收集上清液。取一定体积上清液进行旋转蒸发后，重新溶解于1mL超纯水中，采用0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，获得可溶性糖提取液。
液相色谱仪为Waters UPLC ACQUITY H-Class系统，色谱柱：UPLC ACQUITY BEHAmide(1.7μm×100mm×2.1mm)；流动相：85％(v/v)的乙腈和15％(v/v)的超纯水；流速：0.2mL/min；柱温：45℃；检测器类型：ELSD；进样量：2μL。根据样品峰面积和标准曲线计算葡萄糖、果糖、山梨醇和蔗糖的含量，所检测的四种糖分含量之和作为总糖含量，甜度指数的计算公式为：Sweetness＝0.75×[Glucose]+1.7×[Fructose]+1.0×[Sucrose]+0.6×[Sorbitol]。
3.转录组分析
借助EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(RN3802，艾德莱，北京)提取不同发育时期的‘ERC’与‘CG’梨果实样品的总RNA。再采用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific，美国)和Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国)鉴定样本RNA纯度、浓度和完整性后，采用NEBNext UltraTM RNA Library PrepKit for Illumina(E7770，NEB，美国)试剂盒构建转录组文库。而后，采用HiSeq X-ten测序平台对构建的文库进行测序。在去除低质量reads后，获得clean reads用于后续数据分析。使用HISAT2软件与‘砀山酥梨’基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/)进行比对，并进行基因表达量(FPKM)计算。转录组测序和分析由百迈客生物科技有限公司(北京，中国)完成。
4.参与可溶性糖积累的PbrbZIP15基因的筛选
分析‘早红考密斯(ERC)’与‘翠冠(CG)’果实生长发育过程中PbrbZIPs基因表达谱及其表达量与果实糖分含量、甜度指数及不同糖分比值间的相关性(相关性系数设为|R|>0.8)，筛选出可能调控梨果实糖分积累的家族成员PbrbZIP15。
5.RT-qPCR验证PbrbZIP15基因在果实不同发育时期的相对表达量
采用植物总RNA提取试剂盒(RE-05011，成都福际生物技术有限公司)提取梨果肉中的总RNA(提取方法参考试剂盒说明书)。而后采用全式金EasyScript cDNA第一链合成试剂盒(AE301-02，北京全式金生物)将总RNA反转成cDNA。最后，采用Light Cycler 480SYBRGreen I Master(4887352001，Roche)试剂检测PbrbZIP15基因在果实不同发育时期的相对表达量。以梨tubulin基因(PbrTub)作为内参基因。PbrbZIP15和PbrTub基因的引物序列见表1。
表1 PbrbZIP15和PbrTub基因的RT-qPCR引物序列
实验结果：如图1-2所示，根据转录组注释与前人报道，我们共发掘78个PbrbZIPs成员在‘早红考密斯(ERC)’与‘翠冠(CG)’果实生长发育过程表达。其中，PbrbZIP15表达水平在果实发育的中后期远高于其他成员，且其在‘ERC’果实发育过程中的基因表达量整体高于‘CG’，而且是所有PbrbZIPs中与果糖与总糖含量、甜度指数相关性最高的成员。
如图3所示，对PbrbZIP15基因在‘ERC’与‘CG’果实发育过程中表达量进行RT-qPCR验证，其结果与转录组数据相吻合。
实施例2PbrbZIP15基因的功能验证
1.PbrbZIP15基因的克隆与序列分析
以‘ERC’梨果实cDNA为模板，扩增PbrbZIP15基因的编码序列(去除终止密码子)(引物序列见表2)，插入pCAMBIA1300-GFP质粒并转化大肠杆菌感受态细胞。测序得到如SEQID No.3所示的基因编码序列。PbrbZIP15基因编码的蛋白质序列如SEQ ID No.4所示。
2.PbrbZIP15的亚细胞定位分析
将上述测序正确的重组质粒pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，选取阳性菌株进行扩增，扩大培养至OD600为0.6-0.8时进行菌体收集。然后，用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200μM乙酰丁香酮，pH＝5.7)重悬菌液，黑暗条件下诱导3-5h后侵染烟草叶片。同时，用携带pCAMBIA1300-GFP空载的农杆菌侵染烟草作为对照。侵染后72h左右，摘取注射叶片进行DAPI(4'，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚)染色，然后，利用LeicaTCs SP2激光共聚焦显微镜观察荧光信号。
