CN114133438B

CN114133438B - 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用

Info

Publication number: CN114133438B
Application number: CN202111549083.6A
Authority: CN
Inventors: 齐永文; 付丹文; 樊丽娜
Original assignee: Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy Of Sciences
Current assignee: Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy Of Sciences
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114133438A

Abstract

本发明公开了一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3‑2及其应用。本发明以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbMYB1的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，获得了IbMYB1基因的上游调控因子IbEIN3‑2。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbMYB1启动子与上游调控因子IbEIN3‑2之间存在相互作用。本发明在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

Description

一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用

技术领域

本发明涉及植物遗传与变异的分子机制领域，具体涉及一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用。

背景技术

甘薯是一年生或多年生的旋花科甘薯属根茎类草本植物，是全球最重要的粮食作物之一，它已经在100多个国家栽植。我国的甘薯种植面积达660万公顷，产量为1亿吨，占世界甘薯总产量的70％。

花青素相关的结构基因的表达主要受到IbMYB1基因启动子的调控。已有学者研究发现IbMYB1受到光、激素等环境因子的调控，但由于甘薯块根是深埋于地下的不见光部分。IbMYB1启动子可能受到其它还未发现的基因对它的调控，从而参与花青素的合成途径。研究发现，在心里美萝卜中，RsMYB1启动子上游存在7372bp的CACTA类型转座子，其在心里美萝卜肉色形成中发挥重要作用，同时高度甲基化的转座子扩散到RsMYB1启动子区域，使该基因的表达受到抑制，阻断花青苷的合成，形成白肉突变体。在玉米中，MYB1启动子和PL1蛋白相互作用，能够使果皮和淀粉层合成花青素。在荔枝中，LcbHLH1和LcbHLH3蛋白分别与LcMYB1启动子相互作用，调节花色素苷生物合成结构基因DFR和ANS的表达,进而促进花色素苷的生物合成。由此可见，MYB1启动子通过与某些蛋白相互作用，调控花青素的合成，因此寻找MYB1启动子在花青素合成途径中的互作蛋白具有重大意义。

转录因子MYB、bHLH(Basic helix-loop-helix)和WD40参与调控植物花色素苷合成。MYB常与bHLH和WD40蛋白形成“MBW”蛋白三元复合体其作用，通过形成复合体共同促进下游花色素苷合成途径关键结构基因表达，从而促进花色素苷合成。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于筛选紫心甘薯IbMYB1表达的上游调控因子。

为了解决上述技术问题，本发明首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。

进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶

Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbMYB1的启动子DNA片段，并将启动子IbMYB1构建到pAbAi载体中，扩增IbMYB1的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：

PIbMYB1-F：5'-TATTGCTCTCAATGTGCAAGAATCA-3'和

PIbMYB1-R：5'-TTTGATACGCATACCTTATGCCTAA-3'。

构建的pAbAi-PIbMYB1诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。

本发明其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi-PIbMYB1感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbMYB1基因表达的上游调控因子为IbEIN3-2。

因此，本发明的第一个目的是提供一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述的编码基因的转基因细胞系或表达盒。

本发明的第五个目的是提供一种上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2的扩增引物，该扩增引物的具体序列如下所示：

IbEIN3-2-F：5'-ATGGCTTCGGAGGACGTGAAGGCTG-3'和

IbEIN3-2-R：5'-TCAGTCCGATATTTTGATCTCAACTCCCAA-3'。

本发明的第六个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2在促进甘薯IbMYB1转录因子表达中的应用。

本发明的第七个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2在促进甘薯花色素苷生物合成中的应用。

本发明的第八个目的是提供上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2在甘薯色素性状分子定向育种中应用，优选的，是在甘薯高花色素苷品种选育中的应用。

本发明人通过酵母单杂交的方法从cDNA文库中筛选出促进IbMYB1表达的上游调控因子包括IbERF1、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4和IbEIN3-2，但是不同上游调控因子的作用位点不同。IbMYB1启动子分成四段，第二和第三段具有控制不住的自激活活性，其中IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4和IbEIN3-2作用位点在第一段(位于启动子的前面)，而IbERF1作用位点在第四段(位于启动子的后面)。

