CN108220300B

CN108220300B - 一种万寿菊转录因子基因及应用

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Publication number: CN108220300B
Application number: CN201810009425.7A
Authority: CN
Inventors: 牛向丽; 黄胜雄; 冯国栋; 商亚芳; 刘永胜; 唐维; 唐晓凤; 王莹莹; 王洋
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2018-01-04
Filing date: 2018-01-04
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2038-01-04
Also published as: CN108220300A

Abstract

本发明公开了一种万寿菊转录因子基因及应用。其中氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在万寿菊未成熟花中克隆获得了TeIMTF1基因。实时定量分析表明，TeIMTF1基因在万寿菊未成熟花中表达水平较叶片、成熟花显著升高。当在烟草叶片中瞬时表达TeIMTF1时，叶黄素含量降低。本发明从色素万寿菊所克隆转录因子TeIMTF1在叶黄素生物合成中发挥负调控作用，能够用于调控植物叶黄素含量。

Description

一种万寿菊转录因子基因及应用

技术领域

本发明涉及植物遗传工程技术领域，具体涉及一种从色素万寿菊中克隆叶黄素合成途径转录因子TeIMTF1，以及该基因在调控植物叶黄素合成中的应用。

背景技术

叶黄素(3，3'-二羟基-β，α-胡萝卜素)是一种不对称的二羟基类胡萝卜素，橙黄色粉末，不溶于水，溶于己烷等有机溶剂。植物和微生物等可自行合成叶黄素，但在人体内不能合成。而叶黄素是人眼视网膜黄斑色素主要组成部分，在预防老年性眼球视网膜黄斑区病变引起的视力下降与失明具有独特功能。同时，叶黄素具有抗氧化作用，能防止由机体衰老而引发的各种疾病。人体可以利用所摄入叶黄素酯，将其在体内转化成为游离叶黄素。虽然大多数水果蔬菜中含有叶黄素，但其含量微少，日常饮食摄入量不足。因此，叶黄素可作为食品补充剂补充摄入。

万寿菊(Tagetes erecta L.)属菊科植物，俗称臭芙蓉、万盏灯、蜂窝菊等，一年生草本植物，原产于美洲，易于栽培。万寿菊可做观赏植物，夏秋季开花，花呈黄色或橙色，有香味，可作芳香剂，也可以用于制茶、保健饮料。万寿菊花中绝大多数叶黄素均以酯形式存在，由于叶黄素两侧的每一个紫罗酮环都有一个羟基，在植物细胞内与脂肪酸发生酯化作用生成单酯和二酯的衍生物。万寿花中橙色品种干花朵叶黄素酯约占总类胡萝卜素88％～92％。由于叶黄素在医药、食品、化妆品等各领域中的广泛应用，国内外需求量逐年递增。富含叶黄素的万寿菊成为在多地种植用于提取天然叶黄素的重要植物资源。

叶黄素是类胡萝卜素中的含氧多萜类物质。在植物体内，合成前体异戊烯基焦磷酸经过多次缩合、脱氢、环化、羟基化、环氧化等转化为类胡萝卜素。利用拟南芥、番茄、矮牵牛花等模式植物，已经对植物中参与类胡萝卜素生物合成途径，催化各级反应的酶类有了比较清楚的认识，但调控这一合成途径的转录因子则报道较少。对于非模式植物的万寿菊来说，虽然它是提取天然叶黄素的重要植物资源，但对其合成途径中的酶基因、调控基因，及其调控作用机制均知之甚少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种调控万寿菊叶黄素合成途径的转录因子基因。

本发明要解决的另外一个技术问题是提供上述转录因子TeIMTF1在调控植物叶黄素合成中的应用。

对于转录因子基因，本发明提供的技术方案是，一种调控万寿菊叶黄素合成途径的转录因子基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还包括上述转录因子TeIMTF1在调控植物叶黄素合成中的应用。

本发明从色素万寿菊中克隆叶黄素生物合成转录因子，命名为Tagetes erectaImmature Flower Transcription Factor 1(简称TeIMTF1)。

本发明从色素万寿菊中进行TeIMTF1基因的克隆：根据对色素万寿菊的高通量转录组深度测序对TeIMTF1基因进行数据组装；然后利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊未成熟花花瓣中提取总RNA，反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)克隆获得TeIMTF1基因。

通过在万寿菊未成熟、成熟花组织的实时定量分析和表达TeIMTF1基因的烟草叶片中叶黄素含量测量，表明本发明所述SEQ ID NO.1基因在色素合成中发挥作用，能够用于调控植物中叶黄素等类胡萝卜素色素的含量。