3.PbrbZIP15基因的瞬时过表达
将上述鉴定成功的包含pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP质粒的农杆菌培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，黑暗条件下诱导4h后，调节OD600为1.0。用注射器将菌液缓慢匀速注入‘CG’梨果肉中，注射后避光处理24h，注射5天后采集注射部位的果肉进行后续测定。瞬时过表达所选用的‘CG’梨果实采自花后70d左右。同时，另选大小相近、发育状态一致果实的注射携带pCAMBIA1300空载的农杆菌作为对照(OE-EV)。
4.PbrbZIP15基因的瞬时沉默
以上述测序正确的pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP质粒为模板，扩增约350bp左右的PbrbZIP15基因编码序列(引物序列见表2)，插入pTRV2载体中，转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，选取阳性菌株进行扩繁，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，黑暗诱导4h后，调节OD600至1.0。将分别携带重组质粒pTRV2-PbrbZIP15与pTRV1的菌液按1：1混合后注射到‘CG’果肉中，注射后避光处理24h。注射5天后采集注射部位的果肉进行后续测定。瞬时沉默所选用的‘CG’梨果实采自花后100d左右。以携带pTRV2空载与pTRV1的菌液共注射的果肉作为对照(VI-EV)。
5.PbrbZIP15在梨愈伤组织中的过表达
以‘Clapp's Favourite(CF)’梨果肉的愈伤组织为实验对象，野生型愈伤组织生长于MS培养基上(30g/L蔗糖、1mg/L 2,4-D与0.5mg/L 6-BA)，每2周继代一次，为后续转基因备好材料。用携带pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP的农杆菌侵染愈伤组织，侵染后的愈伤组织在含有乙酰丁香酮(AS)的MS培养基上共培养2d，随后转移到含有潮霉素(Hyg)的MS培养基(碳源：30g/L蔗糖)上培养1.5-2个月。再生愈伤组织经DNA与RNA鉴定后，获得阳性系，并加以扩繁。随后，将转化PbrbZIP15的不同阳性系愈伤组织与对照(转化空载pCAMBIA1300-GFP的愈伤组织，OE-EV)共同转移至以山梨醇与蔗糖混合物(各15g/L)或葡萄糖(30g/L)作为碳源的MS培养基上(包含Hyg)生长，用于后续基因表达量与糖分含量测定。
6.果实与愈伤组织中PbrbZIP15基因表达量分析
利用植物总RNA提取试剂盒(RE-05011，成都福际生物技术有限公司)提取组织中的总RNA，并将提取到的总RNA反转录合成cDNA。采用Light Cycler 480SYBR Green IMaster(4887352001，Roche)试剂检测PbrbZIP15基因的表达量(引物序列见表1)。以PbrTub作为内参基因，引物序列见表1。
7.果实与愈伤组织中可溶性糖含量分析
称取0.5g组织，在液氮中研磨成粉末，采用80％的乙醇进行糖分含量提取，4℃12000rpm离心20min，收集上清液。取一定体积上清液进行旋转蒸发后，重新溶解于1mL超纯水中，采用0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，获得可溶性糖提取液。利用液相色谱仪测定4种可溶性糖含量，并计算总糖与甜度系数。
表2 PbrbZIP15基因克隆、亚细胞定位、过表达与基因沉默的引物序列
实验结果：如图4所示，PbrbZIP15定位于细胞核。如图5所示，瞬时过表达PbrbZIP15的果实与PbrbZIP15阳性系愈伤组织中可溶性糖(果糖、蔗糖、总糖)含量及甜度系数均显著提升，而在瞬时沉默PbrbZIP15的果实中则观察到相反的现象。此外，葡萄糖培养基上的PbrbZIP15阳性系愈伤组织中葡萄糖含量显著低于对照。
实施例3转录因子PbrbZIP15的下游靶基因PbrXylA1的筛选及其调控分子机制
1.PbrbZIP15的下游靶基因筛选
对‘ERC’与‘CG’梨果实发育过程中转录组数据进行分析，鉴定出100个在‘ERC’中至少在45、75和120DAFB三个时期表达量始终高于(或低于)‘CG’果实(倍数≥1.5，FDR<0.01)糖代谢相关基因。其中，5个糖代谢相关基因(PbrSS1，PbrXylA1，PbrSOT19，PbrSOT21，PbrERDL6-1)表达量在‘ERC’果实整个发育过程中均高于‘CG’(倍数≥1.5，FDR<0.01)，且与果实总糖含量及甜度指数呈极显著相关性(|R|>0.8)，与PbrbZIP15基因表达量显著相关(|R|>0.6)，因此被选为PbrbZIP15参与糖代谢的5个可能的下游靶基因。
