CN110904067B - 烟草绿原酸合成基因NtHQT及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个烟草绿原酸合成基因NtHQT及其应用专利申请。该基因全长4086 bp，包含1个内含子和2个外显子，其中编码区长1128 bp。烟草绿原酸合成基因NtHQT所编码的转移酶，含有375个氨基酸。在现有烟草基因工程基础上，发明人克隆获得了新的与绿原酸含量相关的烟草HQT基因（NtHQT）。进一步功能验证过程中，发明人对其进行了超表达，结果表明，将该基因超表达后，新的转基因植株中绿原酸含量得到了明显提高。这也进一步证明该基因确实与烟叶中绿原酸含量相关。而基于这一结果，可为烟草生长过程中品质调节、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和参考借鉴。

Description

烟草绿原酸合成基因NtHQT及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个烟草绿原酸合成基因NtHQT及其应用专利申请。

背景技术

绿原酸（Chlorogenic acid，CGA），又名咖啡单宁，是植物在有氧呼吸过程中经苯丙氨酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸广泛存在于咖啡豆、茶叶、水果、蔬菜以及各种谷物中，也广泛的存在于各类中药材中。已有研究认为，绿原酸具有广谱性的抗炎、抗菌、抗病毒、抗突变、预防高血压、冠心病等生物医学功能。

就绿原酸的生理代谢研究表明，苯并氨酸代谢途径的多个酶都参与了绿原酸的合成。其中羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶 (hydroxycinnamoyl-CoA quinatehydroxycinnamoyl transferase，HQT)被认为是绿原酸合成代谢途径的关键酶。目前，在烟草、番茄、咖啡、金银花、朝鲜蓟等植物中均成功克隆获得了HQT基因。但是现有对于HQT的基因功能的深入研究仍然较为有限。

已有研究中，在番茄中过表达烟草 HQT 基因，可使叶中绿原酸含量增加高达 85%（Niggeweg et al.，Engineering plants with increased levels of the antioxidantchlorogenic acid，Nat Biotechnol 2004）；而在咖啡中的研究发现，HQT 基因的表达量与绿原酸含量程正相关（Lepelley et al.，Chlorogenic acid synthesis in coffee: Ananalysis of CGA content and real-time RT-PCR expression of HCT, HQT, C3H1,and CCoAOMT1 genes during grain development in C. canephora，Plant Sci，2007）。

就烟草而言，烟草作为一种异源四倍体植物，一个功能基因一般至少对应4个同源基因。目前虽然在烟草中已经克隆一个HQT基因，但是其他的HQT的同源基因是否也在绿原酸合成中具有重要作用，则仍需进一步实验验证。

发明内容

基于现有烟草HQT 基因及烟草基因工程深入，本申请目的在于提供一个新的烟草NtHQT基因，从而烟草中绿原酸调控、新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草绿原酸合成基因NtHQT，全长4086 bp，包含1个内含子和2个外显子，其中编码区长1128 bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述烟草绿原酸合成基因NtHQT在叶片绿原酸含量调节中应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草HQT基因表达量，来调节控制烟叶中绿原酸含量情况。

含有所述烟草绿原酸合成基因NtHQT的超表达载体，通过如下步骤制备而成：

（1）为增加BsmBI和Esp3II酶切位点，设计PCR扩增用引物序列如下：

上游引物F：5'- CAGTCGTCTCACAACATGAAAGAAGCATTAAGTAA-3'，

下游引物R：5'-CAGTCGTCTCATACAAAATTCATACAAATACTTCT-3'；

然后，以烟草基因组（具体例如为红花大金元基因组）cDNA为模板，进行PCR扩增，并回收、纯化扩增产物；

（2）酶切、连接

对步骤（1）中的PCR扩增产物采用BsmBI和Esp3II进行双酶切，同时对pBWA(V)HS-GLosgfp载体采用BsmBI和Esp3II进行双酶切，并分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

（3）转化、筛选和鉴定

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌DH5α，并进行筛选，挑取阳性克隆质粒进行菌落PCR鉴定和测序鉴定，确保重组构建正确，并将最终构建正确重组超表达载体质粒命名为：pBWA(V)HS-NtHQT-Glosgfp。

所述烟草绿原酸合成基因NtHQT的PCR扩增制备方法，具体包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以红花大金元叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

上游引物NtHQT-F：5'-ATGAAAGAAGCATTAAGTAATG-3'，

下游引物NtHQT-R：5'-AAATTCATACAAGTACTTCTCA-3'。

烟草绿原酸合成基因NtHQT所编码的转移酶，对应合成基因NtHQT的1128 bp编码区，含有375个氨基酸；具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述烟草烟草绿原酸合成基因HQT所编码的转移酶在叶片绿原酸含量调控中的应用，该转移酶与植物叶片中绿原酸含量相关，对该转移酶超表达或者说提高其含量后，叶片中绿原酸含量明显增加。

