CN110272905B

CN110272905B - 一种提高植物类黄酮含量的基因及应用

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Publication number: CN110272905B
Application number: CN201910597255.3A
Authority: CN
Inventors: 牛向丽; 王瑞鹏; 冯国栋; 商亚芳; 黄胜雄; 王莹莹; 徐焕焕; 王洋
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2019-07-03
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2039-07-03
Also published as: CN110272905A

Abstract

本发明公开了一种提高植物类黄酮含量的基因及应用。该基因TeTF5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明在万寿菊成熟花中克隆获得了TeTF5基因。基因表达水平分析结果表明，TeTF5在芦丁含量较高的万寿菊成熟花中表达量较未成熟花显著升高。当在烟草叶片中表达TeTF5基因时，黄酮类化合物含量增加。本发明从万寿菊所克隆TeTF5基因在类黄酮生物合成中发挥调控作用，能够用于提高植物中芦丁等黄酮类化合物含量。

Description

一种提高植物类黄酮含量的基因及应用

技术领域

本发明涉及植物遗传工程技术领域，具体涉及一种从万寿菊中克隆获得的类黄酮合成途径调控基因TeTF5，以及该基因在调控植物中芦丁等黄酮类化合物含量方面的应用。

背景技术

类黄酮(flavonoids)是一类具有黄烷核基本骨架(两个具酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接)的多酚类重要次生代谢物。在植物中，类黄酮在病原菌防御、紫外辐射等多种生物、非生物胁迫中发挥重要保护作用。由于黄酮类化合物能够清除自由基、抗辐射，同时也能降低毛细血管的通透性和脆性，具有多种药用功效，可以防治高血脂症、糖尿病及高血压等疾病。同时，一些黄酮类化合物，如芦丁(rutin)也可作为复配药和药物中间体，有广泛的药用价值。此外，类黄酮可以作为添加剂，以天然食用色素和抗氧剂进行使用。由于类黄酮吸收紫外线能力较强，也可以在化妆品中作为防晒霜的主要成分加以利用。类黄酮在植物中虽广泛存在，但目前提取芦丁等黄酮类化合物的植物原料主要为苦荞、槐米、橙皮、芦笋等。

万寿菊(Tagetes erecta L.)属菊科一年生草本植物，虽原产于墨西哥及美洲地区，但在中国云南、山东、内蒙古等地都有规模种植。万寿菊花色鲜艳，呈黄色至橙红色，花期较长，使其成为园林观赏植物。此外，由于万寿菊花中富含类胡萝卜素，通过培育种植高色素含量品种，使其成为提取类胡萝卜素，尤其是叶黄素的一种主要植物资源。除类胡萝卜素之外，万寿菊中还富含酚类、萜类物质，使其具备较高的食用和药用价值。

通过对模式植物的研究，类黄酮的合成途径主要步骤已有较清楚的了解。前体物质丙二酰辅酶A、香豆酰辅酶A在查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)和查尔酮异构酶(cha lcone isomerase，CHI)作用下形成柚皮素，然后由黄烷醇3-脱氢酶(flavanone 3-hydroxylase，F3H)、黄烷醇合成酶(flavonol synthetase，FLS)等酶催化下形成各种下游黄酮类化合物质。其中CHS是黄酮类生物合成的第一个关键酶，也是整个合成过程中的重要限速酶，直接影响着下游黄酮类化合物的生物合成。万寿菊中富含多酚类物质，提示其类黄酮合成途径也可能较为活跃，但对万寿菊合成途径相关催化酶基因、调控基因序列信息所知甚少。编码类黄酮合成途径各反应步骤催化酶的基因是万寿菊中黄酮类物质合成的分子基础，而调控这些催化酶表达的转录基因则可能发挥重要的整体调节作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种调控万寿菊类黄酮合成途径的基因TeTF5。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供上述TeTF5基因在调控植物类黄酮合成中的应用。

对于TeTF5基因，本发明提供的技术方案是，一种调控万寿菊类黄酮合成途径的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还包括上述TeTF5基因在调控植物类黄酮合成中的应用。