本发明的有益效果是：

本发明的万寿菊转录因子TeIMTF1为在植物中调控类胡萝卜素色素含量提供了一种新的调控基因资源，可用于高色素营养品质植物材料的筛选、培育和改良。

具体实施方式

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J.和Russell，D.W.的分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：万寿菊高通量转录组测序

由于万寿菊基因组尚未测定，为获得万寿菊功能基因转录本序列，利用色素万寿菊栽培品种菊王组织样品，通过分别提取三个单株的叶片、未成熟花、成熟花RNA各1份，进行高通量转录组序列测定与组装注释。

1、试剂

植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于Takara公司，RNA文库制备试剂盒(RNA Library Prep Kit)来自北京百迈客生物科技有限公司,其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。

3、方法

3.1 RNA提取

1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1ml Trizol，剧烈震荡，室温放置5min；

2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；

3)4℃，12000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；

4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；

5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；

6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底；

7)加入1mL 70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

9)室温干燥5-10min；

10)加入50μL无RNA酶水(RNase-free H₂O)，溶解RNA；

11)根据RNA溶液浓度取RNA 50μg，加入5μL 10X缓冲液(400mM Tris-HCL,pH 7.5,80mM MgCl₂,50mM DTT)、5μL Dnase I、2μL RNA酶抑制剂，37℃反应30min；

12)加入2.5μL 0.5M EDTA，80℃，2min失活Dnase；

13)加入10μL 3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；

14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

15)加入1mL 70％乙醇清洗RNA；

16)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

17)室温干燥5-10min；

18)加入50μL无RNA酶水，溶解RNA；

19)检测RNA样品的纯度、浓度。

3.2转录组测序组装与注释

转录组测序利用RNA Library Prep Kit，通过北京百迈客生物科技有限公司Illumina HiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：

1)用带有Oligo(dt)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；

2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、RNA酶H和DNA聚合酶I合成第二条cDNA链，利用微珠(beads)纯化cDNA；

3)纯化的双链cDNA再进行末端修复，并连接测序接头，然后用微珠进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库；

4)对文库的浓度和插入片段大小进行检测；

5)利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，测序读长为PE125；

6)将测序片段(reads)截除测序接头、引物序列，过滤低质量值数据后，获得高质量的测序数据；

7)利用Trinity组装软件将高质量测序read延伸成较长的片段(contig)，并利用这些片段之间的重叠，得到片段集合(component)，最后利用De Bruijn图的方法获得转录本序列(unigene)；

8)使用BLAST软件将转录本序列(unigene)与NR(NCBI非冗余数据库)、Swiss-Prot(欧洲生物信息学研究所维护数据库)、GO(Gene Ontology)、COG(Clusters ofOrthologous Groups)、KOG(euKaryotic Orthologous Groups)、KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)数据库比对；

9)利用TransDecoder软件进行unigene的编码区序列及其对应氨基酸序列的预测，使用HMMER软件与Pfam(Protein family)数据库比对，获得unigene的注释信息。

4.结果

通过上述将万寿菊组织材料进行RNA提取、建库、高通量转录组深度测序，然后对测序序列进行组装和基因功能预测，获得Tagetes erecta Immature FlowerTranscription Factor 1(TeIMTF1)基因的推测序列。

实施例2：万寿菊TeIMTF1基因的克隆

根据实施例1对万寿菊TeIMTF1基因的数据组装，利用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计PCR特异引物，从万寿菊未成熟花花瓣中提取总RNA，反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)克隆获得TeIMTF1基因。

1、试剂

植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于Takara公司；反转录酶(TransScript Reverse Transcriptase)购于北京全式金生物技术有限公司；高保真DNA聚合酶PrimeStar购于TaKaRa公司；克隆载体pEASY-Blunt Simple CloningVector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α购于北京全式金生物技术有限公司；色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王种子由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。

3、培养基和溶液

LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基:胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基:方法同上述SOB培养基的配制，再加入2mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖。

100×Mg²⁺溶液:20.33g MgCl₂.6H₂O和24.65g MgSO₄.7H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

1000×氨卞青霉素(Amp)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。

4、方法

4.1万寿菊成熟花组织RNA提取

如实施例1中3.1所述操作步骤进行。

4.2 RT-PCR

4.2.1 RT

1)取1μg总RNA与1μL polyT₁₈(10μM)引物混合，用RNase-free ddH₂O补足到12.75μL，轻轻混匀；

2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；

3)加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)，TransScript Reverse Transcriptase反转录酶1μL(100U/μL)，42℃1h，合成第一链cDNA；