利用所述烟草绿原酸合成基因NtHQT的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtHQT基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得绿原酸含量变化的烟草新品种；

具体例如：基于基因工程中相关技术，利用超表达载体pBWA(V)HS-Glosgfp，构建获得含有NtHQT的重组超表达载体，然后转化烟草植株，筛选获得绿原酸含量上升的植物新品种。

换言之，一种培育高绿原酸含量烟草新品种培育方法，利用超表达载体pBWA(V)HS-Glosgfp来对NtHQT基因进行超表达，HQT基因超表达的新烟草品种植株中绿原酸含量明显上升。

本申请中，在现有烟草基因工程基础上，基于以往研究，发明人克隆获得了新的与绿原酸含量相关的烟草HQT基因（NtHQT）。进一步功能验证过程中，发明人对其进行了超表达，结果表明，将该基因超表达后，新的转基因植株中绿原酸含量得到了明显提高。这也进一步证明该基因确实与烟叶中绿原酸含量相关。而基于这一结果，可为烟草生长过程中品质调节、烟草新品种培育奠定一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

图1为烟草NtHQT的亚细胞定位分析；

图2为烟草过表达NtHQT植株表型分析；

图3为过表达NtHQT烟草植株绿原酸含量测定与分析；

图4对照和超表达植株叶片绿原酸含量（t test P<0.01）。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

红花大金元、K326，均为常用烟草品种材料；相关烟草材料种植于郑州烟草院种植基地，培育条件为：22℃、16h光/8h暗；

相关引物合成及测序工作，由郑州擎科生物科技有限公司合成和提供；

实验试剂：

植物 RNA 快速提取试剂盒，北京艾德来生物科技有限公司产品；

PrimeScript® ReverseTranscriptase试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司；

琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒，Takara公司产品；

实验仪器：

离心管和枪头等， AXYGEN公司产品；

NanoDrop2000 超微量分光光度计，赛默飞世尔科技有限公司；

2100 生物分析仪，美国安捷伦公司产品；

激光共聚焦显微镜ZEISS LSM 700，Germany；

定量PCR仪LightCycler®96，Roche公司产品。

实施例1

本实施例就烟草NtHQT基因的克隆、序列分析过程简要说明如下。

（一）NtHQT基因的克隆

以生长4周的红花大金元叶为样品，参考试剂盒说明书，提取其总RNA，并利用 DNA酶 （DNase I）去除 RNA 中残留的少量 DNA，然后利用分光光度计测定OD₂₃₀、OD₂₆₀和 OD₂₈₀值并计算浓度，同时用生物分析仪测定 RNA 的完整性；

进一步参考反转录试剂盒说明书，选择纯度高、完整性好的总RNA 用于cDNA第Ⅰ链的合成。

基于NCBI数据库、以及现有HQT 基因序列及相关BLAST分析结果，发明人设计了PCR扩增用引物序列如下：

上游引物NtHQT-F：5'-ATGAAAGAAGCATTAAGTAATG-3'，

下游引物NtHQT-R：5'-AAATTCATACAAGTACTTCTCA-3'。

然后，以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，PCR扩增过程中，25 µL反应体系设计如下：

PremixTaq，12.5 μL；

上游引物，0.4 μL；

下游引物，0.4 μL；

cDNA模板，2μL；

ddH₂O，9.7 μL；

PCR反应程序：94℃预变性 5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸75s，30个循环；72℃延伸 10 min。

对PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用回收试剂盒回收目的片段。

对所回收的目的片段、纯化后，参考现有常规转基因操作，将其与pMD19-T 载体连接，并转化感受态细胞DH5α，进一步挑取筛选后阳性白色单菌落进行扩增（37℃、200 r/min摇床12 h左右）后，进行菌液PCR鉴定，并提取质粒进行测序鉴定。

测序结果表明，本申请克隆所得HQT基因，为一新基因，全长4086bp，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

