CN113929759B - 上游调控因子IbERF73及其在调控紫心甘薯IbWD40表达中的应用 - Google Patents

上游调控因子IbERF73及其在调控紫心甘薯IbWD40表达中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了上游调控因子IbERF73及其在调控紫心甘薯IbWD40表达中的应用。本发明以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbWD40的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，成功获得了IbWD40基因的上游调控因子IbERF73。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbWD40启动子与上游调控因子IbERF73之间存在相互作用。亚细胞定位结果显示，IbERF73定位在细胞核。自激活活性实验结果表明，IbERF73具有自激活活性。本发明在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

Description

上游调控因子IbERF73及其在调控紫心甘薯IbWD40表达中的 应用
技术领域
本发明涉及植物基因育种技术领域，具体涉及上游调控因子IbERF73及其在调控紫心甘薯IbWD40表达中的应用。
背景技术
甘薯是重要的粮食、饲料和工业原料作物。紫心甘薯因其块根富含花色素苷呈紫色而得名，是一种特用型甘薯品种类型。花色素苷具有抗氧化和清除自由基的作用、对肝脏和眼睛具有保护作用、对糖尿病具有治疗作用。目前，对于植物的花、果、茎、叶等地上部分花色素苷合成以及环境信号因子影响的分子机制有了一定的认识，尤其是光照对花色素苷合成的调控机制及信号传导过程已比较清楚。对于非依光型或无法直接接受光照的植物根、块根或块茎中花色素苷合成调控机制及信号传递过程却不甚明了。
植物花色素苷的合成和积累是由一系列酶催化形成的，而酶基因的表达是受转录因子的调控，转录因子对合成酶基因的表达调控是植物花色素苷生物合成最为重要的调控环节。参与植物花色素苷合成酶基因调控的转录因子主要有三类：MYB、bHLH和WD40。在不同的甘薯品种或品系的基因组中，IbWD40均不存在内含子，其基因ORF区氨基酸序列没有发生变异，IbWD40在细胞膜、细胞质和细胞核中均存在。IbWD40的表达水平与花色素苷含量的变化趋势一致，并且与花色素苷合成途径中的合成酶基因的表达水平的变化趋势基本相同。初步证明IbWD40是通过调控花色素苷合成途径中一系列合成酶基因的表达影响紫心甘薯中花色素苷的积累。另一方面，植物细胞内外的环境因子(植物激素、糖、光照等)对植物花色素苷的合成是通过转录因子而实现的。因此，转录因子处于植物花色素苷合成调控的核心位置，对转录因子结构、功能以及相互作用的研究是解析植物花色素苷合成和调控机制的关键。寻找转录因子基因启动子结合的上游调控因子或信号因子，无疑将有利于进一步阐明花色素苷在特定时空合成与积累的调控网络。
紫心甘薯作为花色素苷合成和积累部位特殊及具有重要开发价值的植物资源，用其进行非依光型及植物地下部分花色素苷合成的调控机制研究，在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯IbWD40转录因子表达的上游调控因子。
为了解决上述技术问题，本发明首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。
进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Prime
Figure BDA0003359485600000021
Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbWD40的启动子DNA片段，并将启动子IbWD40构建到pAbAi载体中，扩增IbWD40的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：
PIbWD40-F：5'-TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA-3'和
PIbWD40-R：5'-TCTCATACCACCACACCCTAGTGG-3'。
构建的pAbAi-PIbWD40诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
本发明其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi-PIbWD40诱感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbWD40基因表达的上游调控因子为IbERF73。
因此，本发明的第一个目的是提供一种紫心甘薯IbWD40转录因子的上游调控因子IbERF73，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述的上游调控因子IbERF73的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。
本发明的第四个目的是提供一种含有上述的编码基因的转基因细胞系或表达盒。
本发明的第五个目的是提供一种上述的上游调控因子IbERF73的扩增引物，该扩增引物的具体序列如下所示：
IbERF73-F：5'-ATGTGCGGTGGTGCTATAATCTC-3'和