4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应；

4.2.2 PCR

根据实施例1所述获得的TeIMTF1基因推测序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列如下：

TeIMTF1F1:5’AACCTCGCTCACACATTAACAC 3’

TeIMTF1R1:5’AAAACAAAAAGAAGTAGAATTGTCA 3’

TeIMTF1F2:5’GGGGTACCATGGACCAACAACAACCGTT 3’

TeIMTF1R2:5’GAAGGCCTATGAAATCCAGACGTGTCAGG 3’

取4.2.1所获万寿菊成熟花的cDNA，进行TeIMTF1基因的克隆。将200μL EP管放置于冰上，加入试剂：

按以下程序进行扩增：98℃2min(预变性)；98℃10s(变性)，55℃20s(复性)，72℃60s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(总延伸)。

以上述PCR产物为模板，以引物TeIMTF1F2和TeIMTF1R2进行第二轮PCR，复性温度56℃，其它条件同上。

通过上述操作，获得了TeIMTF1基因PCR扩增产物。

4.3 PCR扩增产物与pEASY-Blunt载体连接

将由上述4.2所述获得的TeIMTF1基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY-BluntSimple Cloning Vector按摩尔分子数比1：4连接(25℃，15min)，连接体系如下：

pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(50μg/μL) 4μL

PCR产物(～150μg/μL) 1μL

4.4大肠杆菌转化

1)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受态细胞冰浴解冻；

2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

3)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；

4)加入0.8mL SOC，混匀，37℃温和振荡培养1h；

5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜。

4.5菌落PCR鉴定

将4.4所述大肠杆菌再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：

反应条件：94℃3min(预变性)；94℃30s(变性)，56℃20s(复性)，72℃60s(延伸)，所述变性-复性-延伸26个循环；72℃5min(总延伸)。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-TeIMTF1，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-Blunt Simple克隆载体的TeIMTF1基因全长序列，基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

实施例3：TeIMTF1在万寿菊不同组织中的表达分析

根据实施例2克隆获得TeIMTF1基因全长序列，利用引物设计软件Primer Premier5.0设计定量PCR引物，分别从万寿菊叶片、未成熟花、成熟花中提取总RNA，反转录获得cDNA，进行TeIMTF1基因表达水平的定量分析。

1、试剂

RNA提取、反转录试剂如实施例1所述；实时定量PCR试剂TransStart Green qPCRSuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、方法

取万寿菊植株发育时期的未成熟花、成熟花样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1中3.1、实施例2中4.2所述。

根据高通量测序结果，以在万寿菊不同组织中均稳定表达的TranslationInitiation Factor 6(TIF6)做为内参对照基因，进行Te TeIMTF1PTF1表达水平的定量PCR分析。TeIMTF1引物为TeIMTF1F3和TeIMTF1R3、TIF6引物为TIF6F和TIF6R。引物序列如下：

TeIMTF1F3:5’ACGATACGGTCCTCGAAACTG 3’

TeIMTF1R3:5’ACTTCTGGGCTAAGCTGATTG 3’

TIF6F:5’TAAGACCTGGTGGTGGAAATAGA 3’

TIF6R:5’CAGCACCATGAGGACGAAGA 3’

定量PCR反应体系如下：

反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃15s，72℃10s，40个循环。其中cDNA为实施例2中4.2.1方法所述获得cDNA模板稀释30倍后用于定量PCR。扩增后，65℃5s，每个循环增加0.5℃，60个循环，进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Bio-Rad CFX 96上运行。

3、结果

实时定量PCR分析结果显示，TeIMTF1基因在色素万寿菊未成熟花组织中表达量约为叶片、成熟花的7倍，显著高于成熟花。表明TeIMTF1基因所编码转录因子可能在万寿菊花发育及色素合成中发挥调控作用。

实施例4：HPLC方法测定万寿菊花瓣叶黄素含量

1、试剂

叶黄素标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚购于国药集团化学试剂有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、方法

取万寿菊未成熟花、成熟花样品，45℃烘干，将烘干后样品液氮研磨，称重0.15g，加入1mL乙醇(含0.1％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，涡旋15s，加入400mL 50％KOH水溶液，涡旋15s，于50℃水浴60min，每15min涡旋一次。用3.3mL正己烷提取3次，合并提取液，取50μL滤液上样。色谱条件：高效液相色谱仪(美国WATERS公司)；色谱柱SymmetryC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈：二氯甲烷：甲醇为70：20：10(v：v：v)；流速1mL/min；检测波长475nm；柱温30℃。