ATGAAAGAAGCATTAAGTAATGTTCTTGTTTCATTTTACCCAATGGCTGGAAGATTAGCTAGAGATGAACAAGGAAGAATTGAGATAAATTGTAATGGAGAAGGAGTTTTATTTGTTGAAGCTGAAAGTGATGCTTTTGTTGATGATTTTGGTGATTTTACTCCAAGTTTGGAACTTAGGAAACTTATTCCTACTGTTGACACTTCTGGTGATATTTCTACTTTCCCCCTCATCATCTTTCAGGTATTTATATACACCAATATTTTTACACTATCAGTATATTTTTATATGTCGTAATAGGTTTTCTGCTTTATTTTATTGGCTACTGATTTCACTTATTACGATCATCTAGCCGGGGGCGGAGATGATGGGTATATCAGTGTATTTTAATATGTCCTAATAGGTTTCTTGCTTAGTGATTTCACTTATTATGATCATCTAGCTGGGGGCGGAGTTGCAGCTATGTGATCTGGACGTCATATGTTCTAGCCGTCAAAACAGTCTCTTGAGAAACGCAGGGTAAGACTGCATACAATAGAGCTTTGTAGTTCGGCCCTTCCTCGAAACCTGCACATAGCTTAGCTTAGTACACCGGACTACTTTTTTAGCTGGGGCAGAAATGATGGGTATATCGGTACGCTATCAGTATATTTTAATATGCCGTAGTAGGTTTCTTACATTATTTTCTTGGTTATTGATTTCACTTATTATGATCGTCTAGCACCTATAGACGGGGTGGAACTAGAGGGTAAGATATTAGTTCGAATGAATTCAGTAGATTTAACTCGCACTTGTTAAAAAGTTTACTAAATAAGTACAAGTAATTGATTTTGAGCCGAATAGCTCAAATGAGGTTGTGTTAGATCTTGATTCGAGCTTATAAAGTTCAAATTTCAGATCCGCCCCTATTTAATTTAAAAAATATTTACATTGTCATGTATAGAATCTAAACTTTTGAGTAGTGAAAGAATAATATTTCTACTAGAATAAGATTTTGATGGTCCAAACTTTTGATTGGAAAGATTGGAAAGATTGGAAGGGAGAGTAGTAGCTGTGAAATGGTGAAACATTGAAAAAATTTTACTGAAAATGGAGAGGAAATATAGACACCTACTTTTCTTGTTATTCAATTAAGGCGCCGTTTGTCCATAAAAAAATTTGATTTTCTTTTATAAAAAAAAAATTAAAAATGTGTTTGTCCATGAATTTTTGCAGATTTTTATAATTTTTTTCCCCATTCACGCAACTGTAATATTTTTTCAAGGGAAATGCATGTTCAAACATAATTTCAAATTCCAAATACCATTTTTCAACATAACTCTAATTACTATTTTTTTCCAAAAATTATAATTTTTATGTCCAAACGCCTACTAAAAAATTCACTATTTTTTTCCCTTTCTTTTTCTAGTATGAAAATATAGACTTGTTCTACTATGCTTTAAAAATAATACATACACTAATTAAAGTAAATAGCTAGCAATAGCTAAGGGGCACTTTCGTCGCAATTACTTTTGAACTACCCACTTTGAAAATTTGGTCAAAGATTATGTGTTTGGTGTAGAAGGTATTTTGGGAAAGATTTATCTTTGAATTTAAATTTTATGGGTTCTAATATGAAAATTTTAATACTAAATTTATTTTATTTTTAAGTTTACGAATTCAAAATTAAATATTTACTAATTTTTTTTATAATTTTATACATTTAATGTAAAAATATTATATTCAGTTGAACTCGTACGAAGAATCTATCCAATTATTGGTGGCAATTAATTTTAGAGGAGAAAGAGGACTTTTAATTTCATAGGTACACAAATCTAGGGAAAATATACATTTATTATAGTTTACGAGGTGGAGGAATACAGATAAAACCATAAATGTAAAGTGCTAATTAGATCTATAAGTTAATTAGTGCTATCTTATTTAGTGTTAAACTTATTAAAAAAAGTCAAAAGTACACACAATTTGACTTTGATATAGTGTTTAAAAAAGAAAGATAAAAAGGACAGAACCACTCCAAAATAGAAAATTACGATTTTAAAGGAATACATAAAGCTGTCCAAATACCAAATCCAAAACTTCTTAGTACATTAAAACCTATTTATACATACTTGTTTGTTTCAATATTTTTTTTGTGTTACTCTAAATGCTGTTAGAGATTAGATATATTATAACATAATATAAAAATCGGTTTCGAAAAATTTGAATTTTATAATGAATCCCTATTATACAGGGATGTTTGTTATACAAAGGTTTGAATATATTGTCTATTTATTATTTTATTTCATCTGGAGTTCGGTATTCGCTGGCGTTCGGTATTCGCTTTGAGCTCGGCTACTCCAGATTCTCGTTGGATAGTCCAATTTTAAGAGTATAATGTTCCCTATTAAATACGACTTCATTTTCAAAATTTGAATTTAAAACCTTAATTAAAGATAAACAAATATTTATTACTCTGCTGCAAACTTTGGTGATACCGTTAATAATTCATAAAGACTATATGAGAAACAACAAGTGGCGCAGTGCGTAGGCCATACATAGATTTAATATTCCATCAGTATGAAAGGTTTGTGTTTGGATTTTTGCTCTTTACTGTATTTGGATCTGTGCATGTGAAAGCATTAATAAAATGATAAAATTTACTATAGTTCACAACTCACATTTCCCTAGCAAGTTGGTCCATAAATTAGTTCACACGTCACATCTCCCTAGTAAATTTGTCTAAAAATGAATGGCTCATAAACTCATATTAAATCATATATTTTTAAATATATTTACAGTATATTTATGTTCTTAGATTGTTATTACTGTCTACTATTTGATTGCTATCTTTCGCTTCGGTGGTCTTAAAAACTTGTTATTACTACTTGTAGCCATTGCTTCTTTGCATCTTTTCTTTAGTCGAGTTTCTATCGGAAACAACCTTACTGTCCTCCCAGGGTAGGTGCACGATCTGCGTACACATCTACTCTCCCACAGACCCCATTATGAAATTTACTGGATTATTATTGTTGTCGTTGTAGAAACTGCTAATTTTTAGATTATCAAATCATACTTAATATGAGAAATTACATGTTATTGTATATCTACTAAATTTGATAGTACAAGAACTTTTATATTGCAGTGACATTTCTTGTTATTTGTAGTAGTATGAATAAAGATTGACACTTAAATTTAATATTATTTTGTGTGATCTTTAATTAGGTTACTCGTTTCAAATGTGGTGGAGTTTCACTTGGTGGAGGAGTATTCCACACTTTATCAGATGGTCTCTCATCAATTCACTTCATCAACACATGGTCCGATATAGCCCGAGGCCTCTCCGTCGCCATCCCGCCGTTCATCGACCGGACCCTCCTCCGTGCACGGGACCCACCAACATCGTCTTTCGAGCACGTCGAGTATCATCCTCCTCCATCTCTAATTTCATCATCAAAAACCCTAGAATCCACAAGCCCAAAGCCTAGTATGACAACCATGTTAAAATTCTCTAGTGACCAACTTGGGCTTTTAAAGTCCAAGTCCAAACATGAAGGTAGCACATACGAAATCCTCGCGGCCCATATTTGGCGTTGCACGTGCAAAGCACGTGCACTAGCCGACGATCAATTGACCAAATTACATGTTGCCACTGATGGTAGGTCTAGGCTTTGTCCTCCTTTACCACCAGGTTACTTGGGAAATGTTGTGTTCACAGCTACACCGATGGCAAAATCAAGTGAACTTTTACAAGAACCATTGACAAATTCAGCTAAGAGAATTCATACTTCATTGTCAAAAATGGATGATAATTACCTAAGATCAGCGCTCGATTACCTCGAATTACAGCCCGATTTATCGGCTTTAATCCGTGGCCCGACATACTTTGCTAGCCCTAATCTTAATATTAATAGTTGGACTAGATTGCCTGTTCATGATTCAGATTTTGGATGGGGAAGACCAATTCATATGGGACCAGCTTGCATTTTATATGAAGGGACAGTTTATATATTACCAAGTCCAAATAGTAAAGATAGAAACTTACGTTTGGCTGTTTGTTTAGATGCTGATCATATGCCACTATTTGAGAAGTATTTGTATGAATTTTGA。