IbERF73-R：5'-TCAGTTTCTTTTGTGGGTTGGTT-3'。
本发明的第六个目的是提供上述的上游调控因子IbERF73在促进紫心甘薯IbWD40转录因子表达中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述的上游调控因子IbERF73在促进植物花色素苷生物合成中的应用。
本发明的第八个目的是提供上述的上游调控因子IbERF73在植物高花色素苷品种选育中的应用。
进一步的，所述的植物为紫心甘薯。
进一步的，为了进一步验证筛选出来的上游调控因子IbERF73与启动子IbWD40结合，将IbERF73构建到pGADT7酵母重组表达载体，将pGADT7-IbERF73酵母重组表达载体质粒与pAbAi-PIbWD40诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳性对照p53AbAi+AD53转化的菌株在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对照pAbAi-PIbWD40+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长。说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而pAbAi-PIbWD40+pGADT7-IbERF73在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长(图1)，说明IbERF73蛋白能结合在启动子IbWD40上。
本发明再次检测了上游调控因子IbERF73是否具有自激活活性，构建pGBKT7-IbERF73融合表达载体，构建成功后将融合表达载体转入酵母Y2HGold，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸缺陷培养基上生长，挑取阳性单克隆点在组氨酸缺陷培养基上培养，结果显示pGBKT7-IbERF73转化的酵母菌株能在组氨酸缺陷培养基上生长，并能使X-α-Gal显现蓝色(图2)。说明IbERF73蛋白具有自激活活性。
进一步的，为了验证启动子IbWD40与其上游转录因子IbERF73的相互作用，本发明将这IbERF73构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK上，将测序成功的重组菌液提取质粒后与PIbWD40+pGreenII0800LUC重组质粒共同转入拟南芥原生质体中。结果显示IbERF73都能够提高IbWD40启动子的活性(图3)，说明IbERF73都能够促进IbWD40的表达。
进一步的，为了明确上游调控因子IbERF73的功能，本发明构建了IbERF73与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbERF73的作用场所进行定位。通过构建亚细胞定位表达载体，瞬时转化拟南芥原生质体后，利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，pCambia1300-GFP作为阳性对照。空载中的GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbERF73蛋白在细胞核中表达(图4)，表明IbERF73是一个典型的转录因子。
本发明的有益效果在于：通过酵母单杂交文库筛选实验，对启动子IbWD40的上游调控因子的筛选中成功获得了其上游调控因子IbERF73。此发明结果在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。
附图说明
图1为IbWD40启动子与其上游调控因子IbERF73回转验证结果。阳性对照为p53AbAi+AD-53，阴性对照为PIbWD40-pAbAi+AD，阳性菌落(PIbWD40-1-pAbAi+IbERF73-AD)说明相应上游调控因子蛋白(IbERF73)能结合在IbWD40启动子上，AD：pGADT7。
图2为IbWD40启动子上游调控因子IbERF73的自激活活性检测。
图3为IbWD40启动子与其上游调控因子IbERF73的相互作用。
图4为IbWD40启动子上游调控因子IbERF73在拟南芥原生质体的亚细胞定位(标尺20μm)。A：绿色荧光图；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
实施例1：构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库
(1)用Trizol法从紫心甘薯(品系A5)块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA。
(2)扩增得到的cDNA要用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit进行纯化处理，使dH2O溶出。
(3)对用限制性内切酶SfiI酶切后cDNA 进行过柱处理，再经过PCI/CI净化处理，最终使ddH2O溶出。
(4)将pGADT7-SfiI vector(clontech,货号630490)与适量过柱后cDNA用DNAligation Kit连接。纯化精制连接液，得到初级cDNA文库。
(5)通过电转化的方法将少量初级文库连接液转入感受态细胞E.coli HST08；鉴定正确后，取适量的菌液涂布在含Amp抗性的LB平板上，37℃培养12h；通过平板上生长的菌落个数，计算初级文库库容。
(6)将扩增菌落进行过夜培养，然后进行质粒提取，得到文库质粒。
