CN110283832A

CN110283832A - 一种促进花青苷合成的ItfEF71a基因及其重组表达载体与应用

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Publication number: CN110283832A
Application number: CN201910724002.8A
Authority: CN
Inventors: 张华�; 姚改芳; 胡康棣; 宁致远; 唐君; 邓敬宇; 孙红叶; 钟庭颖; 孙忱
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2019-08-07
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2039-08-07
Also published as: CN110283832B

Abstract

一种促进花青苷合成的ItfERF71a基因及其重组表达载体与应用，ItfERF71a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。ItfERF71a基因在促进紫薯甘薯块根花青苷转运的应用，为促进甘薯块根花青苷的积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

Description

一种促进花青苷合成的ItfEF71a基因及其重组表达载体与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及促进花青苷合成的ItfEF71a基因及其重组表达载体的构建与应用，具体涉及从紫薯中分离、克隆得到一个参与紫薯块茎花青苷生物合成相关的AP2/ERF家族成员ItfERF71a基因及其应用。

背景技术

紫薯是世界上重要的粮食作物之一，紫薯因外观漂亮和花青素含量高而非常受人欢迎，紫薯也是一种保健食物，其具有抗癌变、抗突变(Joachimet al.,2013)以及改善肝肌能(Choi J H et al.,2010)的保健功能。紫薯块茎含有大量的多酚，花青素是紫薯中主要的可见类多酚物质(Reyes L F et al.,2003)。紫薯花色苷具有很多的生理功能，紫薯花色苷除了具有抗氧化，调节血脂血糖外(Zhang Z F et al.,2013)，还有消除炎症(Hwang Y P et al.,2011)以及改善记忆力(Lu J et al.,2012)等其它生理功能。

花青素，是一类水溶性类黄酮色素，由于具有独特的生理功能而广泛受到关注。花青素是植物体内重要的次级代谢产物，不仅能决定花、果实、蔬菜的颜色，还能保护植物免受紫外线损伤(Sarma和Sharma 1999)，抵御低温(Christie et al.,1994)、干旱胁迫(Castellarin et al.,2007)及微生物病原体的侵害(Lorenc-Kukula et al.,2005)。在预防人类的神经系统和心血管疾病，癌症和糖尿病方面也有重要的作用(Konczak et al.,2004)，因此花青苷具有很大的研究价值。大多数植物花色素的合成是通过MYB-bHLH复合物或者MYB-bHLH-WD40复合物(MBW复合物)进行调节(Broun et al.,2005)。

另外，转录因子通过与MBW复合物的相互作用影响花色素苷的生物合成。乙烯反应因子(ERF)家族是一个大的基因家族，ERFs是植物特有的转录因子，在各种生物过程和对环境胁迫的反应中发挥着关键作用(Nakano et al.,2006)。例如，在苹果果实成熟过程中，MdERF2通过抑制乙烯合成而对乙烯合成产生负调控作用。MdACS 1转录(Li et al.,2016)。在枇杷果实中，EjAP2-1AP2/ERF因子，通过与EjMYB 1的相互作用直接抑制木质素的生物合成(Zeng et al.2015)。还发现几种ERFs可以调节不同植物中花青素的生物合成。在拟南芥里面双突变体减少光敏花青素积累，表明这两种ERFs对光诱导花青素生物合成具有正调节作用(Koyama和Sato,2018)。在苹果，MdERF 3由MdMYB 1转录调控，参与花青素的生物合成(An et al.2018)。在梨中，PpERF3与PpMYB114和PpbHLH3相互作用，形成ERF3-MYB114-bHLH3复合物，共同调节梨果实的色泽(Yao et al.2017)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进花青苷合成的ItfEF71a基因及其重组表达载体与应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种促进花青苷合成的ItfEF71a基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种由上述促进花青苷合成的ItfEF71a基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种上述促进花青苷合成的ItfEF71a基因的宿主菌。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种克隆权上述促进花青苷合成的ItfEF71a基因的引物对，上游引物ItfEF71a-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物ItfEF71a-R1序列如SEQ ID No.4所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述促进花青苷合成的ItfEF71a基因在促进紫薯块茎中花青苷合成中的应用。

优选的技术方案为：所述的促进花青苷合成的ItfEF71a基因联合ItfMYBb基因或者bHLH3基因在促进紫薯块茎中花青苷合成中的应用；所述的ItfMYBb基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述的bHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种含有上述促进花青苷合成的ItfEF71a基因的重组表达载体。