2.RT-qPCR验证PbrbZIP15对下游候选靶基因的调控作用
利用植物总RNA提取试剂盒(RE-05011，成都福际生物技术有限公司)提取过表达PbrbZIP15愈伤组织或瞬时过表达/沉默PbrbZIP15的梨果肉中的总RNA，并将提取到的总RNA反转录合成cDNA。采用Light Cycler 480SYBR Green I Master(4887352001，Roche)试剂检测候选下游靶基因(PbrXylA1，PbrSS1，PbrSOT19，PbrSOT21，PbrERDL6-1)的表达量(引物序列见表3)。以PbrTub作为内参基因(引物序列见表1)
表3 PbrbZIP15下游候选靶基因的RT-qPCR的引物序列
3.PbrXylA1基因启动子的克隆与序列分析
根据梨基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/)中PbrXylA1基因的启动子序列设计特异性引物(引物序列见表4)。以‘ERC’梨果实DNA为模板进行PbrXylA1启动子序列扩增，并插入pGreenII 0800-LUC载体，转化大肠杆菌感受态细胞。测序得到如SEQID No.5所示的PbrXylA1基因启动子序列。将PbrXylA1基因启动子序列提交至PlantCARE数据库(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行顺式作用元件分析，确认是否存在bZIP转录因子结合元件G-box及其分布位置。
4.双荧光素酶报告实验(Dual-luciferase assays，DLR)
以‘ERC’果实DNA和cDNA为模板，设计特异性引物克隆PbrXylA1基因启动子和PbrbZIP15基因CDS序列(引物序列见表4)。利用G-box突变引物(引物序列见表4)，将PbrXylA1基因启动子中的G-box元件进行突变，获得突变型启动子序列PbrXylA1Mutpro。将PbrbZIP15基因CDS序列插入pCAMBIA1300载体，同时，将PbrXylA1基因启动子序列及其突变体插入pGreenII 0800-LUC载体中。将测序正确的转录因子重组质粒(pCAMBIA1300-PbrbZIP15)和启动子重组质粒(pGreenII 0800-PbrXylA1pro-LUC或pGreenII 0800-PbrXylA1Mutpro-LUC)分别转化农杆菌GV3101与GV3101(psoup)。选取阳性菌株扩大培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体，然后用侵染液(10mM MgCl2，10mM MES，200μM乙酰丁香酮，pH＝5.7)重悬菌液，黑暗条件下诱导3-5h后侵染烟草叶片。注射前将含有转录因子和启动子重组质粒的农杆菌菌液按9：1(v/v)比例混合，以携带pCAMBIA1300空载与相应启动子重组质粒(pGreenII0800PbrXylA1pro-LUC或pGreenII 0800-PbrXylA1Mutpro-LUC)的农杆菌菌液共转染的烟草叶片作为对照。侵染后60-72h，采集叶片，用Dual-Luciferase ReporterAssay System试剂盒(Promega，美国)检测萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性(具体步骤参见说明书)。
5.染色质免疫共沉淀定量PCR实验(Chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR，ChIP-qPCR)
称取10g包含pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP的愈伤组织，碾碎后，于1％(v/v)甲醛交联缓冲液中进行15-30min的交联反应。加入甘氨酸终止交联，交联所得产物经液氮研磨与细胞裂解得到染色质，进一步经超声打断得到可溶性剪切染色质(平均DNA长度200-500bp)。一部分可溶性剪切染色质用作Input，剩余部分经洗涤和预净化后分别用于与GFP抗体和非特异抗体IgG(阴性对照)进行免疫沉淀(IP)。IP产物须经过夜解交联与DNA纯化后方可用于后续试验。分别在包含G-box元件的PbrXylA1启动子区域(S1)和不包含G-box元件的PbrXylA1启动子区域(S2)设计特异的荧光定量引物(引物见表4)，分别以Input产物、GFP抗体的IP产物以及IgG抗体的IP产物为模板进行qPCR检测。
6.酵母单杂实验(Yeast one-hybrid assay，Y1H)