实施例2：构建pAbAi-PIbWD40诱饵载体
(1)以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Prime
Figure BDA0003359485600000061
Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbWD40的启动子DNA片段，扩增IbWD40的启动子DNA片段的PCR引物对的序列为PIbWD40-F：5'-TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA-3'和PIbWD40-R：5'-TCTCATACCACCACACCCTAGTGG-3'。反应体系(20μL)如下：
Figure BDA0003359485600000071
PCR反应条件为：
Figure BDA0003359485600000072
(2)将启动子IbWD40(序列如SEQ ID NO.3所示)构建到pAbAi载体(柯蕾生物科技有限公司，货号kl-zl-0879)，步骤为：使用TaKaRa限制性内切酶QuickCutTM Hind III和QuickCutTM SmaⅠ对pAbAi质粒进行双酶切，合成引物序列见表2中的PW1F/PW1R，反应条件为37℃，酶切3h以上，反应体系如下：
Figure BDA0003359485600000073
Figure BDA0003359485600000081
经电泳检测正确的酶切产物进行切胶回收。
使用Clon Express II One Step Cloning Kit试剂盒(Vazyme)将目的片段和表达载体进行连接，反应条件为37℃，连接30min。反应体系如下：
Figure BDA0003359485600000082
(3)连接产物用于后续转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl2法)：
(1)接种大肠杆菌DH5α到5mL的LB液体培养基中，在37℃下220rpm振荡培养过夜。
(2)转移过夜培养的2mL菌液到100mL的LB液体培养基中，继续振荡培养至OD600到0.5左右，冰上放置30min。
(3)取1mL菌液到到新的1.5mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液。
(4)用移液枪吸取1mL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，轻吹混匀，冰上放置30min。
(5)4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液，用移液枪吸取0.2mL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰上放置5h即可用于转化。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：
(1)取上述制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞100μL到新的1.5mL离心管，于超净工作台中加入10μL的DNA连接产物，轻弹混匀后在冰上放置30min。
(2)将转化产物于42℃水浴锅中热激90s，取出立刻至于冰上5min。
(3)加入1mL不含抗性的LB液体培养基，37℃下180rpm振荡培养60～90min。
(4)室温5000rpm离心4min，在无菌条件下用移液枪吸走900μL上清液，轻吹重悬剩余200μL液体。
(5)将菌液均匀涂布于含有Amp的LB固体培养基中，放置30min晾干。
(6)37℃培养箱倒置培养12～16h。
阳性克隆的筛选与测序鉴定：
从培养皿上用无菌小枪头挑取抗性单菌落于含抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养4h，取2μL上述菌液作为模板进行菌落PCR检测。取PCR反应中扩增得到与目的片段大小一致的阳性菌种的菌液200μL，送至上海生工生物有限公司进行测序。测序正确的菌液中加入20％的灭菌甘油于1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存，提取pAbAi-PIbWD40诱饵质粒。
实施例3：pAbAi-PIbWD40诱饵菌株自激活检测
将pAbAi-PIbWD40诱饵质粒转化Y1H酵母菌，得到诱饵菌株。采用自激活试验测试抑制诱饵菌株的最低AbA浓度，观察它们在SD/-Ura固体培养基上的生长情况，诱饵菌株自激活检测及最低AbA浓度的确定方法如下：
(1)AbA母液的配制：1mL无水乙醇溶解1mg AbA，配制成1mg/mL的AbA母液，于4℃下避光保存。
(2)从Y1H[pAbAi-prey]和Y1H[p53AbAi]的培养皿中挑取较大的单克隆菌落，用10μL的0.9％NaCl溶液重悬菌液，将重悬溶液稀释成10-1、10-2和10-3浓度梯度。
(3)吸取10μL重悬菌液点在SD/-Ura，SD/-Ura/AbA(100ng/mL～1000ng/mL)培养基上。
(4)若在某一浓度下菌落Y1H[pAbAi-prey]不生长，而对照组Y1H[p53AbAi]正常生长，则此浓度为抑制该重组酵母菌株的最低AbA浓度，可用于后续实验。
注：pAbAi-prey即为pAbAi-PIbWD40。
经检测，确定pAbAi-PIbWD40诱饵菌株的自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
实施例4：酵母单杂交文库筛选
