KR100544994B1 - 배추의 안토사이아니딘 합성에 관여하는디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)로부터 분리된 안토사이아니딘(Anthocyanidin) 합성의 가장 결정적인 단계의 물질인 디하이드로플라보놀 환원효소(Dihydroflavonol reductase)를 코딩하는 유전자에 관한 것으로, 이를 이용하여 배추 및 그 유사작물을 형질전환시키면, 인간에 있어 유용성분인 디하이드로플라보놀 환원효소의 생합성량을 높일 수 있고, 식물체내 화색변화를 유도하여 식물의 관상가치를 높일 수 있으므로 원예 및 농업발전에 있어서 매우 유용한 발명이다.
배추, 안토사이아니딘, 디하이드로플라보놀 환원효소
Description
도 1은 DFR F1/DFR R1 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 배추로부터 증폭된 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 코딩하는 유전자의 단편을 전기영동한 사진이다.
도 2는 DFR F1/DFR R4 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 배추로부터 증폭된 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 전체 유전자를 전기영동한 사진이다.
도 3은 DFR F1/DFR R4 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 배추로부터 증폭된 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 전체 유전자의 아미노산과 양배추(Brassica oleracea) 유전자의 아미노산을 상동성 비교한 결과이다.
본 발명은 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)로부터 분리된 안토사이아니딘(Anthocyanidin) 합성의 가장 결정적인 단계의 물질인 디하이드로플라보놀 환원효소(Dihydroflavonol reductase)를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
일반적으로 안토사이아니딘(Anthocyanidin)은 꽃의 색깔을 결정하는 여러 가지 색소 중에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 꽃 수분의 유인, UV-B 광선에 대한 방어 기능, 항산화성과 항암성이 있는 것으로 보고되어 있다. 안토사이아니딘(Anthocyanidin)은 카로티노이드(Carotenoid)와 함께 꽃 색깔에 관여 하는데, 안토사이아니딘은 플라고니딘(오렌지색에서 붉은 벽돌색), 사이아니딘(붉은색에서 분홍색), 그리고 딜피니딘(보라색에서 파란색)으로 분류되어지는 것으로 알려져 있다.
안토사이아니딘(Anthocyanidin)의 생합성 경로는 플라보노이드의 신진대사의 사이사이 과정에서 많이 보고되어 왔다. 그리고 돌연변이에 의해 여러 가지 효소가 작용한다는 것도 밝혀졌다. 처음 대상 작물은 애기 장대(Arabidopsis)를 가지고 연구하여 칼콘 합성효소(chalcone synthase: CHS), 칼콘 이성질화효소(chalcone isomerase: CHI), 플라바논 3-하이드로플라보놀(flavanone 3-hydroflavonol: F3H), 플라보놀 합성효소(flavonol synthase) , 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)과 같은 여러 가지 효소가 생합성 과정에서 영향을 준다는 것을 밝혀냈다. 이중 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)는 안토사이아니딘(Anthocyanidin)과 프로안토사이아니딘(Proanthocyanidin) 생성에 중요 조절작용을 하고 있다.
특히 디하이드로플라보놀 환원효소는 도 1에서 보는 바와 같이 안토사이아니딘(Anthocyanidin)의 발현 양을 결정적으로 조절할 수 있는 중요한 위치에 있기 때 문에 여러 식물에서 연구되어 왔다. 그 예로 토레니아(torenia)와 같은 꽃은 칼콘 합성효소(chalcone synthase: CHS), 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)의 상호작용에 의해 기존 꽃 색보다 짙은 붉은색과 파란색 사이에서 조절된다는 것도 알게 되었다. 참고로 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)의 코딩 유전자를 안티센스 방향으로 조절시키면 기존 꽃 색보다 좀더 짙은 파란색으로 발현된다고 보고된 바 있다.
이와 같이 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 조절하는 유전자는 화색을 발현시키는데 중요한 작용을 하는 유전자로서 관상가치가 있는 여러 꽃식물에선 많은 보고 자료가 있다.
디하이드로플라보놀 환원효소 유전자에 관한 선행특허로는, 미국특허 US638715에서 기질특이성을 결정하는 영역의 아미노산 서열을 변경시킨 수식된 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자에 관해 개시한 바 있다.