进一步利用DNAMAN软件对上述序列进行分析，结果表明，本申请克隆所得NtHQT基因，包含1个内含子和2个外显子，其中编码区（CDS）长1128bp，编码375个氨基酸，编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

MKEALSNVLVSFYPMAGRLARDEQGRIEINCNGEGVLFVEAESDAFVDDFGDFTPSLELRKLIPTVDTSGDISTFPLIIFQVTRFKCGGVSLGGGVFHTLSDGLSSIHFINTWSDIARGLSVAIPPFIDRTLLRARDPPTSSFEHVEYHPPPSLISSSKTLESTSPKPSMTTMLKFSSDQLGLLKSKSKHEGSTYEILAAHIWRCTCKARALADDQLTKLHVATDGRSRLCPPLPPGYLGNVVFTATPMAKSSELLQEPLTNSAKRIHTSLSKMDDNYLRSALDYLELQPDLSALIRGPTYFASPNLNINSWTRLPVHDSDFGWGRPIHMGPACILYEGTVYILPSPNSKDRNLRLAVCLDADHMPLFEKYLYEF。

需要说明的是，尽管本申请克隆所得HQT基因与现有从普通烟草克隆所得HQT基因相似度较高（基因相似性为83.6%、氨基酸序列相似性为83.94%），但综合分析认为，这仍然属于两个完全不同的功能基因，因此对其功能仍有必要进行进一步分析和验证。

实施例2

为确定克隆所得NtHQT基因功能，针对该基因，发明人进一步制备了超表达载体，从而为相关转基因植株构建及基因功能验证奠定基础，本实施例就相关超表达载体构建过程简要说明如下。