酵母单杂交文库筛选方法按照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
(1)取25μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。
(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒(实施例1得到)，600μL Y1HGold感受态细胞(含诱饵表达载体pAbAi-PIbWD40)，涡旋混匀。
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8mL 0.9％NaCl溶液，重悬菌体。
(7)吸取200μL转化后的酵母菌液，均匀涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA培养皿上，AbA浓度为抑制自激活最低浓度(即300ng/mL)。
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定方法参考实施例2，选用通用引物pGADT7F/R对菌液进行PCR检测，pGADT7F/R引物序列见表1，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分析。
表1主要载体通用引物
Figure BDA0003359485600000111
通过酵母单杂交的方法筛选得到了紫心甘薯IbWD40基因表达的上游调控因子为IbERF73，该上游调控因子IbERF73的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。并设计了上游调控因子IbERF73的扩增引物为IbERF73-F：5'-ATGTGCGGTGGTGCTATAATCTC-3'和IbERF73-R：5'-TCAGTTTCTTTTGTGGGTTGGTT-3'。
实施例5：上游调控因子IbERF73与启动子IbWD40结合的验证
将IbERF73构建到pGADT7酵母重组表达载体(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-1639)，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的IbERF73-ADF/IbERF73-ADR，构建方法参考实施例2。将pGADT7-IbERF73酵母重组表达载体质粒与pAbAi-PIbWD40诱饵载体共同转化Y1HGold单杂交酵母菌株中进行酵母单杂交实验。
酵母单杂交文库筛选方法按照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
(1)取25μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。
(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒，600μL Y1HGold感受态细胞，涡旋混匀。
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8mL 0.9％NaCl溶液，重悬菌体。
(7)吸取200μL转化后的酵母菌液，均匀涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA培养皿上，AbA浓度为抑制自激活最低浓度(即300ng/mL)。
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选用通用引物pGADT7F/R(序列见表1)，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分析。
结果发现：阳性对照p53AbAi+AD-53(即在pAbAi载体插入阳性对照53基因序列得到p53AbAi，在pGADT7载体插入阳性对照53基因序列得到AD-53，构建方法参考实施例2)转化的菌株能够在SD/-Leu/AbA培养基上生长；而阴性对照pAbAi-PIbWD40+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长；说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。pAbAi-PIbWD40+pGADT7-IbERF73能够在SD/-Leu/AbA培养基上生长(图1)，说明IbERF73蛋白能结合在启动子IbWD40上。
实施例6：检测上游调控因子IbERF73的自激活活性
将IbERF73导入pGBKT7质粒(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-8123)中，构建pGBKT7-IbERF73融合表达载体，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的IbERF73-BDF/IbERF73-BDR，构建方法参考实施例2。构建成功后将融合表达载体转入Y2HGold酵母菌株，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸缺陷培养基(Takara Cat#630413)上生长，挑取阳性单克隆点在组氨酸缺陷培养基(即SD/-His/ABA/X-α-Gal plus培养基，Takara Cat#630415)上培养，结果显示pGBKT7-IbERF73转化的酵母菌株能在组氨酸缺陷培养基上生长，并能使X-α-Gal显现蓝色(图2)。以上结果说明IbERF73蛋白具有自激活活性。