优选的技术方案为：以pSAK277为出发载体，将权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfEF71a基因插入EcoR I和Xbal I位点之间所得。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述的促进花青苷合成的ItfEF71a基因的重组表达载体在促进紫薯块茎中花青苷合成中的应用。

优选的技术方案为：权利要求9所述的促进花青苷合成的ItfEF71a基因的重组表达载体联合含ItfMYBb基因的重组载体在紫薯块茎中花青苷合成中的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1.ItfERF71a基因在促进紫薯甘薯块茎花青苷转运的应用，为促进紫薯甘薯块茎花青苷的积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

2.本发明将转录因子ItfERF71a与辅助因子ItfMYBb以及bHLH3共转化草莓果实和烟草叶片导致草莓果实和烟草叶片花青苷大量积累，并经生物学功能验证，表明本发明克隆ItfERF71a与辅助因子ItfMYBb以及bHLH3联合促进甘薯块茎花青苷转运的功能。

附图说明

图1为本发明涉及的ItfERF71a在不同种类甘薯中的RT-qPCR表达分析。误差线代表n次平均值的SE(n＝3)。

图2：A.为本发明ItfERF71a与其它转录因子形成调控复合体共转化烟草叶片促进花青苷的积累。a.pSAK277(空载)；b.ItfERF71a；c.ItfMYBb；d.ItfMYBb+bHLH3；e.ItfERF71a+ItfMYBb；f.ItfERF71a+ItfMYBb+bHLH3.B.通过色差仪测量烟草叶片花青苷积累附近色素积累，a*/b*的比值表示色素变化，a*/b*的比值从负值转为正值表示烟草叶片的颜色由绿色变为红色。误差线是六次检测的平均值。C.对烟草叶片总花色苷含量的测定。

图3为本发明ItfERF71a与其它转录因子形成调控复合体共转化促进草莓果实花青苷积累。

其中：A.'YW5AF7'草莓花青苷着色的表型图。a.pSAK277(空载)；b.ItfERF71a；c.ItfMYBb；d.ItfMYBb+bHLH3；e.ItfERF71a+ItfMYBb；f.ItfERF71a+ItfMYBb+bHLH3.B.通过色差仪在草莓果实的着色区域检测色素的变化，a*/b*的比值从负值转为正值表示草莓果实的颜色由绿色变为红色。误差线是测量6个着色区域比值的平均值。C.对草莓果实总花色苷含量的测定。D.花青苷生物合成和转运相关基因的RT-qPCR分析。a.FvUFGT在不同瞬时转化草莓果实组合中的表达模式；b.FvDFR1在不同瞬时转化草莓果实组合中的表达模式；c.FvANS在不同瞬时转化草莓果实组合中的表达模式；d.FvRAP在不同瞬时转化草莓果实组合中的表达模式。e.FvMYB10在不同瞬时转化草莓果实组合中的表达模式。f.FvbHLH3在不同瞬时转化草莓果实组合中的表达模式。

图4通过酵母双杂交(Y2H)验证转录因子之间的相互作用。A.I-VI代表ItfMYBb的不同氨基酸残基。B.验证ItfMYBb和ItfERF71a的相互作用位点。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：本发明不同种类甘薯中ItfERF71s基因的表达模式分析

在不同种类的甘薯对本发明ItfERF71s基因进行RT-qPCR表达分析，发现在紫色甘薯中的表达水平高于其他种类的甘薯(图1)。RT-qPCR分析ItfERF71a所用的正向引物是5’-