以测序正确的pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP质粒为模板克隆PbrbZIP15基因CDS序列全长(引物见表4)，并插入pGADT7中，形成猎物载体PbrbZIP15-AD。分别以测序正确的pGreenII 0800PbrXylA1pro-LUC和pGreenII 0800-PbrXylA1Mutpro-LUC质粒为模板，根据G-box的分布情况设计引物(引物见表4)，扩增含有G-box或其突变体的PbrXylA1启动子片段并插入pAbAi载体中，形成两个诱饵载体PbrXylA1_pro-pAbAi和PbrXylA1_Mutpro-pAbAi。将单独的诱饵载体和猎物载体共转入酵母菌株中，利用Matchmaker Gold YeastOne-Hybrid Library Screening System(唯地，上海，中国)酵母单杂交文库筛选系统开展Y1H实验(具体步骤参见说明书)。在添加金担子素A(AbA)的SD/-Ura缺素培养基上进行PbrXylA1_pro-pAbAi的自激活检测，并选定合适的AbA浓度进行后续试验。将共转化诱饵载体与猎物载体的酵母菌株在添加适宜浓度的SD/-Leu缺素培养基上进行培养，以检测PbrbZIP15对PbrXylA1启动子的结合能力。以pGAD-p53与p53-AbAi共转化的酵母菌株作为阳性对照，以pGADT7-AD和PbrXylA1_pro-pAbAi(或PbrXylA1_Mutpro-pAbAi)共转化的酵母菌株作为阴性对照。
7.电泳迁移率试验(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)
以测序正确的pCAMBIA1300-PbrbZIP15-GFP质粒为模板扩增PbrbZIP15 CDS全长，并插入pCold-TF表达载体(引物序列见表4)。将测序正确的pCold-PbrbZIP15质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)以获取带有His标签的重组蛋白His-PbrbZIP15，同时表达pCold-TF空载蛋白作为对照，粗提蛋白经纯化后用于后续试验。根据目的基因启动子上G-box元件附近的序列信息合成30-40bp左右的DNA探针，包括携带未突变(或突变)G-box元件的生物素标记探针以及携带G-box元件的未标记的竞争性探针。DNA探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成(探针序列见表4)。EMSA实验根据Chemiluminescent EMSA Kit(碧云天，中国)所提供操作手册进行。
表4启动子克隆、DLR、ChIP-qPCR、Y1H、EMSA相关引物或探针序列
实验结果：如图6～8所示，‘ERC’与‘CG’梨果实发育过程中共鉴定出100个在‘ERC’中至少在45、75和120DAFB三个时期表达量均高于(或低于)‘CG’果实(倍数≥1.5，FDR<0.010)糖代谢相关基因。其中，5个糖代谢相关基因(PbrSS1，PbrXylA1，PbrSOT19，PbrSOT21，PbrERDL6-1)表达量在‘ERC’果实整个发育过程中均高于‘CG’(倍数≥1.5，FDR<0.010)，且与果实总糖含量及甜度指数呈极显著相关性(|R|>0.8)，并且还与PbrbZIP15基因表达量显著相关(|R|>0.6)，因此被选为PbrbZIP15参与糖代谢的5个可能的下游靶基因。在过表达PbrbZIP15的愈伤组中，PbrXylA1是5个候选靶中唯一上调表达的基因，并且瞬时过表达PbrbZIP15的梨果实中PbrXylA1显著上调表达，而瞬时沉默PbrbZIP15的梨果实则相反，说明PbrbZIP15对PbrXylA1的表达存在正向的调控作用。
进一步结合双荧光素酶报告试验、ChIP-qPCR、酵母单杂交以及EMSA试验的结果得出，转录因子PbrbZIP15特异地结合于PbrXylA1基因上游启动子中的G-box元件(转录起始位点ATG上游-858到-853)，激活PbrXylA1基因的转录。
实施例4PbrXylA1的催化活性研究
1.PbrXylA1蛋白的原核表达
以‘ERC’果实cDNA为模板，设计特异引物扩增PbrXylA1 CDS全长并插入pCold-TF表达载体(引物序列见表5)。测序得到如SEQ ID No.1所示的基因编码序列。PbrXylA1基因编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。将测序正确的pCold-PbrXylA1重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)以获取带有His标签的重组蛋白His-PbrXylA1。蛋白粗提液过Ni-NTA(His标签结合树脂)预装重力柱进行纯化，收集His-PbrXylA1蛋白，溶解于0.1M MOPS缓冲液(pH7.0)中用于后续XylA活性检测。