本发明从万寿菊中克隆类黄酮生物合成调控基因，命名为Tagetes erectaTranscription Factor 5(简称TeTF5)。

本发明从万寿菊中进行TeTF5基因的克隆：根据对万寿菊的高通量转录组深度测序对TeTF5基因进行数据组装；然后利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊成熟花花瓣中提取总RNA，反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)克隆获得TeTF5基因。

通过在万寿菊未成熟、成熟花组织的基因表达水平分析和黄酮类代表物质芦丁含量测定，以及表达TeTF5基因的烟草叶片中总黄酮、芦丁含量的检测，表明TeTF5基因在类黄酮合成中发挥作用，能够用于调控植物中黄酮类化合物的含量。

本发明的有益效果是：

本发明的万寿菊基因TeTF5为在植物中类黄酮的合成提供了一种新的调控基因资源，可用于富含类黄酮植物材料的培育和改良。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例的万寿菊未成熟花、成熟花中TeTF5、TeCHS基因表达量分析，及对应样品中黄酮类代表物质芦丁的含量测定结果。

图2是本发明实施例TeTF5基因在烟草叶片中表达的Western blot蛋白印迹检测结果。

具体实施方式

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J.和Russell，D.W.的分子克隆实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：万寿菊高通量转录组测序

由于万寿菊基因组尚未测定，为获得万寿菊功能基因转录本序列，利用万寿菊栽培品种组织样品，通过分别提取三个单株的叶片、未成熟花、成熟花RNA各1份，进行高通量转录组序列测定与组装注释。

1、试剂

植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于TaKaRa公司，RNA文库制备试剂盒(RNA Library Prep Kit)来自北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王购于赤峰鑫卉园艺公司。

3、方法

3.1 RNA提取

1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1mlTrizol，剧烈震荡，室温放置5min；

2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；

3)4℃，12000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；

4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；

5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；

6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底；

7)加入1mL 70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

9)室温干燥5-10min；

10)加入50μL无RNA酶水(RNase-free H₂O)，溶解RNA；

11)根据RNA溶液浓度取RNA 50μg，加入5μL 10X缓冲液(400mM Tris-HCL，pH 7.5，80mM MgCl₂，50mM DTT)、5μL Dnase I、2μL RNA酶抑制剂，37℃反应30min；

12)加入2.5μL 0.5M EDTA，80℃，2min失活Dnase；

13)加入10μL 3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；

14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

15)加入1mL 70％乙醇清洗RNA；

16)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

17)室温干燥5-10min；

18)加入50μL无RNA酶水，溶解RNA；

19)检测RNA样品的纯度、浓度。

3.2转录组测序组装与注释

转录组测序利用RNA Library Prep Kit，通过北京百迈客生物科技有限公司Illumina HiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：

1)用带有Oligo(dt)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；

2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、RNA酶H和DNA聚合酶I合成第二条cDNA链，利用微珠(beads)纯化cDNA；

3)纯化的双链cDNA再进行末端修复，并连接测序接头，然后用微珠进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库；

4)对文库的浓度和插入片段大小进行检测；

5)利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，测序读长为PE125；

6)将测序片段(reads)截除测序接头、引物序列，过滤低质量值数据后，获得高质量的测序数据；

7)利用Trinity组装软件将高质量测序read延伸成较长的片段(contig)，并利用这些片段之间的重叠，得到片段集合(component)，最后利用De Bruijn图的方法获得转录本序列(unigene)；

8)使用BLAST软件将转录本序列(unigene)与NR(NCBI非冗余数据库)、Swiss-Prot(欧洲生物信息学研究所维护数据库)、GO(Gene Ontology)、COG(Clusters ofOrthologous Groups)、KOG(euKaryotic Orthologous Groups)、KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)数据库比对；

9)利用TransDecoder软件进行unigene的编码区序列及其对应氨基酸序列的预测，使用HMMER软件与Pfam(Protein family)数据库比对，获得unigene的注释信息。