3、结果

根据叶黄素标准品标准曲线和HPLC测定结果，测得万寿菊未成熟花、成熟花中叶黄素含量分别为3.6、16.3mg/g干重。

实施例5：TeIMTF1基因植物表达载体的构建

将pEASY-TeIMTF1质粒、植物表达载体pBTEX-HA载体进行酶切纯化和连接，并转化大肠杆菌和农杆菌。

1、试剂

胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于Omega公司，Taq DNA聚合酶、dNTP、DNAmarker、T4 DNA Ligase购于Tansgen公司，限制性内切酶KpnI和StuI购于Fermentas公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、载体和菌株

植物表达载体pBTEX-HA来自美国University of Idaho大学Fangming Xiao博士实验室。大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV2260购于北京全式金生物技术有限公司。

3、培养基和溶液

LB液体培养基、LB固体培养基、SOC培养基配制方法如实施例2中所述。

1000×卡那霉素(Kan)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。

500×利福平(Rif)：50mg/mL，溶于甲醇或DMSO中，-20℃保存。

4、方法

4.1质粒提取

将实施例2所获pEASY-TeIMTF1质粒、植物表达载体pBTEX-HA载体进行质粒提取，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。

1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm，离心1min，弃废液，待用；

2)12000rpm，1min，离心收集菌沉淀，尽量弃尽上清；加入250μL P1(已加RNaseA)，吹吸混匀至菌沉淀彻底悬浮；

3)加入250μL P2，温和上下翻转8次离心管，使菌体充分裂解；

4)加入350μL P3，立即温和上下翻转8次离心管，12000rpm，离心10min；

5)吸出上清至新的离心管中，12000rpm，离心5min；

6)小心转移上清至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃废液；

7)加入500μL PD，12000rpm，离心1min，弃废液；

8)加入600μL PW(已加无水乙醇)，12000rpm，离心1min，弃废液，重复操作一次；

9)12000rpm，离心2min，除尽残留的PW；

10)将吸附柱转移至新离心管中，在柱中央加入50μL无菌ddH₂O，室温2min，12000rpm，离心2min，洗脱DNA；

11)将重新洗脱液吸出至吸附柱中，再重复此操作一次。

4.2质粒酶切

用KpnI和Stu I酶切pEASY-TeIMTF1、pBTEX-HA。反应体系如下所述，37℃，1h：

4.3胶纯化

将上述4.2酶切后TeIMTF1基因编码序列片段、pBTEX-HA质粒进行胶回收，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。

1)向胶回收吸附柱CA2中加入500μL的平衡液BL，在12000rpm离心机中离心1min，倒去柱底部的废液；

2)带上塑胶手套，在紫外切胶仪器上回收电泳好的片段，将切下的片段放入预先准备的干净的EP管中；

3)根据胶的质量来确定加入溶胶液PN的体积，根据1:1体积加入。将EP管放入50℃的加热器上，加速溶解的速度，溶解10-15min，至胶完全溶解为止；

4)溶胶完全后，待其冷去至室温后，将溶解液体转入到胶回收吸附柱CA2中，静置3min，让溶胶液和吸附膜充分接触；

5)静置完全后，在12000rpm离心机中离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2收集柱底部的废液。向吸附管中加入600μL的PW，漂洗洗去质粒中的杂质，静置3min；

6)12000rpm离心1min，倒去胶回收吸附柱CA2收集柱底部的废液。完成后，重复上一步的过程；

7)将空的吸附柱放入离心机中12000rpm离心3min，放置于通风处，放置15min，待酒精全部挥发干净；

8)向吸附柱CA2中正中心吸附膜上加入30μL洗脱剂EB，静置3min，12000rpm离心3min，获得胶回收产物。

4.3连接

将酶切回收的TeIMTF1基因编码序列片段、pBTEX-HA质粒以T4连接酶进行连接，反应体系如下，25℃，3h：

4.4大肠杆菌转化

将上述连接产物进行大肠杆菌转化，实验步骤如实施例2中4.4所述。

4.5菌落PCR鉴定

将上述4.4所获大肠杆菌菌落进行单克隆挑取、培养，然后进行菌落鉴定，实验步骤如实施例2中4.5所述。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pBTEX-TeIMTF1，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pBTEX，并带有HA标签的TeIMTF1基因植物表达载体。

