CN107365778B

CN107365778B - 调控叶黄素合成的转录因子基因及其应用

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Publication number: CN107365778B
Application number: CN201710844462.5A
Authority: CN
Inventors: 牛向丽; 冯国栋; 黄胜雄; 马飞; 毛云; 张政; 刘永胜; 王洋; 王莹莹
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2037-09-18
Also published as: CN107365778A

Abstract

本发明公开了一种调控叶黄素生物合成的转录因子基因及其应用。其中转录因子基因TePTF1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；该转录因子编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。在万寿菊成熟花组织中克隆获得了TePTF1基因。实时定量分析表明，TePTF1基因在成熟花中的表达量较未成熟花明显增加。当在烟草叶片中瞬时表达TePTF1基因时，叶黄素含量增加。所述SEQ ID NO.1基因在植物叶黄素生物合成中发挥正调控作用，本发明从色素万寿菊中所克隆转录因子TePTF1能够用于提高植物叶黄素含量。

Description

调控叶黄素合成的转录因子基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物遗传工程技术领域，具体涉及从色素万寿菊中克隆叶黄素生物合成转录因子TePTF1，该基因的核苷酸序列、蛋白质序列，及利用TePTF1 基因在调节植物叶黄素合成中的应用。

背景技术

万寿菊(Tagetes erecta L.)是一种在世界各地广泛种植的菊科万寿菊属植物。它原产美洲墨西哥等地，其花花形大、花色多样、花期长、植株适应能力强、生产周期短(汪殿蓓等，《北方园艺》，2007，1：44-46)。万寿菊花可提取多种次生代谢产物。据《食品科学》(李大婧等，2005，9：582-586)介绍，万寿菊花萃取物有93％可利用的色素，其中全反式和顺式叶黄素、叶黄素酯占 88％，全反式和顺式玉米黄质占5％。Antony等报道(The world ofFood ingredients，2001，4-5：65-67)万寿菊花提取物主要成分为叶黄素酯，占花瓣色素含量的90％。Philip和Berry的研究(Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(10)：4189-4194.)也认为，万寿菊花中叶黄素含量在常见类胡萝卜素来源植物中最高。

叶黄素属于类胡萝卜素类色素，分子式为C₄OH₅₆O₂，相对分子量为568.85。橙黄色粉末，浆状或液体，不溶于水，溶于己烷等有机溶剂。多数叶黄素在植物体内均以酯形式存在，而非游离态。在人体内不能合成叶黄素，但是可以利用叶黄素酯，使其在体内转化成为游离叶黄素(许秀兰等，《粮食与油脂》， 2004，10：3-7)。由于叶黄素在人体不能合成，又因其有多种异构体，也难采用化学方法合成，需要从天然植物中提取。虽然在叶黄素广泛存在于水果蔬菜中，但其含量及其微少，日常饮食摄入不足。叶黄素能防止人体机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤病等。叶黄素在预防老年性眼球视网膜黄斑区病变引起的视力下降与失明也具有独特功能。因此，1995年美国食品药品管理局(Food and DrugAdministration)批准将叶黄素作为食品补充剂。虽然叶黄素价格昂贵，有“软黄金”之称，但由于叶黄素在禽类养殖、医药、食品、化妆品中的广泛应用，国内外对其需求量逐年增加，富含这一成分又能大面积推广种植的色素万寿菊因而成为提取天然叶黄素的重要植物资源(《新疆农垦经济》，2012， 6：52-55)。

我国万寿菊育种基础研究方面进展缓慢，至今没有培育出能够真正替代欧美品种的新品种，主要原因是对其遗传研究的缺乏。据《西北农业学报》(李浦等，2012，5；174-178)介绍，对万寿菊的遗传分析表明叶黄素含量性状以主基因遗传效应为主，多基因效应为辅。叶黄素是类胡萝卜素中的含氧多萜类物质。在植物体内，合成前体异戊烯基焦磷酸通过多次缩合、脱氢、环化、羟基化、环氧化等过程转化为类胡萝卜素。通过拟南芥、玉米、番茄、矮牵牛花等模式植物的研究，发现类胡萝卜素合成主要受两类基因影响：一类是结构基因，直接编码与类胡萝卜素生物合成有关的各种酶类；另一类是调控基因，其编码的转录因子参与调节结构基因的表达。其中Myb、Myc类转录因子在植物花色物质合成中发挥重要作用。目前，在万寿菊花发育过程中特异上调或下调，从而控制花色素成分合成的转录因子基因尚未克隆分离。对这些色素调控基因的利用将可用于培育高叶黄素含量的植物资源，满足食品、医药、化妆品等领域对天然色素的需求。