TCTCCGGCCAACCTGAATCAG-3’(SEQ ID NO.9),反向引物是5’-

CTGCTTCTTCCGCCGTGTTG-3’(SEQ ID NO.10)；ItfERF71b所用的正向引物是5’-

GAGGCGGAGAATCAAGTGCG-3’(SEQ ID NO.11)，反向引物是5’-

GTTAACGACACTGCTTGGGCTG-3’(SEQ ID NO.12)。

实施例2：本发明紫薯中ItfERF71a基因的克隆和重组载体的构建

1、从紫薯块茎中提取RNA：紫薯的总RNA的提取采用PlantTotalRNAIsolationKitPlus(Foregene，RE-05022)试剂盒，按照该试剂盒提供的操作说明书操作，具体为：取500mg冷冻干燥后的‘韩紫’紫薯的块根于研钵中，加入液氮充分研磨至细粉末；吸取500μLBufferPSL1于2mL离心管中，加入10μLβ-巯基乙醇，混匀；用液氮遇冷的蓝色枪头刮取磨好的适量(约50mg)粉末转入BufferPSL1中，漩涡震荡混匀；室温静置5min后加入100μLBufferPS，轻柔混匀；将所有液体转移至DNA-CleaningColumn中，12000rpm离心2min后去除过滤柱，保留收集管内上清液；小心转移上清液300mL至新的2mL离心管中，加入450mLBufferPSL2，轻柔混匀；取500μL混合液转移至RNA-onlyColumn中，12000rpm离心1min后弃掉废液；向RNA-onlyColumn中加入500μLBufferPRW1，离心1min后弃掉废液；加入700μL无水乙醇，离心1min后弃掉废液；向RNA-onlyColumn中加入700μLBufferPRW2，12000rpm离心1min，弃掉废液，并重复一次此步骤；12000rpm离心2min，弃掉收集管；将RNA-onlyColumn转移至新的2mL离心管中，向膜中央滴入60μL于65℃预热的RNase-FreeddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心1min后收集RNA。取2μL的RNA跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度估算RNA的浓度，并于-80℃冰箱保存备用。

2、第一链cDNA的合成采用PrimeScriptTMRTMasterMix(Takara)反转录试剂盒(按照该试剂盒提供的说明书操作)。反转录体系为10μL：5×PrimeScriptR^TMasterMix2μL，totalRNA2μL，RNase-FreeddH₂O6μL。反应条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。得到的cDNA可放置-20℃冰箱保存。经反转录得到的第一链cDNA用于扩增ItfERF71a基因全长。扩增基因引物对为ItfERF71a-F1：5’-actagtggatccaaagaattcATGTGTGGCGGTGCATTCC-3’(SEQ IDNo.3)；ItfERF71a-R1:5’-tcattaaagcaggactctagaTTAATTGGAGTTAACGACACTGCTTG-3’(SEQID No.4)。超保真DNA聚合酶Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1)购自诺唯赞生物科技公司。扩增的反应体系为50μL中包括200ng cDNA，2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(1U/μl)1μL，10μM 2μL上述引物，加ddH₂O至50μL。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，步骤参照AxyGEN小量胶回收试剂盒使用说明书。回收纯化的DNA溶液一部分送至上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。ItfERF71a基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

回收纯化的DNA溶液一部分与双酶切(EcoRI/XbaI)的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶II One Step Cloning Kit(货号：C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL，其中包括2μL的5×CE IIBuffer，50～200ng线性化克隆载体(本实施例具体为100ng)，50～200ng插入片段扩增产物(本实施例具体为100ng)，1μLII。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰水浴中冷却5min，反应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序。含有目的基因序列的正确质粒命名为ItfERF71a-pSAK277。应用冻融法将上述重组载体导入到农杆菌GV3101中。挑取农杆菌GV3101单菌落接种到20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃，200rpm，培养1天；吸取200μl菌液加入20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃培养至OD₆₀₀为0.3-0.4；取2ml菌液，4℃，10000rpm离心10min弃上清，用800μl冰预冷的0.01mol/L的Tris-Cl(pH7.0)重悬沉淀，离心10min弃上清；用冰预冷的100μl YEB液体培养基重悬菌块，并加入至分别含5μl的1.0μg/μl的pSAK277-ItfMYBb 10μl冰预冷的LTE(10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L Na₂EDTA，pH8.0)溶液中，轻柔混合，立即将混合物置于液氮中5min后，迅速转入37℃水浴锅25min；添加室温下放置的LB液体培养基100μL，28℃预表达1.5h，并涂布到附加60μg/mlGentamycin和60μg/mlKanamycin的YEB固体培养基上，28℃，培养1-2天，至单菌落出现。

本实施方式证明ItfERF71a与辅助因子ItfMYBb以及bHLH3联合促进甘薯块茎花青苷积累的新的功能应用。

紫薯cDNA：紫薯‘韩紫’块根总RNA反转录得到cDNA，反转方法为cDNA的合成采用Prime Script^TMRT Master Mix(Takara)反转录试剂盒(按照该试剂盒提供的说明书操作)。反转录体系为10μL：5×Prime Script^RT Master Mix 2μL，total RNA xμL，RNase-FreeddH₂O 10-xμL。反应体条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。得到的cDNA可放置-20℃冰箱保存。