进一步的，为了进一步验证筛选出来的上游调控因子IbEIN3-2与启动子IbMYB1结合，将IbEIN3-2构建到pGADT7酵母重组表达载体，选择载体中EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2。将pGADT7-IbEIN3-2酵母重组表达载体质粒与pAbAi-PIbMYB1诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳性对照p53AbAi+AD53转化的菌株在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对照pAbAi-PIbMYB1+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长。说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而pAbAi-PIbMYB1+pGADT7-IbEIN3-2在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长(图1)，说明IbEIN3-2蛋白能结合在启动子IbMYB1上。

本发明再次检测了上游调控因子IbEIN3-2是否具有自激活活性，构建pGBKT7-IbEIN3-2融合表达载体，构建成功后将融合表达载体转入酵母Y2HGold，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸缺陷培养基上生长，挑取阳性单克隆点在组氨酸缺陷培养基上培养，结果显示pGBKT7-IbEIN3-2转化的酵母菌株能在组氨酸缺陷培养基上生长，并能使3AT-α-Gal显现蓝色(图2)。说明IbEIN3-2蛋白具有自激活活性。

进一步的，为了验证启动子IbMYB1与其上游转录因子IbEIN3-2的相互作用，本发明将IbEIN3-2构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK上，将PIbMYB1插入到载体pGreenII0800-LUC荧光素酶的前端作为报告质粒，选择pGreenII 0029 62-SK载体中Sac I和Xho I及pGreenII 0800-LUC载体中的Kpn I和Nco I作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2。将测序成功的重组菌液提取质粒后与PIbMYB1+pGreenII 0800LUC重组质粒共同转入拟南芥原生质体中。结果显示IbEIN3-2能够提高IbMYB1启动子的活性(图3)，说明IbEIN3-2能够促进IbMYB1的表达。

进一步的，为了明确上游调控因子IbEIN3-2的功能，本发明构建了IbEIN3-2与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbEIN3-2的作用场所进行定位。亚细胞定位载体是C17GFP，根据载体和互作蛋白的关键位点选择限制性内切酶，用SmaI进行单酶切。设计包含起始密码子而去掉终止密码子的特定引物，构建C17GFP亚细胞表达载体上，并通过转化拟南芥原生质体瞬时表达蛋白，观察目的基因蛋白的亚细胞定位。合成引物序列见表2，空载中的GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbEIN3-2蛋白在细胞核中表达(图4)，表明IbEIN3-2是一个典型的转录因子。

本发明的有益效果在于：通过酵母单杂交文库筛选实验，对启动子IbMYB1的上游调控因子的筛选中成功获得了其上游调控因子IbEIN3-2。此发明结果在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

附图说明

图1为IbMYB1启动子与其上游调控因子IbEIN3-2回转验证结果。阳性对照为p53AbAi+AD-53，阴性对照为PIbMYB1-pAbAi+AD，阳性菌落(PIbMYB1-pAbAi+IbEIN3-2-AD)说明相应上游调控因子蛋白(IbEIN3-2)能结合在IbMYB1启动子上，AD：pGADT7。

图2为IbMYB1启动子上游调控因子IbEIN3-2的自激活活性检测。

图3为IbMYB1启动子与其上游调控因子IbEIN3-2的相互作用。

图4为IbMYB1启动子上游调控因子IbEIN3-2在拟南芥原生质体的亚细胞定位(标尺20μm)。A：绿色荧光图；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。

实施例1：构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库

(1)用Trizol法从紫心甘薯(品系A5)块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA。

(2)扩增得到的cDNA要用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit进行纯化处理，使dH₂O溶出。

(3)对用限制性内切酶SfiI酶切后cDNA进行过柱处理，再经过PCI/CI净化处理，最终使ddH₂O溶出。

(4)将pGADT7-SfiI vector(clontech,货号630490)与适量过柱后cDNA用DNAligation Kit连接。纯化精制连接液，得到初级cDNA文库。

(5)通过电转化的方法将少量初级文库连接液转入感受态细胞E.coli HST08；鉴定正确后，取适量的菌液涂布在含Amp抗性的LB平板上，37℃培养12h；通过平板上生长的菌落个数，计算初级文库库容。

(6)将扩增菌落进行过夜培养，然后进行质粒提取，得到文库质粒。

实施例2：构建pAbAi-PIbMYB1诱饵载体

(1)以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶

Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbMYB1的启动子DNA片段，扩增IbMYB1的启动子DNA片段的PCR引物对的序列为PIbMYB1-F：5'-TATTGCTCTCAATGTGCAAGAATCA-3'和PIbMYB1-R：5'-TTTGATACGCATACCTTATGCCTAA-3'。反应体系(20μL)如下：