发明内容

本发明属于植物遗传工程技术领域，具体涉及从色素万寿菊中克隆叶黄素生物合成转录因子TePTF1，该基因的核苷酸序列、蛋白质序列，及利用该基因在调节植物叶黄素合成中的应用。

本发明从色素万寿菊中克隆叶黄素合成转录因子，命名为Tagetes erectaPositive Transcription Factor 1(简称TePTF1)；其核苷酸序列如序列表中 SEQ IDNO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明从色素万寿菊成熟花中进行TePTF1基因的克隆：根据对色素万寿菊的高通量转录组深度测序对TePTF1基因进行数据组装；然后利用引物设计软件 Primer Premier5.0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊花瓣中提取总RNA，反转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)克隆获得TePTF1基因。

本发明通过万寿菊未成熟、成熟花组织的实时定量分析和烟草瞬时表达样品中叶黄素含量测量，表明本发明所述SEQ ID NO.1基因在叶黄素合成调控方面具有作用，能够用于提高植物中叶黄素等类胡萝卜素色素的含量。

本发明所述叶黄素合成转录因子TePTF1的有益效果是：为在植物中提高叶黄素等类胡萝卜素色素含量提供了一种新的调控基因资源，可用于高色素营养品质植物材料的筛选、培育和改良。

具体实施方式

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J.和Russell，D.W.的分子克隆实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：万寿菊高通量转录组测序

由于万寿菊基因组尚未测定，为获得万寿菊功能基因转录本序列，利用色素万寿菊栽培品种菊王组织样品，通过分别提取三个单株的叶、未成熟花、成熟花RNA各1份，进行高通量转录组序列测定与组装注释。

1、试剂

植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于 Takara公司，RNA文库制备试剂盒(RNA Library Prep Kit)购于北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。

3、方法

3.1 RNA提取

1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1ml Trizol，剧烈震荡，室温放置5min；

2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；

3)4℃，12000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；

4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；

5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；

6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底；

7)加入1mL 70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

9)室温干燥5-10min；

10)加入50μL无RNA酶水(RNase-free H₂O)，溶解RNA；

11)根据RNA溶液浓度取RNA 50μg，加入5μL 10X缓冲液(400mM Tris-HCL，pH 7.5，80mM MgCl₂，50mM)、5μL Dnase I、2μL RNA酶抑制剂， 37℃反应30min；

12)加入2.5μL 0.5M EDTA，80℃，2min失活Dnase；

13)加入10μL 3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；

14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

15)加入1mL 70％乙醇清洗RNA；

16)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

17)室温干燥5-10min；

18)加入50μL无RNA酶水，溶解RNA；

19)检测RNA样品的纯度、浓度。

3.2转录组测序组装与注释

转录组测序利用RNA Library Prep Kit，通过北京百迈客生物科技有限公司Illumina HiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：

1)用带有Oligo(dt)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；

2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条eDNA链，然后加入 dNTPs、RNA酶H和DNA聚合酶I合成第二条eDNA链，利用微珠(beads)纯化cDNA；

3)纯化的双链cDNA再进行末端修复，并连接测序接头，然后用微珠进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库；

4)对文库的浓度和插入片段大小进行检测；

5)利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，测序读长为PE125；

6)将测序片段(reads)截除测序接头、引物序列，过滤低质量值数据后，获得高质量的测序数据；

7)利用Trinity组装软件将高质量测序read延伸成较长的片段(contig)，并利用这些片段之间的重叠，得到片段集合(component)，最后利用De Bruijn 图的方法获得转录本序列(unigene)；

8)使用BLAST软件将转录本序列(unigene)与NR(NCBI非冗余数据库)、 Swiss-Prot(欧洲生物信息学研究所维护数据库)、GO(Gene Ontology)、COG (Clusters ofOrthologous Groups)、KOG(euKaryotic Orthologous Groups)、 KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)数据库比对；

9)利用TransDecoder软件进行unigene的编码区序列及其对应氨基酸序列的预测，使用HMMER软件与Pfam(Protein family)数据库比对，获得unigene 的注释信息。