首先，针对实施例1所获得的目的基因NtHQT，设计PCR扩增用引物（目的在于增加BsmBI和Esp3II酶切位点）如下：

上游引物F：5'- CAGTCGTCTCACAACATGAAAGAAGCATTAAGTAA-3'，

下游引物R：5'-CAGTCGTCTCATACAAAATTCATACAAATACTTCT-3'；

然后以实施例1中所制备的含有NtHQT基因的重组pMD19-T 质粒载体为模板，进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行回收、纯化。

对PCR扩增产物采用BsmBI和Esp3II进行双酶切，同时对pBWA(V)HS-GLosgfp载体采用BsmBI和Esp3II进行双酶切，并分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并进行筛选，挑取阳性克隆质粒进行菌落PCR鉴定和测序鉴定，确保重组构建正确，并将最终构建正确重组超表达载体质粒命名为：pBWA(V)HS-NtHQT-Glosgfp。

需要说明的是，pBWA(V)HS-Glosgfp本身含有GFP荧光蛋白，利用这一特点，发明人将上述重组超表达载体质粒pBWA(V)HS-NtHQT-Glosgfp和pBWA(V)HS-GLosgfp空载体分别转化烟草原生质体，转化成功后，利用激光共聚焦显微镜检测荧光信号，以对NtHQT在细胞内的分布情况进行亚细胞定位。

结果如图1所示。分析可以看出：NtHQT表达蛋白定位在细胞质中，并在细胞质中有团状表达。

实施例3

基于实施例2所制备的超表达载体，发明人进一步将其转化烟草植株，并筛选、培育获得新的转基因烟草新品种，具体过程简要介绍说明如下。

（1）制备农杆菌感受态细胞

挑取单菌落农杆菌GV3101在2ml的 LB（含20 mg/mL Rif）中28℃培养过夜，然后取生长良好的菌液2 ml（含25 mg/L Rif）接种于50 ml LB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀=0.5左右；

将菌液转移至50 ml离心管，放置冰上30分钟，然后离心收集菌体（4℃、5000 rpm离心5分钟）；

用10 ml的0.15 M 预冷的氯化钠溶液轻悬菌体，离心收集菌体（4℃、5000 rpm离心5分钟）；

弃去上清，加入20 ml预冷的20 mM氯化钙溶液悬浮菌体，将制好的感受态细胞以100 µl/管分装以便使用。

（2）转化农杆菌

取1 μl 实施例2所制备的超表达质粒，加入含100 µl农杆菌感受态细胞的离心管中，冰上放置30分钟；

随后转入液氮速冻1分钟，然后37℃温育5分钟；

加入1 ml的LB液体培养基，28℃震荡培养3小时；

5000 rpm离心1分钟，弃去上清，加入200 μl LB液体培养基，重悬沉淀；

取200 μl重悬菌液均匀地涂于含20mg/L Rif和50mg/L卡那霉素（Kan）的LB固体平板上，28℃培养2-3天；

菌落PCR鉴定，确保质粒转化正确，此即为后续转化有浸染菌液。

（3）转化烟草

将生长旺盛的K326烟草叶片消毒后剪成1cm²小块，置于MS分化培养基中，于28℃、光照强度2000Lx、光照时间为16 h/d的条件下，预培养2天；

然后放入上述步骤（2）所制备浸染菌液中侵染10-15min，期间摇荡菌液数次，然后用无菌滤纸吸干多余菌液；再转入MS分化培养基中，于28℃、黑暗条件下共培养4天左右；

用无菌水将共培养后的植物体洗涤3次，用无菌纸吸干，转入含潮霉素和羧苄青霉素的MS分化培养基中，恒温培养；期间每隔10天左右更换1次培养基；

待不定芽长至1-2cm时，将丛生不定芽切割成单个小芽，转移到含潮霉素、羧苄青霉素和活性炭的MS生根培养基中，促进其生根；

待根系发育好后，将组培苗取出，用清水洗净根部的培养基，剪掉下部少量叶片，转移到盛有疏松无菌土的花盆中，按常规管理培养。此即为转基因初代苗（T0代）。

需要说明的是，上述转基因苗筛选鉴定过程中，采用PCR方式进行鉴定，具体而言：

首先，设计表达载体的特异性引物对如下：

上游引物（特异性结合35S启动子）：5'-TCATTCAAGATCTCTCTGCCGACAG-3'；

下游引物（特异性结合NtHQT基因）：5'-TCAAAATTCATACAAATACTTC-3'；

然后，以幼苗基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增出特异性条带的即为阳性转基因幼苗。

为了验证表型能否稳定的遗传到下一代，收集T0代阳性植株种子，继续种植后获得T1代植株，进行PCR扩增分析。

栽种过程中，为对比分析转基因植株中HQT基因表达情况，发明人同时栽培了常用K326植株作为对照（栽培表型如图2所示，HQT过表达植株叶片稍有卷曲，叶色较对照比颜色更绿）。