辅助因子ItfMYBb克隆的模板是紫薯cDNA，PCR扩增的正向引物序列是：5’-actagtggatccaaagaattcATGGTGGGAGCTGCTGAGAA-3’(SEQ ID NO.13)；反向引物序列是5’-tcattaaagcaggactctagaTCAGAAAATAAACCCTCCATTCCA-3’(SEQ ID NO.14)，扩增的反应体系为50μL中包括200ng cDNA，2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)1μL，10μM 2μL上述引物，加ddH₂O至50μL。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒,35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。PCR扩增的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，回收纯化的DNA溶液与双酶切(EcoRI/XhoI)的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶II One Step Cloning Kit(货号：C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL，其中包括2μL的5×CE II Buffer，50～200ng线性化克隆载体(本实施例具体为100ng)，50～200ng插入片段扩增产物(本实施例具体为100ng)，1μLII。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰水浴中冷却5min，反应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)。测序结果表明，ItfMYBb基因全长为720bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，构建重组载体命名为pSAK277-ItfMYBb；应用冻融法将上述重组载体导入到农杆菌GV3101中。挑取农杆菌GV3101单菌落接种到20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃，200rpm，培养1天；吸取200μl菌液加入20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃培养至OD₆₀₀为0.3-0.4；取2ml菌液，4℃，10000rpm离心10min弃上清，用800μl冰预冷的0.01mol/L的Tris-Cl(pH7.0)重悬沉淀，离心10min弃上清；用冰预冷的100μl YEB液体培养基重悬菌块，并加入至分别含5μl的1.0μg/μl的pSAK277-ItfMYBb 10μl冰预冷的LTE(10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L Na₂EDTA，pH8.0)溶液中，轻柔混合，立即将混合物置于液氮中5min后，迅速转入37℃水浴锅25min；添加室温下放置的LB液体培养基100μL，28℃预表达1.5h，并涂布到附加60μg/mlGentamycin和60μg/mlKanamycin的YEB固体培养基上，28℃，培养1-2天，至单菌落出现。

实施例3：本发明ItfERF71a基因与其它的共作用因子ItfMYBb以及bHLH3共转化导致烟草叶片中花青苷积累

促进花青苷合成的ItfERF71a基因联合ItfMYBb基因或者bHLH3基因在促进烟草叶片中花青苷合成中的应用；所述的ItfMYBb基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述的bHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

构建的重组载体通过农杆菌介导瞬时转化烟草叶片。

实施方式一：挑取携带植物表达载体ItfERF71a-pSAK277质粒的农杆菌GV3101单菌落，然后在28℃下倒置培养2d，将农杆菌GV3101重新悬浮于10ml含有10mM MgCl₂、200μm乙酰丁香酮和10mM MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸，ph＝5.6)的缓冲液中至OD600值为0.8-1.0，在25℃下悬浮培养4～5小时后用于侵染，得到ItfERF71a菌液。随后用注射器在2～3周龄的烟草叶片背面沿轴线两端注射适量菌液，随后将烟草至于16℃避光诱导12h后拿出放置长日照(16h)组培间培养4～7天观察表型并拍照取样，用于后续实验。

实施方式二：挑取携带植物表达载体pSAK277-ItfMYBb质粒的农杆菌GV3101单菌落，然后在28℃下倒置培养2d，将农杆菌GV3101重新悬浮于10ml含有10mM MgCl₂、200μm乙酰丁香酮和10mM MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸，ph＝5.6)的缓冲液中至OD600值为0.8-1.0，在25℃下悬浮培养4～5小时后用于侵染，得到ItfMYBb菌液。用注射器在2～3周龄的烟草叶片背面沿轴线两端注射由ItfERF71a菌液和ItfMYBb菌液按照1：1的质量比例构成的混合菌液，随后将烟草至于16℃避光诱导12h后拿出放置长日照(16h)组培间培养4～7天观察表型并拍照取样，用于后续实验。

实施方式三：制得携带植物表达载体bHLH3-pSAK277质粒的农杆菌GV3101单菌落，制备方法和转化方法与携带植物表达载体ItfERF71a-pSAK277质粒的农杆菌GV3101单菌落的方法和携带植物表达载体pSAK277-ItfMYBb质粒的农杆菌GV3101单菌落的方法相同。