4.结果

通过上述步骤将万寿菊组织材料进行RNA提取、建库、高通量转录组深度测序，然后对测序序列进行组装和基因功能预测，获得万寿菊MYB转录因子Tagetes erectaPositive Transcription Factor 1(TePTF1)基因的推测序列。

实施例2：万寿菊TePTF1基因的克隆

根据实施例1对万寿菊转录因子TePTF1基因序列进行分离。从万寿菊成熟花中提取总RNA，反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)克隆获得TePTF1基因。

1、试剂

植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司；DNA酶I(Dnase I)购于 Takara公司；反转录酶(TransScript Reverse Transcriptase)、Pfu高保真 DNA聚合酶、克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α购于北京全式金生物技术有限公司；色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王种子由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。

3、培养基和溶液

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH 至7.0，高压灭菌。

SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L， 100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基：方法同上述SOB培养基的配制，再加入2mL过滤除菌的 1mol/L葡萄糖。

100×Mg²⁺溶液：20.33g MgCl₂.6H₂O和24.65g MgSO₄.7H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

1000×氨苄青霉素(Amp)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，无菌抽滤后分装，-20℃保存。

4、方法

4.1万寿菊成熟花组织RNA提取

如实施例1中3.1所述操作步骤进行。

4.2 RT-PCR

4.2.1 RT

1)取1μg总RNA与1μL polyT₁₈(10μM)引物混合，用RNase-free ddH₂O 补足至12.75μL，轻轻混匀；

2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；

3)加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，RNA抑制剂0.25μL(40U/ μL)，TransScript Reverse Transcriptase反转录酶1μL(100U/μL)，42℃ 1h，合成第一链cDNA；

4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应。

4.2.2 PCR

根据实施例1所述获得的TePTF1基因推测序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计引物序列如下：

TePTF1F1：5′ CATCTTTTGCTCTGTTTCATCC 3′

TePTF1R1：5′ AACTATCATTAACCCTATCATCTCC 3′

TePTF1F2：5′ GGTACCATGGTGAGATCACCTTGTTGTG 3′

TePTF1R2：5′ AGGCCTTCTCCATATACTGATACTATGCTCAT 3′

取4.2.1所获万寿菊成熟花cDNA，进行TePTF1基因的克隆。将200μL EP 管放置于冰上，加入试剂：

按以下程序进行扩增：98℃ 2min(预变性)；98℃ 10s(变性)，55℃ 30s (复性)，72℃ 90s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃ 5min(总延伸)。

以上述PCR产物为模板，以引物TePTF1F2和TePTF1R2进行第二轮PCR，复性温度56℃，其它条件同上。

通过上述操作，获得了TePTF1基因PCR扩增产物。

4.3高保真PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt连接

将由上述4.2所述获得的TePTF1基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY-BluntSimple Cloning Vector按摩尔分子数比1∶4连接(25℃，15min)，连接体系如下：

pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(50μg/μL) 4μL

PCR产物(～150μg/μL) 1μL

4.4大肠杆菌转化

1)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5 α感受态细胞冰浴解冻；

2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

3)42℃热击90s，立即冰浴1-2min；

4)加入0.8mL SOC，混匀，37℃温和振荡培养1h；

5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜。

4.5快速裂解法鉴定重组克隆

1)挑取单克隆接种于500μL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养液中， 37℃振荡培养至A₆₀₀为0.6～0.8；

2)取200μL菌液至0.5mL EP管中，13000rpm离心1min，去上清，留约 20μL上清；

3)加入20μL 2×快速裂解液(0.2M NaOH 50mL，SDS 0.5g，蔗糖27.2g，加双蒸水至200mL)，剧烈振荡；

4)13000rpm离心15min；

5)取5μL上清直接电泳。与对照相比，电泳带滞后的即可能是重组载体。

4.6菌落PCR鉴定重组质粒

将4.5所述经快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：

反应条件：94℃ 3min(预变性)；94℃ 30s(变性)，56℃ 30s(复性)， 72℃ 90s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72℃ 5min(总延伸)。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-TePTF1，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-Blunt Simple克隆载体的TePTF1基因全长序列，基因序列如序列表中SEQID NO.1所示，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