2.PbrXylA1基因在酿酒酵母中的异源表达
用多个物种的已知功能的XylA蛋白序列为索引，在酵母基因组中(https://yeastgenome.org/)进行BLASTP，未发现任何XylA同源序列，因此排除酵母本体XylA蛋白对PbrXylA1功能验证的干扰。鉴于酿酒酵母己糖激酶1(HXK1)作为糖酵解的起始酶和限速酶，可催化ATP将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，在菌体的生长过程中起着重要作用。此外，苹果果糖激酶2(MdFRK2)对果糖的偏好性远高于葡萄糖。因此，我们敲除HXK1，并将MdFRK2导入酿酒酵母菌株CEN.PK2-1D，以削弱其葡萄糖转化能力，但增强其果糖磷酸化潜能，以便于验证PbrXylA1在葡萄糖异构化中的作用。利用CRISPR-Cas9技术敲除HXK1，为防止脱靶，以酵母基因组HXK1为模板，合成两条sgRNA(引物序列见表5)；相应的修复DNA片段，通过三对引物合成(引物序列见表5)。以‘嘎啦’苹果叶片cDNA为模板扩增MdFRK2 CDS全长(引物序列见表5)。HXK1 sgRNA和MdFRK2 CDS序列分别插入pRS426-Cas9-sgRNA(载体的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)和pRS425-PGK1p-CYC1t(载体的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)载体，并导入CEN.PK2-1D中，形成工程菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2)。随后，以测序正确的pCold-PbrXylA1质粒为模板扩增PbrXylA1 CDS全长并插入pRS423-SED1p-ADH1t(载体的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)载体中(引物序列见表5)。将测序正确pRS423-SED1p-PbrXylA1-ADH1t重组质粒转入CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2)，得到目的菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)。同时，将空的pRS423-SED1p-ADH1t质粒导入CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2)，形成对照菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+EV)。最终，将鉴定成功的CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)和对照菌株分别培养于以果糖和葡萄糖为碳源的缺素(-Ura/His/Leu)培养基上，观察其长势并收集菌体用于酶活性检测。
为了测定酿酒酵母中的XylA活性，将0.2g菌体于1.0mL 0.1M MOPS缓冲液(pH7.0)在0℃下均质。于4℃10000g离心10分钟后，收集上清作为粗酶提取物进行XylA活性测定。
此外，我们还使用相应的检测试剂盒对上述两菌株的HXK(G0810W，苏州格锐思生物科技有限公司)和FRK活性(G0871W，苏州格锐思生物科技有限公司)进行了测定。
3.XylA的活性检测
催化反应在25℃下进行，300μL的反应混合溶液中包含0.1M MOPS(pH 7.0)、10mMMgSO4、1mM CoCl2、100μL酶提取物和50μL的800mM底物(葡萄糖或果糖)(A2)。以不含酶提取物或底物的混合溶液作为空白(A0)或对照(A1)，缺少的酶提取物或底物用等体积的0.1MOPS(pH 7.0)缓冲液补充。反应结束后，将混合溶液(A0，A1与A2)采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法检进行葡萄糖含量测定。
葡萄糖异构化(或果糖异构化)能力是通过葡萄糖的消耗或形成来确定的。葡萄糖作为底物时，监测葡萄糖消耗量(ΔA＝A0-(A2-A1))；而以果糖为底物时，测定葡萄糖的生成量(ΔA＝A2-A1)。
使用BCA蛋白测定试剂盒(BCAP-1-W，苏州科铭生物科技有限公司)检测蛋白浓度，以每小时每毫克蛋白的底物消耗量或产物形成量计算XylA活性。
表5原核表达与酿酒酵母基因敲除或异源表达引物序列