PCR反应条件为：

(2)将启动子IbMYB1(序列如SEQ ID NO.3所示)构建到pAbAi载体(柯蕾生物科技有限公司，货号kl-zl-0879)，步骤为：使用TaKaRa限制性内切酶QuickCut^TM Hind III和QuickCut^TM Sma Ⅰ对pAbAi质粒进行双酶切，合成引物序列见表2中的PM1-F/PM1-R，反应条件为37℃，酶切3h以上，反应体系如下：

经电泳检测正确的酶切产物进行切胶回收。

使用Clon Express II One Step Cloning Kit试剂盒(Vazyme)将目的片段和表达载体进行连接，反应条件为37℃，连接30min。反应体系如下：

(3)连接产物用于后续转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl₂法)：

(1)接种大肠杆菌DH5α到5mL的LB液体培养基中，在37℃下220rpm振荡培养过夜。

(2)转移过夜培养的2mL菌液到100mL的LB液体培养基中，继续振荡培养至OD₆₀₀到0.5左右，冰上放置30min。

(3)取1mL菌液到到新的1.5mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液。

(4)用移液枪吸取1mL预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，轻吹混匀，冰上放置30min。

(5)4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液，用移液枪吸取0.2mL预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰上放置5h即可用于转化。

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：

(1)取上述制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞100μL到新的1.5mL离心管，于超净工作台中加入10μL的DNA连接产物，轻弹混匀后在冰上放置30min。

(2)将转化产物于42℃水浴锅中热激90s，取出立刻至于冰上5min。

(3)加入1mL不含抗性的LB液体培养基，37℃下180rpm振荡培养60～90min。

(4)室温5000rpm离心4min，在无菌条件下用移液枪吸走900μL上清液，轻吹重悬剩余200μL液体。

(5)将菌液均匀涂布于含有Amp的LB固体培养基中，放置30min晾干。

(6)37℃培养箱倒置培养12～16h。

阳性克隆的筛选与测序鉴定：

从培养皿上用无菌小枪头挑取抗性单菌落于含抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养4h，取2μL上述菌液作为模板进行菌落PCR检测。取PCR反应中扩增得到与目的片段大小一致的阳性菌种的菌液200μL，送至上海生工生物有限公司进行测序。测序正确的菌液中加入20％的灭菌甘油于1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存。

实施例3：pAbAi-PIbMYB1诱饵菌株自激活检测

将pAbAi-PIbMYB1诱饵质粒转化Y1H酵母菌，得到诱饵菌株。采用自激活试验测试抑制诱饵菌株的最低AbA浓度，观察它们在SD/-Ura固体培养基上的生长情况，诱饵菌株自激活检测及最低AbA浓度的确定方法如下：

(1)AbA母液的配制：1mL无水乙醇溶解1mg AbA，配制成1mg/mL的AbA母液，于4℃下避光保存。

(2)从Y1H[pAbAi-prey]和Y1H[p53AbAi]的培养皿中挑取较大的单克隆菌落，用10μL的0.9％NaCl溶液重悬菌液，将重悬溶液稀释成10^-1、10^-2和10^-3浓度梯度。

(3)吸取10μL重悬菌液点在SD/-Ura，SD/-Ura/AbA(100ng/mL～1000ng/mL)培养基上。

(4)若在某一浓度下菌落Y1H[pAbAi-prey]不生长，而对照组Y1H[p53AbAi]正常生长，则此浓度为抑制该重组酵母菌株的最低AbA浓度，可用于后续实验。

注：pAbAi-prey即为pAbAi-PIbMYB1。

经检测，确定pAbAi-PIbMYB1诱饵菌株的自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。

实施例4：酵母单杂交文库筛选

酵母单杂交文库筛选方法按照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：

(1)取25μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟，待温度降至4℃(重复一次)。

(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒(实施例1得到)，600μL Y1HGold感受态细胞(含诱饵表达载体pAbAi-PIbMYB1)，涡旋混匀。

(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。

(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。

(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。

(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8mL 0.9％NaCl溶液，重悬菌体。

(7)吸取200μL转化后的酵母菌液，均匀涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA培养皿上，AbA浓度为抑制自激活最低浓度(即300ng/mL)。