实施例3：TePTF1在万寿菊不同时期花组织中的表达分析

根据实施例2克隆获得TePTF1基因全长序列，利用引物设计软件Primer Premier5.0设计定量PCR引物，分别从万寿菊未成熟花、成熟花中提取总RNA，反转录获得cDNA，进行TePTF1基因表达水平的定量分析。

1、试剂

RNA提取、反转录试剂如实施例1所述。定量PCR试剂盒TransStart Top GreenqPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、方法

取万寿菊植株发育时期的未成熟花、成熟花样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1中3.1、实施例2中4.2所述。

根据高通量测序结果，以在万寿菊不同组织中均稳定表达的TranslationInitiation Factor 6(TIF6)做为内参对照基因，进行TePTF1表达水平的定量PCR分析。TePTF1引物为TePTF1F3和TePTF1R3、TIF6引物为TIF6F和TIF6R。引物序列如下：

TePTF1F3：5′ ATGGACCAAAGAAGAAGATGAAC 3′

TePTF1R3：5′ ATAATTAATCCAACGGAGTCTACA 3′

TIF6F：5′ TAAGACCTGGTGGTGGAAATAGA 3′

TIF6R：5′ CAGCACCATGAGGACGAAGA 3′

定量PCR反应体系如下：

反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 15s，72℃ 10s，40个循环。其中 cDNA为实施例2中4.2.1方法所述获得cDNA模板稀释30倍后用于定量PCR。扩增后，65℃5s，每个循环增加0.5℃，60个循环，进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Bio-Rad CFX 96上运行。

3、结果

实时定量PCR分析结果显示，TePTF1基因在色素万寿菊成熟花组织中表达量约为未成熟花的5倍，显著高于末成熟花。表明TePTF1基因所编码转录因子可能在万寿菊花发育及色素合成中发挥正调控作用。

实施例4：HPLC方法测定万寿菊花瓣叶黄素含量

1、试剂

叶黄素标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，2，6-二叔丁基-4- 甲基苯酚购于国药集团化学试剂有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、方法

取万寿菊未成熟花、成熟花样品，45℃烘干，将烘干后样品液氮研磨，称重0.15g，加入1mL乙醇(含0.1％2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，涡旋15s，加入400mL 50％ KOH水溶液，涡旋15s，于50℃水浴60min，每15min涡旋一次。用3.3mL正己烷提取3次，合并提取液，取50μL滤液上样。色谱条件：高效液相色谱仪(美国WATERS公司)；色谱柱SymmetryC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相∶乙腈∶二氯甲烷∶甲醇为70∶20∶10(v∶v∶v)；流速1mL/min；检测波长475nm；柱温30℃。

3、结果

根据叶黄素标准品标准曲线和HPLC测定结果，测得万寿菊未成熟花、成熟花中叶黄素含量分别为3.6、16.3mg/g干重。

实施例5：TePTF1基因烟草瞬时表达载体构建

提取实施例2所获得pEASY-TePTF1质粒、烟草瞬时表达载体pBTEX-HA，分别以KpnI、Stu I酶切，将酶切产物胶回收后进行连接，并转化大肠杆菌、农杆菌。

1、试剂

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于Omega公司；Pfu高保真DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶Kpn I和Stu I酶购于Fermentas公司；植物表达载体pBTEX-HA来自美国University of Idaho大学Fangming Xiao博士实验室。其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和农杆菌菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5 α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV2260购于北京全式金生物技术有限公司。

3、培养基和抗生素

LB液体培养基、LB固体培养基、SOC培养基的配制方法如实施例2所述。

1000×卡那霉素(Kan)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，无菌抽滤后分装-20℃保存。

500×利福平(Rif)：50mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。

4、方法

4.1质粒提取

将实施例2所获得pEASY-TePTF1质粒、植物表达载体pBTEX-HA进行质粒提取，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。