实施例7：双荧光素酶报告系统载体的构建
将上游调控因子IbERF73的基因序列构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK(上海钦城生物科技有限公司，货号QCP0465)上，称之为效应质粒，将PIbWD40插入到载体pGreenII0800-LUC(柯蕾生物科技有限公司，货号kl-zl-0808)荧光素酶的前端作为报告质粒。选择pGreenII 0029 62-SK载体中Sac I和Xho I及pGreenII 0800-LUC载体中的Kpn I和Nco I作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2中的IbPW1 0800F/IbPW10800R以及IbERF73-62-SKF/IbERF73-62-SKR，构建方法参考实施例2。
实施例8：拟南芥原生质体的制备及转化
1、拟南芥原生质体的制备步骤如下：
(1)配制酶解液于55℃水浴锅中预热。
(2)选择四周后抽苔前的野生型拟南芥叶片，将叶片下表皮撕掉后迅速放入酶解液中。
(3)25℃，50rpm避光振荡酶解50min，至叶肉细胞酶解完全，可在显微镜下观察原生质体的形态，当细胞较圆、透亮时状态比较好。
(4)用等体积的W5溶液稀释酶液，轻轻混匀，用清水洗干净75μm的尼龙网布，然后将其用W5溶液浸湿后过滤原生质体。
W5溶液的配制(100mL)：
Figure BDA0003359485600000141
Figure BDA0003359485600000151
(5)800rpm离心2min，尽量吸去上清，用1mL W5溶液重悬原生质体(重复此步骤三次)。
(6)将原生质体重悬于1mL W5溶液中，然后冰上放置30min备用。
2、拟南芥原生质体的转化步骤如下：
(1)2mL EP管中加入10～20μg的目的质粒(实施例7构建的IbERF73-pGreenII002962-SK重组质粒和PIbWD40-pGreenII 0800-LUC重组质粒)，加入100μL的拟南芥原生质体，轻轻混匀，加完后立即放冰上。
(2)加入110μL PEG/CaCl2，轻弹离心管使之混匀，室温孵育10min。
(3)在冰上加入220μL W5溶液，颠倒离心管使其混匀，冰上放置1min。
(4)再次向离心管加440μL W5溶液，轻轻颠倒，冰上放置1min。
(5)最后向离心管加880μL W5溶液，颠倒混匀，冰上放置1min。
(6)4℃800rpm离心3min，吸去上清。
(7)原生质体用500μL W5溶液重悬，22℃黑暗条件下培养16～20h。
实施例9：双荧光素酶报告系统的检测
使用Dual-
Figure BDA0003359485600000152
Reporter Assay(Promega)检测LUC和REN两种荧光素酶活性，具体步骤如下：
(1)100μL 1×PLB裂解液的制备：20μL 5×Passive Lysis Buffer加水至100μL。10mL LAR II的制备：吸取10mL冰上融化的Luciferase Assay Buffer II加入到Luciferase Assay Substrate中，轻轻摇晃使之溶解(-20℃可放置一个月，–70℃可放置一年)。100μL Stop&
Figure BDA0003359485600000161
Reagent的制备：吸取100μL Stop&
Figure BDA0003359485600000162
Buffer，加入2μL 50×Stop&
Figure BDA0003359485600000163
Substrate，可稍微涡旋使其混匀(在-20℃可放置15d)。
(2)取实施例8转化后的拟南芥原生质体溶液，4℃，13200rpm离心90s，除去W5溶液。
(3)加入100μL 1×PLB裂解液，轻轻吹打混匀后转移至24孔板中，置于水平摇床，室温低速晃动15min。
(4)收集裂解液，转移至1.5mL离心管中，4℃13200rpm离心10min，取上清液60μL置冰上待测荧光素酶。
(5)避光条件下，在黑色的96孔酶标板中加入100μL LAR II，然后加入20μL细胞裂解液，用枪头轻轻混匀2～3次，避免产生气泡。
(6)放入酶标仪中检测LUC的酶活性，并记录数据。
(7)取出96孔板，在同一孔中加入100μL Stop&
Figure BDA0003359485600000164
Reagent，用枪头轻轻混匀2～3次，整个操作过程要避免强光照射。
(8)放入酶标仪中检测REN的酶活性并记录数据。
(9)实验重复3次，取平均值，通过对比不同样品的LUC/REN的比值，检测转录因子对启动子的激活作用。
结果显示：IbERF73能够提高IbWD40启动子的活性(图3)，说明IbERF73能够促进IbWD40的表达。
实施例10：明确上游调控因子IbERF73的功能
构建了IbERF73与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbERF73的作用场所进行定位。将上游调控因子IbERF73的基因序列构建到亚细胞定位表达载体pCambia1300(上海联迈生物工程有限公司，货号LM1375)上，选择pCambia1300载体中BamHⅠ和HindⅡ作为目的片段插入的酶切位点，设计包含起始密码子不包含终止密码子的特定引物，合成引物序列见表2中的IbERF73-1300F/IbERF73-1300R，构建方法参考实施例2。然后将IbERF73-pCambia1300瞬时转化拟南芥原生质体后，利用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位情况，以pCambia1300-GFP作为阳性对照。空载中的GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbERF73蛋白在细胞核中表达(图4)，表明IbERF73是一个典型的转录因子。