(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。

挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定方法参考实施例2，选用通用引物pGADT7F/R对菌液进行PCR检测，pGADT7F/R引物序列见表1，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分析。

表1主要载体通用引物

通过酵母单杂交的方法筛选得到了紫心甘薯IbMYB1基因表达的上游调控因子为IbEIN3-2，该上游调控因子IbEIN3-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQID NO.2所示。并设计了上游调控因子IbEIN3-2的扩增引物为IbEIN3-2-F：5'-ATGGCTTCGGAGGACGTGAAGGCTG-3'和IbEIN3-2-R：5'-TCAGTCCGATATTTTGATCTCAACTCCCAA-3'。

实施例5：上游调控因子IbEIN3-2与启动子IbMYB1结合的验证

将IbEIN3-2构建到pGADT7酵母重组表达载体(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-1639)，选择载体中EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的IbEIN3-2-ADF/IbEIN3-2-ADR，构建方法参考实施例2。将pGADT7-IbEIN3-2酵母重组表达载体质粒与pAbAi-PIbMYB1诱饵载体共同转化Y1HGold单杂交酵母菌株中进行酵母单杂交实验。

(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒，600μL Y1HGold感受态细胞，涡旋混匀。

(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。

(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。

(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。

挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选用通用引物pGADT7F/R(序列见表1)，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分析。

结果发现：阳性对照p53AbAi+AD-53(即在pAbAi载体插入阳性对照53基因序列(Gene ID:2768677)得到p53AbAi，在pGADT7载体插入阳性对照53基因序列得到AD-53，构建方法参考实施例2)转化的菌株能够在SD/-Leu/AbA培养基上生长；而阴性对照pAbAi-PIbMYB1+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长；说明该酵母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。pAbAi-PIbMYB1+pGADT7-IbEIN3-2能够在SD/-Leu/AbA培养基上生长(图1)，说明IbEIN3-2蛋白能结合在启动子IbMYB1上。

实施例6：检测上游调控因子IbEIN3-2的自激活活性

将IbEIN3-2导入pGBKT7质粒(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-8123)中，构建pGBKT7-IbEIN3-2融合表达载体，选择载体中EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2中的IbEIN3-2-BDF/IbEIN3-2-BDR，构建方法参考实施例2。构建成功后将融合表达载体转入Y2HGold酵母菌株，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸缺陷培养基(Takara Cat#630413)上生长，挑取阳性单克隆点在含GAL和3AT的组氨酸缺陷培养基(即SD/-His/-3AT-a-Gal plus培养基，该培养基是在组氨酸缺陷培养基(Takara Cat#630415)和SD基础培养基(Takara Cat#630411)混合基础上添加GAL显色剂和3AT抑制剂制备得到的)上培养，结果显示pGBKT7-IbEIN3-2转化的酵母菌株能在含GAL和3AT的组氨酸缺陷培养基上生长，并能使3AT-α-Gal显现蓝色(图2)。以上结果说明IbEIN3-2蛋白具有自激活活性。

实施例7：双荧光素酶报告系统载体的构建

将上游调控因子IbEIN3-2的基因序列构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK(上海钦城生物科技有限公司，货号QCP0465)上，称之为效应质粒，将PIbMYB1插入到载体pGreenII 0800-LUC(柯蕾生物科技有限公司，货号kl-zl-0808)荧光素酶的前端作为报告质粒。选择pGreenII 0029 62-SK载体中Sac I和Xho I及pGreenII 0800-LUC载体中的KpnI和Nco I作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2中的IbPM1-0800F/IbPM1-0800R以及IbEIN3-2-62-SKF/IbEIN3-2-62-SKR，构建方法参考实施例2。

实施例8：拟南芥原生质体的制备及转化

1、拟南芥原生质体的制备步骤如下：

(1)配制酶解液于55℃水浴锅中预热。

(2)选择四周后抽苔前的野生型拟南芥叶片，将叶片下表皮撕掉后迅速放入酶解液中。

(3)25℃，50rpm避光振荡酶解50min，至叶肉细胞酶解完全，可在显微镜下观察原生质体的形态，当细胞较圆、透亮时状态比较好。

(4)用等体积的W5溶液稀释酶液，轻轻混匀，用清水洗干净75μm的尼龙网布，然后将其用W5溶液浸湿后过滤原生质体。

W5溶液的配制(100mL)：

(5)800rpm离心2min，尽量吸去上清，用1mL W5溶液重悬原生质体(重复此步骤三次)。

(6)将原生质体重悬于1mL W5溶液中，然后冰上放置30min备用。

2、拟南芥原生质体的转化步骤如下：

(1)2mL EP管中加入10～20μg的目的质粒(实施例7构建的IbEIN3-2-pGreenII002962-SK重组质粒和PIbMYB1-pGreenII 0800-LUC重组质粒)，加入100μL的拟南芥原生质体，轻轻混匀，加完后立即放冰上。