1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm，离心1min，弃废液，待用；

2)12000rpm，1min，离心收集菌沉淀，尽量弃尽上清；加入250μL P1 (已加RNaseA)，吹吸混匀至菌沉淀彻底悬浮；

3)加入250μL P2，温和上下翻转8次离心管，使菌体充分裂解；

4)加入350μL P3，立即温和上下翻转8次离心管，12000rpm，离心10min；

5)吸出上清至新的离心管中，12000rpm，离心5min；

6)小心转移上清至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃废液；

7)加入500μL PD，12000rpm，离心1min，弃废液；

8)加入600μL PW(已加无水乙醇)，12000rpm，离心1min，弃废液，重复操作一次；

9)12000rpm，离心2min，除尽残留的PW；

10)将吸附柱转移至新离心管中，在柱中央加入50μL无菌ddH₂O，室温 2min，12000rpm，离心2min，洗脱DNA。

11)将重新洗脱液吸出至吸附柱中，再重复此操作一次。

4.2酶切

利用限制性内切酶Kpn I、Stu I对上述4.1所获的pEASY-TePTF1、 pBTEX-HA质粒进行酶切。反应体系如下所述，37℃，1h：

4.3胶回收

将上述4.2酶切后质粒进行胶回收，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。

1)向胶回收吸附柱CA2中加入500μL的平衡液BL，在12000rpm离心机中离心1min，倒去柱底部的废液。

2)带上塑胶手套，在紫外切胶仪器上回收电泳好的片段，将切下的片段放入预先准备的干净的EP管中。

3)根据胶的质量来确定加入溶胶液PN的体积，根据1∶1体积加入。将 EP管放入50℃的加热器上，加速溶解的速度，溶解10-15min，至胶完全溶解为止。

4)溶胶完全后，待其冷去至室温后，将溶解液体转入到胶回收吸附柱CA2 中，静置3min，让溶胶液和吸附膜充分接触。

5)静置完全后，在12000rpm离心机中离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2 收集柱底部的废液。向吸附管中加入600μL的PW，漂洗洗去质粒中的杂质，静置3min。

6)12000rpm离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2收集柱底部的废液。完成后，重复上一步的过程。

7)将空的吸附柱放入离心机中12000rpm离心3min，放置于通风处，放置15min，待酒精全部挥发干净。

8)向吸附柱CA2中正中心吸附膜上加入30μL洗脱剂EB，静置3min， 12000rpm离心3min，获得胶回收产物。

4.4酶切片段连接

将上述4.2酶切回收的pEASY-TePTF1、pBTEX-HA质粒片段以T4连接酶进行连接，连接反应体系如下，25℃，3h：

4.5大肠杆菌转化

实验步骤如实施例2中4.4所述。

4.6菌落PCR鉴定重组质粒

实验方法步骤如实施例2中4.6所述。

将菌落PCR鉴定重组载体(命名为pBTEX-TePTF1)，进行测序。测序结果表明，TePTF1编码序列已连接于pBTEX载体。将测序正确重组大肠杆菌-80℃保存。

4.7农杆菌转化

1)按实施例3中4.1所述步骤提取pBTEX-TePTF1质粒。

2)将pBTEX-TePTF1质粒加入50μL农杆菌菌株GV2260感受态细胞中，轻轻搅拌混匀，并让在冰上冰浴30min。

3)放置于液氮中冷激1min。

4)将EP管移置于37℃恒温加热器上，加热5min。

5)加入SOC培养液800μL，放置于摇床中28℃，200rpm/min培养4-5h。

6)菌液于4000rpm/min离心5min。

7)在超净台中吸取上清，剩余约100μL，将菌体轻轻吹打悬浮混匀。

8)用灭菌玻璃球将菌液均匀涂布于LB+Rif+Kana固体培养基，于28℃恒温培养箱培养48h。

9)按实施例2中4.6相同方法步骤进行菌落PCR鉴定，并将鉴定转入重组质粒的阳性农杆菌-80℃保存。

实施例6：TePTF1在烟草中瞬时表达

本实施例将TePTF1基因通过农杆菌介导方法在烟草叶片中瞬时表达，对TePTF1编码蛋白的表达进行检测，并对表达TePTF1基因的烟草样品中叶黄素的含量进行测定。

1、试剂

乙酰丁香酮、HA标签小鼠单克隆抗体购于美国Sigma公司；PageRuler PlusPrestained Protein Ladder、Western Blot ECL Substrate购于美国 ThermoScientific公司。其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

烟草(Nicotiana benthamiaaa)来自美国University of Idaho大学 FangmingXiao博士实验室，种植于人工气候培养室。

3、培养基和溶液

IM溶液：

475mL IM溶液：2-吗啉乙磺酸(MES)4.88g；葡萄糖2.5g；NaH₂PO₄ 0.126g。先将MES加入到ddH₂O中，调节pH值至5.6，再加入葡萄糖和NaH₂PO₄，搅拌均匀，高温灭菌。