그러나, 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)와 같은 식용을 목적으로 하는 작물에서는 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)에 관한 보고가 드물고, 배추에서 디하이드로플라보놀 환원효소 코딩 유전자를 분리해냈다는 연구는 아직까지 보고된 바 없었다.
본 발명자들은 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)로부터 안토사이아니딘(Anthocyanidin)과 프로안토사이아니딘(Proanthocyanidin)의 생합성에 관여하는 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR) 코딩 유전자를 분리해내어 이를 배추 뿐만 아니라 그와 같은 과에 속하는 활용성 높은 유채꽃 과 같은 식물에 효과적으로 적용하고자 한다.
따라서 본 발명의 목적은, 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)로부터 안토사이아니딘(anthocyanidin) 생합성에 있어서 결정적 단계에 있는 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase)를 코딩하는 유전자를 분리하여 그 염기서열을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은, 배추의 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자를 크로닝 할 수 있는 프라이머 및 이를 이용하여 배추로부터 디하이드로플라보놀 환원효소 코딩 유전자를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)로부터 분리된 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)로부터 분리된 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자를 제공하며, 또한 상기 유전자를 크로닝할 수 있는 프라이머 및 이를 이용하여 배추로부터 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)로부터 디하이드 로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자를 분리하기 위해, 우선 프라이머를 작성하고, 상기 프라이머를 이용하여 RT-PCR 과정을 거쳐 배추로부터 일부 유전자 단편을 분리하고, 상기 일부 단편을 기본으로 새로운 프라이머 조합을 가지고 점차 확장시키는 방법을 이용하여, 배추의 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 전체 유전자의 염기서열을 밝혔다.
본 발명은, 기존에 발표되어 있는 채소작물의 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 전체 유전자 염기서열들의 상동성을 기초로, 디하이드로플라보놀 환원효소 유전자를 크로닝할 수 있는 프라이머를 작성하는 단계; 상기 여러 프라이머 조합을 이용한 RT-PCR 방법으로 배추로부터 디하이드로플라보놀 환원효소 유전자를 얻는 단계; 및 상기 염기서열을 함유하는 재조합 벡터를 제조하여 이를 아그로박테리움에 형질전환시킨 다음, 상기 아그로박테리움을 이용하여 배추를 형질 전환시키는 단계로 이루어진다.
본 발명에 사용된 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)는 유리온실에서 키운 잎에서 샘플을 채취하여 RNA 분리에 사용하였다.
본 발명의 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR) 유전자를 분리하는 과정은 다음과 같다.
첫째, 디하이드로플라보놀 환원효소(DFR) 유전자 조사는 아래와 같이 수행하였다.
(1) NCBI GenBank를 통해 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR) 유전자 시퀀스를 수집한다. (2) 수집된 유전자 시퀀스 중 배추과 에 속하는 작물들을 우선 대상으로 하여 코딩 지역만을 분리한 뒤 유전자 코딩 지역만을 정렬(alignment)한다. (3) 정렬(alignment)한 결과 중 상동성 빈도가 높은 곳을 택하여 프라이머를 작성한다. 상기와 같이 작성된 프라이머 세트의 염기서열은 서열번호 1과 2 및 서열번호 1과 3에 해당한다.
둘째, 배추로부터 RNA의 분리는 GibcoBRL회사에서 제공된 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 아래와 같이 수행하였다.
(1) 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)의 잎을 액체질소를 이용하여 곱게 분쇄한다. (2) 1ml 트리졸(Trizol) 용액을 첨가하고 잘 섞은 후 5분 동안 상온에 둔다. 이를 12000rpm으로 10분간 원심 분리하여 얻어진 상등액을 새 튜브에 취한다. (3) 그것에 200㎕의 클로로포름(chloroform)을 넣고 섞은 다음 다시 4℃에서 10분 동안 원심분리한 뒤 그 혼합액의 투명액을 새 튜브로 옮긴 뒤 이소프로페놀 (isopropanol)을 넣고 다시 원심 분리하여 침전시킨다. (4) 그 후, 상등액인 이소프로페놀을 제거하고 난 후의 침전물을 75% 에탄올로 세척한 뒤, 잘 건조시킨 후 DEPC 처리된 멸균 증류수에 녹여 사용한다.