(2)加入110μL PEG/CaCl₂，轻弹离心管使之混匀，室温孵育10min。

(3)在冰上加入220μL W5溶液，颠倒离心管使其混匀，冰上放置1min。

(4)再次向离心管加440μL W5溶液，轻轻颠倒，冰上放置1min。

(5)最后向离心管加880μL W5溶液，颠倒混匀，冰上放置1min。

(6)4℃ 800rpm离心3min，吸去上清。

(7)原生质体用500μL W5溶液重悬，22℃黑暗条件下培养16～20h。

实施例9：双荧光素酶报告系统的检测

使用Dual-

Reporter Assay(Promega)检测LUC和REN两种荧光素酶活性，具体步骤如下：

(1)100μL 1×PLB裂解液的制备：20μL 5×Passive Lysis Buffer加水至100μL。10mL LAR II的制备：吸取10mL冰上融化的Luciferase Assay Buffer II加入到Luciferase Assay Substrate中，轻轻摇晃使之溶解(-20℃可放置一个月，–70℃可放置一年)。100μL Stop&

Reagent的制备：吸取100μL Stop&

Buffer，加入2μL 50×Stop&

Substrate，可稍微涡旋使其混匀(在-20℃可放置15d)。

(2)取实施例8转化后的拟南芥原生质体溶液，4℃，13200rpm离心90s，除去W5溶液。

(3)加入100μL 1×PLB裂解液，轻轻吹打混匀后转移至24孔板中，置于水平摇床，室温低速晃动15min。

(4)收集裂解液，转移至1.5mL离心管中，4℃13200rpm离心10min，取上清液60μL置冰上待测荧光素酶。

(5)避光条件下，在黑色的96孔酶标板中加入100μL LAR II，然后加入20μL细胞裂解液，用枪头轻轻混匀2～3次，避免产生气泡。

(6)放入酶标仪中检测LUC的酶活性，并记录数据。

(7)取出96孔板，在同一孔中加入100μL Stop&

Reagent，用枪头轻轻混匀2～3次，整个操作过程要避免强光照射。

(8)放入酶标仪中检测REN的酶活性并记录数据。

(9)实验重复3次，取平均值，通过对比不同样品的LUC/REN的比值，检测转录因子对启动子的激活作用。

结果显示：IbEIN3-2能够提高IbMYB1启动子的活性(图3)，说明IbEIN3-2能够促进IbMYB1的表达。

实施例10：明确上游调控因子IbEIN3-2的功能

构建了IbEIN3-2与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbEIN3-2的作用场所进行定位。亚细胞定位载体是C17GFP(BioVector NTCC典型培养物保藏中心，货号：BiovectorC17GFP)，根据载体和互作蛋白的关键位点选择限制性内切酶，用SmaI进行单酶切。设计包含起始密码子而去掉终止密码子的特定引物，将IbEIN3-2构建到C17GFP亚细胞表达载体上，并通过转化拟南芥原生质体瞬时表达蛋白，观察目的基因蛋白的亚细胞定位。合成引物序列见表2中的IbEIN3-2-GFPF/IbEIN3-2-GFPR。结果显示：空载中的GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbEIN3-2蛋白在细胞核中表达(图4)，表明IbEIN3-2是一个典型的转录因子。

表2构建载体使用引物序列(下划线为酶切位点)

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省科学院南繁种业研究所

<120> 一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 1

Met Ala Ser Glu Asp Val Lys Ala Gly Glu Ser Ala Val Glu Lys Ile

1 5 10 15

Val Asn Leu Ala Glu Glu Ala Lys Leu Ala Arg Arg Lys Leu Ser Gln

20 25 30

Leu Ala Thr Pro Ser Val Ser Ala Ser Leu Ser Ser Leu Glu Val Leu

35 40 45

Leu Val Ala Cys His Gly Gln Leu Leu Leu Leu Trp Asn Val Lys Tyr

50 55 60

Cys Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Ile Ile Asn Thr Met Ala Gln Phe Lys