1L 20×AB盐溶液：NH₄Cl 20g；MgSO₄，6g；KCl，3g；FeSO₄0.05g，CaCl₂， 2g。依次加入各组分，完全且均匀溶解后，高温灭菌。

200mM乙酰丁香酮(acetosyringone，1000×)：将39mg乙酰丁香酮粉末溶于1mLDMSO，-20℃避光保存。

20mL诱导培养基：IM溶液19mL，20×AB盐溶液1mL，200mM乙酰丁香酮20μL，25mg/mL卡那霉素20μL。

1L 5×蛋白质电泳缓冲液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)15.1g，甘氨酸 72.0g，SDS5.0g。

1L 10×western blot转膜缓冲液：甘氨酸144g，Tris 30.2g。将Tris、甘氨酸溶解于0.9L ddH₂O中，搅拌混匀，加ddH₂O定容至1L。配制1L 1×转膜缓冲液时，加入10×转膜缓冲液100mL、甲100mL，加ddH₂O定容至1L。

1L 10×TBS(Trish-buffered saline)缓冲液：：NaCl 80g，KCl 2g， Tris 30g。将各组分溶解于0.8L ddH₂O中，调pH至7.4，加ddH₂O定容至 1L。配制1L 1×TBST(Trish-buffered saline with Tween)缓冲液时，加入10×TBS 100mL、20％Tween-202.5mL，加ddH₂O定容至1L。

蛋白质提取缓冲液：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，5mM 乙二胺四乙酸，10％甘油、1％聚乙烯吡咯烷酮、20μM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟、植物蛋白酶抑制剂(plant protease inhibitors，100μL/10mL提取缓冲液)。

4、方法

4.1烟草瞬时表达

将TePTF1基因通过农杆菌介导方法在烟草叶片中瞬时表达，对TePTF1 编码蛋白的表达进行检测。

1)将转入pBTEX-TePTF1重组质粒和pBTEX-HA空载体的农杆菌，分别在带有Rif和Kana的LB培养板上划线，28℃恒温箱中培养48h。

2)挑取单克隆28℃培养12h，取300μL菌转接至2.7mL LB+Rif+Kana 培养液中，28℃培养6-8h。

3)室温条件下，3000rpm离心6min，弃上清，加入3mL IM溶液重悬菌体；重复一次，以3mL IM溶液重悬菌体后，28℃ 250rpm培养5-14h；

4)3000rpm离心6min，弃上清，加入10mM MES 2mL(pH 5.7，带有200mM ACE 200μL)，重悬菌体，涡旋震荡。重复一次；

5)以10mM MES作为空白对照，测定菌液浓度(OD₆₀₀)，配制侵染液；

6)使用一次性注射器，将侵染液从烟草叶片下表皮注射到叶片中，并标记侵染范围；

7)将注射植株置于阴暗处0.5h，放于光照下生长36-48h收取样品，液氮中速冷，-80℃保存。

4.2western杂交

1)从-80℃冰箱中取出样品，研钵中液氮磨样，将样品磨成粉末状，转入预冷的1.5mL EP管中。

2)加入300μL蛋白质提取液，在涡旋仪器上震荡，使得提取液和样品混合均匀，静置10min。

3)低温离心机中4℃ 12000rpm离心10min。

4)吸取200μL上清转移至新的EP管中，加入2×蛋白上样缓冲液100 μL，95℃加热5min。

5)将样品点入聚丙烯凝胶中，电泳2h。

6)转膜后以5％脱脂牛奶封闭1h，抗体免疫反应1h。。

7)洗膜3次，加入辣根过氧化酶联二抗，室温1h。

8)洗膜3次，加入反应底物(western blotting ECL substrate)，在化学发光仪中对蛋白表达情况进行检测。

4.3叶黄素含量测定

按照实施例4方法所述，对表达TePTF1基因的烟草叶片中叶黄素含量进行测定。pBETX-HA空载体作为负对照。

5、结果

Western blot蛋白印迹实验结果显示，所构建万寿菊转录因子基因TePTF1 植物表达载体通过农杆菌介导，使TePTF1基因编码蛋白在烟草叶片中表达，获得约30KD预期大小蛋白条带。表达的TePTF1基因的烟草叶片组织与转入空载体的对照样品相比，叶黄素含量升高，从0.25mg/g干重增至0.33mg/g干重，所述SEQ ID NO.1基因在植物叶黄素合成途径中具有正调控作用，本发明从色素万寿菊中克隆转录因子TePTF1能够用于提高植物叶黄素含量。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 合肥工业大学