实验结果：如图9所示，体外条件下PbrXylA1可催化葡萄糖与果糖的异构，且葡萄糖异构活性远高于果糖异构活性。如图10所示，尽管CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)表现出更高的XylA活性，但CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)菌株与对照菌株在果糖培养基上的生长状态不存在显著差异。当葡萄糖作为碳源时，菌株CEN.PK2-1D(hxk1Δ+MdFRK2+PbrXylA1)的生长速度明显高于对照，具有较高的XylA活性，但两菌株之间FRK和HXK活性没有明显差异。这些证据共同证实PbrXylA1具有催化葡萄糖异构为果糖的能力。
实施例5PbrXylA1基因在植物体内的功能验证
1.PbrXylA1基因编码蛋白的亚细胞定位分析
以测序正确的pCold-PbrXylA1质粒为模板，扩增PbrXylA1基因的编码序列(去除终止密码子)(引物序列见表6)，并插入pBI221-GFP质粒，转化大肠杆菌感受态细胞。将测序正确的pBI221-PbrXylA1-GFP质粒与内质网标记基因(ER-rk CD3-959-mcherry)共同转染拟南芥原生质体，以pBI221-GFP与ER-rk CD3-959-mcherry共转染的原生质体作为对照。转染后72h左右利用激光共聚焦显微镜观察荧光信号。
2.PbrXylA1基因的瞬时过表达
以测序正确的pBI221-PbrXylA1-GFP质粒为模板扩增PbrXylA1基因的编码序列(引物序列见表6)，插入pCAMBIA130-GFP载体中，并转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，选取阳性菌株进行扩繁，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，诱导4h后，调节OD600至1.0。用注射器将菌液缓慢匀速注入‘CG’梨果肉中，注射后避光处理24h，然后移至光照条件下。注射后5天采集注射部位的果肉进行后续测定。瞬时过表达所选用的‘CG’梨果实采自花后70d左右。同时，另选大小相近、发育状态一致果实的注射携带pCAMBIA1300空载的农杆菌作为对照(OE-EV)。
3.PbrXylA1基因的瞬时沉默
以测序正确的pBI221-PbrXylA1-GFP质粒为模板扩增PbrXylA1基因编码区片段(705-1074bp)(引物序列见表6)，插入pTRV2载体中，并转化农杆菌GV3101。经PCR鉴定后，选取阳性菌株进行扩繁，培养至OD600为0.6-0.8时收集菌体；用侵染液(10mM MgCl2、10mM MES和200mM乙酰丁香酮)重悬菌体，黑暗诱导4h后，调节OD600至1.0。将分别携带重组质粒pTRV2-PbrXylA1与pTRV1的菌液按1：1混合后注射到‘CG’果肉中，注射后避光处理24h，然后移至光照条件下。注射5天后采集注射部位的果肉进行后续测定。瞬时沉默所选用的‘CG’梨果实采自花后100d左右。以携带pTRV2空载与pTRV1的菌液共注射的果肉作为对照(VI-EV)。
4.PbrXylA1在梨愈伤组织中的过表达
用携带pCAMBIA1300-PbrXylA1-GFP的农杆菌侵染愈伤组织，侵染后的愈伤组织在含有乙酰丁香酮(AS)的MS培养基上共培养2d，随后转移到含有潮霉素(Hyg)的MS培养基(碳源：30g/L蔗糖)上培养1.5-2个月。再生愈伤组织经DNA与RNA鉴定后，获得阳性系，并加以扩繁。随后，将转化PbrXylA1的不同阳性系愈伤组织与对照(转化空载pCAMBIA1300-GFP的愈伤组织，OE-EV)共同转移至以山梨醇与蔗糖混合物(各15g/L)或葡萄糖(30g/L)作为碳源的MS培养基上(包含Hyg)生长，用于后续基因表达量与糖分含量测定。
5.果实与愈伤组织中PbrXylA1基因表达量分析
利用植物总RNA提取试剂盒(RE-05011，成都福际生物技术有限公司)提取瞬时过表达/沉默PbrXylA1的果肉或过表达PbrXylA1的愈伤组织中的总RNA，并将提取到的总RNA反转录合成cDNA。采用Light Cycler 480SYBR Green I Master(4887352001，Roche)试剂检测PbrXylA1基因的表达量(引物序列见表3)。以PbrTub作为内参基因(引物序列见表1)。
6.果实与愈伤组织中可溶性糖含量分析
称取0.5g组织，在液氮中研磨成粉末，采用80％的乙醇进行糖分含量提取，4℃12000rpm离心20min，收集上清液。取一定体积上清液进行旋转蒸发后，重新溶解于1mL超纯水中，采用0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，获得可溶性糖提取液。利用液相色谱仪测定4种可溶性糖含量，并计算总糖与甜度系数。
表6 PbrXylA1基因克隆、亚细胞定位、瞬时表达与沉默、RT-qPCR的引物序列