具体分析HQT基因表达情况分析时，以烟草L25基因作为内参基因，采用定量PCR扩增方法进行分析，分析过程中，具体引物序列设计如下：

上游引物：5'-TATCATCCTCCTCCATCTCTA -3' ，

下游引物： 5'-TTCGTATGTGCTACCTTCAT-3' ；

L25内参基因上游引物：5'-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3'，

L25内参基因下游引物：5'- AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3'；

反应结束后，根据得到的CT值，用2^-△△CT方法计算NtHQT基因的相对表达量。

基于相关表达量分析和栽培表型结果，T0代植株的相关表达特性能稳定的遗传到T1代，也即，转基因植株构建是成功的和稳定的。

具体表达量结果如图3所示。可以看出：超表达NtHQT转基因植株叶片中NtHQT表达量显著提高，转基因烟草植株(OE-2、OE-3、OE-4和OE-5)中绿原酸的含量和对照（K326）相比，表达量均有明显提高。

进一步地，发明人对不同转基因植株中绿原酸含量进行了检测分析。首先就绿原酸检测分析中的GC-MS分析方法简要说明如下。

色谱柱：Symmetry C18 (4.6×250 mm，5 µm)；

检测波长340 nm，进样量5 µL，流速1.0 mL/min，

流动相A为：水/甲醇/乙酸(44/5/1，v/v/v)，B为甲醇/水/乙酸(44/5/1，v/v/v)；

梯度洗脱程序：

0~15.0 min，10％-30％B；

15.0~26.0 min，30％-90％B；

26.0~28.0 min，90％B；

28.1-35.0 min，10％B。

具体绿原酸含量测定结果如图4所示。可以看出，基因过表达后，转基因烟草植株(OE-2、OE-3、OE-4和OE-5)中绿原酸的含量和对照（K326）相比，均有明显增加，具体数值而言，分别增加了17.9%、38.7%、27.6%和30.6%。这一结果表明，本申请所提供的新的NtHQT基因在烟草绿原酸合成中具有重要的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120> 烟草绿原酸合成基因NtHQT及其应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4086

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgaaagaag cattaagtaa tgttcttgtt tcattttacc caatggctgg aagattagct 60