4.6农杆菌转化

1)按本实施例中4.3所述步骤提取pBTEX-TeIMTF1质粒；

2)将pBTEX-TeIMTF1加入50μL农杆菌菌株GV2260感受态细胞中，轻轻搅拌混匀，并让在冰上冰浴30min；

3)放置于液氮中冷激1min；

4)将EP管移置于37℃恒温加热器上，加热5min；

5)加入SOC培养液800μL，放置于摇床中28℃，200rpm/min培养4-5h；

6)菌液于4000rpm/min离心5min；

7)在超净台中吸取上清，剩余约100μL，将菌体轻轻吹打悬浮混匀；

8)用灭菌玻璃球将菌液均匀涂布于LB+Rif+Kana固体培养基，于28℃恒温培养箱培养48h；

9)按实施例2中4.5所述相同方法步骤进行菌落PCR鉴定，并将鉴定转入重组质粒的阳性农杆菌-80℃保存。

实施例6：TeIMTF1在烟草叶片中瞬时表达

将TeIMTF1通过农杆菌介导方法在烟草叶片中瞬时表达，对TeIMTF1编码蛋白的表达进行检测，并对表达TeIMTF1基因的烟草样品中叶黄素的含量进行测定。

1、试剂

乙酰丁香酮、小鼠HA标签单克隆抗体anti-HA、抗小鼠抗体anti-mouse购于Sigma公司；PVDF膜购于Merck Millipore公司；ECL蛋白印迹底物购于GE公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

本氏烟草(Nicotiana benthamiana)来自美国康奈尔大学博伊斯汤普森研究所，种植于人工气候培养室。

3、培养基和溶液

IM溶液：2-吗啉乙磺酸(MES)4.88g；葡萄糖2.5g；NaH₂PO₄0.126g。先将MES加至去离子水中，调节pH值至5.6，再加入葡萄糖、NaH₂PO₄，搅拌均匀，定容至475mL，高温灭菌。

20×AB盐溶液：NH₄Cl 20g；MgSO₄6g；KCl 3g；FeSO₄0.05g，CaCl₂2g。依次加入各组分，完全且均匀溶解后定容至1L，高温灭菌。

200mM乙酰丁香酮(acetosyringone，1000×)：将39mg乙酰丁香酮粉末溶于1mL二甲基亚砜，-20℃避光保存。

诱导培养基：IM溶液19mL，20×AB盐溶液1mL，200mM乙酰丁香酮20μL，25mg/mL卡那霉素20μL，加去离子水定容至20mL。

蛋白质提取缓冲液：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，5mM乙二胺四乙酸，10％甘油、1％聚乙烯吡咯烷酮、20μM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟、植物蛋白酶抑制剂(plant protease inhibitors，100μL/10mL提取缓冲液)。

5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)0.6mL，50％甘油5mL，10％SDS2mL，β-巯基乙醇0.5mL，1％溴酚蓝1mL，加入去离子水定容至10mL。

10×SDS-PAGE电泳缓冲液：120g Tris base、576g甘氨酸、40g SDS溶解于去离子水中，定容至4L。使用前加水稀释至1×。

10×western blot转膜缓冲液：甘氨酸144g，Tris 30.2g。将Tris、甘氨酸溶解于0.9L去离子水中，搅拌混匀，定容至1L。配制1L 1×转膜缓冲液时，加入10×转膜缓冲液100mL、甲醇100mL，加去离子水定容至1L。

10×TBS(Trish-buffered saline)缓冲液：80g NaCl，2g KCl，30g Tris。将各组分溶解于0.8L去离子水中，调pH至7.4，加去离子水定容至1L。配制1×TBST(Trish-buffered saline with Tween)缓冲液时，加入10×TBS 100mL、20％Tween-202.5mL，加去离子水定容至1L。