<120> 调控叶黄素合成的转录因子基因及应用

<160> 2

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> 万寿菊（Tagetes erecta）

<220>

<221> mRNA

<222> (1)…(798)

<223> 万寿菊叶黄素合成调控基因

<400> 1

CATCTTTTGC TCTGTTTCAT CCATGGTGAG ATCACCTTGT TGTGAAAAAG ATCACACCAA 60

CAAAGGTGCA TGGACCAAAG AAGAAGATGA ACGTCTTGTT ACCTACATCA ACGCCCATGG 120

TGAAGGCTCA TGGAGATCTT TACCTAAATC AGCCGGTTTA AACCGATGCG GAAAAAGTTG 180

TAGACTCCGT TGGATTAATT ATCTCAGACC CGATCTCAAA CGCGGTAATT TCACCCCGCA 240

GGAAGATCAA CTCATTGTTA GTCTCCATGC AGTTCTTGGT AACAAGTGGT CTATGATTGC 300

TTCAAGATTA CCTGGGCGGA CGGATAACGA AATCAAGAAT TACTGGAATA CACATATCAA 360

GAGGAAACTG TCTGTTAATC ACCCCACTCC AACAACCGCA GCCACCACCA CCACAGCCAA 420

TGTTGTGAAA GCCGTACAAC AAACACATGT TCCACCACTA CCTGAGTATT CAGCACAGGT 480

AGTGGAGACA TCTAACAGTG GCGGCGGTGG TGGAGGAGGT GGGGGAGGGG GTGTGAGTAG 540

CAGTTCCACT AGTGGATTAT CAATTGAAGA GTATACACAA GTTGTGAACA TCAAAGAACC 600

TGAAATCAAT CTTGAGCTAT CTATTGGTCT ACCGTTGAGT CCCGAACCGA AAACAGTGAC 660

GGTGCCAGTG TCAACAGCAC CGCCACGGGT TTCGGTTTCT CCATTTACTT TTTATCAAGA 720

AAGTAGTAAT GGGTGTGGCT TGTTGTTTAA CAATGAGCAT AGTATCAGTA TATGGAGATG 780

ATAGGGTTAA TGATAGTT 798

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 万寿菊（Tagetes erecta）

<400> 2

Met Val Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Asp His Thr Asn Lys Gly

1 5 10 15

Ala Trp Thr Lys Glu Glu Asp Glu Arg Leu Val Thr Tyr Ile Asn

20 25 30

Ala His Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ser Ala Gly

35 40 45

Leu Asn Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr

50 55 60

Leu Arg Pro Asp Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Pro Gln Glu Asp

65 70 75

Gln Leu Ile Val Ser Leu His Ala Val Leu Gly Asn Lys Trp Ser

80 85 90

Met Ile Ala Ser Arg Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys

95 100 105

Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile Lys Arg Lys Leu Ser Val Asn His

110 115 120

Pro Thr Pro Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Asn Val Val

125 130 135

Lys Ala Val Gln Gln Thr His Val Pro Pro Leu Pro Glu Tyr Ser

140 145 150

Ala Gln Val Val Glu Thr Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

155 160 165

Gly Gly Gly Gly Gly Val Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly Leu Ser

170 175 180

Ile Glu Glu Tyr Thr Gln Val Val Asn Ile Lys Glu Pro Glu Ile

185 190 195

Asn Leu Glu Leu Ser Ile Gly Leu Pro Leu Ser Pro Glu Pro Lys

200 205 210

Thr Val Thr Val Pro Val Ser Thr Ala Pro Pro Arg Val Ser Val

215 220 225

Ser Pro Phe Thr Phe Tyr Gln Glu Ser Ser Asn Gly Cys Gly Leu

230 235 240

Leu Phe Asn Asn Glu His Ser Ile Ser Ile Trp Arg

245 250

Claims

1.调控万寿菊叶黄素合成的转录因子基因，其特征在于：其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的转录因子基因在植物叶黄素合成中的应用。