65 70 75 80

Ala Asn Ile Ser Gly Glu Leu Arg Ala Ser Glu Asp Tyr Leu Arg Val

85 90 95

Met Gly Pro Thr Val His Ala Ser Ser Gln Thr Gln Leu Ser Ser Ser

100 105 110

Ser Ala Met Ser Arg Pro Pro Arg Ala Ser Tyr Gly Tyr Ile Gly Asn

115 120 125

Lys Gln Glu Met Arg Met Leu Ser Ser Leu Leu Tyr Cys Val Leu Glu

130 135 140

Leu Glu Leu Val Leu Glu Leu Pro Cys Leu Gln Pro Thr Gln Trp Thr

145 150 155 160

Trp Ser Val Ala Gly Leu Ser Lys Gln Ile Ser Leu Leu Ile Ser Thr

165 170 175

Gly Glu Cys Phe Met Leu Cys Gln Leu Cys Ser Ala Arg Lys Val His

180 185 190

Gly Leu Tyr Thr Arg Val Gly Phe His Leu Ser Glu Leu Phe His Met

195 200 205

Trp Val Thr Leu Leu Ser Met Asn Leu Trp Lys Ile Gly Cys Asn Leu

210 215 220

Thr Leu Leu Asp Trp Leu Lys Ile Leu Ser Leu Val Leu Leu Gln Gly

225 230 235 240

Trp His Val Gly Leu Leu Gln Gly Leu Leu Val Lys Leu Leu Leu Thr

245 250 255

Leu Leu Met Leu Phe Ala Glu Glu Cys Lys Trp Trp Val Gly Lys Met

260 265 270

Leu His Leu Leu Pro Val Lys Glu Arg Ala Gly Leu Pro Leu Asn Ile

275 280 285

Leu Ala Met Leu Leu Gly Lys Leu Phe Gly Met Arg Val Glu His Cys

290 295 300

Thr Arg Val Trp Ser Pro Ile Gln Arg Leu Phe His Pro Leu Leu Leu

305 310 315 320

Leu His Thr Ser Lys Leu Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Arg Ser Lys Tyr