agagatgaac aaggaagaat tgagataaat tgtaatggag aaggagtttt atttgttgaa 120

gctgaaagtg atgcttttgt tgatgatttt ggtgatttta ctccaagttt ggaacttagg 180

aaacttattc ctactgttga cacttctggt gatatttcta ctttccccct catcatcttt 240

caggtattta tatacaccaa tatttttaca ctatcagtat atttttatat gtcgtaatag 300

gttttctgct ttattttatt ggctactgat ttcacttatt acgatcatct agccgggggc 360

ggagatgatg ggtatatcag tgtattttaa tatgtcctaa taggtttctt gcttagtgat 420

ttcacttatt atgatcatct agctgggggc ggagttgcag ctatgtgatc tggacgtcat 480

atgttctagc cgtcaaaaca gtctcttgag aaacgcaggg taagactgca tacaatagag 540

ctttgtagtt cggcccttcc tcgaaacctg cacatagctt agcttagtac accggactac 600

ttttttagct ggggcagaaa tgatgggtat atcggtacgc tatcagtata ttttaatatg 660

ccgtagtagg tttcttacat tattttcttg gttattgatt tcacttatta tgatcgtcta 720

gcacctatag acggggtgga actagagggt aagatattag ttcgaatgaa ttcagtagat 780

ttaactcgca cttgttaaaa agtttactaa ataagtacaa gtaattgatt ttgagccgaa 840

tagctcaaat gaggttgtgt tagatcttga ttcgagctta taaagttcaa atttcagatc 900

cgcccctatt taatttaaaa aatatttaca ttgtcatgta tagaatctaa acttttgagt 960

agtgaaagaa taatatttct actagaataa gattttgatg gtccaaactt ttgattggaa 1020

agattggaaa gattggaagg gagagtagta gctgtgaaat ggtgaaacat tgaaaaaatt 1080

ttactgaaaa tggagaggaa atatagacac ctacttttct tgttattcaa ttaaggcgcc 1140

gtttgtccat aaaaaaattt gattttcttt tataaaaaaa aaattaaaaa tgtgtttgtc 1200

catgaatttt tgcagatttt tataattttt ttccccattc acgcaactgt aatatttttt 1260

caagggaaat gcatgttcaa acataatttc aaattccaaa taccattttt caacataact 1320

ctaattacta tttttttcca aaaattataa tttttatgtc caaacgccta ctaaaaaatt 1380

cactattttt ttccctttct ttttctagta tgaaaatata gacttgttct actatgcttt 1440

aaaaataata catacactaa ttaaagtaaa tagctagcaa tagctaaggg gcactttcgt 1500

cgcaattact tttgaactac ccactttgaa aatttggtca aagattatgt gtttggtgta 1560

gaaggtattt tgggaaagat ttatctttga atttaaattt tatgggttct aatatgaaaa 1620

ttttaatact aaatttattt tatttttaag tttacgaatt caaaattaaa tatttactaa 1680

ttttttttat aattttatac atttaatgta aaaatattat attcagttga actcgtacga 1740

agaatctatc caattattgg tggcaattaa ttttagagga gaaagaggac ttttaatttc 1800

ataggtacac aaatctaggg aaaatataca tttattatag tttacgaggt ggaggaatac 1860

agataaaacc ataaatgtaa agtgctaatt agatctataa gttaattagt gctatcttat 1920

ttagtgttaa acttattaaa aaaagtcaaa agtacacaca atttgacttt gatatagtgt 1980

ttaaaaaaga aagataaaaa ggacagaacc actccaaaat agaaaattac gattttaaag 2040

gaatacataa agctgtccaa ataccaaatc caaaacttct tagtacatta aaacctattt 2100

atacatactt gtttgtttca atattttttt tgtgttactc taaatgctgt tagagattag 2160

atatattata acataatata aaaatcggtt tcgaaaaatt tgaattttat aatgaatccc 2220

tattatacag ggatgtttgt tatacaaagg tttgaatata ttgtctattt attattttat 2280

ttcatctgga gttcggtatt cgctggcgtt cggtattcgc tttgagctcg gctactccag 2340

attctcgttg gatagtccaa ttttaagagt ataatgttcc ctattaaata cgacttcatt 2400

ttcaaaattt gaatttaaaa ccttaattaa agataaacaa atatttatta ctctgctgca 2460

aactttggtg ataccgttaa taattcataa agactatatg agaaacaaca agtggcgcag 2520

tgcgtaggcc atacatagat ttaatattcc atcagtatga aaggtttgtg tttggatttt 2580

tgctctttac tgtatttgga tctgtgcatg tgaaagcatt aataaaatga taaaatttac 2640

tatagttcac aactcacatt tccctagcaa gttggtccat aaattagttc acacgtcaca 2700

tctccctagt aaatttgtct aaaaatgaat ggctcataaa ctcatattaa atcatatatt 2760

tttaaatata tttacagtat atttatgttc ttagattgtt attactgtct actatttgat 2820

tgctatcttt cgcttcggtg gtcttaaaaa cttgttatta ctacttgtag ccattgcttc 2880

tttgcatctt ttctttagtc gagtttctat cggaaacaac cttactgtcc tcccagggta 2940

ggtgcacgat ctgcgtacac atctactctc ccacagaccc cattatgaaa tttactggat 3000

tattattgtt gtcgttgtag aaactgctaa tttttagatt atcaaatcat acttaatatg 3060

agaaattaca tgttattgta tatctactaa atttgatagt acaagaactt ttatattgca 3120

gtgacatttc ttgttatttg tagtagtatg aataaagatt gacacttaaa tttaatatta 3180

ttttgtgtga tctttaatta ggttactcgt ttcaaatgtg gtggagtttc acttggtgga 3240

ggagtattcc acactttatc agatggtctc tcatcaattc acttcatcaa cacatggtcc 3300

gatatagccc gaggcctctc cgtcgccatc ccgccgttca tcgaccggac cctcctccgt 3360

gcacgggacc caccaacatc gtctttcgag cacgtcgagt atcatcctcc tccatctcta 3420

atttcatcat caaaaaccct agaatccaca agcccaaagc ctagtatgac aaccatgtta 3480

aaattctcta gtgaccaact tgggctttta aagtccaagt ccaaacatga aggtagcaca 3540

tacgaaatcc tcgcggccca tatttggcgt tgcacgtgca aagcacgtgc actagccgac 3600

gatcaattga ccaaattaca tgttgccact gatggtaggt ctaggctttg tcctccttta 3660

ccaccaggtt acttgggaaa tgttgtgttc acagctacac cgatggcaaa atcaagtgaa 3720

cttttacaag aaccattgac aaattcagct aagagaattc atacttcatt gtcaaaaatg 3780

gatgataatt acctaagatc agcgctcgat tacctcgaat tacagcccga tttatcggct 3840

ttaatccgtg gcccgacata ctttgctagc cctaatctta atattaatag ttggactaga 3900

ttgcctgttc atgattcaga ttttggatgg ggaagaccaa ttcatatggg accagcttgc 3960

attttatatg aagggacagt ttatatatta ccaagtccaa atagtaaaga tagaaactta 4020

cgtttggctg tttgtttaga tgctgatcat atgccactat ttgagaagta tttgtatgaa 4080

ttttga 4086

<210> 2

<211> 375

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Lys Glu Ala Leu Ser Asn Val Leu Val Ser Phe Tyr Pro Met Ala