4.结果

通过上述将万寿菊组织材料进行RNA提取、建库、高通量转录组深度测序，然后对测序序列进行组装和基因功能预测。对类黄酮合成途径基因的组装注释和分析结果表明，在万寿菊中，该合成途径中分布有69个相应催化酶基因，这些大量存在的催化酶基因提示该植物资源中合成黄酮类物质的分子基础。与未成熟花相比，一些类黄酮合成途径基因表达水平在成熟花中发生了显著变化，尤其是整个合成过程中的第一个关键限速酶-查尔酮合成酶基因TeCHS(Tagetes erecta chalcone synthase)，在成熟花中表达水平显著升高了9.3倍(图1)。相应地，对成熟花中表达明显升高的调控基因进行分析，其中组装获得的Tagetes erecta Transcription Factor 5(TeTF5)基因推测序列，在成熟花中显著提高了28.7倍(图1)。

实施例2：不同发育时期万寿菊花中芦丁含量的测定

取实施例1测序对应时期的万寿菊未成熟花、成熟花样品，进行黄酮类物质提取。由于类黄酮成分芦丁具有典型的黄酮类结构，在很多含有黄酮类物质的植物中广泛存在，而且含量比较高，是类黄酮家族中比较典型的代表物质。进一步以芦丁标准品按照高效液相方法对不同发育时期万寿菊花中类黄酮的含量进行测定。

1、试剂

芦丁标准品购于上海源叶生物科技有限公司，乙腈、二氯甲烷、甲醇为国产色谱纯。

2、方法

取万寿菊未成熟花、成熟花样品，45℃烘干。将烘干后样品液氮研磨，称重0.2g，加入3mL甲醇，以超声仪提取1h，重复提取一次，合并提取液，过滤，取50μL滤液上样。色谱条件：高效液相色谱仪(美国WATERS公司)；色谱柱SymmetryC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈∶二氯甲烷∶甲醇为7∶2∶1(v∶v∶v)；流速1mL/min；检测波长510nm；柱温25℃。

3、结果

根据芦丁标准品标准曲线和HPLC测定结果，测得万寿菊未成熟花、成熟花中芦丁含量平均值分别为3.061、9.769mg/g干重。在成熟花中类黄酮代表物质芦丁的含量显著高于未成熟花。

实施例3：万寿菊TeTF5基因的克隆

根据实施例1对万寿菊TeTF5基因的数据组装，利用引物设计软件Primer Premier5.0设计PCR特异引物，从万寿菊成熟花中提取总RNA，反转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)克隆获得TeTF5基因。

1、试剂

植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于TaKaRa公司，反转录酶、dNTP、高保真DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、载体与菌株

克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector购于北京全式金生物技术有限公司，大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α购于北京全式金生物技术有限公司。

3、培养基与试剂

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基：方法同上述SOB培养基的配制，再加入2mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖。

100×Mg²⁺溶液：20.33g MgCl₂.6H₂O和24.65g MgSO₄.7H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

1000×氨苄青霉素：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。

4、方法

4.1万寿菊成熟花组织RNA提取

如实施例1中3.1所述操作步骤进行。

4.2 RT-PCR

4.2.1 RT

1)取1μg总RNA与1μL polyT₁₈(10μM)引物混合，用RNase-free ddH₂O补足到12.75μL，轻轻混匀；

2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；

3)加入5×反应缓冲液4μL、10mM dNTP 2μL、RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)、反转录酶1μL(100U/μL)，42℃1h，合成第一链cDNA；

4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应；

4.2.2 PCR

根据实施例1所述获得的TeTF5基因推测序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，具体的序列如下：

TeTF5F1：5’ ttctacatctccactaaccctca 3’

TeTF5R1：5’ taagattcataacaatcatccctta 3’

TeTF5F2：5’ ggggtaccatggagtcacttaacagatgctc 3’

TeTF5R2：5’ gaaggcctatgaaacgacgtcgtcgttac 3’

取4.2.1所获万寿菊成熟花的cDNA，进行TeTF5基因的克隆。将200μL EP管放置于冰上，加入试剂：

按以下程序进行扩增：98℃ 2min(预变性)；98℃ 10s(变性)，55℃ 20s(复性)，72℃ 60s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃ 5min(总延伸)。