4、方法

4.1烟草瞬时表达

1)将转入pBTEX-TeIMTF1、pBTEX-HA载体的农杆菌，分别在带有Rif和Kana的LB培养板上划线，28℃恒温箱中培养48h；

2)挑取单克隆28℃培养12h，取300μL菌转接至2.7mL LB+Rif+Kana培养液中，28℃培养6-8h；

3)室温条件下，3000rpm离心6min，弃上清，加入3mL IM溶液重悬菌体；重复一次，以3mL IM溶液重悬菌体后，28℃250rpm培养5-14h；

4)3000rpm离心6min，弃上清，加入10mM MES 2mL(pH 5.7，带有200mM乙酰丁香酮200μL)，重悬菌体，涡旋震荡。重复一次；

5)以10mM MES作为空白对照，测定测量菌液浓度(OD₆₀₀)，配制侵染液；

6)使用一次性注射器，将侵染液从烟草叶片下表皮注射到叶片中，并标记侵染范围；

7)将注射植株置于阴暗处0.5h，放于光照下生长36-48h收取样品，液氮中速冷，-80℃保存。

4.2 western杂交

1)从-80℃冰箱中取出样品，研钵中液氮磨样，将样品磨成粉末状，转入预冷的1.5mL EP管中；

2)加入300μL蛋白质提取液，在涡旋仪器上震荡，使得提取液和样品混合均匀，静置10min；

3)低温离心机中4℃12000rpm离心10min；

4)吸取200μL上清转移至新的EP管中，加入5×蛋白上样缓冲液40μL，95℃加热5min。

5)将样品进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳；

6)凝胶进行PVDF膜转印，100V,1h；

7)将PVDF膜以5％脱脂牛奶封闭1h；

8)加入anti-HA抗体室温反应1h；

9)以1×TBST缓冲液洗膜3次，加入辣根过氧化酶联的抗小鼠抗体，室温反应1h；

10)以1×TBST缓冲液洗膜3次，加入反应底物(western blotting ECLsubstrate)，在化学发光仪中对蛋白表达情况进行检测。

4.3叶黄素含量测定

按照实施例4方法所述，对表达TeIMTF1基因的烟草叶片中叶黄素含量进行测定。pBETX-HA空载体作为负对照。

5、结果

Western blot蛋白印迹实验结果显示，通过农杆菌介导，在注射万寿菊转录因子基因TeIMTF1植物表达载体的烟草叶片中，获得约28KD预期大小TeIMTF1编码蛋白条带。表达TeIMTF1的烟草叶片组织与转入空载体的对照样品相比，叶黄素含量从0.09mg/g干重降至0.17mg/g干重。如SEQ ID NO.1所示的基因在植物叶黄素合成途径中具有负调节作用，本发明从色素万寿菊中克隆转录因子TeIMTF1能够用于调控植物叶黄素含量。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<120> 一种万寿菊转录因子基因及应用

<160> 1

<170> Patent In Version 3.3

<210> 1

<211> 226

<212> PRT

<213> 万寿菊（Tagetes erecta）

<400> 1

Met Asp Gln Gln Gln Pro Phe Asn Trp Pro Ala Ala Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Asp Thr Ser Ser Ser Glu Ser Ser His Ser Gly Gln Lys Pro

20 25 30

Lys His Ser Asp Gln Ile Lys Gly Pro Trp Thr Ala Glu Glu Asp

35 40 45

Lys Ile Leu Thr Arg Phe Val Glu Arg Tyr Gly Pro Arg Asn Trp

50 55 60

Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Lys Gly Arg Ser Gly Lys Ser Cys

65 70 75

Arg Leu Arg Trp Cys Asn Gln Leu Ser Pro Glu Val His His Arg

80 85 90

Pro Phe Ser Gln Glu Glu Asp Glu Thr Ile Leu Ala Ala His Ala

95 100 105

Gln Tyr Gly Asn Arg Trp Ala Thr Ile Ala Arg Leu Leu Pro Gly

110 115 120

Arg Thr Asp Asn Ala Val Lys Asn His Trp Asn Ser Thr Leu Lys

125 130 135

Lys Arg Arg Val Glu Asn Lys Ser Ile Glu Gly Gly Glu Met Leu

140 145 150

Lys Met Ser Asp Asp Asp Gly Gly Cys Lys Gly Phe Gly Thr Met

155 160 165

Gly Asn Val Gly Val Val Ala Asp Glu Glu Asp Asp Pro Met Thr

170 175 180

Val Leu Ser Leu Ala Pro Pro Gly Thr Gly Gly Ser Glu Ser Leu

185 190 195

Pro Thr Gly Phe Trp Asp Val Met Arg Gly Val Ile Ala Arg Glu

200 205 210

Val Arg Asp Tyr Val Thr Thr Ser Phe Pro Asp Thr Ser Gly Phe

215 220 225

His

Claims

1.一种调控万寿菊叶黄素合成途径的转录因子基因，所述转录因子基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述转录因子基因在调控植物叶黄素合成中的应用。