实验结果：如图11所示，PbrXylA1定位于拟南芥原生质体内质网。如图12所示，瞬时过表达PbrXylA1的果实与PbrXylA1阳性系愈伤组织中可溶性糖(果糖、蔗糖、总糖)含量及甜度系数均显著提升，而在瞬时沉默PbrXylA1的果实中则观察到相反的现象。此外，过表达PbrXylA1的阳性系愈伤组织中葡萄糖含量显著低于对照。
综上所述，本发明基于一种bZIP家族转录因子PbrbZIP15，其可与PbrXylA1基因上游启动子中的G-box元件(转录起始位点ATG上游-858到-853)结合，调控其表达，促进梨果实中葡萄糖向果糖的转化(如图13所示)，从而影响可溶性糖组成与丰度，为实现梨果实糖代谢精准调控及果实品质的遗传改良提供理论和实践基础。
以上所述对本发明具体的实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。应当指出的是在不脱离本发明技术原理的前提下，任何本领域技术人员做出的改进、等同替换等，均应包含在本发明的权利要求保护范围内。

Claims (13)

1.PbrXylA1基因或与PbrXylA1基因相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中可溶性糖积累中的应用，所述PbrXylA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与PbrXylA1基因相关的生物材料为(1)～(8)中的至少一种：
(1)所述PbrXylA1基因编码的蛋白；
(2)含有所述PbrXylA1基因的表达盒；
(3)含有所述PbrXylA1基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有所述PbrXylA1基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PbrXylA1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1～3中任一所述的应用，其特征在于，过表达或沉默所述的PbrXylA1基因提高或降低果实中可溶性糖的含量。
5.转录因子PbrbZIP15或与转录因子PbrbZIP15相关的生物材料在调控蔷薇科果树的果实中可溶性糖积累中的应用，所述转录因子PbrbZIP15的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，与转录因子PbrbZIP15相关的生物材料为以下(1)～(8)中的至少一种：
(1)编码所述转录因子PbrbZIP15的基因；
(2)含有(1)所述基因的表达盒；
(3)含有(1)所述基因的重组载体；
(4)含有(2)所述表达盒的重组载体；
(5)含有(1)所述基因的重组微生物；
(6)含有(2)所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)所述重组载体的重组微生物；
(8)含有(4)所述重组载体的重组微生物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，(1)中编码所述转录因子PbrbZIP15的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
8.根据权利要求5～6中任一所述的应用，其特征在于，所述的转录因子PbrbZIP15通过调控权利要求1中所述PbrXylA1基因的表达量，以调控果实中可溶性糖的积累。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的转录因子PbrbZIP15通过与所述PbrXylA1基因的启动子进行互作调控权利要求1中所述PbrXylA1基因的表达量，以调控果实中可溶性糖的积累，所述的PbrXylA1基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，过表达或沉默所述的转录因子PbrbZIP15能够提高或抑制所述PbrXylA1基因的表达量，进一步提高或降低果实中可溶性糖的含量。
11.一种提高蔷薇科果树的果实中可溶性糖积累的方法，其特征在于，过表达转录因子PbrbZIP15的编码基因或/和PbrXylA1基因提高果实中可溶性糖的含量；所述转录因子PbrbZIP15的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述的PbrXylA1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
12.权利要求1～10中任一中所述的应用，权利要求11中所述的方法，其特征在于，所述的蔷薇科果树为梨。
13.权利要求1～10中任一中所述的应用，权利要求11中所述的方法，其特征在于，所述的可溶性糖为果糖、蔗糖和总糖的至少一种。
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