以上述PCR产物为模板，以引物TeTF5F2和TeTF5R2进行第二轮PCR，复性温度56℃，其它条件同上。

通过上述操作，获得了TeTF5基因PCR扩增产物。

4.3 PCR扩增产物与pEASY-Blunt载体连接

将由上述4.2所述获得的TeTF5基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY-Blunt SimpleCloning Vector按摩尔分子数比1∶4连接(25℃，15min)，连接体系如下：

pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(50μg/μL) 4μL

PCR产物(～150μg/μL) 1μL

4.4大肠杆菌转化

1)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受态细胞冰浴解冻；

2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

3)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；

4)加入0.8mL SOC，混匀，37℃温和振荡培养1h；

5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养12h。

4.5菌落PCR鉴定

将4.4所述大肠杆菌再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：

反应条件：94℃ 3min(预变性)；94℃ 30s(变性)，56℃ 20s(复性)，72℃ 60s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72℃ 5min(总延伸)。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-TeTF5，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-Blunt克隆载体的TeTF5基因全长序列，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

实施例4：TeTF5基因植物表达载体的构建

将pEASY-TeTF5质粒、植物表达载体pBTEX-HA载体进行酶切纯化和连接，并转化大肠杆菌，测序鉴定正确后转入农杆菌。

1、试剂

胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于天根生化科技有限公司，高保真DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶购于北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶Kpn I和Stu I购于Fermentas公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、载体和菌株

植物表达载体pBTEX-HA、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV2260来自美国University of Idaho大学Fangming Xiao博士实验室。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α购于北京全式金生物技术有限公司。

3、培养基和溶液

LB液体培养基、LB固体培养基、SOC培养基配制方法如实施例3中所述。

1000×卡那霉素(Kan)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。

500×利福平(Rif)：50mg/mL，溶于甲醇或DMSO中，-20℃保存。

4、方法

4.1质粒提取

将实施例3所获pEASY-TeTF5质粒、植物表达载体pBTEX-HA载体进行质粒提取，实验步骤按试剂盒的说明书进行。

1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm，离心1min，弃废液，待用；

2)12000rpm，1min，离心收集菌沉淀，尽量弃尽上清；加入250μL P1(已加RNaseA)，吹吸混匀至菌沉淀彻底悬浮；

3)加入250μL P2，温和上下翻转8次离心管，使菌体充分裂解；

4)加入350μL P3，立即温和上下翻转8次离心管，12000rpm，离心10min；

5)吸出上清至新的离心管中，12000rpm，离心5min；

6)小心转移上清至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃废液；

7)加入500μL PD，12000rpm，离心1min，弃废液；

8)加入600μL PW(已加无水乙醇)，12000rpm，离心1min，弃废液，重复操作一次；

9)12000rpm，离心2min，除尽残留的PW；

10)将吸附柱转移至新离心管中，在柱中央加入50μL无菌ddH₂O，室温2min，12000rpm，离心2min，洗脱DNA；

11)将重新洗脱液吸出至吸附柱中，再重复此操作一次。

4.2质粒酶切

用Kpn I和Stu I酶切pEASY-TeTF5、pBTEX-HA。

反应体系如下所述，37℃，1h：

4.3胶纯化

将上述4.2酶切后TeTF5基因编码序列片段、pBTEX-HA质粒进行胶回收，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。

1)向胶回收吸附柱CA2中加入500μL的平衡液BL，在12000rpm离心机中离心1min，倒去柱底部的废液；

2)带上塑胶手套，在紫外切胶仪器上回收电泳分离DNA片段，将切下的凝胶块放入预先准备的干净的EP管中；

3)根据胶的质量来确定加入溶胶液PN的体积，根据1∶1体积加入。将EP管放入50℃的加热器上，加速溶解的速度，溶解10-15min，至胶完全溶解为止；

4)溶胶完全后，待其冷去至室温后，将溶解液体转入到胶回收吸附柱CA2中，静置3min，让溶胶液和吸附膜充分接触；

5)静置完全后，在12000rpm离心机中离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2收集柱底部的废液。向吸附管中加入600μL的PW，漂洗洗去质粒中的杂质，静置3min；