325 330 335

Arg Thr

<210> 2

<211> 1064

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 2

atggcttcgg aggacgtgaa ggctggcgaa tcggcggtgg agaagattgt aaacctcgcc 60

gaagaggcga agctcgctag gaggaaatta agccaactag ccacgccgtc ttaagtatct 120

gcaagtctct cgtcgctgga ggtgttgctg gtggcgtgtc acggacagct gttgctcctc 180

tggaacgttt gaaaatattg ctacaggttc agaatcctca taatataaaa tacaatggca 240

caattcaagg cctaaaatat atctggagaa ctgagggctt cagaggatta tttaagggta 300

atgggaccaa ctgtgcacgc atcctcccaa actcagctgt caagttcttc agctatgagc 360

aggcctccaa gggcatctta tggctatata gggaacaaac aggaaatgag gatgctcagc 420

tcactcctgt attgcgtctt ggagctggag cttgtgctgg aataattgcc atgtctgcaa 480

cctacccaat ggacatggtc cgtggcgggc taactgtcca aacagataag tctccttatc 540

agtacagggg aatgcttcat gctttgtcaa ctgtgctccg cgaggaaggt ccacgggctt 600

tatacaaggg ttggcttcca tctgtcatag gagttattcc atatgtgggt ctgaactttg 660

ctgtctatga atctttggaa gattggctgt tgaaatctaa ccctcttgga ctggttgaag 720

attctgagct tggtgttgtt acaaggctgg catgtggggc tactgcaggg actattggtc 780

aaactgttgc ttaccctctt gatgttattc gcagaagaat gcaaatggtg ggttggaaag 840

atgctgcatc tattgtaacc ggtgaaggaa agggcagggc tgcccttgaa tatactggca 900

tgatagatgc ttttaggaaa actgttcggc atgagggtgt gagagcattg tacaagggtc 960

tggtccccaa ttcagtaaag gttgttccat ccatagctat tgcttttgtg acatacgagc 1020

aagttaagga gatattggga gttgagatca aaatatcgga ctga 1064

<210> 3

<211> 2183

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 3

tattgctctc aatgtgcaag aatcaaatga agtatcaatc agaagtttaa ttgggacata 60

tttattggta gcaaataaaa acaaacttgt taactctatt actaagtcaa aaaccttgtg 120

gtctagtgac acccgattgc acccccacat gggaagggtg agttcgagct tcagtaaatg 180

tgatattggc tctatgtgct tcatttggtt gagaaaatag ctataaacat atactacatt 240

gtaatggagt caatagttct caaaaaaaaa aaaaaagtct tcgaccgttt gcctactaac 300

ctagtattaa tgggagtttc tctcatacat tttataaaaa tttaaaaaga gtaatgctat 360

ttctctctaa aaaaaattct tctcaaaatt tcccgtaaca ttatttgatt ggccactttt 420

ctttttcatt aagggtccat ctgaaaaaca ggaaggatgt gtttggttgg ggggtttagg 480

cataaggtat gcgtatcaaa gtgattgtta gtgtttggtt gataggtttt gtgaatgtta 540

ctatgggttt ggaatacccc attaatggca aaacccatac ccttattaaa taagggtttc 600

atctcccttc atcatttttt ccccaattat taataaccat tcccattcca cccaactacc 660

aaacatgcta aatacttcca ccaaaaccca ttacccttac caagtatttg atacccattc 720

cgattccgat tccgattccc acgtgcgaac caaacgcacc cgaaaatgtc ttctgaaaaa 780

tgagtacaat tgtttaatta aacattttaa ttattttatt taaaatataa aaaattattt 840

ataataatat taaaaatatg ttatttatta ttgttattat tattttttaa atgatggttt 900

ccgacggaat ggtttctgcc gaaaacgaga gcctaggtcc agaaaatgta aagattttcc 960

cagtcaatgg aaagtgtttt tcgttgactg gatttttcaa gcgcatccaa acactggaaa 1020

ctccgaaaat gattttcaga aaacattttt cgagttttca aacaccctaa atgtgtgttg 1080

gtgtgtagtc agttaattca ttgcacccaa tgattataaa acatgtcatg cagagaattt 1140

aaagagagaa aaaattagaa tgagtaagaa gcatttttca ataaataatt aaataaataa 1200

aagattccta tgttatgaca aatttttggg caattaagat attgcttaaa ttatataatt 1260

tttacacaat attataatac tcatccaacg gttctcgata gaggcataca agtcgtgctc 1320

tagatattta gaaatatttg gagcaaatcc aatgatttga cacagcaaat atttgtgtgg 1380

cccacaaaat ttttttatgc acctcaaaaa tttaatgatg tctaatataa tgcattagtt 1440

aatttcttac ttattacatc aagttaaatt aatacgattt gtataaaatg acaatcatgt 1500

ttattacatc aagctaaata aatacgattt gtattaaatt aatacaataa taataataat 1560

caaggacaat ttagtcattt tctttgtttg ttcttttttc aagatgcatt aaattctaat 1620

ttctaggaga tatatgaatt gcaatttcac aaatagaaaa aattgcaatt ccatcaattc 1680

aaacaccgta gtttatagct ccgttaaatt gcattgtaat tgaattaaaa tttatgtcaa 1740

ccaattaacc gaacaccctc taagggaatc tcttgtaatc taaaaaaaaa tgaattatca 1800

aaaatttaaa tgttgtttgt aaacctgtct tattcacaaa ctttatgtga tcatacagaa 1860

tctacataat gattttaata aaaaaaaaaa aagttaagaa aacaagtgta tttcgaaaaa 1920

aaaaaaaaaa acaagtggaa aacatgtgca gtgtcatcat gtaagtactc agtggtatat 1980

atagtagctg tgctaactat attgcagggc atacttatac caataattgg atgctgcgct 2040

atcttctatt atattactca aggtcgtttc tccatctttt cttcactttt tttttccgga 2100

attttggtgc taccacaccc aagtagccta cctatactac aacaacctta gctaagaatt 2160

tccgacaccc ttcaatatat ata 2183

Claims

1.一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2的基因。

3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或重组菌。

5.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒。

6. 一种权利要求1所述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbEIN3-2-F：5'- ATGGCTTCGGAGGACGTGAAGGCTG -3'和IbEIN3-2-R：5'- TCAGTCCGATATTTTGATCTCAACTCCCAA -3'。

7.权利要求1所述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2在促进紫心甘薯IbMYB1转录因子表达中的应用。