셋째, E.Coli DH5α의 형질전환은 하기와 같이 수행하였다.
(1) 대장균 DH5α를 LB 50ml에 접종시켜 37℃에서 OD570= 0.375~0.400이 되도록 배양한다. (2) 균주배양액을 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 얻어진 침전물은 0.1M CaCl2 용액으로 풀어준 후 30분간 얼음에 둔다. (3) 3000rpm에서 7분간 원심분리한 후 0.1M CaCl2 에 침전물을 녹인다. (4) 재조합 플라스미드를 함께 섞어 얼음 에 30분간 두었다가 42℃에서 90초간 열 충격을 준다. (5) 10분간 얼음에 두었다가 LB 배지 700㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕배양한다. (6) 배양액을 1200rpm으로 수초간 원심분리한 후 100㎕만 남기고 상등액을 제거하였으며 그 상등액으로 침전물을 녹인다. (7) 엠피실린(Ampicillin) (50mg/L), X-gal (200mg/L in N-N dimethylformamide) IPTG (200mg/L)가 첨가된 고체 LB 배지에 전개하여 37℃에서 12시간 배양한다. (8) 고체배지에서 저항성을 보이며 흰색의 콜로니를 형성하는 형질 전환된 것을 선발하여 배양한다. (9) 재조합 플라스미드 DNA를 분리,정제하여 PCR과 제한 효소처리로 벡터 내 유전자 삽입여부를 확인한다.
넷째, 플라스미드 DNA의 분리는 아래와 같이 수행하였다.
(1) 항생제가 첨가된 LB배지에 콜로니를 감염시킨 후 37℃에서 12시간 배양한다. (2) 배양액은 12000rpm, 4℃ 원심분리기에서 10분간 원심분리한다. (3) Solution I(100㎕/ml)을 첨가하여 보텍스(vortex)를 수초간 실행한다. (4) Solution II(200㎕/ml)를 첨가하여 조심스럽게 섞은 후 실온에서 10분간 방치한다. (5) Solution III를 150㎕/ml를 첨가하여 잘 섞은 후 얼음에서 5분간 둔 뒤 12000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 한다. (6) 이에서 얻어진 상등액을 취하여 1/10양의 NaOAC를 첨가한 후 2.5배의 100% 에탄올을 첨가하여 -4℃에서 2시간 침전시킨 후 원심 분리하여 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후 멸균 증류수에 녹인 후 사용한다.
배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)의 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 코딩하는 유전자를 크로닝할 수 있는 프라이 머는 서열번호 1, 2 및 3에 기재되었고, 또한 상기 프라이머를 이용하여 얻어진 배추의 DFR을 코딩하는 유전자의 전체 염기서열은 서열번호 4에 기재되었다.
이하에서는, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 디하이드로플라보놀 환원효소(Dihydroflavonol reductase: DFR) 유전자를 분리하기 위한 프라이머의 작성
디하이드로플라보놀 환원효소 유전자의 공통된 부분을 찾기 위하여 기존에 발표되어 있는 작물별 DFR 유전자를 "National Center for Biotechnology Information(NCBI) Genbank"에서 검색하였다. 유전자의 전체 염기서열을 수집하기 위해 Entrez program을 사용하였다. 검색방법으로는 유전자명을 디하이드로플라보놀 환원효소(Dihydroflavonol reductase: DFR)을 검색어로 선정하였다.