6)12000rpm离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2收集柱底部的废液。完成后，重复上一步的过程；

7)将空的吸附柱放入离心机中12000rpm离心3min，放置于通风处，放置15min，待酒精全部挥发干净；

8)向吸附柱CA2中正中心吸附膜上加入30μL洗脱剂EB，静置3min，12000rpm离心3min，获得胶回收产物。

4.3连接

将酶切回收的TeTF5基因编码序列片段、pBTEX-HA质粒以T4连接酶进行连接，反应体系如下，25℃，3h：

4.4大肠杆菌转化

将上述连接产物进行大肠杆菌转化，实验步骤如实施例3中4.4所述。

4.5菌落PCR鉴定

将上述4.4所获大肠杆菌菌落进行单克隆挑取、培养，然后进行菌落鉴定，实验步骤如实施例3中4.5所述。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pBTEX-TeTF5，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pBTEX并带有HA标签的TeTF5基因植物表达载体。

4.6农杆菌转化

1)按本实施例中4.1所述步骤提取pBTEX-TeTF5质粒；

2)将pBTEX-TeTF5加入50μL农杆菌菌株GV2260感受态细胞中，轻轻搅拌混匀，在冰上冰浴30min；

3)放置于液氮中冷激1min；

4)将EP管移置于37℃恒温加热器上，加热5min；

5)加入SOC培养液800μL，放置于摇床中28℃，200rpm/min培养4-5h；

6)菌液于4000rpm/min离心5min；

7)在超净台中吸取上清，剩余约100μL，将菌体轻轻吹打悬浮混匀；

8)用灭菌玻璃球将菌液均匀涂布于LB+Rif+Kan固体培养基，于28℃恒温培养箱培养48h；

9)按本实施例中4.5所述相同方法步骤进行菌落PCR鉴定，并将鉴定转入重组质粒的阳性农杆菌-80℃保存。

实施例5：TeTF5基因在烟草叶片中表达

将TeTF5基因通过农杆菌介导方法在烟草叶片中瞬时表达，对TeTF5编码蛋白的表达情况进行检测，并对表达TeTF5基因的烟草样品中类黄酮的含量进行测定。

1、试剂

乙酰丁香酮、小鼠HA标签单克隆抗体anti-HA、抗小鼠抗体anti-mouse购于Sigma公司；PVDF膜购于Merck Millipore公司；ECL蛋白印迹底物购于GE公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

本氏烟草(Nicotiana benthamiana)来自美国康奈尔大学博伊斯汤普森研究所，种植于人工气候培养室。

3、培养基与试剂

IM溶液：2-吗啉乙磺酸(MES)4.88g；葡萄糖2.5g；NaH₂PO₄ 0.126g。先将MES加至去离子水中，调节pH值至5.6，再加入葡萄糖、NaH₂PO₄，搅拌均匀，定容至475mL，高温灭菌。

20×AB盐溶液：NH₄Cl 20g；MgSO₄ 6g；KCl 3g；FeSO₄ 0.05g，CaCl₂ 2g。依次加入各组分，完全且均匀溶解后定容至1L，高温灭菌。

200mM乙酰丁香酮(acetosyringone，1000×)：将39mg乙酰丁香酮粉末溶于1mL二甲基亚砜，-20℃避光保存。

诱导培养基：IM溶液19mL，20×AB盐溶液1mL，200mM乙酰丁香酮20μL，25mg/mL卡那霉素20μL，加去离子水定容至20mL。

蛋白质提取缓冲液：50mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH 7.5)，150mMNaCl，5mM乙二胺四乙酸，10％甘油、1％聚乙烯吡咯烷酮、20μM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟、植物蛋白酶抑制剂(plant protease inhibitors，100μL/10mL提取缓冲液)。

5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)0.6mL，50％甘油5mL，10％SDS2mL，β-巯基乙醇0.5mL，1％溴酚蓝1mL，加入去离子水定容至10mL。