表2构建载体使用引物序列(下划线为酶切位点)
Figure BDA0003359485600000171
Figure BDA0003359485600000181
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省科学院南繁种业研究所
<120> 上游调控因子IbERF73及其在调控紫心甘薯IbWD40表达中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 271
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 1
Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asp Ile Lys Pro Pro Val Arg Thr
1 5 10 15
Ser Arg Arg Leu Thr Ser Glu Leu Leu Trp Gly Ser Ala Asp Arg Ser
20 25 30
Ser Ala Gly Gly Lys Lys Lys Lys Asn Phe Ala Gly Ser Tyr Tyr Ser
35 40 45
Gly Gly Leu Arg Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp Asn Glu Phe Glu Ala
50 55 60
Asp Phe Gln Asp Phe Asn Asp Tyr Asp Asp Asp Glu Gly Val Glu Leu
65 70 75 80
Asp Val Lys Pro Phe Pro Phe Gly Leu Ser Ser Gly Phe Ser Ser Asp
85 90 95
Ser Lys Asp Phe Asp Gln Ser Met Lys Arg Lys Arg Lys Asn Gln Tyr
100 105 110
Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Arg Leu Lys Ser Val
115 120 125
Ile Arg Val Lys Val Leu Glu Ser Gly Glu Leu Ser Thr Leu Leu Lys
130 135 140
Lys Leu Arg Glu Pro Met Ile Leu Arg Leu Gly Gly Ser Glu Ala Thr
145 150 155 160
Lys Leu Ser Ile Ser Leu Leu Lys Leu Lys Gln Asn Arg Leu Gly Ala
165 170 175
Pro Ser Arg Ile His Gly Arg Trp Phe Leu Arg Arg Ile Asn Leu Met
180 185 190
Arg Val Thr Trp Thr Ile Ala Ile Met Ile Leu Val Phe Trp Asn Lys
195 200 205
Asn Arg Gln Asn Cys Thr Ile Pro Trp Glu Ile Trp Asp Cys Tyr Leu
210 215 220
Val Met Gln Thr Phe Ile Ser Phe Trp Trp Lys Gln Phe Leu Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Ala Trp Phe Glu Asp Ser Arg Asp Ile Leu Cys Ser Val Gly Trp
245 250 255
Cys Ser Asp Ser Val His Ser Gly Asn Gln Pro Thr Lys Glu Thr
260 265 270
<210> 2
<211> 845
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 2
atgtgcggtg gtgctataat ctccgatatc aaaccgccgg tgcggacgtc gcgccggctg 60
acctctgagt tgctgtgggg aagcgctgat cggagcagcg caggtgggaa gaagaagaag 120
aattttgctg gaagttacta ttccggaggc ctgcgatccg cggcttttga cctcgataat 180
gaattcgagg ctgattttca ggacttcaat gactatgatg atgatgaggg cgtagagttg 240
gacgtcaaac ccttcccttt cggactctct tccggtttca gctcggattc aaaggacttt 300
gaccaatcta tgaagagaaa gaggaaaaat cagtacaggg ggatcaggca gcgtccttgg 360
ggcaaatggc ggctgaaatc cgtgatccga gtaaaggtgt tagagtctgg ctaggaactt 420
tcgacactgc tgaagaagct gcgagagcct atgatactga ggctcggagg atcagaggca 480