挑取携带植物表达载体bHLH3-pSAK277质粒的农杆菌GV3101单菌落，然后在28℃下倒置培养2d，将农杆菌GV3101重新悬浮于10ml含有10mM MgCl₂、200μm乙酰丁香酮和10mMMES(2-(N-吗啉)-乙磺酸，ph＝5.6)的缓冲液中至OD600值为0.8-1.0，在25℃下悬浮培养4～5小时后用于侵染，得到bHLH3菌液。用注射器在2～3周龄的烟草叶片背面沿轴线两端注射由bHLH3菌液、ItfERF71a菌液和ItfMYBb菌液按照1：1：1的质量比例构成的混合菌液，随后将烟草至于16℃避光诱导12h后拿出放置长日照(16h)组培间培养4～7天观察表型并拍照取样，用于后续实验。

结果表明，单独转化ItfMYBb有较少的花青苷含量的积累，而需要共同转化三个转录因子ItfERF71a、ItfMYBb以及bHLH3才能观察到花青苷在烟草叶片中有明显的积累(图2的A)。花青苷积累的烟草叶片通过色差仪和分光光度计检测色素含量(图2的B，C)，结果与表型图一致。因此，ItfERF71a基因与其它的共作用因子ItfMYBb以及bHLH3共转化烟草叶片可以促进烟草叶片花青苷的大量合成。

实施例4：本发明ItfERF71a基因与其它的共作用因子ItfMYBb以及bHLH3共转化导致草莓果实中花青苷积累

促进花青苷合成的ItfERF71a基因联合ItfMYBb基因或者bHLH3基因在促进草莓果实中花青苷合成中的应用；所述的ItfMYBb基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述的bHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

取-80度保存的GV3101农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化。处于冰水混合状态时插入冰中。向50ul感受态加入0.1ug的pSAK277-ItfERF71a重组质粒，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37度水浴5分钟、冰浴5分钟。加入700ul无抗生素的LB，于28度振荡培养2～3小时。6000rpm离心一分钟收菌，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含壮观霉素和利福平的LB平板(每100ml固体LB加80ul 100mg/ml和250ul 10mg/ml利福平上，倒置放于28度培养箱培养2～3天。

构建的重组载体通过农杆菌介导瞬时转化黄色草莓‘Yellow wonder’5AF7(YW5AF7)果实(花后2周)。结果表明，单独转化ItfMYBb有少量花青苷积累，而共同侵染转化共同转化三个转录因子ItfERF71a、ItfMYBb以及bHLH3在草莓果实注射区域有较多花青苷的积累(图3的A)。此外，色差仪(Minolta chromameter，Japan)测定共转化ItfERF71a、ItfMYBb以及bHLH3着色区域的a*/b*的比值显著高于单独注射或者空载(P<0.01)(图3的B)。当检测总花青素含量时，ItfERF71a、ItfMYBb以及bHLH3高于单独注射和空载(图3的C)。我们进一步对花色苷生物合成和转运相关基因的表达水平进行RT-qPCR分析。与空载体(pSAK277)相比，ItfERF71a、ItfMYBb以及bHLH3的过表达显着上调FvUFGT，FvANS和FvRAP表达(图3的D)。本实施例的其它方法同实施例3。

实施例5：酵母双杂交验证ItfERF71a和ItfMYBb之间的互作

为了验证ItfERF71a和ItfMYBb是否存在互作，酵母双杂交试验进行验证，ItfMYBbCDS全长序列和C-或N-端残基氨基酸序列分别克隆，并插入到pGBKT7载体，分别验证自激活活性。同时克隆了ItfERF71a的CDS全长序列插入pGADT7载体目的是检测与ItfMYBb是否存在蛋白互作。首先共转化ItfERF71a与ItfMYBb在二缺SD-Trp-Leu的培养基上生长，再把转化子转移到四缺SD-Trp-Leu-His-Ade的培养基上筛选，结果表明，ItfMYBb CDS的氨基酸序列(V)和(VI)表现出很强的转录激活活性。共同转化酵母时，氨基酸序列(V)和(VI)与ItfERF71a不但能在在二缺SD-Trp-Leu的培养基上生长，而且能在四缺SD-Trp-Leu-His-Ade培养基上生长，这说明ItfMYBb与ItfERF71a之间存在互作位点(图4的A，B)。

实施例5：一种上述促进花青苷合成的ItfEF71a基因的宿主菌

参考文献

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以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种促进花青苷合成的ItfEF71a基因及其重组表达载体与应用