10×SDS-PAGE电泳缓冲液：120g Tris、576g甘氨酸、40g十二烷基磺酸钠溶解于去离子水中，定容至4L。使用前加去离子水稀释至1×。

10×western blot转膜缓冲液：144g甘氨酸、30.2g Tris溶解于0.9L去离子水中，搅拌混匀，定容至1L。配制1L 1×转膜缓冲液时，加入10×转膜缓冲液100mL、甲醇100mL，加去离子水定容至1L。

10×TBS(Tris-buffered saline)缓冲液：将80g NaCl、2g KCl、30g Tris溶解于0.8L去离子水中，调pH至7.4，加去离子水定容至1L。配制1×TBST(Tris-buffered salinewith Tween)缓冲液时，加入10×TBS 100mL、20％Tween-20 2.5mL，加去离子水定容至1L。

4、方法

4.1烟草瞬时表达

1)将转入pBTEX-TeTF5、pBTEX-HA载体的农杆菌，分别在带有Rif和Kan的LB培养板上划线，28℃恒温箱中培养48h；

2)挑取单克隆28℃培养12h，取300μL菌转接至2.7mL LB+Rif+Kan培养液中，28℃培养6-8h；

3)室温条件下，3000rpm离心6min，弃上清，加入3mL IM溶液重悬菌体；重复一次，以3mL IM溶液重悬菌体后，28℃ 250rpm培养5-14h；

4)3000rpm离心6min，弃上清，加入10mM MES 2mL(pH 5.7，带有200mM乙酰丁香酮200μL)，重悬菌体，涡旋震荡。重复一次；

5)以10mM MES作为空白对照，测定测量菌液浓度(OD₆₀₀)，配制侵染液；

6)使用一次性注射器，将侵染液从烟草叶片下表皮注射到叶片中，并标记侵染范围；

7)将注射植株置于阴暗处0.5h，然后放于光照下生长36-48h后收取叶片样品，在液氮中速冷，-80℃保存。

4.2 western杂交

1)从-80℃冰箱中取出样品，研钵中液氮磨成粉末状，转入预冷的1.5mL EP管中；

2)加入300μL蛋白质提取液，在涡旋仪器上震荡，使得提取液和样品混合均匀，静置10min；

3)低温离心机中4℃ 12000rpm离心10min；

4)吸取200μL上清转移至新的EP管中，加入5×蛋白上样缓冲液40μL，95℃加热5min。

5)将样品进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳；

6)凝胶进行PVDF膜转印，100V，1h；

7)将PVDF膜以5％脱脂牛奶封闭1h；

8)加入anti-HA抗体室温反应1h；

9)以1×TBST缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化酶联的抗小鼠抗体，室温反应1h；

10)以1×TBST缓冲液洗膜3次，加入反应底物(western blotting ECL substrate)，在化学发光仪中对蛋白表达情况进行检测。

4.3类黄酮含量测定

称取上述4.1所获得烟草样品3.0g，置于25mL具塞试管中，加入80％乙醇20mL于暗室中4℃浸提24h，过滤至25ml容量瓶中，用80％的乙醇溶液不断清洗样品，进行定容，即得到黄酮粗提液。量取5mL粗提液于试管中，加入5％亚硝酸钠溶液0.5mL，颠倒混匀，室温静置6min，然后加入10％三氯化铝溶液0.5mL，摇匀，静置6min后加入4％氢氧化钠溶液2mL，混匀，放置10min，于510nm测定吸光度。以芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的含量。

按照实施例4方法所述，对表达TeTF5基因的烟草叶片中黄酮代表物质芦丁的含量进行提取和高效液相色谱测定。注入pBTEX-HA空载体的烟草样品作为对照。

5、结果

Western blot蛋白印迹实验结果显示(图2)，通过农杆菌介导，在注射万寿菊TeTF5基因进行植物表达的烟草叶片中，获得约60KD预期大小TeTF5编码蛋白条带，而未转入外源基因的pBTEX空载体的对照样品则未检测到标签蛋白表达产物。同时，表达TeTF5的烟草叶片组织与转入空载体的对照样品相比，总黄酮含量由0.06mg/g升高至0.13mg/g。进一步对黄酮类化合物中的典型代表物质芦丁的含量进行HPLC测定，结果显示在转入并翻译表达TeTF5基因的烟草中芦丁的平均含量为0.09mg/g，明显高于未表达TeTF5的烟草叶片(0.05mg/g)。表明如SEQ ID NO.1所示的基因在类黄酮合成途径中具有调控作用，本发明从万寿菊中克隆的转录因子TeTF5能够用于提高植物类黄酮含量。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种提高植物类黄酮含量的基因及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 万寿菊(Tagetes erecta)