acaaagctaa gttgaatttc cctgctgaaa ctcaagcaaa atcgtctagg cgcaccgtca 540
aggtgaatcc atggaaggtg gttcctaaga cggatcaacc tgatgcgagt aacatggaca 600
atagctatta tgatcctatg agtgttttgg aacaaaaacc gccagtgaaa ctgtacgatt 660
ccgtgggaga tatgggactg ctatctggtg atgcaaacct ttatttcatt ctgatggtgg 720
aagcaattcc ttggactgta ttgagcatgg ttcgaggact ccagagatat cctctgctct 780
gtcggctggt gttgaagctg atgagattca gttcattcag gaaaccaacc cacaaaagaa 840
actga 845
<210> 3
<211> 1135
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 3
tcctagccaa gaagagtgga gagaggtgga gcccatgcat ggaatcaagg acaagtaatt 60
aaatcctaat tacttataca ataccaccta atatttcttt gaataatact agcctttgaa 120
tattactaat ctcgtaaact tctaatgtgt ttggtctttg attggggacc atttccaagc 180
acatccttat caactttaat aaaataaatc atcacttaaa atttgagtta attaataata 240
ataagtaatt agagacaaag ttcaatgttt attgtccttt ttgagtaatt tacgctagtt 300
acatcttcaa cgtttctttg ttgttgtttg tgctggatat tgtatgattt gcttgcatat 360
attgtaaagt ttttatgtga aaataacagt atttacgtga aaacaatcag acaacgtttt 420
ataagagttg ttatatgggt gaattgcaaa tttgcaatgc attgatgaat tacaagaaaa 480
gtgggagaga ttgagagtga aatgatgaga cagctaccaa tttgaatcca ctagggtgtg 540
gtggtatgag atatgagatc gaacacaaag ttgaaatatg taattaagtg aaagaacagg 600
gtatgaaggt catttaggat gcttattggg ccggttaact tgatggatag taagagaaat 660
aagcccaata gctccttgtc ccatagttat accatggacc tgattctcga gtccacattg 720
taatgtaaac ccataactat ttagtattta cgtactgaat attcacaatt taaaatttta 780
cttaccgaat attcacaatt taaattataa acatttaata tgtaaattgt gtatttttaa 840
ctcgaactcg ggttcacgga ataatttgtc attccggccc aaattactga gtcaaggccc 900
aaagctgtca agaatgactg ggaaaaggct gagtcaatcg acgcgttata actcattatc 960
acatgttctt cacaatcaca gttctctctc gggttattta agccaccggc gagccaactt 1020
ccggtcagaa aacggccggc gatttggagg aaagatcgaa tttttaaccc attatccttc 1080
aattcaaaga tggagaactc aacccaagga tcgaatctta gatccgagaa ttccg 1135

Claims (9)

1.一种紫心甘薯IbWD40转录因子的上游调控因子IbERF73，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述的紫心甘薯IbWD40转录因子的上游调控因子IbERF73的基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或重组菌。
5.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒。
6. 一种权利要求1所述的紫心甘薯IbWD40转录因子的上游调控因子IbERF73的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbERF73-F：5'-ATGTGCGGTGGTGCTATAATCTC -3'和IbERF73-R：5'-TCAGTTTCTTTTGTGGGTTGGTT-3'。
7.权利要求1所述的上游调控因子IbERF73在促进紫心甘薯IbWD40转录因子表达中的应用。
8.权利要求1所述的上游调控因子IbERF73在促进紫心甘薯花色素苷生物合成中的应用。
9.权利要求1所述的上游调控因子IbERF73在紫心甘薯高花色素苷品种选育中的应用。
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