<130> 20190520

<160> 23

<210> 1

<211> 929 <212> DNA

<213> ‘韩紫’紫薯

<223> 促进花青苷合成的ItfEF71a基因

<400> 1

atgtgtggcg gtgcatttct cttcgatcgt aaattcccta gggatggtgg ccgcagtgtc 60

tcctccggcg acatctggcc tgagttttgc cccacttctc agacgactgc caaatcgagt 120

ttctccgncc aacctgaatc agccgccacn cctaaacggt ctcagccatg cacaggtaat 180

tattactagt ggcatctgta tacctttttt acatgaattt ctgtacgtgt taatagtagg 240

aattttgtca aacaggtggt gggagtcctg agaaggcgaa gaagaagagg cagaggaaaa 300

acatgtacag gggaataagg cagcgcccct ggggcaaatg ggctgccgag atccgcgacc 360

cgagaaaagg cgttagggtt tggcttggta cgttcaacac ggcggaagaa gcagccagag 420

cttacgacag ggaagctagg aaaatcagag gtaaaaaagc taaggttaac ttccccaacg 480

atgataccaa ctttaatccg ctggcgcagc cggaataccg ccggaatcct cctgataagt 540

ccatcggaaa agctgatctg agtgtggagc cctattgtcc tcgatcctat tcaatgatca 600

acgcggggaa tctaatagga tttgcttctc cgtccggttc agagaatggt aacgagggtt 660

tattgaaaga gaagagggcg ggcggggagg aaatgaagat gagtgccggt gcagagataa 720

aggaggcgga gaatcaagtg cgtaagctct cggaggagct aatggtgtac gagtcgtata 780

tgaaattcta cgagatacct tatctggacg gccagtcaac ggcggcggcg caagttaacc 840

cggttccaga cacggtggtt ggcggtggtt ctatagatct ctggagcttc gatgatgtca 900

gcccaagcag tgtcgttaac tccaattaa 929

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> ‘韩紫’紫薯

<223> 促进花青苷合成的ItfEF71a基因编码的蛋白

<400> 2

MCGGAFLFDR KFPRDGGRSV SSGDIWPEFC PTSQTTAKSS FSXQPESAAX PKRSQPCTGN 60

YYWHLYTFFT ISVRVNSRNF VKQVVGVLRR RRRRGRGKTC TGEGSAPGAN GLPRSATREK 120

ALGFGLVRST RRKKQPELTT GKLGKSEVKK LRLTSPTMIP TLIRWRSRNT AGILLISPSE 180

KLIVWSPIVL DPIQSTRGID LLLRPVQRMV TRVYKRRGRA GRKRVPVQRR RRRIKCVSSR 240

RSWCTSRINS TRYLIWTASQ RRRRKLTRFQ TRWLAVVLIS GASMMSAQAV SLTPI 295

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 上游引物ItfEF71a-F1

<400> 3 actagtggat ccaaagaatt catgtgtggc ggtgcattcc 40

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 下游引物ItfEF71a-R1

<400> 4 tcattaaagc aggactctag attaattgga gttaacgaca ctgcttg 47

<210> 5

<211> 635 <212> DNA

<213>‘韩紫’紫薯

<223> ItfMYBb基因

<400> 5

atggtgggag ctgctgagaa agtagggtgg aggaaagggc catggacgcc caaggaagac 60

aagcttcttg gcgattatgt tagcttgcat ggtgaaggaa gatggagctc tgtggctaga 120

tgtgcaggtt tgaattgcat gctttatggg gcaacaaatg gtcaactata gcaagatact 180

tgccaggaag aacagacaat gagataaaga actactggag aactcatttc aagaagaaac 240

ctgcaactgg gaagactagc gaaaagcaag ataggagaaa gaaccgcaga aagagaaatg 300

aagagaaagt aataaacgac accaaaccac aagagacgat gagtaataat gattcttcgt 360

gcatcaccgc cgccgccgct ccgatgggag ataataacca gctgggcggt acgtcagcca 420

acactacgac gtcgttgtat catgaagaca ttgaatcctg ggtagacagc tttgccatgg 480

atatggatgg tttgtgggga ggggaattat ggaacctaga ccatgatgac agttatcctg 540

aagcggcatt attagagcag ggccacgtga ttcaaaatcc ttgtggtttt ggagctgatc 600

atgccgttaa cctctggaat ggagggttta ttttc 635

<210> 6

<211> 202

<212> PRT

<213> ‘韩紫’紫薯

<223> ItfMYBb基因编码的蛋白

<400> 6

MVGAAEKVGW RKGPWTPKED KLLGDYVSLH GEGRWSSVAR CAGLNCMLYG ATNGQLQDTC 60

QEEQTMRRTT GELISRRNLQ LGRLAKSKIG ERTAEREMKR KTTPNHKRRV IMILRASPPP 120