수집된 디하이드로플라보놀 환원효소 유전자 가운데, 양배추(Brassica
oleracea), 아리비돕시스(Arabidopsis thaliana), 순무(Brassica rapa)들의 염기서열을 선발하고 그것들의 상동성을 많이 보이는 부분을 BLAST program 으로 찾은 뒤 그 부분을 중심으로 프라이머를 제작하였다. 작성된 프라이머는 아래 표 1과 같다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| DFR F1(서열번호 1) | 5' ATG GTA GCT CAC AAA GAG ACC G 3' |
| DFR F2 | 5' AAA GAG ACC GTG TGC GTA ACC 3' |
| DFR F3 | 5' CAA CAT CTT CTT GAT TTG CCA AAC 3' |
| DFR F4 | 5' TGG ATG TAT TTC ATG TCG AAA ACG 3' |
| DFR F5 | 5' GAT TCA TTG GTT CAT GGC TCG T 3' |
| DFR F6 | 5' ATG GTT AGT CAG AAA GAG ACC GT 3' |
| DFR R1(서열번호 2) | 5' CTC GGG ATC CTT TGA TTC AAA AT 3' |
| DFR R2 | 5' GGG AGA AAA CCC TTT GGA CGA 3' |
| DFR R3 | 5' TGC ACA TAC TGT CCT TGT CTT AT 3' |
| DFR R4(서열번호 3) | 5' TCA CAC ATT CAT AAG ACA ATA GAT 3' |
실시예 2: 디하이드로플라보놀 환원효소(Dihydroflavonol reductase: DFR) 유전자의 분리
디하이드로플라보놀 환원효소 유전자의 분리는 확보된 RNA를 주형으로 oligo dT 프라이머(primer)와 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용, cDNA를 합성한 뒤 작성한 프라이머로 PCR하여 분리하였다. cDNA합성 프로그램 조건은 1㎍의 RNA를 oligo dT primer와 70℃에서 두어 RNA 이차구조를 제거한 뒤 42℃에서 30분간 역전사 시키고 그 사용된 역전사효소를 불활성화 시키기 위해 75℃에서 10분간 두었다. 그 후 합성된 cDNA 1 마이크로그램을 사용, 작성한 프라이머와 태크 중합효소(tag polymerase)로 PCR하였는데 그 프로그램은 96℃에서 2분간 초기 변성 시간을 둔 뒤 96℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 40 순환(cycle) 실행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 최종 연장시킨 후 4℃를 유지하여 전체 반응을 종료하였다.
각각의 프라이머들로 증폭된 단편들은 그 각각의 염기서열을 분석하기 위해 PCR 산물용 벡터 pGEM-T easy vector에 크로닝하고 삽입된 자리에 근접한 T7,SP6 프라이머를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
실시예 3: 배추의 디하이드로플라보놀 환원효소(Dihydroflavonol reductase: DFR)
유전자의 단편 확인과 유전자 전체의 분리
염기서열 분석용 pGEM-T easy vector 내부에 크로닝 된 PCR 단편의 염기서열 분석은 GenBank BLAST program을 사용하여 이루어졌다. 그 결과 DFR F1(서열번호 1)과 DFR R1(서열번호 2) 프라이머로 증폭된 약 290bp 산물의 염기서열과 아미노산 서열을 분석한 결과, 양배추(Brassica
oleracea), 아리비돕시스(Arabidopsis thaliana)의 디하이드로플라보놀 환원효소의 mRNA와 각각97%, 88%로 높은 상동성을 보였으며, 단편만 등록된 유채(Brassica napus)의 mRNA와는 98%의 높은 상동성을 보임으로서 디하이드로플라보놀 환원효소 유전자 내부에 이 부분이 포함되어 있음을 확인하였다(도 3 참조). 즉, RNA를 대상으로 DFR F1/DFR R1을 이용해 RT-PCR을 수행한 결과 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR) 유전자의 일부분이 증폭된다는 것을 확인할 수 있었다.
일부분이 밝혀진 정확한 유전자 염기정보를 바탕으로 전체 유전자 염기서열을 밝히기 위해 좌우로 프라이머를 다시 조합하여 RT-PCR을 수행한 결과, DFR F1(서열번호 1)과 DFR R4(서열번호 3)에서 시작코돈(start codon)과 종료코돈(stop codon)이 포함된 유전자 전체를 분리할 수 있었다. 시작코돈과 종료코돈을 결정한 후 처음과 끝 각각에 제한효소자리를 시작코돈 쪽에는 Spe 1 절단서열을, 종료코돈 쪽에는 Pml 1 절단서열을 부착한 뒤 새롭게 전체 유전자를 한꺼번에 크로닝하기 위한 프라이머를 작성하여 배추의 cDNA로부터 PCR하여 전체 유전자를 염기서열 분석 용 pGEM-T easy vector 내부에 크로닝하여 확보한 뒤 그 염기서열을 읽는다. 그 배추로부터 분리된 전체 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 코딩하는 유전자로 결정, 서열번호 4에 그 염기서열을 제시한다.