<400> 1

ttctacatct ccactaaccc tcataagatc ctattttcca caaccaaatc ccaacatgga 60

gtcacttaac agatgctcat cagcctcttc ttcgtcatca gaatcatcag actcttcaca 120

ctcgaacaaa acggaccgaa tcaagggtcc ttggaacgct gaagaggatc ggatcttaac 180

tcgacttgtt gacacatatg gcccaagaaa ctggtcactt attagcaagt atataaaggg 240

acgttccggt aaatcttgta gactcaggtg gtgtaatcag cttagtccca atgtgcaaca 300

ccgcccgttt tctacggccg aggatgagac cattttagct gctcaagctc agtatggtaa 360

ccggtgggct accattgcgc gtttgcttcc tggacggacg gataatgcgg tcaagaatca 420

ttggaactcg acgttgaaac gacgtcggat tgagaaattg gattcggaga tggaggttat 480

gaggtttggg gatagttctt tgtcgtcggg atttgtgtcg agtggggttg tggaggatcc 540

gatgacgacg ctgtcgttgg ctacacccgg gatgggtgga tatgggtcgc cggagaaagt 600

gaccgagaat atgtcggtgg agttttggga tgctatgaga ggggtgattg cgagagaggt 660

tagggaatat gtaacgacga cgtcgtttca ttaggctctg ggattcatta attaatgaac 720

ttattattta ttttatttta taaattttat tttttataat tttttaaggg atgattgtta 780

tgaatctta 789

<210> 2

<211> 212

<212> PRT

<213> 万寿菊(Tagetes erecta)

<400> 2

Met Glu Ser Leu Asn Arg Cys Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Glu

1 5 10 15

Ser Ser Asp Ser Ser His Ser Asn Lys Thr Asp Arg Ile Lys Gly Pro

20 25 30

Trp Asn Ala Glu Glu Asp Arg Ile Leu Thr Arg Leu Val Asp Thr Tyr

35 40 45

Gly Pro Arg Asn Trp Ser Leu Ile Ser Lys Tyr Ile Lys Gly Arg Ser

50 55 60

Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Cys Asn Gln Leu Ser Pro Asn Val

65 70 75 80

Gln His Arg Pro Phe Ser Thr Ala Glu Asp Glu Thr Ile Leu Ala Ala

85 90 95

Gln Ala Gln Tyr Gly Asn Arg Trp Ala Thr Ile Ala Arg Leu Leu Pro

100 105 110

Gly Arg Thr Asp Asn Ala Val Lys Asn His Trp Asn Ser Thr Leu Lys

115 120 125

Arg Arg Arg Ile Glu Lys Leu Asp Ser Glu Met Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Gly Asp Ser Ser Leu Ser Ser Gly Phe Val Ser Ser Gly Val Val Glu

145 150 155 160

Asp Pro Met Thr Thr Leu Ser Leu Ala Thr Pro Gly Met Gly Gly Tyr

165 170 175

Gly Ser Pro Glu Lys Val Thr Glu Asn Met Ser Val Glu Phe Trp Asp

180 185 190

Ala Met Arg Gly Val Ile Ala Arg Glu Val Arg Glu Tyr Val Thr Thr

195 200 205

Thr Ser Phe His

210

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ttctacatct ccactaaccc tca 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

taagattcat aacaatcatc cctta 25

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggggtaccat ggagtcactt aacagatgct c 31

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gaaggcctat gaaacgacgt cgtcgttac 29

Claims

1.一种调控万寿菊类黄酮合成的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的基因，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述基因在提高植物类黄酮合成中的应用。