PLRWEIITSW AVRQPTLRRR CIMKTLNPGT ALPWIWMVCG EGNYGTTMMT VILKRHYSRA 180

TFKILVVLEL IMPLTSGMEG LF 202

<210> 7

<211> 735

<212> DNA

<223> bHLH3基因

<400> 7 ccaaatatca agagaggaga ctttaaagag gatgaagtag atcttatact tagacttcac240

aggcttttgg gaaacaggtg gtcattgatt gctagaagac ttccaggaag aacagcgaat 300

gatgtgaaaa attattggaa cactcgattg cggatcgatt ctcgcatgaa aacgttgaaa 360

aataaatctc aagaaacgag aaagaccaat gtgataagac ctcagcccca aaaattcatc 420

aaaagttcat attacttaag cagtaaagaa ccaattctag aacatattca atcagcagaa 480

gatttaagta cgccatcaca aacgtcgtcg tcaacaaaga acggaaatga ttggtgggag 540

accttgttcg aaggcgagga tacttttgaa agggctgcat gtcccagcat tgagttagag 600

tcaaaagaag aatagtttcc tgaagaagga caaagtagaa gtgaattctc ctttagcatg 660

gacctttgga atcatgaaga actcttcaca actttttggt ttgatgatcg actgtcggca 720

agatcatgtg ccaat 735

<210> 8

<211> 244

<212> PRT

<223> bHLH3基因编码的蛋白

<400> 8

TLFEGEDTFE RAACPSIELE EELFTTFWFD DRLSARSCAN FPEEGQSRSE FSFSMDLWNH 60

SKEEPNIKRG DFKEDEVDLI LRLHRLLGNR WSLIARRLPG RTANDVKNYW NTRLRIDSRM 120

KTLKNKSQET RKTNVIRPQP QKFIKSSYYL SSKEPILEHI QSAEDLSTPS QTSSSTKNGN 180

DWWEMEGYNV NLSVRKGAWT REEDNLLRQC IEIHGEGKWN QVSYKAGLNR CRKSCRQRWL 240

NYLK 244

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ItfERF71a RT-qPCR分析的正向引物

<400> 9 tctccggcca acctgaatca g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ItfERF71a RT-qPCR分析的反向引物

<400> 10 ctgcttcttc cgccgtgttg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ItfERF71b RT-qPCR分析的正向引物

<400> 11

gaggcggaga atcaagtgcg 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> ItfERF71b RT-qPCR分析的反向引物

<400> 12 gttaacgaca ctgcttgggc tg 22

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 克隆引物ItfMYBb-F

<400> 13

actagtggat ccaaagaatt catggtggga gctgctgaga a 41

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 克隆引物ItfMYBb-R

<400> 14 tcattaaagc aggactctag atcagaaaat aaaccctcca ttcca 45

Claims

1.一种促进花青苷合成的ItfERF71a基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种由权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因编码的蛋白，其特征在于；所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因的宿主菌。

4.一种克隆权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因的引物对，其特征在于：上游引物ItfERF71a-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物ItfERF71a-R1序列如SEQ IDNo.4所示。

5.权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因在促进紫薯块根中花青苷合成中的应用。

6.根据权利要求5所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因在促进紫薯块根中花青苷合成中的应用，其特征在于：权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因联合ItfMYBb基因或者bHLH3基因在促进紫薯块根中花青苷合成中的应用；所述的ItfMYBb基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，所述的bHLH3基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

7.一种含有权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因的重组表达载体，其特征在于：以pSAK277为出发载体，将权利要求1所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因插入EcoRI和Xbal I位点之间所得。

9.权利要求7所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因的重组表达载体在促进紫薯块根中花青苷合成中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：权利要求9所述的促进花青苷合成的ItfERF71a基因的重组表达载体联合含ItfMYBb基因的重组载体在紫薯块根中花青苷合成中的应用。