실시예 4: 아그로박테리움을 이용한 배추의 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol
reductase: DFR) 유전자의 식물체내로의 도입
배추의 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR) 유전자를 식물체내로 도입하기 위한 발현 재조합 벡터를 만들기 위해 삽입(insert)될 배추의 전체 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자를 포함하고 있는 pGEM-T easy vector를 Spe 1과 Pml 1으로 절단하고 전기영동을 통하여 유전자 단편의 크기를 확인한 후 겔(gel)에서 추출하는 방법으로 삽입(insert)을 준비하였다.
같은 방법으로 벡터인 pCABIA1302의 T-DNA부분에도 제한효소 Spe 1과 Pml 1으로 절단하고 DNA단편의 크기를 확인하고 겔(gel)에서 추출하는 방법으로 벡터를 준비하였다. 준비한 벡터와 insert를 적정농도로 혼합한 후 T4 DNA 리가아제 (ligase)를 이용하여 결합시키고 DH5α에 형질전환시켰다. 형질전환을 통해 얻은 콜로니를 배양하여 재조합 DNA를 추출하고 그 DNA를 제한효소 Spe 1과 Pml으로 절단하고 전기영동을 통하여 벡터와 insert의 크기와 존재를 확인하고 PCR과 시퀀싱(sequencing)을 통해 제대로 결합했는지 확인하였다.
벡터와 insert의 결합이 확인된 발현 벡터를 아크로박테리움 튜마시엔스 LBA4404(A. tumefaciens LBA4404)에 Freeze-thaw법에 의하여 형질전환시켰다. 형질 전환 후 아그로박테리움 역시 콜로니를 배양하여 재조합 벡터가 제대로 포함되었는지 PCR과 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다. 이때 PCR은 플라스미드(plasmid)를 주형(template)으로 넣는 대신 태그(Tag) 중합효소, 유전자전체를 분리할 수 있는 프라이머 즉, DFR F1: 5' ATG GTA GCT CAC AAA GAG ACC G 3', DFR R1: 5' TCA CAC ATT CAT AAG ACA ATA GAT 3' 와 10X tag buffer, 염화마그네슘 용액이 포함된 액체에 콜로니가 찍힌 이쑤시개를 넣어 액체속에 그 콜로니가 녹게 한 뒤 그것으로 PCR하여 그 중, 발현 벡터(vector)의 도입이 확인된 아그로박테리움 튜마시엔스 LBA4404를 식물형질전환에 사용하였다. PCR 반응조건은 94℃ 에서 3분간 처리후 30순환의 94℃ 30초、55℃ 30초、72℃ 1분 처리 그리고 마지막으로 72℃에서 3분 처리하였다.
이상, 상기와 같이 본 발명은 배추로부터 안토사이아니딘(anthocyanidin) 생합성의 가장 결정적 단계인 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 코딩하는 전체 유전자의 분리에 관한 것으로, 이를 이용하여 배추 및 그 유사작물을 형질전환시키면, 인간에 있어 유용성분인 디하이드로플라보놀 환원효소의 생합성량을 높일 수 있고, 식물체내 화색변화를 유도하여 식물의 관상가치를 높일 수 있으므로 원예 및 농업발전에 있어서 매우 유용한 발명이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (2)
- 서열번호 1과 2에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 통해 배추(Brassica campestris ssp. pelinensis)로부터 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)의 일부 유전자 단편을 분리하는 단계 및 상기 유전자 단편의 염기정보를 바탕으로 시작코돈과 종료코돈이 포함된 서열번호 1과 3에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 통해 디하이드로플라보놀 환원효소의 유전자 전체를 분리하는 단계를 포함하는, 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)의 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 코딩하는 유전자를 분리하는 방법.
- 서열번호 4에 기재된 배추(Brassica campestris ssp. pekinensis)의 디하이드로플라보놀 환원효소(dihydroflavonol reductase: DFR)를 코딩하는 유전자.
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