1 5 10 15

Gly Arg Leu Ala Arg Asp Glu Gln Gly Arg Ile Glu Ile Asn Cys Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Val Leu Phe Val Glu Ala Glu Ser Asp Ala Phe Val Asp

35 40 45

Asp Phe Gly Asp Phe Thr Pro Ser Leu Glu Leu Arg Lys Leu Ile Pro

50 55 60

Thr Val Asp Thr Ser Gly Asp Ile Ser Thr Phe Pro Leu Ile Ile Phe

65 70 75 80

Gln Val Thr Arg Phe Lys Cys Gly Gly Val Ser Leu Gly Gly Gly Val

85 90 95

Phe His Thr Leu Ser Asp Gly Leu Ser Ser Ile His Phe Ile Asn Thr

100 105 110

Trp Ser Asp Ile Ala Arg Gly Leu Ser Val Ala Ile Pro Pro Phe Ile

115 120 125

Asp Arg Thr Leu Leu Arg Ala Arg Asp Pro Pro Thr Ser Ser Phe Glu

130 135 140

His Val Glu Tyr His Pro Pro Pro Ser Leu Ile Ser Ser Ser Lys Thr

145 150 155 160

Leu Glu Ser Thr Ser Pro Lys Pro Ser Met Thr Thr Met Leu Lys Phe

165 170 175

Ser Ser Asp Gln Leu Gly Leu Leu Lys Ser Lys Ser Lys His Glu Gly

180 185 190

Ser Thr Tyr Glu Ile Leu Ala Ala His Ile Trp Arg Cys Thr Cys Lys

195 200 205

Ala Arg Ala Leu Ala Asp Asp Gln Leu Thr Lys Leu His Val Ala Thr

210 215 220

Asp Gly Arg Ser Arg Leu Cys Pro Pro Leu Pro Pro Gly Tyr Leu Gly

225 230 235 240

Asn Val Val Phe Thr Ala Thr Pro Met Ala Lys Ser Ser Glu Leu Leu

245 250 255

Gln Glu Pro Leu Thr Asn Ser Ala Lys Arg Ile His Thr Ser Leu Ser

260 265 270

Lys Met Asp Asp Asn Tyr Leu Arg Ser Ala Leu Asp Tyr Leu Glu Leu

275 280 285

Gln Pro Asp Leu Ser Ala Leu Ile Arg Gly Pro Thr Tyr Phe Ala Ser

290 295 300

Pro Asn Leu Asn Ile Asn Ser Trp Thr Arg Leu Pro Val His Asp Ser

305 310 315 320

Asp Phe Gly Trp Gly Arg Pro Ile His Met Gly Pro Ala Cys Ile Leu

325 330 335

Tyr Glu Gly Thr Val Tyr Ile Leu Pro Ser Pro Asn Ser Lys Asp Arg

340 345 350

Asn Leu Arg Leu Ala Val Cys Leu Asp Ala Asp His Met Pro Leu Phe

355 360 365

Glu Lys Tyr Leu Tyr Glu Phe

370 375

Claims (4)

1.烟草绿原酸合成基因NtHQT在叶片绿原酸含量调节中应用，其特征在于，利用基因超表达方法，通过上调烟草HQT基因表达量，来提高烟叶中绿原酸含量；

所述烟草绿原酸合成基因NtHQT，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草绿原酸合成基因HQT所编码的转移酶在叶片绿原酸含量调控中的应用，其特征在于，该转移酶与植物叶片中绿原酸含量相关，对该转移酶超表达或者说提高其含量后，叶片中绿原酸含量明显增加；

所述烟草绿原酸合成基因NtHQT所编码的转移酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草绿原酸合成基因NtHQT的烟草品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术，构建含有NtHQT基因的超表达载体，转化烟草，筛选获得绿原酸含量上调的烟草品种；

所述烟草绿原酸合成基因NtHQT，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述利用烟草绿原酸合成基因NtHQT的烟草品种培育方法，其特征在于，构建含有NtHQT基因的超表达载体时，通过如下步骤制备获得：

（1）设计PCR扩增用引物序列如下：

上游引物F：5'- CAGTCGTCTCACAACATGAAAGAAGCATTAAGTAA-3'，

下游引物R：5'-CAGTCGTCTCATACAAAATTCATACAAATACTTCT-3'；

然后，以烟草基因组cDNA为模板，进行PCR扩增，并回收、纯化扩增产物；

（2）酶切、连接

对步骤（1）中的PCR扩增产物采用BsmBI和Esp3II进行双酶切，同时对pBWA(V)HS-GLosgfp载体采用BsmBI和Esp3II进行双酶切，并分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

（3）转化、筛选和鉴定

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌DH5α，并进行筛选，挑取阳性克隆质粒进行菌落PCR鉴定和测序鉴定，确保重组构建正确，并将最终构建正确重组超表达载体质粒命名为：pBWA(V)HS-NtHQT-Glosgfp。

Images